COVID-19 IgM ELISA

KAPCOVID19M

DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue du Bosquet, 2 - B-1348 Louvain-la-Neuve - Belgium

Version: 200602
 History

Summary of change :

Previous Version : Current Version :

200408/1 200602

Assay Procedure
• Paragraph Assay Procedure, point
1: Revised phrasing to clarify the
number of replicates needed for
the controls and samples.
Interpretation of results
• Addition of statement regarding
criteria for laboratories establishing
cut offs.
Performance Characteristics
• Addition of the paragraph Assay
Development
• Addition of the paragraph
Reactivity/inclusivity
• Addition of supplementary
information in the paragraph Limit
of Detection
• Addition of supplementary
information in the paragraph
Repeatability
• Addition of supplementary
information in the paragraph
Reproducibility
• Addition of supplementary
information in the paragraph Class
specificity
• Addition of supplementary
information in the paragraph
Cross-reactivity
• Addition of the paragraph
Transportation Stability
Clinical Testing
• Addition of supplementary
information

No Spanish Spanish version added

 COVID-19 IgM ELISA
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) for the qualitative detection of
the COVID-19 IgM in human Serum
KAPCOVID19M
IN VITRO DIAGNOSTIC
DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium - Tel: +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 91
INTENDED USE
This kit is for in vitro diagnostics use only. The kit is detecting novel COVID-19 IgM
antibody in human serum. It is for screening or to aid in the diagnosis of COVID-
19. Patients with suspected clustering cases require diagnosis or differential
diagnosis of novel coronavirus infection. The assay is validated manually, but can
be adapted to an automated instrument. The assay is for the qualitative detection
only.
INTENDED USER
This kit is for laboratory professional use or healthcare professionals.
SUMMARY OF PHYSIOLOGY
2019 novel coronavirus (COVID-19) is a single-stranded RNA coronavirus2.
Comparisons of the genetic sequences of this virus have shown similarities to
SARS-CoV and bat coronaviruses7. In humans, coronaviruses cause respiratory
infections3. Coronaviruses are composed of several proteins including the spike
(S), envelope (E), membrane (M), and nucleocapsid (N)4. Results suggest that the
spike protein retains sufficient affinity to the Angiotensin converting enzyme 2
(ACE2) receptor to use it as a mechanism of cell entry6. Human to human
transmission of coronaviruses is primarily thought to occur among close contacts
via respiratory droplets generated by sneezing and coughing1. IgM is the first
immunoglobulin to be produced in response to an antigen and will be primarily
detectable during the early onset of the disease5.
ASSAY PRINCIPLE
This ELISA kit is designed, developed, and produced for the qualitative
measurement of the COVID-19 IgM antibody in serum. This assay utilizes the “IgM
capture” method on microplate based enzyme immunoassay technique.
Assay controls and samples are added to the microtiter wells of a microplate that
was coated with an anti-human IgM specific antibody. After the first incubation
period, the unbound protein matrix is removed with a subsequent washing step. A
horseradish peroxidase (HRP) labeled recombinant COVID-19 antigen is added to
each well. After an incubation period, an immunocomplex of "Anti-hIgM antibody -
human COVID-19 IgM antibody - HRP labeled COVID-19 antigen" is formed if there
is novel coronavirus IgM antibody present in the tested materials. The unbound
tracer antigen is removed by the subsequent washing step. HRP-labeled COVID-
19 antigen tracer bound to the well is then incubated with a substrate solution in a
timed reaction and then measured in a spectrophotometric microplate reader. The
enzymatic activity of the tracer antigen bound to the coronavirus IgM on the wall of
the microtiter well is proportional to the amount of the coronavirus IgM antibody
level in the tested materials.
REAGENTS: Preparation and Storage
This test kit must be stored at 2 – 8°C upon receipt. For the expiration date of the
kit refer to the label on the kit box. All components are stable until this expiration
date. Prior to use allow all reagents to come to room temperature
1. COVID-19 Antigen Coated Microplate
One microplate with 12 x eight strips (96 wells total) coated with anti-human
IgM specific antibody. The plate is framed and sealed in a foil Ziploc bag with
a desiccant. This reagent should be stored at 2 – 8°C and is stable until the
expiration date on the label.
2. Ag HRP Enzyme conjugate
One vial containing 11 mL ready to use HRP labeled COVID-19 Antigen in a
stabilized protein matrix. This reagent should be stored at 2 – 8°C and is
stable until the expiration date on the label.
3. DIL SPE Sample Diluent
One vial containing 15 mL ready to use sample diluent buffer. This reagent
should be stored at 2 – 8°C and is stable until the expiration date on the label.
Catalogue nr: KAPCOVID19M
4. WASH SOLN CONC Washing buffer
One bottle containing 30 mL of a 30-fold concentrate. Before use the contents
must be diluted with 870 mL of distilled water and mixed well. Upon dilution
this yields a working wash solution containing a surfactant in phosphate
buffered saline with a non-azide preservative. The concentrated washing
solution should be stored at 2-25°C and is stable until the expiration date on
the label.
5. CHROM TMB TMB-Substrate solution
One bottle containing 15 mL of tetramethylbenzidine (TMB) with stabilized
hydrogen peroxide. This reagent should be stored at 2 – 8°C and is stable
until the expiration date on the label.
6. STOP SOLN Stop Solution
One bottle containing 15 mL of 0.5 M sulfuric acid. This reagent should be
stored at 2 – 25°C and is stable until the expiration date on the label.
7. CONTROL - Negative Control
One vial containing 1 ml ready to use negative control with a bovine serum
albumin based matrix with a non-azide preservative. Control products do not
contain any serum from patients with new type of coronavirus infection. This
reagent should be stored at 2 – 8°C and is stable until the expiration date on
the label.
8. CONTROL + Positive Control
One vial containing 0.5 ml ready to use positive control with a bovine serum
albumin based matrix with a non-azide preservative. Control products do not
contain any serum from patients with new type of coronavirus infection. This
reagent should be stored at 2 – 8°C and is stable until the expiration date on
the label.
SAFETY PRECAUTIONS
The reagents are for in-vitro diagnostic use only. Source material which contains
reagents of bovine serum albumin was derived in the contiguous 48 United
States. It was obtained only from healthy donor animals maintained under
veterinary supervision and found free of contagious diseases. Wear gloves while
performing this assay and handle these reagents as if they were potentially
infectious. Avoid contact with reagents containing hydrogen peroxide, or sulfuric
acid. Do not get in eyes, on skin, or on clothing. Do not ingest or inhale fumes. On
contact, flush with copious amounts of water for at least 15 minutes. Use Good
Laboratory Practices.
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
1. Precision single channel pipettes capable of delivering 20 µL, 25 µL,
100 µL, and 1000 µL.
2. Repeating dispenser suitable for delivering 100 µL.
3. Disposable pipette tips suitable for dispensing of the volumes indicated
above.
4. Disposable 12 x 75 mm or 13 x 100 glass tubes.
5. Disposable plastic 1000 mL bottle with caps.
6. Aluminum foil.
7. Deionized or distilled water.
8. Plastic microtiter well cover or polyethylene film.
9. ELISA multichannel wash bottle or automatic (semi-automatic) washing
system.
10. Spectrophotometric microplate reader capable of reading absorbance
at 450 nm.
11. Incubator capable of holding the temperature at 37 ºC.
SPECIMEN COLLECTION
Only 20 μL of human serum is required for measurement in duplicate. Samples
should only be used on the same day. Severe hemolytic samples should not be
used.
Revision nr : 200602
ASSAY PROCEDURE Interpretation Interval Results
1. Reagent Preparation Negative Measured value ≤ The sample does not contain the
(1) Prior to use allow all reagents to come to room temperature. Reagents Negative cutoff new coronavirus ( COVID-19 ) IgM
from different kit lot numbers should not be combined or interchanged. related antibody
(2) Washing Buffer must be diluted to working solution prior to use. Please Positive Measured value ≥ The sample contains novel
see REAGENTS section for details. Positive cutoff coronavirus ( COVID-19 ) IgM
associated antibodies.
2. Assay Procedure Borderline Negative cutoff ﹤ Retest the sample in conjunction
(1) Place a sufficient number of microwell strips in a holder to run negative Measured value with other clinical tests.
control in triplicate, positive control in singlet, and samples in duplicate. ﹤ Positive cutoff
(2) Test Configuration
4. Race and geographical region may affect the results from normal donor
ROW STRIP 1 STRIP 2 STRIP 3
samples. Laboratories may establish or modify the cutoff based upon
A Negative Control SAMPLE 3 SAMPLE 7
additional validation.
B Negative Control SAMPLE 3 SAMPLE 7
C Negative Control SAMPLE 4 SAMPLE 8 EXPECTED VALUES
D Positive Control SAMPLE 4 SAMPLE 8 Samples from the clinical testing presented ODs of 0.164-0.661 for the positive
E SAMPLE 1 SAMPLE 5 SAMPLE 9 values and 0.000 – 0.151 for the negative values. These values should not be in
F SAMPLE 1 SAMPLE 5 SAMPLE 9 lieu of the interpretation of results calculation.
G SAMPLE 2 SAMPLE 6 SAMPLE 10
H SAMPLE 2 SAMPLE 6 SAMPLE 10 LIMITATION OF THE PROCEDURE
1. This test is only for qualitative detection. Test results should not be the
(3) Add 100 µL of controls into the designated microwells. sole basis for clinical diagnosis and treatment. The confirmation of
(4) Add 10 µL of samples into the designated microwells. infection with novel coronavirus (COVID-19) must be combined with the
(5) Add 100 µL of Sample Diluent to the microwells with the samples. patient's clinical signs in conjunction to other tests.
Note: Do not add sample diluent to the wells with the controls! 2. In the first week of the onset of the infection with the novel coronavirus
(6) Mix gently and cover the plate with one plate sealer and aluminum foil. (COVID-19) patients results may be negative for IgM. In addition,
Incubate at 37ºC for 30 minutes. patients with low immunity or other diseases that affect immune
(7) Remove the plate sealer. Aspirate the contents of each well. Wash each function, failure of important systemic organs, and use of drugs that
well 5 times by dispensing 350 µL of diluted washing solution into each suppress immune function can also lead to negative results of new
well, and then completely aspirate the contents. Alternatively, an coronavirus IgM.
automated microplate washer can be used. 3. Bacterial or fungal contamination of serum specimens or reagents, or
(8) Add 100 µL of the enzyme conjugate into the microwells. cross-contamination between reagents may cause erroneous results.
(9) Mix gently and cover the plate with one plate sealer and aluminum foil. 4. Water deionized with polyester resins may inactive the horseradish
Incubate at 37ºC for 30 minutes. peroxidase enzyme.
(10) Remove the plate sealer. Aspirate the contents of each well. Wash each
well 5 times by dispensing 350 µL of diluted washing buffer into each QUALITY CONTROL
well, and then completely aspirate the contents. Alternatively, an To assure the validity of the results each assay must include both negative and
automated microplate washer can be used. positive controls. The average value of the absorbance of the negative control is
(11) Add 100 µL of the TMB-Substrate solution into the microwells. less than 0.25, and the absorbance of the positive control is not less than 0.50. We
(12) Mix gently and cover the plate with aluminum foil. Incubate at room also recommend that all assays include the laboratory’s own controls in addition to
temperature (20-25 ºC) for 20 minutes. those provided with this kit.
(13) Remove the aluminum foil and add 100 µL of stop solution into each of
the microwells. Mix by gently by tapping the plate. PERFORMANCE CHARACTERISTICS
(14) Read the absorbance at 450 nm within 10 minutes with a microplate Assay Development
reader. This assay was developed by evaluating eight commercially available COVID-19
antigens to screen for optimal use in this serological test. The assays were first
PROCEDURAL NOTES evaluated with normal healthy donor serum samples to obtain negative test results.
1. It is recommended that all samples be assayed in duplicate. The The assays were further evaluated with 20 positive serum samples from confirmed
average absorbance reading of each duplicate should be used for data COVID-19 patients tested by RT-PCR. The best performing antigen was selected
reduction and the calculation of results. for the development of the kit.
2. Keep light-sensitive reagents in the original bottles and avoid
unnecessary exposure to the light. Reactivity/Inclusivity
3. Store any unused antibody-coated strips in the foil Ziploc bag with Although mutations in the SARS-CoV-2 genome have been identified as the virus
desiccant to protect from moisture. has spread, no serologically unique strains have been described relative to the
4. Careful technique and use of properly calibrated pipetting devices are originally isolated virus (this research is exceptionally limited at present).
necessary to ensure reproducibility of the test.
5. Incubation times or temperatures other than those stated in this insert Limit of Detection
may affect the results. Three lots of material were tested with one assay using a blank control in sixteen
6. Avoid air bubbles in the microwell as this could result in lower binding replicates. LoD was calculated as the mean of the OD for the blank control plus
efficiency and higher CV% of duplicate reading. three times the standard deviation. The highest of the three runs was established
7. All reagents should be mixed gently and thoroughly prior to use. Avoid for the LoD at 0.0669. The results are as follows:
foaming.
Average OD (450 nm) CV (%) LOD (x + 3 SD)
INTERPRETATION OF RESULTS Run 1 0.0560 5.32% 0.0649
1. Calculate the average value of the absorbance of the negative control Run 2 0.0568 5.63% 0.0663
(xNC). Run 3 0.0561 6.46% 0.0669
2. Calculate the cutoffs using the following formulas:
• Positive cutoff = 1.1 X (xNC + 0.10)
• Negative cutoff = 0.9 x (xNC + 0.10) Repeatability
3. Determine the interpretation of the sample by comparing the OD to the One lot of material was tested with one assay using three samples (strong positive,
following table: light positive, and negative) in sixteen replicates. For all sixteen replicates, sample
1 and 2 are positive and in sample 3 is all negative. The repeatability results are
very satisfactory with acceptable CV. The results are as follows:

ID Average OD (450 nm) Results CV (%)

Sample 1 1.023 16/16 are Positive 4.48%
Sample 2 0.443 16/16 are Positive 4.83%
Sample 3 0.125 16/16 are Negative 9.17%

Catalogue nr: KAPCOVID19M Revision nr : 200602

Reproducibility Agent Disease State Confirmation Results
One lot of material was tested over twelve assays using three samples (strong Test
positive, light positive, and negative) in two replicates and a set of positive and Influenza A Virion/Serion 5/5 Negative
negative controls in three replicates. For all twelve assays, sample 1 and 2 are Influenza B Virion/Serion 5/5 Negative
positive and sample 3 is all negative. The results for reproducibility are very Respiratory syncytial virus EIA, Virion/Serion 5/5 Negative
satisfactory with an acceptable CV. The results are as follows: Hepatitis C Virus Roche Ampliprep/Taqman 5/5 Negative
Antinuclear Antibodies Bio-Rad Hep 2 5/5 Negative
ID Average OD (450 nm) Results CV (%) Hepatitis B Virus Siemens 5/5 Negative
Sample 1 1.18 12/12 are Positive 1.93%
Sample 2 0.53 12/12 are Positive 2.37% Transportation Stability
Sample 3 0.13 12/12 are Negative 3.32% One lot of material was shipped from 4 San Diego to an external site in the United
Negative Control 0.09 12/12 are Negative 3.92% States and returned. The kit was packaged in a foam box with blue ice which was
Positive Control 0.89 12/12 are Positive 3.49% not changed for the duration of the study to simulate transport conditions. The kits
were in this condition for a total of 31 days. A comparison of the values obtained
Class Specificity before and after shipment demonstrates the stability of the materials. The results
To evaluate class specificity, Ten RT-PCR confirmed COVID-19 patient serum are as follows:
samples were tested in duplicate in the DIAsource ImmunoAssay SA IgG and IgM
ELISA Kits. Samples 1 - 5 are IgM positive and IgG negative. Sample 1 is a natural Before Shipment After Shipment
and untreated IgM positive, IgG negative. Sample 2 - 5 were originally positive for Well ID OD Average Well ID OD Average
IgG and IgM but used protein A/ProSep A to remove the IgG. Samples 6 -10 are 0.098 0.091
IgG positive and IgM negative. All samples 6 - 10 are natural and untreated IgG Negative 0.101 0.103333 Negative 0.089 0.090333
positive, IgM negative. There is 100% agreement between the results of this test. 0.111 0.091
This demonstrates that the assay is specific to the detection of IgM class without
Positive 1.387 N/A Positive 0.868 N/A
cross reaction to COVID-19 IgG class. The results are as follows:
Neg. Cut-off 0.255 Neg. Cut-off 0.243
Pas. Cut-off 0.312 Pas. Cut-off 0.297
Sample ID IgM Result IgG Result
Sample 1 + -
Sample 2 + -
CLINICAL TESTING
Sample 3 + - Patient samples were tested using the IgM ELISA kit at three sites: Center for
Sample 4 + - Disease Control and Prevention in China, a University Hospital in China, and a
Sample 5 + - laboratory in the United States. The combined cohort consisted of normal healthy
Sample 6 - + patients with samples collected prior to the COVID-19 outbreak (N=233) and RT-
Sample 7 - + PCR confirmed positive patients (N = 41). The results are as follows:
Sample 8 - +
Sample 9 - + Confirmed Confirmed
Sample 10 - + Positive Negative
COVID-19 IgM Positive 30 0
ELISA Kit Negative 11 233
Cross-Reactivity Total 41 233
A large number of known negative samples (N=80) collected in the US prior to PPA 73.1% 95% CI (Wilson's 0.581-0.843
December 2019 were tested from a population with a high prevalence of Score):
vaccination against, and/or infection with, the following viruses, and specificity of NPA 100% 95% CI (Wilson's 0.984-1.000
100% is observed, cross-reactivity testing for the following viruses would not be Score):
expected at this time:

anti-influenza A (IgG and IgM) IgM is the first immunoglobulin to be produced in response to an antigen and will
anti-influenza B (IgG and IgM) be primarily detectable during the early onset of the disease. The National Health
Commission of the People's Republic of China states that IgM antibodies begin to
anti-HCV (IgG and IgM) show positive after 3-5 days of onset of COVID-19. Serum samples for some of the
clinical testing were from patients after two weeks of the onset of the disease.
anti-HBV (IgG and IgM) Therefore, low levels of clinical sensitivity for IgM can be attributed to the collection
anti-Haemophilus influenzae (IgG and IgM) date of the positive cohort where IgM levels are expected to be lower.

anti-229E (alpha coronavirus) WARRANTY

anti-NL63 (alpha coronavirus)
anti-OC43 (beta coronavirus)
anti-HKU1 (beta coronavirus)
ANA
anti-respiratory syncytial virus (IgG and IgM)
anti-HIV
To demonstrate cross-reactivity of the test, DIAsource ImmunoAssay SA used the
FDA required minimum of 5 individual samples tested in duplicate for each
disease/infectious agent using natural specimen confirmed with commercially
available diagnostic tests. All samples were sourced from natural specimens using
sera from patients with the underlying diseases in the acute or convalescent stages
of infection. The disease and Infection agents were selected based on
recommendations from the FDA EUA Program. The recommendation also included
Anti-haemophilus influenzae and rhinovirus, but this material was unable to be
tested due to lack of availability.
This product is warranted to perform as described in its labeling and literature when
used in accordance with all instructions. DIASource ImmunoAssays S.A.
DISCLAIMS ANY IMPLIED WARRANTY OF MERCHANTABILITY OR FITNESS
FOR A PARTICULAR PURPOSE, and in no event shall DIASource ImmunoAssays
S.A. be liable for consequential damages. Replacement of the product or refund of
the purchase price is the exclusive remedy for the purchaser. This warranty gives
you specific legal rights and you may have other rights, which vary from state to
state.
REFERENCES
1. CDC (2020). Transmission of Novel Coronavirus (COVID-19).
2. Chenjia Yuan , Shi Jinsong , Qiudong An , Liu Chang , Li Xin , Qiang ,
Ruanji Shou , mountains . Wuhan 2019 Bioinformatics coronavirus genome
analysis [J / OL]. Bioinformatics : 1-10 [2020-02-10 ].
3. Fehr, A. R., & Perlman, S. (2015). Coronaviruses: An Overview of Their
Replication and Pathogenesis. Coronaviruses Methods in Molecular Biology, 1–23.
doi: 10.1007/978-1-4939-2438-7_1
4. Li, F., Li, W., Farzan, M., & Harrison, S. (2005). Structure of SARS
coronavirus spike receptor-binding domain complexed with its receptor. doi:
10.2210/pdb2ajf/pdb
5. Wu, L.-P., Wang, N.-C., Chang, Y.-H., Tian, X.-Y., Na, D.-Y., Zhang, L.-
Y., … Liang, G.-D. (2007). Duration of Antibody Responses after Severe Acute
Respiratory Syndrome. Emerging Infectious Diseases, 13(10), 1562–1564. doi:
10.3201/eid1310.070576
6. Xu, X., Chen, P., Wang, J., Feng, J., Zhou, H., Li, X., … Hao, P. (2020).
Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling
of its spike protein for risk of human transmission. Science China Life Sciences.
doi: 10.1007/s11427-020-1637-5

Catalogue nr: KAPCOVID19M Revision nr : 200602

7. Zhou, P., Yang, X.-L., Wang, X.-G., Hu, B., Zhang, L., Zhang, W., …
Shi, Z.-L. (2020). A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of
probable bat origin. Nature. doi: 10.1038/s41586-020-2012-7

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Revision date: 2020-06-02

Catalogue nr: KAPCOVID19M Revision nr : 200602

 COVID-19 IgM ELISA
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la detección cualitativa de
IgM de COVID-19 en suero humano
KAPCOVID19M
DIAGNÓSTICO IN VITRO
DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Bélgica - Tel.: +32 10 84 99 11 - Fax: +32 10 84 99 91
INDICACIONES
Este kit es solo para uso diagnóstico in vitro. Este kit detecta los nuevos
anticuerpos IgM de COVID-19 en suero humano. Es adecuado para detectar el
COVID-19 o para ayudar en su diagnóstico. Los pacientes con sospecha de casos
agregados requieren diagnóstico o diagnóstico diferencial de la infección por el
nuevo coronavirus. El ensayo se valida manualmente, pero se puede adaptar a un
instrumento automatizado. El ensayo solo es apto para la detección cualitativa.
USUARIO PREVISTO
Este kit debe utilizarse en un laboratorio profesional o ser empleado por
profesionales sanitarios.
RESUMEN DE LA FISIOLOGÍA
El nuevo coronavirus 2019 (COVID-19) es un coronavirus de una sola cadena de
ARN2. Las comparaciones de las secuencias genéticas de este virus han
demostrado similitudes con los coronavirus de murciélago7. En seres humanos, los
coronavirus causan infecciones respiratorias3. Los coronavirus se componen de
varias proteínas, entre ellas la proteína espiga (S), la de envoltura (E), la de
membrana (M) y la nucleocápside (N)4. Los resultados sugieren que la proteína
espiga tiene suficiente afinidad por el receptor de la enzima convertidora de
angiotensina 2 (ECA2) como para usarlo como mecanismo de entrada en la
célula6. Se cree que la transmisión de coronavirus entre humanos se da
principalmente entre contactos cercanos a través de las gotitas respiratorias
producidas por los estornudos y la tos1. La IgM es la primera inmunoglobulina que
se produce en respuesta a un antígeno y se podrá detectar principalmente durante
el inicio temprano de la enfermedad5.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
Este kit ELISA se ha diseñado, desarrollado y producido para la determinación
cualitativa de anticuerpos IgM de COVID-19 en suero. Este ensayo utiliza el
método de captura de IgM con la técnica de inmunoensayo enzimático basado en
microplaca.
Los controles y las muestras del ensayo se añaden a los pocillos de
microvaloración de una microplaca recubierta con un anticuerpo específico de IgM
antihumana. Después del primer periodo de incubación, la matriz de proteínas no
unidas se elimina en el siguiente paso de lavado. Se añade un antígeno
recombinante de COVID-19 marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a
cada pocillo. Después de un periodo de incubación, si en el material analizado se
halla presente el nuevo anticuerpo IgM de coronavirus, se formará un
inmunocomplejo de anticuerpo de IgM antihumana - anticuerpo IgM de COVID-19
humano- antígeno de COVID-19 marcado con HRP. El antígeno marcador no
unido se elimina en el siguiente paso de lavado. Después, el antígeno marcador
de COVID-19 marcado con HRP unido al pocillo se incuba con una solución de
sustrato en una reacción cronometrada y luego se mide en un lector de microplacas
espectrofotométrico. La actividad enzimática del antígeno marcador unido a la IgM
de coronavirus en la pared del pocillo de microvaloración es directamente
proporcional a la cantidad del nivel de anticuerpos IgM de coronavirus del material
analizado.
REACTIVOS: Preparación y conservación
El kit de la prueba debe conservarse entre 2 y 8 °C una vez recibido. Consulte en
la etiqueta de la caja la fecha de caducidad del kit. Todos los componentes son
estables hasta dicha fecha de caducidad. Deje que todos los reactivos alcancen
la temperatura ambiente antes de usarlos.
1. Microplaca recubierta con antígeno de COVID-19
Una microplaca con 12 x 8 tiras (96 pocillos en total) recubierta con
anticuerpo específico de IgM antihumana. La placa está enmarcada y sellada
en una bolsa de aluminio tipo Ziploc con un desecante. Este reactivo debe
conservarse entre 2 y 8 °C, y es estable hasta la fecha de caducidad indicada
en la etiqueta.
Ag HRP
2. Conjugado enzimático
Un vial que contiene 11 ml de antígeno de COVID-19 marcado con HRP en
una matriz de proteínas estabilizadas listo para usar. Este reactivo debe
N.º de catálogo: KAPCOVID19M
conservarse entre 2 y 8 °C, y es estable hasta la fecha de caducidad indicada
en la etiqueta.
3. DIL SPE Diluyente de la muestra
Un vial que contiene 15 ml de tampón de diluyente de la muestra listo para
usar. Este reactivo debe conservarse entre 2 y 8 °C, y es estable hasta la
fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
4. WASH SOLN CONC Tampón de lavado
Un frasco que contiene 30 ml de solución concentrada 30 veces. El contenido
debe diluirse con 870 ml de agua destilada y mezclarse bien antes de usar.
Al diluirlo se forma una solución de lavado de trabajo que contiene un
tensioactivo en tampón fosfato salino con un conservante sin azida. La
solución de lavado concentrada debe conservarse entre 2 y 25 °C, y es
estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
5. CHROM TMB Solución de sustrato de TMB
Un frasco que contiene 15 ml de tetrametilbencidina (TMB) con peróxido de
hidrógeno estabilizado. Este reactivo debe conservarse entre 2 y 8 °C, y es
estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
6. STOP SOLN Solución de parada
Un frasco que contiene 15 ml de ácido sulfúrico 0,5 M. Este reactivo debe
conservarse entre 2 y 25 °C, y es estable hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta.
7. CONTROL - Control negativo
Un vial que contiene 1 ml de control negativo listo para usar en una matriz
de albúmina de suero bovino con un conservante sin azida. Los productos
de control no contienen suero de pacientes con el nuevo tipo de infección por
coronavirus. Este reactivo debe conservarse entre 2 y 8 °C, y es estable
hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
8. CONTROL + Control positivo
Un vial que contiene 0,5 ml de control positivo listo para usar en una matriz
de albúmina de suero bovino con un conservante sin azida. Los productos
de control no contienen suero de pacientes con el nuevo tipo de infección por
coronavirus. Este reactivo debe conservarse entre 2 y 8 °C, y es estable
hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD
Los reactivos son solo para uso diagnóstico in vitro. El material original que
contiene los reactivos de albúmina de suero bovino proviene de los 48 estados
limítrofes de Estados Unidos. Se obtuvo exclusivamente de animales donantes
sanos mantenidos bajo control veterinario y libres de enfermedades contagiosas.
Lleve guantes mientras realice este ensayo y manipule estos reactivos como si
fueran potencialmente infecciosos. Evite el contacto con reactivos que contengan
peróxido de hidrógeno o ácido sulfúrico. No se salpique los ojos, la piel ni la ropa.
No ingiera ni inhale los vapores. Si se produce contacto, lávese con abundante
agua durante 15 minutos como mínimo. Observe las Buenas Prácticas de
Laboratorio.
MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Pipetas de un solo canal que puedan dispensar 20 µl, 25 µl, 100 µl y
1000 µl.
2. Dispensador repetitivo adecuado para dispensar 100 µl.
3. Puntas de pipeta desechables adecuadas para dispensar los
volúmenes indicados anteriormente.
4. Tubos de vidrio desechables de 12 x 75 mm o de 13 x 100 mm.
5. Frascos de plástico desechables de 1000 ml con tapón.
6. Papel de aluminio.
7. Agua desionizada o destilada
8. Tapa para pocillos de microvaloración de plástico o film de polietileno.
N.º de revisión: 200602
 9. Frasco de lavado multicanal de ELISA o sistema de lavado automático 2. Calcule los valores de corte mediante las siguientes fórmulas:
(semiautomático). • Valor de corte positivo = 1,1 X (xNC + 0,10)
10. Lector de microplacas espectrofotométrico con capacidad para leer la • Valor de corte negativo = 0,9 X (xNC + 0,10)
absorbancia a 450 nm. 3. Determine la interpretación de la muestra comparando la DO con la
11. Incubadora que pueda mantener la temperatura a 37 ºC. tabla siguiente:

RECOGIDA DE MUESTRAS
Solo se necesitan 20 µl de suero humano para medir por duplicado. Las muestras Interpretación Intervalo Resultados
solo deben utilizarse en el mismo día. No deben emplearse muestras hemolíticas Negativo Valor medido ≤ La muestra no contiene nuevos
graves. Valor de corte anticuerpos IgM relacionados con
negativo el coronavirus (COVID-19 ).
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Positivo Valor medido ≤ La muestra contiene nuevos
1. Preparación de los reactivos Valor de corte anticuerpos IgM relacionados con
(1) Deje que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes positivo el coronavirus (COVID-19).
de usarlos. No deben combinarse ni intercambiarse reactivos de Al límite Valor de corte Vuelva a analizar la muestra junto
distintos números de lote del kit.
(2) El tampón de lavado debe diluirse con la solución de trabajo antes de negativo ﹤ Valor con otras pruebas clínicas.
usarse. Véase más información en el apartado REACTIVOS. medido ﹤ Valor
de corte positivo
2. Procedimiento del ensayo
(1) Coloque un número suficiente de tiras de micropocillos en un soporte
4. La raza y la zona geográfica pueden afectar a los resultados de
para analizar el control negativo por triplicado, el control positivo en muestras de donantes normales. Los laboratorios pueden establecer o
singulete y las muestras por duplicado.
modificar el valor de corte basándose en una validación adicional.
(2) Configuración de la prueba
VALORES ESPERADOS
FILA TIRA 1 TIRA 2 TIRA 3 Las muestras de las pruebas clínicas presentaban DO de 0,164-0,661 para los
A Control negativo MUESTRA 3 MUESTRA 7 valores positivos y de 0,000-0,151 para los valores negativos. Estos valores no
B Control negativo MUESTRA 3 MUESTRA 7 deben sustituir la interpretación del cálculo de los resultados.
C Control negativo MUESTRA 4 MUESTRA 8
D Control positivo MUESTRA 4 MUESTRA 8 LIMITACIÓN DEL PROCEDIMIENTO
E MUESTRA 1 MUESTRA 5 MUESTRA 9 1. Esta prueba solo es adecuada para la detección cualitativa. Los
F MUESTRA 1 MUESTRA 5 MUESTRA 9 resultados de la prueba no deben ser la única base del diagnóstico
G MUESTRA 2 MUESTRA 6 MUESTRA 10 clínico y el tratamiento. La confirmación de infección por el nuevo
H MUESTRA 2 MUESTRA 6 MUESTRA 10 coronavirus (COVID-19) debe combinarse con los indicios clínicos del
paciente y otras pruebas.
(3) Añada 100 µl de los controles a los pocillos designados. 2. Durante la primera semana desde el inicio de la infección por el nuevo
(4) Añada 10 µl de las muestras a los pocillos designados. coronavirus (COVID-19), es posible que los resultados de los pacientes
(5) Añada 100 µl de diluyente de la muestra a los micropocillos con las sean negativos para IgM. Además, los pacientes con una baja
muestras. inmunidad u otras enfermedades que afecten a la función inmune, fallo
Nota: ¡No añada diluyente de la muestra a los pocillos con los de órganos sistémicos importantes y uso de fármacos inhibidores de la
controles! función inmune también pueden obtener resultados negativos para IgM
(6) Mezcle suavemente y cubra la placa con un sellador de placas y papel del nuevo coronavirus.
de aluminio. Incube a 37 ºC durante 30 minutos. 3. Una contaminación bacteriana o fúngica de las muestras de suero o de
(7) Retire el sellador de placas. Aspire el contenido de cada pocillo. Lave los reactivos, o la contaminación cruzada entre reactivos podría
cada pocillo 5 veces dispensando 350 µl de solución de lavado diluida producir resultados erróneos.
en cada pocillo y luego aspire totalmente el contenido. Como 4. El agua desionizada con resinas de poliéster podría inactivar la enzima
alternativa, puede utilizarse un lavador de microplacas automático. de peroxidasa de rábano.
(8) Añada 100 µl de conjugado enzimático a los micropocillos.
(9) Mezcle suavemente y cubra la placa con un sellador de placas y papel CONTROL DE CALIDAD
de aluminio. Incube a 37 ºC durante 30 minutos. Para garantizar la validez de los resultados, cada ensayo debe incluir tanto los
(10) Retire el sellador de placas. Aspire el contenido de cada pocillo. Lave controles negativos como los positivos. El valor promedio de la absorbancia del
cada pocillo 5 veces dispensando 350 µl de tampón de lavado diluido control negativo es menor de 0,25, y la absorbancia del control positivo no es
en cada pocillo y luego aspire totalmente el contenido. Como menor de 0,50. Recomendamos que todos los ensayos incluyan los controles
alternativa, puede utilizarse un lavador de microplacas automático. propios del laboratorio además de los proporcionados con este kit.
(11) Añada 100 µl de solución de sustrato de TMB a los micropocillos.
(12) Mezcle suavemente y cubra la placa con papel de aluminio. Incube a EFICACIA DIAGNÓSTICA
temperatura ambiente (20-25 ºC) durante 20 minutos. Desarrollo del ensayo
(13) Retire el papel de aluminio y añada 100 µl de solución de parada a Esta ensayo se desarrolló mediante la evaluación de ocho antígenos de COVID-
cada uno de los micropocillos. Mezcle dando golpecitos suaves a la 19 disponibles en el mercado para determinar el uso óptimo de esta prueba
placa. serológica. Los ensayos se evaluaron primero con muestras séricas de donantes
(14) Lea la absorbancia a 450 nm antes de transcurridos 10 minutos en un normales y sanos para obtener un resultado negativo de la prueba. Después se
lector de microplacas. evaluaron los ensayos con 20 muestras séricas positivas de pacientes con COVID-
19 confirmado analizadas por RT-PCR. Para desarrollar el kit se escogió el
NOTAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO antígeno con mejor rendimiento.
1. Se recomienda analizar todas las muestras por duplicado. Para la
reducción de datos y el cálculo de los resultados, debe utilizarse la Reactividad/Inclusividad
lectura del promedio de la absorbancia de cada duplicado. Aunque se han identificado mutaciones del genoma del SARS-CoV-2 a medida
2. Mantenga los reactivos fotosensibles en sus frascos originales y evite que el virus se ha extendido, no se han descrito cepas únicas serológicas
que exponerlos innecesariamente a la luz. relacionadas con el virus aislado originalmente (esta investigación es actualmente
3. Conserve las tiras recubiertas con anticuerpo no utilizadas en la bolsa excepcionalmente limitada).
de aluminio tipo Ziploc con desecante para protegerlas de la humedad.
4. Es necesario realizar la técnica con sumo cuidado y utilizar dispositivos Límite de detección
de pipeteo calibrados para garantizar la reproducibilidad de la prueba. Se analizaron tres lotes de material, en un ensayo se utilizó un control en blanco
5. Los tiempos o temperaturas de incubación distintos a los indicados en en dieciséis réplicas. El LoD se calculó como el promedio de la DO por el control
este prospecto pueden influir en los resultados. en blanco más tres veces la desviación estándar. El más alto de los tres análisis
6. Evite que se formen burbujas en el micropocillo ya que esto podría se estableció a 0,0669 para el LoD. Los resultados son los siguientes:
reducir la eficacia de la unión y aumentar el %CV de la lectura del
duplicado. DO promedio (450 CV (%) LoD (x + 3 SD)
7. Todos los reactivos deberían mezclarse suavemente y por completo nm)
antes de usar. Evite que se forme espuma. Análisis 1 0,0560 5,32% 0,0649
Análisis 2 0,0568 5,63% 0,0663
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Análisis 3 0,0561 6,46% 0,0669
1. Calcule el valor promedio de la absorbancia del control negativo (xNC).

N.º de catálogo: KAPCOVID19M N.º de revisión: 200602

Repetibilidad Para demostrar la reactividad cruzada de la prueba, DIAsource ImmunoAssay SA
Se analizó un lote de material, en un ensayo se utilizaron tres muestras (positivo utilizó el mínimo requerido por la FDA de 5 muestras individuales analizadas por
fuerte, positivo leve y negativo) en dieciséis réplicas. Para las dieciséis réplicas, la duplicado para cada enfermedad/agente infeccioso mediante muestras naturales
muestra 1 y la 2 son positivas, y en la muestra 3 todos los resultados son negativos. confirmadas con pruebas diagnósticas disponibles en el mercado. Todas las
Los resultados de la repetibilidad son muy satisfactorios y con un CV aceptable. muestras se obtuvieron de muestras naturales mediante suero de pacientes con
Los resultados son los siguientes: las enfermedades subyacentes en la etapa aguda o convaleciente de la infección.
Los agentes de las enfermedades e infecciones se seleccionaron basándose en
ID DO promedio (450 nm) Resultados CV (%) las recomendaciones del programa FDA EUA. En dichas recomendaciones
Muestra 1 1,023 16/16 son Positivos 4,48% también se incluía el antihaemophilus influenzae y el rinovirus, pero este material
Muestra 2 0,443 16/16 son Positivos 4,83% no pudo analizarse por falta de disponibilidad.
Muestra 3 0,125 16/16 son Negativos 9,17%

Agente Prueba de confirmación del Resultados

Reproducibilidad estado de la enfermedad
Se analizó un lote de material en doce ensayos mediante tres muestras (positivo Influenza A Virion/Serion 5/5 Negativo
fuerte, positivo leve y negativo) en dos réplicas y un grupo de controles positivos y Influenza B Virion/Serion 5/5 Negativo
negativos en tres réplicas. Para los doce ensayos, la muestra 1 y la 2 son positivas, Virus sincitial respiratorio EIA, Virion/Serion 5/5 Negativo
y en la muestra 3 todos los resultados son negativos. Los resultados de la Virus hepatitis C Roche Ampliprep/Taqman 5/5 Negativo
reproducibilidad son muy satisfactorios y con un CV aceptable. Los resultados son Anticuerpos antinucleares Bio-Rad Hep 2 5/5 Negativo
los siguientes: Virus hepatitis B Siemens 5/5 Negativo

ID DO promedio (450 nm) Resultados CV (%) Estabilidad del transporte

Muestra 1 1,18 12/12 son Positivos 1,93% Se envió un lote de material desde San Diego a un centro externo de Estados
Muestra 2 0,53 12/12 son Positivos 2,37% Unidos y después regresó. El kit se envasó en una caja de espuma con hielo azul
Muestra 3 0,13 12/12 son Negativos 3,32% que no se cambió durante el estudio para simular condiciones de transporte. Los
Control negativo 0,09 12/12 son Negativos 3,92% kits se mantuvieron en estas condiciones durante un total de 31 días. La
Control positivo 0,89 12/12 son Positivos 3,49% comparación de los valores obtenidos antes y después del envío demuestra la
estabilidad de los materiales. Los resultados son los siguientes:
Especificidad de clase
Para evaluar la especificidad de clase, se analizaron diez muestras séricas de Antes del envío Después del envío
pacientes con COVID-19 confirmado por RT-PCR por duplicado mediante los kits ID pocillo DO Promedio ID pocillo DO Promedio
DIAsource ImmunoAssay SA IgG y ELISA IgM. Las muestras 1-5 son positivas en 0,098 0,091
IgM y negativas en IgG. La muestra 1 es positiva en IgM natural y no tratada y Negativo 0,101 0,103333 Negativo 0,089 0,090333
negativa en IgG. Las muestras 2-5 fueron originalmente positivas en IgG e IgM, 0,111 0,091
pero se utilizó proteína A/ProSep A para eliminar la IgG. Las muestras 6-10 son Positivo 1,387 N/A Positivo 0,868 N/A
positivas en IgG y negativas en IgM. Todas las muestras de la 6 a la 10 son Valor corte Valor corte
positivas en IgG natural y no tratada, negativas en IgM. Hay un 100% de 0,255 0,243
Neg. Neg.
concordancia entres los resultados de esta prueba. Esto demuestra que el ensayo Pas. Valor Pas. Valor
es específico para la detección de la clase IgM sin reactividad cruzada a la clase 0,312 0,297
corte corte
IgG del COVID-19. Los resultados son los siguientes:

ID muestra Resultado IgM Resultado IgG PRUEBAS CLÍNICAS

Muestra 1 + - Se analizaron muestras de pacientes mediante el kit ELISA IgM en tres centros: el
Muestra 2 + - Centro de Control y Prevención de Enfermedades de China, un hospital
Muestra 3 + - universitario de China y un laboratorio de Estados Unidos. La cohorte combinada
Muestra 4 + - se componía de pacientes normales y sanos cuyas muestras se recogieron antes
Muestra 5 + - del brote de COVID-19 (N=233) y de pacientes con resultado positivo confirmado
Muestra 6 - + por RT-PCR (N = 41). Los resultados son los siguientes:
Muestra 7 - +
Muestra 8 - + Positivo confirmado Negativo
Muestra 9 - + confirmado
Muestra 10 - + Kit COVID-19 Positivo 30 0
IgM ELISA Negativo 11 233
Total 41 233
Reactividad cruzada PPA 73,1% IC 95% (puntuación 0,581-0,843
Se analizó un gran número de muestras negativas conocidas (N=80) recogidas en de Wilson):
Estados Unidos antes de diciembre de 2019 a partir de una población con alta NPA 100% IC 95% (puntuación 0,984-1,000
prevalencia de la vacunación y/o la infección de los virus indicados más adelante, de Wilson):
y se observó una especificidad del 100%. Las pruebas de reactividad cruzada para
los siguientes virus no se esperan en este momento:
La IgM es la primera inmunoglobulina producida como respuesta a un antígeno, y
antiinfluenza A (IgG e IgM) será detectable principalmente durante el inicio temprano de la enfermedad. La
Comisión Nacional de Salud de la República Popular China establece que los
antiinfluenza B (IgG e IgM) anticuerpos IgM empiezan a dar positivo entre 3 y 5 días después del inicio de la
anti-HCV (IgG e IgM) COVID-19. Las muestras séricas de algunas de las pruebas clínicas provenían de
pacientes en los que se había iniciado la enfermedad hacía dos semanas. Por
anti-HBV (IgG e IgM) tanto, los bajos niveles de sensibilidad clínica de la IgM se pueden atribuir a la
fecha de recogida de la cohorte positiva, cuando se espera que los niveles de IgM
antihaemophilus influenzae (IgG e IgM)
sean inferiores.
anti-229E (alfacoronavirus)
GARANTÍA
anti-NL63 (alfacoronavirus) Se garantiza que este producto funcionará según se describe en el etiquetado y
anti-OC43 (betacoronavirus) en la documentación cuando se utilice conforme a todas las instrucciones.
DIASource ImmunoAssays S.A. RENUNCIA A CUALQUIER GARANTÍA
anti-HKU1 (betacoronavirus) IMPLÍCITA DE COMERCIALIZACIÓN O ADAPTACIÓN PARA UN FIN
DETERMINADO y en ningún caso DIAsource ImmunoAssays S.A. será
ANA
responsable de daños derivados. La sustitución del producto o el reembolso del
antivirus sincitial respiratorio (IgG e IgM) precio de adquisición es el único recurso disponible para el comprador. La presente
garantía le proporciona derechos legales específicos, si bien usted puede tener
anti-VIH otros derechos que varían de un país a otro.

N.º de catálogo: KAPCOVID19M N.º de revisión: 200602

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of its spike protein for risk of human transmission. Science China Life Sciences.
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Fecha de revisión: 02/06/2020

N.º de catálogo: KAPCOVID19M N.º de revisión: 200602