CÁC PHƯƠNG PHÁP

CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

Vũ Thanh Thảo
vuthanhthao@ump.edu.vn
 Chẩn đoán phân tử
 Hệ thống chăm sóc sức khỏe ngày nay phụ thuộc
rất nhiều và chủ yếu vào chẩn đoán.
 Cung cấp những thông tin quan trọng ở mọi giai
đoạn từ phòng ngừa, phát hiện bệnh, chẩn đoán,
điều trị
 Các loại chẩn đoán: hóa học lâm sàng, miễn dịch,
huyết học, vi sinh và chẩn đoán phân tử.
 Chẩn đoán phân tử (Molecular Diagnostics): mức
độ phân tử trên DNA, RNA hay phân tử protein
 Giúp tiên lượng bệnh
 Cung cấp các thông tin chi tiết về tình trạng bệnh
 Theo dõi các kết quả của việc điều trị.

2
 Lịch sử chẩn đoán phân tử
 Năm 1980, tư vấn về xét nghiệm di truyền trước sinh đối với
bệnh tan máu bẩm sinh) dựa trên RE cắt DNA tạo ra các chuỗi
DNA khác nhau tùy thuộc vào sự hiện diện của alen.
 Thuật ngữ “Chẩn đoán phân tử”: có trong tên của “Molecular
Diagnostics Incorporated”, “Bethesda Research Laboratories
Molecular Diagnostics”.
 1990: xác định các gen mới được phát hiện và kỹ thuật mới giải
trình tự DNA.
 1995: Hiệp hội Bệnh học phân tử (Association for Molecular
Pathology - AMP) được thành lập.
 Năm 1999, AMP đồng sáng lập Tạp chí Chẩn đoán Y khoa (The
Journal of Medical Diagnostics);
 2002, Dự án Bản đồ Hap (Haplotype map) đã kết hợp thông tin
về sự khác biệt di truyền một chữ cái có trong quần thể người,
dưới dạng đa hình nucleotide đơn
 2012, các kỹ thuật chẩn đoán phân tử bệnh thalassemia sử
dụng các xét nghiệm lai DNA để nhận ra SNP gây ra bệnh. 3
 PP chẩn đoán phân tử
Dựa trên phản ứng PCR
Dựa trên enzyme
Dựa trên kỹ thuật điện di
Dựa trên lai phân tử, botting
Microarray
Giải trình tự

4
 Phương pháp dựa trên PCR
PCR
Multiplex PCR
Reverse Transcription-Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR)
Realtime PCR

5
PCR
ppoting This
khurch o
ai
ky that

DNA , do
so

6
 Đặc điểm của PCR
 Nhược điểm (fibenngo)
 Phản ứng dễ bị ảnh hưởng bởi sự nhiễm tạp của ADN ngoại lai,
có thể được khuếch đại cùng với mẫu. and PCR chi SdIlan
->

 ADN lạ này có thể được mang sang từ các sự khuếch đại trước
đó (amplicon) hoặc từ các nguồn khác.
 Qui trình thực hiện phải được tuân thủ chặt chẻ, kiểm tra chất
lượng enzym một cách nghiêm ngặt và sử dụng bộ pipette
riêng và các thành phần phản ứng nên được phân liều trước.
 Đòi hỏi nhiều kỹ năng kỹ thuật và vài trang thiết
bị thí nghiệm đặc biệt. thao taitren long the e
-

 PCR là bán tự động, kỹ thuật vẫn đòi hỏi một

lượng lao động đáng kể để chuẩn bị mẫu và phát
hiện sản phẩm ADN
that bi
his

-> doi a law

day

ghiam I 7
 bos 1
top shark
-> enzyme trios boo .

Hot Start PCR

hie
60-72e :
hot til' hat 90-95°C :

gan't" dat ↑

55-60°C :

gan ma ; enzyme
van hat .
-> ↳
ospph

peR chind cao .

Clip ghiain 2 +3 .
8
Touchdown PCR
↳
gan ma
thay doitrg air's pi

4 9
 phat him i
sptrog
1
pic .

Multiplex PCR -> Whi BN chin doing this is binh

/
I nhan

↳ phat hi
-
whi binf whar
:
mai
I
 Phản ứng thực hiện đồng thời nhiều trong
phản ứng PCR trong ống PCR đơn.
 Hai hoặc nhiều cặp mồi được bao
gồm trong một ống phản ứng và hai
hoặc nhiều mẫu DNA được gắn với
mồi cùng một lúc.
 Các cặp mồi phải đặc trưng cho gen
mục tiêu và các sản phẩm PCR phải de de pbit
-> ,

có kích thước khác nhau, đặc trưng

cho các chuỗi DNA khác nhau.
 Thiết kế mồi đặc hiệu: quyết định đến
sự thành công của phản ứng
multiplex PCR.
i thuan "
↳tra man darc phain
hiem

 Các mồi nên có nhiệt độ nóng chảy

tương đương nhau, tốt nhất là nằm in
-> che thic him
:
1 pio .

trong khoảng từ 55°C - 60°C.

this be'ma cap ched. 5 10
 SARS-CoVi2
RT-PCR
 Kỹ thuật tổng hợp cDNA từ phiên mã ngược (RT),
sau đó khuếch đại cDNA cụ thể bằng PCR.
 Sử dụng để phát hiện và định lượng mRNA. DNA
->

 RT-PCR chủ yếu được sử dụng để phát hiện virus

và lượng vi khuẩn sống thông qua việc đánh giá
mRNA của vi sinh vật.
 RT-PCR có thể thực hiện theo quy trình một bước
hoặc hai bước

6 11
RT-PCR

dang section -

cap's cong
--
lau
I

->
kuech a
-

thank
-

gia cas
- >

6 12
 RT-PCR

L chi cho o Il 1 .
chicho-ch'thank DNA .

hie
->
ne primers "ta &
2 ,
Whi can this hie pi mos lay' Ra
L Trends-whi
.

-> de hot 55°C no code lam RT-Perturn

->
too
ra
up phan 2
do bar quain hom -

in than tai
-> Sd hot Start PeR matcong -
-> de
tashim
-

6
13
 Real-time PCR
 Xét nghiệm định lượng đơn giản cho bất kỳ chuỗi
DNA khuếch đại nào.
 Được mô tả lần đầu tiên bởi, Higuchi. Nó dựa trên
việc sử dụng các đầu dò có nhãn huỳnh quang để
phát hiện, xác nhận và định lượng sản phẩm PCR
ngay khi chúng được tạo ra.
 Khuếch đại và phát hiện sản phẩm trong cùng
một ống phản ứng.
the "whin that'
o'
ra
↳ sp taw
.

7 14
Nguyên tắc phát hiện sản phẩm Real-time PCR

Nhuộm xen giữa:

 Phản ứng PCR được bổ sung
chất nhuộm xen giữa như SYBR
Green I, ↳phat heyh quang
 Chất này tự do trong dung dịch
thì không phát huỳnh quang,
 Chèn vào sợi đôi ADN (sản phẩm
PCR) sẽ phát huỳnh quang.
 Tín hiệu đọc khi chu kỳ PCR kết
thúc.

7
15
Nguyên tắc phát hiện sản phẩm Real-time PCR

Phân hủy đoạn dò:

 1 đoạn dò đặc hiệu với trình tự sản phẩm
được thiết kế sao cho 1 đầu được gắn phân
tử phát huỳnh quang, 1 đầu gắn phân tử
dập,
 Khi còn nguyên vẹn hoặc gắn trên trình tự
đích thì không thể phát huỳnh quang được.
 Trong pha kéo dài của PCR, Taq polymerase
sẽ sử dụng hoạt tính 5’ exonuclease để
phân hủy đoạn dò, dẫn đến phân tử phát
huỳnh quang và phân tử dập không còn ở
gần nhau nữa nên huỳnh quang sẽ được giải
phóng.
 Tín hiệu được đọc khi chu kỳ PCR kết thúc.

7
16
 Đoạn dò TaqMan
Phân tử phát Phân tử dập
na cons nham
-> -

n
-> phat highs quay
doc do
-

L Biến tính

Tín hiệu bị dập

hating z

E phat Gắn mồi PCR

hught grang và đoạn dò TaqMan

Tín hiệu được giải phóng

-> phat huych quang

Kéo dài
và phân hủy TaqMan
7
is
so'chuly cas .
From him cany how .
17
Nguyên tắc phát hiện sản phẩm Real-time PCR

Lai hóa đoạn dò:

 Hai đoạn dò có gắn phân tử phát huỳnh
quang được thiết kế sao cho đều gắn
đặc hiệu với trình tự đích (sản phẩm
PCR) theo kiểu đuôi-đầu.
 Khi cùng lai hóa trên trình tự đích
huỳnh quang của phân tử thứ nhất sẽ
kích thích sự phát quang của phân tử
thứ 2 tạo ra tín hiệu,
 Trong pha kéo dài, Taq polymerase sẽ
tách 2 đoạn dò ra thành dạng tự do nên
tín hiệu sẽ mất đi.
 Tín hiệu được đọc khi bắt đầu chu kỳ
PCR sau bước gắn mồi.
and ka o'Apvita liven the 2 draw nob mi gar lei
-
blin man .

18
 tin him Ho the
phat hi de
Chu kỳ ngưỡng Ct
so'ban
cat cay is phiasau saw
esing
↓.

I 19
 Phương pháp dựa trên enzym
8 Enzym cắt giới hạn:RFLP (Restriction
fragment length polymorphism), dựa trên
thay đổi vị trí enzym cắt giới hạn hạn chế,
dẫn đến tăng hoặc mất đi các vị trí nhận
diện của enzym. cat think Hi das him / nhan dien
⑲
Enzym phân giải T4 endonuclease VII và
gần đây là T7 endonuclease I để phân hủy
DNA dị hợp tử được hình thành bằng cách
Wild-
ủ DNA hoang dại và DNA đột biến. Đột metant
-

Type
-

L
biến được xác định thông qua kích thước

Lo a
của các mảnh khác nhau.
indian him so drantar
rai's hom

20
Phương pháp dựa trên enzym

21
 Phương pháp dựa trên enzym
 Oligonucleotide ligation assay - OLA:
 Liên quan đến việc lai hai oligonucleotid để kéo dài DNA bổ
sung tại các vị trí có thể xảy ra đột biến.
 Các mồi oligonucleotid được thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi thứ
nhất liền kề với đầu 5’ của mồi thứ hai.
 Đoạn mồi đầu tiên khớp hoàn toàn với DNA đích, có thể được
nối bằng DNA ligase. Nếu không xảy ra sự không khớp ở đầu 3’
của mồi đầu tiênkhông thu được sản phẩm nối nào.

do

10
22
 Phương pháp dựa trên kỹ thuật diện di
 Sàng lọc đột biến đã biết hoặc chưa biết, dựa
trên khả năng di chuyển theo dòng điện khác
nhau của các alen đột biến
 Phân tích đa hình dạng chuỗi đơn (Single strand
conformation polymorphism - SSCP) và phân
tích dị phân tử lai (heteroduplex - HDA)
dua
vir
ben
gradient
char

prich

d)

23
 Phương pháp dựa trên kỹ thuật diện di
 Điện di gel theo gradient nhiệt và và điện di gel theo
gradient chất biến tính (Denaturing and Temperature
Gradient Gel Electrophoresis - DGGE và TGGE)
 Phân tích DNA có kích thước ngắn hoặc trung bình.
 Sự khác biệt về tính di động khi điện di giữa gel hoang
dại và gel bị đột biến có thể quan sát trong một
gradient của các tác nhân biến tính, như urê và
formamid, hoặc tăng nhiệt độ.

Il
24
 Phương pháp dựa trên kỹ thuật lai
 Nền tảng cho hầu hết các công nghệ phát hiện đột
biến hiện nay nhờ vào lợi thế của kỹ thuật là có thể tự
động dễ dàng và do đó thích hợp để phát hiện hoặc
sàng lọc đột biến với thông lượng cao.
 Kỹ thuật lai acid nucleic dựa trên sự kết hợp bằng liên
kết hydro của các base nitơ của hai chuỗi nucleotid bổ
sung từ đó hình thành phân tử lai (duplex).
 Phân tử lai là kết quả của lai DNA-DNA, RNA-RNA
hoặc RNA-DNA DNA RNA, do đó phân tử sợi đơn có
thể là DNA hoặc RNA trong đó một chuỗi acid nucleic
(mẫu dò) từ một sinh vật có đã được xác định và một
chuỗi khác (chuỗi acid nucleic mục tiêu) từ một sinh
vật chưa biết hoặc chưa xác định.

12
25
Phương pháp dựa trên kỹ thuật lai
 Lai hóa đặc hiệu alen của sản phẩm khuếch đại
(allele-specific hybridization of amplified DNA -
PCR-ASO)
 Mở rộng trên các microarray oligonucleotid DNA
để phân tích đột biến với thông lượng cao

Wild
Type
-

12

26
Phương pháp dựa trên kỹ thuật lai
 Mỗi điểm DNA chứa khoảng pmol của một chuỗi
DNA cụ thể, được gọi là mẫu dò.
 Microarray đã có cải biến lớn trong công nghệ về
hiệu quả, khả năng phân biệt, độ nhạy, độ đặc
hiệu do những tiến bộ trong chế tạo, chế tạo
robot và tin sinh học, những cải tiến này giúp
microarray có thể ứng dụng trong chẩn đoán lâm
sàng.

13
27
Phương pháp dựa trên kỹ thuật lai
 Array dạng hạt (beadarray), tương tự như các
microarray đề cập ở trên, các beadarray (Illumina,
San Diego, CA)
 Beadarray là các hạt silica được lắp ráp ngẫu nhiên
vào 1 trong 2 chất nền có sẵn là Sentrix Array
Matrix (SAM) hoặc Sentrix Bead Chip (SBC).

28
 Giải trình tự
 PCR có hạn chế khi phát hiện đột biến thay đổi
trong vùng giàu GC, enzyme polymerase có tần
số sai sót khoảng 10-5 dẫn đến sai sót trong phân
tích kết quả.
 Giải trình tự DNA đóng góp to lớn trong việc phát
hiện các đột biến chưa biết.
 Các phương pháp giải trình tự:
 Thế hệ 1
 Thế hệ 2
 Thế hệ 3
 Thế hệ 4

14

29
Thế hệ 1 - Sanger

30
 Thế hệ 2
 Phương pháp pyrosequencing: dựa trên việc
đo lượng ppi giải phóng trong phản ứng tổng hợp
chuỗi DNA.

31
 Thế hệ 2
 Phương pháp Semiconductor dựa trên việc đo
tín hiệu ion H+ giải phóng ra trong phản ứng tổng
hợp chuỗi DNA.
The picture can't be displayed.

The picture can't be displayed.

32
 Thế hệ 2
 Phương pháp Illumina
 dựa trên việc đo tín hiệu từng loại huỳnh quang gắn vào
nucleotid trong phản ứng tổng hợp chuỗi DNA
 4 loại dNTP có gắn huỳnh quang mang gốc khóa ở đầu
3’OH.

33
34
Các gen sử dụng trong tầm soát ung thư

35
Các gen sử dụng trong tầm soát ung thư

36
 Thế hệ 3
 Dựa trên việc phân tích tín hiệu đơn phân tử (sigle molecular
realtime sequencing- SMRT).
 Phân tích thức thời tín hiệu đơn phân tử huỳnh quang gắn vào
nucleotid trong phản ứng tổng hợp 1 chuỗi DNA trong lỗ nano.
 Genome được cắt bằng enzym cắt giới hạn thành các đoạn
3000-15000 bp. Các đoạn DNA gắn với adapter để primer có
thể bắt cặp. DNA ủ trong các lỗ nano chứa DNA polymerase
cố định ở đáy lỗ.
 Mỗi DNA sẽ được giải trình tự theo cơ chế tổng hợp DNA với 4
loại dNTP gắn 4 loại thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau ở
gốc phosphat, tại 1 thời điểm chỉ có 1 loại dNTP quan tâm mới
đến đủ gần đáy lỗ và ngay trước khi gắn vào chuỗi, tín hiệu
huỳnh quang mà dNTP mang sẽ ghi nhận bằng camera rất
nhạy, ngay sau đó tín hiệu huỳnh quang bị cắt và trôi nổi
trong môi trường.

37
Thế hệ 3

38
 Thế hệ 4
 Công nghệ GTT DNA trên lỗ
Nano của Oxford, giải trình tự
tức thời dựa trên tín hiệu điện
phân tử.
 Sử dụng dòng điện để vận
chuyển mẫu chưa biệt qua một
lỗ có d 1 nm. Một protein
nanopore được gắn lên một
màng polymer không dẫn điện.
Độ lớn của cường độ dòng điện:
kích thước của lỗ nano, thành
phần DNA/RNA trong lỗ.
 Khi đủ gần lỗ mẫu làm thay đổi
đặc trưng bề cường độ dòng
điện qua bề mặt lỗ. Tổng dòng
điện qua lỗ bằng tích phân mặt
của cường độ dòng điện chảy
qua bề mặt lỗ giữa khoảng thời
gian t1 và t2.
39
 Kết luận
 Chẩn đoán phân tử sẽ là một phần không thể thiếu trong thực
hành y tế và chăm sóc sức khỏe
 Toàn bộ trình tự bộ gen có khả năng trở thành tiêu chuẩn vàng
trong việc đánh giá sự biến đổi DNA và những thay đổi trong biểu
hiện gen.
 Trở ngại lớn cần vượt qua trước khi thực hiện các xét nghiệm này
trong các phòng thí nghiệm như sử dụng thử nghiệm nào, lựa
chọn công nghệ và thiết bị và các vấn đề như hiệu quả chi phí, độ
chính xác, khả năng tái tạo, đào tạo nhân sự, bồi hoàn bởi bên
thứ ba người trả tiền, và sở hữu trí tuệ.
 Cùng với thử nghiệm dựa trên genomic và proteomic, những tiến
bộ này sẽ cải thiện chẩn đoán phân tử và sẽ tạo ra những thách
thức bổ sung cho việc triển khai công nghệ này trong các đơn vị
nghiên cứu, bệnh viện, phòng khám và công ty dược phẩm.

40
 Chuyên đề
 Trình bày nguyên lý, các đặc điểm kỹ thuật và
cách tiến hành của 1 trong các phương pháp
khuếch đại acid nucleic sau
 Trình bày 3-5 ví dụ cụ thể về ứng dụng trong
chẩn đoán bệnh hoặc xác định đột biến hoặc
công nghệ gen hoặc xác định kiểu di truyền hoặc
xác định quan hệ huyết thống của một trong các
phương pháp khuếch đại acid nucleic sau

41
 Chuyên đề
 Transcription Mediated Amplification (TMA)
 Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)
 Signal Mediated Amplification of RNA Technology (SMART)
 Strand Displacement Amplification (SDA)
 Rolling Circle Amplification (RCA)
 Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP)
 Isothermal Multiple Displacement Amplification (IMDA)
 Helicase-Dependent Amplification (HDA)
 Single Primer Isothermal Amplification (SPIA)
 Circular Helicase-Dependent Amplification (cHDA)
 Qβ Replicase Amplification (QRA)
 Cycling Probe Reaction (CPR)
 Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
 Branched PCR

42
 Chuyên đề
 Polymerase Cycling Assembly (PCA)
 Allele-specific PCR
 Intersequence-specific PCR
 Inverse PCR
 Ligation-mediated PCR
 Methylation-specific PCR
 Miniprimer PCR
 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)
 Multiplex-PCR
 Overlap-extension PCR (Splicing by overlap extension -
SOE)
 Quantitative PCR
 Solid Phase PCR
 Thermal Asymmetric Interlaced PCR (TAIL-PCR)

43