Weefselkweek

Regeneratie van de tabaks en tomatenplant

Inleiding

Weefselkweektechnieken worden vaak gebruikt om complete planten te regenereren

(laten ontstaan) uit een stukje weefsel. Ook is het een handige methode om de effecten
van groeihormonen te bestuderen. Weefselkweken betekent zoveel als een uitgesneden
stukje plantmateriaal kweken op een synthetisch kweekmedium. Dit gebeurt veelal in
steriele petrischalen of plastic potjes. Er wordt vaak gesproken van in vitro cultuur
verwijzend naar de glazen buizen en potjes waarin dit vroeger plaatsvond.
Het groeimedium, dat door agar tot een gel#achtige vaste stof gebonden is, bestaat uit
anorganische zouten, een koolstofbevattende energiebron zoals een suiker en opgeloste
vitamines.
Planten hebben bestaande delingsweefsels met actief groeiweefsel. Deze worden ook wel
meristemen genoemd. Meristemen bevinden zich bijvoorbeeld in wortel# en stengeltoppen
ten behoeve van de lengtegroei van de plant en in bladokselknoppen voor het maken van
nieuwe takken of bloemen.
Plantendelen zonder actief groeiweefsel hebben de toevoeging van de hormonen auxine
en cytokinine nodig om in vitro te kunnen groeien. Deze plantenhormonen zijn kleine
moleculen die gemakkelijk door de celwand van een plant heen kunnen dringen. Het
meest algemene resultaat van een in vitro weefselkweek is de groei van een klompje
ongedifferentieerde cellen, ook wel callus genaamd.
In een organisme bevat elke celkern de genetische informatie voor alle eigenschappen
van het organisme. Toch komt in een individuele cel maar een beperkt aantal van de
eigenschappen echt tot uiting, terwijl de andere informatie ongebruikt wel in de cel
aanwezig is. De ontwikkeling van een cel tot een bepaalde vorm en functie wordt
differentiatie genoemd. Ongedifferentieerde cellen zijn dus cellen die nog geen specifieke
informatie tot uiting hebben gebracht, ze kunnen nog alle kanten op. Morfogenese, de
ontwikkeling van gedifferentieerde weefsels, kan opgewekt ofwel geïnduceerd worden in
weefselkweken door de samenstelling van het medium te reguleren, met name wat betreft
de verhoudingen tussen verschillende groeihormonen. Belangrijke vooruitgang in het
onderzoeksveld van de plantengroei werd geboekt toen in 1957 Skoog en Miller een
uniek voorbeeld beschreven van de regulatie van de morfogenese van een weefselstukje
van de tabaksplant. Het onderzoek liet zien dat wanneer een specifieke combinatie van
auxine en cytokinine gebruikt werd, alleen ongedifferentieerde callus gevormd werd. Door
de verhouding tussen auxine en cytokinine te variëren, bleek groeimeristeemvorming in
de vorm van wortelvorming of scheuten geïnduceerd te kunnen worden.

Doel

Het doel van dit experiment is het onderzoeken van de effecten van verschillende
concentraties en verhoudingen van auxine (NAA) en cytokinine (BA) op de groei en
morfogenese van tabaksplantweefsel en tomatenplantweefsel in vitro.
Weefselkweek
Regeneratie van de tabaks en tomatenplant

Theorie

Groeimediums

Weefsel# of celkweek vindt plaats op een groeimedium. Dit medium bestaat vaak uit
macro#elementen, micro#elementen, vitaminen, suikers en plantenhormonen. Voor
algemene mediumoplossingen worden geconcentreerde oplossingen gemaakt die later
verdund worden. Om deze verdunningen te maken wordt altijd gebruik gemaakt van mQ
water. Dit is gedemineraliseerd water dat door een Millipore filter is geperst en is het
zuiverste water dat in het lab beschikbaar is.

Inhoud van het medium

Het medium, MS#medium, dat gebruikt wordt voor de groei van de planten is genoemd
naar de twee wetenschappers die dit in 1962 voor het eerst publiceerden: Murashige en
Skoog1. De componenten van het MS#medium staan in bijlage 1.
Voor de weefselkweek van de tabaksplant wordt als basis een standaard medium
gebruikt, het MS20#medium (zie tabel 1). Als 30 g/l sucrose wordt gebruikt in plaats van
20 g/l heet het een MS30#medium.

Tabel 1: MS20#medium (kan gesteriliseerd worden).

MS20#medium
MS#poeder 4.4 g/l
Sucrose 20 g/l
Agar 8 g/l (NB. eerst pH stellen!)

Aanpassen pH

Vóór het steriliseren en toevoegen van agar, moet het medium op pH 5.8 gebracht
worden (om te voorkomen dat de pH#electrode erg vuil wordt). Hierna kan het
gesteriliseerd worden zodat alle ziektekiemen dood zijn en het medium steriel is.
De pH van het medium wordt aangepast met behulp van een geconcentreerde KOH#
(verhoogt de pH) of HCl#oplossing (om de pH te verlagen). De glaselektrode van de pH#
meter wordt bewaard in een 3M KCl#oplossing wanneer zij niet gebruikt wordt. De
elektrode wordt gespoeld met mQ water voor èn na ieder gebruik. De elektrode wordt, na
gespoeld te zijn met mQ water, eerst afgedroogd met een zachte tissue. Normaal
gesproken is de pH van een oplossing iets te laag voor gebruik. De waarden tot waartoe
aangepast moet worden, verschillen per manier van steriliseren. In dit geval, bij
steriliseren, wordt de pH meestal aangepast tot 5.8

Steriel werken

Je gaat aan de slag met bijzonder kwetsbaar materiaal dat erg gevoelig is voor
besmetting. Je moet dus een aantal regels in acht nemen om besmettingen van de

1
Murashige en Skoog, Physiol. Plant 15 (1962) 473#497

2
Weefselkweek
Regeneratie van de tabaks en tomatenplant

weefselkweek met micro#organismen te voorkomen. Om dit experiment goed uit te

kunnen voeren is het nodig om te werken in een steriele omgeving. Aan de orde komen
het gebruik van een autoclaaf, filtersterilisatie en het werken met een laminaire flowkast.

Sterilisatie met behulp van een autoclaaf

Flessen met medium of andere oplossingen worden normaal gesproken met een
autoclaaf gesteriliseerd. Een autoclaaf is in dit geval een grote snelkookpan die
gedurende een bepaalde tijd de oplossing op een temperatuur van 121 °C houdt, onder
verhoogde druk. Hierna worden er geen levende micro#organismen meer in de oplossing
aangetroffen.
Om het medium in een petrischaal te gieten, zijn flessen van 500 ml het makkelijkst
hanteerbaar.

Let op:
- Om te voorkomen dat een fles explodeert in de autoclaaf worden de doppen van de
flessen nooit helemaal vast gedraaid.
- Plak een klein stukje autoclaveertape op de dop van een fles of op het aluminiumfolie
dat over een Erlenmeyer gevouwen is. Door de hoge temperatuur wordt dit witte tape
gedeeltelijk zwart gekleurd. Dit is een controle of het autoclaveren geslaagd is.
- In de kleine panautoclaven wordt ongeveer 4 cm demiwater gedaan.
- Een metalen rekje wordt gebruikt wanneer er kleine dingen geautoclaveerd worden
zodat zij niet in het water vallen.
- Medium wordt ongeveer 20 minuten geautoclaveerd, glas en wegwerpartikelen
ongeveer 30 minuten.
- Wanneer een autoclaaf te vroeg wordt geopend, spuiten de oplossingen uit de flessen
door het drukverschil. Wacht daarom altijd tot de druk in de autoclaaf gelijk is aan de
luchtdruk (kijk op de drukmeter). Dit kan erg lang duren!
- Lege flessen en Erlenmeyers worden altijd apart van flessen met medium
geautoclaveerd.
- Na het autoclaveren moeten de flessen met medium gehomogeniseerd worden door
de flessen een aantal keren voorzichtig heen en weer te zwenken.

Gieten van medium

Het gieten van medium in petrischalen wordt altijd in de flowkast gedaan. Laat het
medium na het autoclaveren eerst afkoelen tot 45#50 °C. Dit kan versneld worden door
de flessen of erlenmeyers in een waterbad van circa 50 °C te plaatsen. Voeg indien nodig
de filter#gesteriliseerde oplossingen toe aan het medium en zwenk de oplossing een
aantal keren om goed te mengen.
Giet nu voorzichtig medium in de petrischalen. Wanneer je langzaam giet, loopt de
oppervlakte van de schaal langzaam vol. Als het gehele oppervlak van de schaal 90 % vol
is, zit er voldoende medium in de petrischaal. Langzaam verspreidt het medium zich nu
over de gehele oppervlakte. Zwenk even als het niet snel genoeg gaat.

3
Weefselkweek
Regeneratie van de tabaks en tomatenplant

Om condenseren tegen te gaan, sluit je de petrischaal niet geheel af met de deksel, maar
gedeeltelijk. Na een korte tijd is het medium gestold, waarna je de schalen geheel af kunt
sluiten.
Schrijf nu op de deksel welk type medium er in de petrischaal zit. Verpak ze per 10 stuks
in aluminiumfolie of in de nu lege plastic verpakkingszakken. Markeer ook deze pakketjes
met het mediumtype en de datum van aanmaak. Bewaar de pakketjes in een koelkast op
de kop, zodat condensatievocht zich in de deksel verzamelt.
Wanneer flessen met medium gestold zijn, kun je het medium weer laten smelten in een
magnetron, autoclaaf of "au bain Marie" in een waterbad met kokend water. Wanneer er
warmtegevoelige stoffen in het medium zitten, zoals antibiotica of hormonen is dit niet
mogelijk.

Het werken in een laminaire flowkast

Een laminaire flowkast is een steriele omgeving. In de flowkast die je in Wageningen gaat
gebruiken, wordt steriele lucht door een filter geblazen in de richting van de objecten die
in de kast staan en dus ook in de richting van de gebruiker. Alleen jij en de door jou
gebruikte spullen kunnen voor een besmetting zorgen. Daarom is het van belang dat er zo
min mogelijk materialen de kast ingaan. Dit houdt ook in dat je alleen met je handen en
onderarmen de kast in gaat.
De volgende handelingen zijn nodig om besmettingen te voorkomen:
- Zet de laminaire flow#kast aan en maak het werkoppervlak en de ruiten (aan de
binnenkant) schoon met 70% alcohol. Hiervoor spuit je eerst wat alcohol op een prop
papier waarna je de oppervlakten schoon gaat maken.
- Wacht ongeveer 15 minuten voordat je aan de slag gaat. Dit is een mooie gelegenheid
om nog een keer te controleren of je alles klaar hebt liggen wat je tijdens het
experiment nodig hebt.
- Zorg ervoor dat de materialen die je gaat gebruiken in de kast schoon zijn, maak ze
eventueel schoon met wat alcohol (70%).
- Was je handen en desinfecteer ze, iedere keer vlak voordat je in de kast gaat werken,
met de aanwezige desinfecterende oplossing.
- Stroop je mouwen op; stof dat van je kleren komt is een bron van besmetting.
- Pincetten, mesjes e.d. moeten met de gebruikseinden in een bekerglas met alcohol
(70%) in de kast gezet worden. Ze blijven daar de hele tijd staan wanneer ze niet
gebruikt worden.
Onthoud dat de flowkast geen opbergplek is. Materialen die je tijdelijk niet gebruikt, zet je
zoveel mogelijk aan de zijkant zodat de luchtstroom van steriele lucht ruim baan heeft om
over je werkplek te blazen. Dingen die je niet meer gebruikt, moeten de kast uit.

4
Weefselkweek
Regeneratie van de tabaks en tomatenplant

Uitvoering

Materialen

- Plantmateriaal: tabak variëteit SR1, tomaatzaailingen variëteit MoneyMaker

- Regeneratie#medium zonder hormonen in voldoende kleine flessen
- Auxine (NAA) 2 mg/l; cytokinine (BA) 1 mg/l
- Steriel mQ#water
- Petri#schalen
- Pincet, scalpels etc.

Veiligheid

Schoonhouden van labruimte

Gebruikte plastic wegwerpartikelen, zoals petrischalen en pipetten kunnen gewoon in de
prullenbak. Niet geheel gebruikte pakken met steriele plastic gebruiksartikelen moeten in
de flowkast weer dichtgemaakt worden met tape zodat ze steriel blijven.
Als je op glas geschreven hebt, kun je de inkt weer verwijderen met aceton of 96%
ethanol. Gebruikt glaswerk moet meteen na gebruik met heet water omgespoeld worden.
Gebruik hierbij nooit zeep. Wanneer er nog resten gestolde agar aanwezig zijn in het
glaswerk, kun je dit smelten in een magnetron. Wanneer dit gesmolten is, moet je het
natuurlijk niet in de gootsteen gieten (dit gaat weer stollen, met alle gevolgen van dien),
maar in de prullenbak.

Glazen wegwerpartikelen kunnen in de speciale afvalbakken worden gedaan. Na gebruik

worden plastic maatcilinders gewassen met heet water. Daarna worden ze eerst
ruimschoots afgespoeld met kraanwater en vervolgens nogmaals met demiwater.

Beschrijving

Dag 1: bereiding stukje weefsels en gieten van medium

- Giet drie reeksen van vijf petrischalen met regeneratie medium en zorg ervoor dat je
de concentraties auxine (NAA) en cytokinine (BA) varieert. Mogelijke concentraties zijn
bijvoorbeeld:

Medium Auxine (mg/l) Cytokinine (mg/l)

1 0 0
2 0.2 0.1
3 0.2 1
4 2 0.1
5 2 1

- Dit medium wordt na autoclaveren aangevuld met 100 mg/l ticarcilline (een
antibioticum) om mogelijk aanwezige microbiële besmetting tot een minimum te
beperken.
- Om de stukjes weefsel te bereiden, snijd je een blad van een steriele, in vitro

5
Weefselkweek
Regeneratie van de tabaks en tomatenplant

gekweekte tabaksplant in stukjes van 0.5 bij 0.5 cm in een beetje steriel water.
- Leg 5 stukjes van dit weefsel met de bovenkant van het blad naar boven op een
petrischaal met medium.
- Snijd de hypocotyl (stukje stengel onder het eerste “blad”) en cotyl (eerste “blad”) in
stukjes weefsels (0.5 cm lang) van steriele in vitro gekweekte tomatenzaailingen in
een paar druppels steriel water in een petrischaal.
- Leg 5 hypocotyl stukjes in een petrischaal met medium en 5 cotyl stukjes in een
petrischaal met medium.
- Maak de petrischalen dicht met huishoudfolie.
- Zet de platen in een incubator vam 25 graden met 16 uur licht.

Na 3#4 weken: resultaten bekijken

- Bepaal voor ieder stukje weefsel het aantal scheuten of scheutprimordia (beginnende
scheuten soms nog maar net een knobbeltje), en wortels per stukje weefsel en het
percentage callus aan de randen.

Resultaten

Maak een analyse van deze data met betrekking tot de effecten van
hormoonconcentraties op de regeneratie van tabak en tomaat. Zijn er verschillen?

A) Resultatenverwerking Tomaat (a=auxine en c=cytokinine in mg/l)

A1) Geschat percentage aanwezig callus op randen weefsel

Schaalnr/ Stukje Stukje Stukje Stukje Stukje Totaal
behandeling weefsel 1 weefsel 2 weefsel 3 weefsel 4 weefsel 5
(a:c)
1: 0:0
2: 0.2:0.1
3: 0.2:1
4: 2:0.1
5: 2:1

A2) aantal scheuten

Schaalnr/ Stukje Stukje Stukje Stukje Stukje Totaal
behandeling weefsel 1 weefsel 2 weefsel 3 weefsel 4 weefsel 5
1: 0a 0c
2: 0.2a 0.1c
3: 0.2a 1c
4: 2a 0.1c
5: 2a 1c

A3) aantal wortels

Schaalnr/ Stukje Stukje Stukje Stukje Stukje Totaal

6
Weefselkweek
Regeneratie van de tabaks en tomatenplant

behandeling weefsel 1 weefsel 2 weefsel 3 weefsel 4 weefsel 5

1: 0a 0c
2: 0.2a 0.1c
3: 0.2a 1c
4: 2a 0.1c
5: 2a 1c

B) Resultatenverwerking Tabak

B1) Geschat percentage aanwezig callus op randen weefsel

Schaalnr/ Stukje Stukje Stukje Stukje Stukje Totaal
behandeling weefsel 1 weefsel 2 weefsel 3 weefsel 4 weefsel 5
1: 0a 0c
2: 0.2a 0.1c
3: 0.2a 1c
4: 2a 0.1c
5: 2a 1c

B2) aantal scheuten

Schaalnr/ Stukje Stukje Stukje Stukje Stukje Totaal
behandeling weefsel 1 weefsel 2 weefsel 3 weefsel 4 weefsel 5
1: 0a 0c
2: 0.2a 0.1c
3: 0.2a 1c
4: 2a 0.1c
5: 2a 1c

B3) aantal wortels

Schaalnr/ Stukje Stukje Stukje Stukje Stukje Totaal
behandeling weefsel 1 weefsel 2 weefsel 3 weefsel 4 weefsel 5
1: 0a 0c
2: 0.2a 0.1c
3: 0.2a 1c
4: 2a 0.1c
5: 2a 1c

7
Weefselkweek
Regeneratie van de tabaks en tomatenplant

Vragen

1. Wat is de relevantie van weefselkweektechnieken in vergelijking met andere

kloontechnieken?

2. Wat zijn de mogelijke toepassingen van weefselkweektechnieken?

3. Wat zouden mogelijke nadelen van weefselkweektechnieken kunnen zijn?

Suggesties voor verder onderzoek

Documentatie

Weefselkweek.nl
Een website van Vitratech Weefselkweek met informatie over, voor, en van weefselkweek.

Oriëntatie op vervolgonderwijs

Het onderwerp van dit experiment kom je ook tegen in de volgende opleidingen van
Wageningen Universiteit:
- Biologie
- Biotechnologie
- Plantenwetenschappen
- Moleculaire Levenswetenschappen

Kijk voor meer informatie op www.wageningenuniversiteit.nl.

8
Weefselkweek
Regeneratie van de tabaks en tomatenplant

Bijlage 1

De samenstelling van het MS medium, in de praktijk wordt een kant en klare mix gebruikt.

Macronutriënten (MS macro = 20x conc.)

NH4NO3 1650 mg/l
KNO3 1900 mg/l
CaCl2.2H2O 440 mg/l
MgSO4.7H2O 370 mg/l
KH2PO4 170 mg/l

Micronutriënten (MS micro = 1000x conc.)

H3BO3 6.2 mg/l
MnSO4.4H2O 22.3 mg/l
ZnSO4.4H2O 8.6 mg/l
Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/l
CuSO4.5H2O 0.025 mg/l
CoCl2.6H2O 0.025 mg/l
Kl 0.83 mg/l

IJzeroplossing Sequestreen
(100x conc.)
Na2EDTA 37.3 mg/l
FeSO4.7H2O 27.8 mg/l

Vitaminen
Myo#inositol 100 mg/l
Nicotinic acid 0.5 mg/l
Pyridoxine#HCl 0.5 mg/l
Thiamine#HCl 0.1 mg/l
Glycerine 2 mg/l