Tổng quan:

- Là một biến thể của PCR cổ điển

- DNA đích được nhân lên và sp được phát
hiện tại mỗi thời điểm diễn ra pư dựa vào tín
hiệu huỳnh quang khi kéo dài chuỗi
=> Mức độ tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận
với số lượng DNA được nhân bản

Định lượng tuyệt đối: dựa vào Ct

Mẫu đối chứng: cơ thể/ các tế bào ở trạng thái ổn định
=> Mức độ biểu hiện gen đích ở mẫu đối chứng là bình
thường
Mẫu đối chứng cũng có gen đích và gen chứng
Gen chứng: gen mà mức độ biểu hiện không/ít thay đổi
(x) delta-delta Ct= (Ct gen đích mt - Ct gen chứng mt) - (Ct gen
đích mđc - Ct gen chứng mđc)
Mức độ bh của gen so vs mẫu chứng = 2 mũ(-x)
Xác định số lượng coppy của đối tượng quan tâm (VK,
virus...) trong một đv thể tích của mẫu thử (huyết thanh, nc
tiểu...)
Khi có sự hiện diện của sp PCR sợi đôi -> chất nhuộm xen vào
-> phát sáng
=> Đo cường độ as phát ra sau mỗi CK
ĐỊNH LƯỢNG
Định lượng tương đối: Loại chất nhuộm này không đặc hiệu (không pb dc sp đích và
Tìm hiểu mức độ biểu hiện gen ở các giai đoạn khác nhau CHẤT NHUỘM phát huỳnh quang sp phụ)
của cùng 1 loại tế bào hoặc ở các cơ thể khác nhau (già vs trẻ) SYBR Green - được sd rộng rãi nhất
Giúp giảm chi phí nhưng cũng giảm tính đặc hiệu

Hai loại huỳnh quang Probe: các đoạn oligoNu sợi đơn, bổ sung đặc hiệu vs 1 vùng
ngắn trên DNA đích
Probe được gắn chất huỳnh quang
REAL-TIME PCR Taqman

ĐOẠN DÒ (probe) gắn huỳnh quang _Probe bắt cặp vs DNA đích _ không phát quang
_Khi DNA đích nhân đôi --> phá vỡ probe --> phóng thích đầu
phát quang --> phát quang

Giai đoạn tích lũy tín hiệu nền (GĐ ủ)

Số lượng bản sao có tăng lên nhưng chưa đủ nhiều, cđ huỳnh
quang chưa đủ để máy ghi nhận

Phần đầu của giai đoạn lũy thừa

Ct càng nhỏ => slg phân tử DNA trong mẫu ban đầu càng
nhiều
4 Giai đoạn chính: slg bản sao DNA đạt đến một ngưỡng nhất định --> CĐ huỳnh
Định tính: Giai đoạn lũy thừa quang tăng lên thì máy ghi nhận được trên biểu đồ - ứng vs 1
chu kỳ xác định Dựa vào Ct tính toán ra số phân tử DNA đích trong mẫu ban
Tương tự PCR cổ điển: xác nhận sự hiện diện đầu
=> CK này gọi là CK ngưỡng (Ct)
của DNA đích trong mẫu thử Sau ck ngưỡng thì cđ tín hiệu sẽ tăng theo lũy thừa

Giai đoạn bình ổn (GĐ bình nguyên) Do tính tự giới hạn của PCR