Mikrobiologija (TIFT)

1. Bakterije, opšte osobine i građa

- Bakterije su jednoćelijski organizmi prokariotske građe koji se uočavaju svetlosnim

mikroskopom i imaju relativno jednostavnu građu u kojoj nedostaju ćelijsko jedro i organele
poput mitohondrija i hloroplasta.

2. Oblici bakterija

- Koke (loptaste bakterije), bacili (štapićaste bakterije) i spiralne (spirili - manji broj spiralnih
zavoja i spirohete - veći broj zavoja).

3. Razmnožavanje bakterija

-Bakterije se razmnožavaju na više načina:

1. Prostom deobom
2. Pupljenjem
3. Egzosporama (spoljašnjim sporama)
4. Fragmentacijom (podelom na više delova)
5. Posebnim načinima polnog razmnožavanja

4. Ishrana bakterija

-Prema načinu ishrane, odnosno da li same stvaraju hranljive materije ili uzimaju gotove iz
prirode dele se na autotrofne i heterotrofne.

5. Bolesti izazvane bakterijama

-Botulizam (clostridium botulinum), dijareja (salmonella), tetanus (clostridium tetani),

tuberkuloza (mycobacterium tuberculosis), kolera (vibrio cholerae).

6. Osnovna pravila rada u mikrobiološkoj laboratoriji

-Pravila rada u mikrobiološkoj laboratoriji (10 zlatnih pravila):

1. Pripremite se unapred za svaku laboratorijsku vežbu. Na taj način se ubrzava rad i
smanjuje mogućnost greške ili povrede.
2. U laboratoriji uvek nositi čist beli mantil. Na taj način se štitimo sebe i odeću od
kontaminacije (zagađenja mikroorganizmima), hemikalija i boja.
3. Nikada nemojte jesti, piti ili pušiti u laboratoriji. Tokom rada ne dodirujte oči, usta i nos.
4. Na radnom mestu treba biti samo ono što je potrebno za vežbu (lab. dnevnik), a sve
ostalo (knjige, jakne, torbe) treba odložiti na predviđeno mesto za to.
5. Pre i posle svake vežbe se peru ruke vodom i sapunom i radna površina se dezinfikuje
alkoholom ili drugim dezinfekcionim sredstvom.
6. Sav materijal koji se koristi mora biti obeležen. Na taj način nećemo pomešati kulture
(bakterije koje gajimo) ili baciti nešto što nam je važno.
 7. Budite pažljivi sa plamenikom! Kada vam nije potreban, ugasite ga. Osobe sa dugom
kosom obavezno vezuju kosu.
8. Sav materijal koji je bio u kontaktu sa mikroorganizmima treba da bude pravilno odložen
i dezinfikovan. Eza (bakteriološka petlja) se posle upotrebe steriliše plamenom.
9. Svaku nezgodu prijaviti profesoru. On će moći da pomogne.
10. Po završenim vežbama sredite laboratoriju. Proveriti da li je slavina zatvorena, plamenik
ugašen, električna struja isključena pre napuštanja laboratorije.

7. Osnovni pribor i oprema mikrobiološke laboratorije

Oprema radnog mesta:

 Mikroskop
 Predmetno staklo
 Pokrovno staklo
 Eza
 Plamenik ili špiritusna lampa
 Savijeni stakleni štapić i čaša za alkohol
 Metalni stalak za epruvete
 Epruvete
 Metalni poklopci za epruvete
 Kofa sa deterdžentom
 Pipete
 Petri šolje

Oprema za opštu upotrebu:

 Autoklav
 Suvi sterilizator
 Sušnica
 Termostat (inkubator)
 Vaga
 Frižider
 Uv lampa
 Termometri

Lični pribor:

 Laboratorijski dnevnik i praktikum

 Beli mantil
 Gumica za kosu
 Olovka, marker, flomaster
 Upaljač ili šibice
  Papirne maramice

8. Svetlosni mikroskop

- Mikroskop je uređaj koji služi za posmatranje sitnih objekata i mikroorganizama. Svetlosni

mikroskop se sastoji od optičkih i mehaničkih delova.

9. Delovi svetlosnog mikroskopa

- Svetlosni mikroskop se sastoji od optičkih i mehaničkih delova. Optički delovi su: okular,
objektivi i sistem za osvetljenje (sijalica i ogledalce). Mehanički delovi su: cev (tubus), zavrtanj,
ručica, stočić, postolje i „revolver“ koji nosi objektive.

10. Pripremanje mikroskopskih preparata u živom stanju

- Pripremanje mikroskopske pločice: Pločica se pere deterdžentom i ispira se vodom. Posle toga
se potapa u 96% etanolu jer on dodatno odmašćuje pločicu i ubija mikroorganizme. Pločica treba
biti čista i suva, nekoliko puta je prevučemo preko plamena i ukapamo kap vode za proveru. Ako
se kap ravnomerno razliva pločica je čista.

- Pripremanje aparata sa živim organizmom: Na čistu pločicu se stavlja kap uzorka i pokriva
pokrovnim staklom. Preparat kratko traje.

11. Preparat viseća kap

- Preparat viseća kap: Ovaj preparat se pravi kada je potrebno dugo posmatranje živih
organizama. Za ovaj preparat se koristi predmetno staklo sa udubljenjem. Preko udubljenja se
maže vazelin jer on sprečava isparavanje uzorka i kap uzorka se stavlja na ljuspicu (pokrovno
staklo).

12. Fiksirani obojeni preparati

- Fiksiranje je proces kojim se ćelije ubijaju i lepe za mikroskopsku pločicu prevlačenjem pločice
preko plamena, a bazne boje koje se koriste za bojenju jesu metilensko plavo, safranin, fuksin…

13. Prosto bojenje metilenskim plavim

- Ovo je najčešće bojenje u mikrobiologiji. Na osušen i fiksiran preparat stavlja se 1-2 kapi
metilensko plave i ostavi 3 minuta. Preparat se ispere vodovodskom vodom i ostavi da se osuši.
Pri mikroskopiranju se koristi malo-srednje-najveće uvećanje.
14. Bojenje po Gramu

- Bojenje po gramu je složeno jer se koristi više od jedne boje i rastvora. Bojenje je
diferencijalno jer se razlikuju dve grupe bakterija: gram pozitivne i gram negativne.

Postupak: Na fiksiran preparat se stavlja ljubičasta boja (Kristal violet) koja će sve bakterije
obojiti u ljubičasto, zatim se stavlja Lugolov rastvor koji učvršćuje ljubičastu boju za ćelijski zid
bakterije. Zatim se preparat ispere etanolom koji će obezbojiti gram negativne bakterije jer se
ljubičasta nije čvrsto vezala za njih. Na kraju se dodaje crvena (fuksin) koji će obojiti gram
negativne bakterije u crveno, a gram pozitivne će ostati bezbojne.

15. Hranljive podloge – namena i osnovne osobine

- Služe za uzgajanje mikroorganizama. One treba da sadrže sve hranljive materije za rast i razvoj
(proteini, minerali). Pored toga treba da budu sterilne, odgovarajuće PH i vlažnosti.

16. Podela hranljivih podloga

17. Agar

- Agar se dodaje u tečnu podlogu kako bi se dobila čvrsta. Dodaje se u maloj koncentraciji
(1,5-2,5%), čvrst je na temp. od 99°C kada se naglo otapa i postaje tečan. On nema hranljivu
vrednost.

18. Želatin

- Želatin se takođe dodaje u tečne podloge kako bi se dobile čvrste, ali se češće koristi agar zbog
svojih prednosti. Želatin je jeftiniji i ima hranljivu vrednost, postepeno se otapa i na 30°C postaje
tečan.

19. Tečne hranljive podloge (bujoni)

- One se koriste u laboratoriji za dobijanje "mase" mikroorganizama ili za određivanje njihovog
prisustva. U industriji se koriste za industrijsko uzgajanje mikroorganizama u bioreaktorima.

20. Prirodne hranljive podloge – primeri

- Ovde spadaju ekstrakt goveđeg srca, krvni agar, mleko, voćni sokovi, ekstrakt kvasca.

21. Osnovne podloge

- One sadrže različite šećere i proteine i na njima raste veliki broj bakterija. Često se nazivaju
MAKSIMALNIM podlogama (primeri su CASO agar, LA, LB).

22. Selektivne podloge

- One imaju neku supstancu (antibiotik npr.) koji onemogućava rast nekim bakterijama. Ovaj
antibiotik deluje selektivno pa će rasti samo bakterije koje su otporne na njega.

23. Podloge za razlikovanje (diferencijalne podloge)

- Služe za vizuelno razlikovanje kolonija nekih bakterija od drugih. Najpoznatije su Endo agar i
EMB agar koje se koriste za određivanje prisustva bakterije Ešerihije koli.

24. Zasejavanje hranljivih podloga

- Metoda išarane ploče se sastoji u tome da se materijal iz koga želimo da izolujemo kulturu
bakterija, zahvati sterilnom ezom, a zatim se ezom šara po površini čvrste šolje u Petri šolji.
Bakterije sa eze prelaze na podlogu, a pri svakom potezu eze nanosi se sve manji broj bakterija.
Na mestima gde je povučena eza pojaviće se pojedinačne kolonije.

25. Aparati za gajenje mikroorganizama

- Sterilna komora, frižider, zamrzivač, termostat, centrifuga.

26. Metoda razređivanja (razblaživanja)

- Sastoji se u tome da se materijal iz koga se izdvaja čista kultura pre zasejavanja razređuje.
Razređivanje se najčešće vrši u fiziološkom rastvoru.
Za ovu metodu je neophodno napraviti seriju sterilnih epruveta sa 9 ml fiziološkog rastvora.
Sterilnom pipetom odmori se 1ml materijala i prenese u prvu epruvetu i tako se dobije
razblaženje od 10 puta. Odatle se uzima 1ml i prebacuje u sledeću epruvetu da bi se dobilo
razblaženje od 100 puta itd. Na kraju se obično pipetom odmeri 0,1ml iz nekog razblaženja i
zaseje na čvrstu hranljivu podlogu. Kap tečnosti se razmazuje po površini staklenim štapićem
koji je pre toga sterilisan i potopljen u alkohol.

27. Alkoholna fermentacija

- Alkoholna fermentacija je proces pretvaranja šećera u etil alkohol i ugljen dioksid u uslovima
bez kiseonika. Ovu fermentaciju mogu da vrše neke gljive i bakterije, ali su najznačajniji kvasci.
Zahvaljujući alkoholnij fermentaciji dobijaju se vino, pivo, rakija.
28. Mlečna fermentacija

- Mlečna fermentacija je proces pretvaranja šećera u mlečnu kiselinu u uslovima bez kiseonika.
Ovu fermentaciju vrše bakterije mlečne kiseline. Ovaj tip fermentacije se koristi za dobijanje
različitih proizvoda: jogurt, kiselo mleko, pavlaka, kefir, kiseli kupus itd.

29. Sirćetna fermentacija

- Sirćetna fermentacija je biohemijski proces u kome se pod uticajem mikroorganizama, u

prisustvu kiseonika, etanol oksidiše u sirćetnu kiselinu ("sirće"). Sirćetnu fermentaciju vrše neke
bakterije.

?30. Merenje veličine ćelije mikroorganizama

- U mikrobiologiji je često potrebno odrediti broj bakterija u nekom uzorku. To se može uraditi
direktnom i indirektnom metodom.

31. Praćenje rasta mikroorganizama

-Radi se pomoću krive rasta i predstavlja broj bakterija tokom vremena po zasejavanju na svežu
hranljivu podlogu.

32. Kriva rasta

- Kriva rasta predstavlja grafički prikaz brojnosti bakterija tokom vremena posle zasejavanja na
hranljivu podlogu. Sastoji se iz 4 faze: LAG (Latent growth), LOG (logaritamska), stacionarna i
odumiranje.

33. Uticaj temperature na rast mikroorganizama

- Temperatura je veoma bitan faktor spoljašnje sredine. Svaki mikroorganizam ima svoju
optimalnu, minimalnu i maksimalnu temperaturu za rast. Optimalna je ona na kojoj je brzina
rasta najveća, maksimalna je najviša moguća na kojoj je moguć rast mikroorganizama, na
temperaturama bliskim minimalnoj dolazi do usporavanja procesa u ćeliji, ali ne dolazi do smrti
ćelije.

34. Uticaj zračenja na mikroorganizme

- Zraci kratkih talasnih dužina u većim dozama deluju smrtonosno na mikroorganizme, a u

manjim dozama izazivaju promene u ćeliji mikroorganizma. Postoji razlika između UV i
jonizujućeg zračenja.

35. Uticaj jonizujućeg zračenja na mikroorganizme

- Kod jonizujućeg zračenja dolazi do promene ćelija mikroorganizma.

36. Uticaj UV zračenja na mikroorganizme

- UV zračenje ubija mikroorganizme. Koristi se za sterilizaciju vazduha.

37. Uticaj radioaktivnog zračenja na mikroorganizme

-Radioaktivno zračenje uništava mikroorganizme.

38. Osnovni laboratorijski stakleni pribor

- Predmetno staklo, ljuspice, štapić, čaša, epruvete…

39. Pranje laboratorijskog posuđa

-Posuđe oprati deterdžentom i četkom, proprati destilovanom vodom i ostaviti da se osuši.

40. Priprema lab. posuđa za sterilizaciju

- Pre sterilizacije suđe je potrebno oprati i sterilisati u autoklavu na 120°C 1 sat.

41. Sterilizacija – osnovni pojmovi i podela

- Sterilizacija predstavlja uništavanje svih oblika mikroorganizama.

Metode sterilizacije:

1. Fizičke metode
a) Toplota (plamen, suva toplota, vlažna toplota)
b) Zračenja (UV zraci, gama zraci)
2. Hemijske metode
a) Etilen oksid
b) Alkohol i dr
3. Membran filter metoda

42. Sterilizacija suvom toplotom

- Ova metoda se vrši u uređaju koji se naziva suvi sterilizator. U ovom uređaju se vrši
sterilizacija staklenog i metalnog pribora u laboratorijama i operacionim salama. Koriste se temp.
od 160-180°C u trajanju od 1,5-2 sata.

43. Sterilizacija vlažnom toplotom

- Ova metoda je efikasnija od sterilizacije suvom toplotom jer brže prodire u ćelije. U nju
spadaju pasterizacija i tindalizacija.

44. Mehanička sterilizacija

- Vrši se pomoću filtera koji imaju pore na sebi koje zadržavaju bakterije. Filtracija se obavlja
primenom pozitivnog ili negativnog pritiska.

45. Membranski filtri

- Izrađeni su od nitroceluloze, a prečnik pora je manji od jednog mikrometra.

46. Pasterizacija

- Pasterizacija je grejanje vode ispod tačke ključanja i koristi se za ubijanje vegetativnih oblika
mikroorganizama. (Temp. 72°C 15 sekundi)

47. Tindalizacija

- Tindalizacija je proces u kome se vrše tri uzastopne pasterizacije podloge, a u međuvremenu se

podloge stavljaju u termostat da proklijaju spore. Zagrevanjem se uništavaju bakterije, a ukoliko
su zaostale spore one klijaju u ćelije i njih uništavamo ponovnim zagrevanjem.

48. Autoklav

- Sterilizacija vodenom parom pod pritiskom vrši se u uređaju koji se zove autoklav. U njemu se
postiže potpuno uništavanje svih vrsta i oblika mikroorganizama.

49. Kohov lonac

- Kohov lonac je aparat za nepotpunu vlažnu sterilizaciju uz pomoć zagrejanje vodene pare.

50. Pribor za uzorkovanje

- Pribor mora biti suv, sterilan, čist, izrađen od nerđajućeg čelika ili stakla.

51. Pravilan način uzorkovanja

- Uzorci se uvek uzimaju pod sterilnim uslovima u sterilne sudove poštujući sve principe
sterilnog rada.

52. Evidentiranje, obeležavanje i pakovanje uzoraka

-Uzorak treba da bude pravilno obeležen: ko je izvršio uzorkovanje, datum i vreme, što precizniji
opis lokacije i drugi detalji ako je potrebno.

53. Uzorkovanje sa čvrstih površina

- Kada se uzima uzorak sa čvrstih površina, uzorak treba uzeti i sa površine, ali i ispod površine
pomoću sterilnog bušača.

54. Uzorkovanje tečnosti

- Pre uzorkovanja tečnosti bitno je prvo dobro promućkati tečnost, a uzorak uzeti sterilnom
pipetom.

55. Uzorkovanje zemljišta

- Uzima se više manjih uzoraka sa parcele (dijagonalno ili cik-cak), zemlja se iskopa ašovom i
nožem skidamo zemlju i sa jedne i sa druge strane ašova, a onaj sloj koji ostaje prikuplja se za
analizu i stavlja se u PVC vrećicu.

56. Uzorkovanje sa ruku i kose

- Za kosu je potrebno uzeti najviše 4cm kose od temena glave, idealna količina je dve supene
kašike kose. Sa ruku se uzorkuje brisem.

57. Uzorkovanje sa odeće i obuće

- Uzorkovanje sa obuće i odeće se uzima brisem.