ANTIMIKROBNI ESEJI

Antimikrobna aktivnost prirodnih

supstanci


Sintetiki antibiotici, penicilin, streptomicin i ostali, su od svog otkria u dvadesetom veku,
znaajno uticali na smanjenje rizika od nastanka zaraznih bolesti.
Poslednjih godina su bakterijske infekcije (infekcija respiratornog trakta, meningitis, polne
bolesti) sve uestanije, uzrokovane pre svega rezistentnou bakterija na sintetike
antibiotike. Stoga je neophodno razviti prirodan i bezbedan nain kontrole i zatite ljudi i
ivotinja od bakterijskih infekcija.
Pored brige za zadravlje ljudi u uem smislu, velika briga postoji i oko sve uestalijeg
smanjenja etvenih useva, jer je kontrola biljnih oboljenja uzrokovana sve rezistentnijim
bakterijama, gljivama, virusima i insektima. Danas postoji velika zabrinutost od sticanja
sistemske rezistencije prirodnih patogena na sintetike pesticide, njihove biodegradacije u
spoljanjij sredini kao i zbog njihovih toksinih ostataka tetnih po zdravlje ljudi.
Iz tog razloga je sve uestalija potreba za pronalaenjem alternativnih supstanci poput
biopesticida, biofungicida i bioinsekticida.
Za veliki broj etarskih ulja, propolisa, sekundarnih metabolita
razliitih bakterija se zna da poseduju antimikrobna svojstva.
Antimikrobna aktivnost testiranih supstanci i njihovih
komponenata moe varirati od delimine do potpune inhibicije
rasta bakterija i drugih patogena, ispoljavajui na taj nain
bakteriostatiku ili baktericidnu aktivnost, odnosno fungistatiku
ili fungicidnu aktivnost u sluaju gljiva.
Metode ispitivanja antimikrobne aktivnosti moemo podeliti na:
difuzione, dilucione i bioautografske metode.
Disc diffusion method
Well diffusion method
Bioautografska TLC metoda
Mikrodiluciona metoda
Difuzione metode se uglavnom koriste u poetnom skrining testu, gde se testirana
supstanca prenosi u bunari na hranljivoj podlozi (Well diffusion method) ili na filter
disk (Filter paper disc diffusion method), odakle se difuzijom radijalno iri po podlozi.
Zona odsustva rasta (zona inhibicije) nastaje oko diska ili bunaria kao posledica
odreene koncentracije testirane supstance koja dovodi do zaustavljanja rasta bakterija.
Izraava se u mm i meri se prenik zone inhibicije.

METODOLOGIJA
Disc diffusion method Well diffusion method
U epruvete se razliva 5 ml rastopljenog soft agara i
dodaje 50 l pripremljene bakterijske suspenzije, a
zatim se inokulisani agar razliva na povrinu vrste
podloge.
Diskovi filter papira natapaju se sa po 10 l
odgovarajueg uzorka testirane supstance (moe se
praviti i serija razliitih koncentracija iste supstance) u
sterilnoj Petri olji. Impregnirani diskovi se zatim
ravnomerno rasporeuju na povrinu zasejane podloge
pomou sterilne pincete.
U svaku Petri olju postavlja se po jedan filter papir
disk impregniran sa 10 l metanola, koji predstavlja
kontrolu rastvaraa, a po elji i odgovarajueg
antibiotika kao pozitivna kontrola.
U epruvete se razliva 7 ml rastopljenog soft agara i
dodaje 70 l pripremljene bakterijske suspenzije, a
zatim se inokulisani agar razliva na povrinu vrste
podloge na koju su prethodno postavljeni sterilni delovi
utih nastavaka.
Nakon solidifikacije inokulisanog agara u
novoformirane bunarie dodaje se po 20 l
odgovarajueg uzorka testirane supstance (moe se
praviti i serija razliitih koncentracija iste supstance).
Potrebno je izbegavati pojavu mehuria.
Na svakoj Petri olji prave se i bunarii, koji
predstavlju kontrolu rastvaraa i pozitivnu kontrolu
odgovarajueg antibiotika.
Bioautografska metoda se moe posmatrati kao jednostavna in situ metoda koja omoguava
razdvajanje sloene smee testirane supstance, a da u isto vreme lokalizuje sve aktivne
sastojke supstance na ploici na kojoj se radi bioautografija.
Tankoslojna hromatografija (TLC), u kombinaciji biolokih i hemijskih metoda detekcije, je
efikasna i jeftina tehnika za prouavanje biljnih ekstrakata. Biotestovi su definisani kao
testovi koji se koriste za otkrivanje bioloki aktivnog ekstrakta ili iste supstance izolovane iz
ekstrakata, dobijenih iz ivog organizma.
Nakon razdvajanja komponenti na TLC, ovi proizvodi su imobilisani na ploici. Njima se lako
pristupa jer su otvoreni i dostupni za spore manipulacije, kao to je inkubacija bakterijskih
kultura zajedno sa ploicom.
Glavna primena TLC bioautografije je brz skrining velikog broja uzoraka za bioaktivnou i
usmerena je ka izolaciji aktivnih jedinjenja. Poto TLC podrazumeva samo broj aktivnih
supstanci na ploici, a ne i njihovu koncentraciju spada u semi-kvantitativni metod.
BIOAUTOGRAFIJA
MIC ESEJ
MIC esej se uspeno primenjuje prilikom
ispitivanja antimikrobnih svojstava prirodnih
proizvoda, ukljuujui sirove ekstrakte,
hromatografske frakcije kao i preiena jedinjenja.
Metoda je brza, osetljiva, relativno jeftina,
pouzdana i pomou nje je mogue utvrditi minimalne
inhibitorne (MIC) i baktericidne koncentracije
(MBC) antimikrobnih agenasa (Sarker et al., 2007).
Resazurin slui kao indikator elijskog rasta, koji se
pored MIC eseja koristi u mnogim drugim testovima,
posebno citotoksinosti. U oksidovanom obliku je
plave boje i nije fluorescentan, niti toksian. U
prisustvu elijskog rasta, delovanjem elijskih
oksidoreduktaza, redukuje se u fluorescentan
rezorufin koji je ruiaste boje.
MIC je definisana kao najnia koncentracija
ispitivanih supstanci pri kojoj ne dolazi do
promene boje, ali dolazi do porasta na
hranljivom medijumu. MBC je ona
koncentracija pri kojoj je ubijeno 99,9% od
poetnog broja bakterijskih elija, tj. ne dolazi
do promene boje kao ni rasta na medijumu.
MIC ESEJ - metodologija
Punjenje MIC ploe
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
Ulje mente Ulje anisa
Ulje mente
+ anisa
Pozitivna
kontrola
(antibiotik)
Kontrola
rastvaraa
(EtOH,
MtOH,
DMSO)
Negativna
kontrola B
C
D
E
F
G
Blank
(medijum) H
Testirana supstanca
U prvi bunari (A red) razliva se 160 l LB i 40 l
odgovarajueg ulja, a u ostale (B-H) samo po 100 l LB.
Gradijent se pravi tako to se iz prvog bunaria uzima 100 l
tenosti i prebacuje u drugi, iz drugog u trei i tako do
poslednjeg bunaria, iz koga se izbacuje 100 l volumena.
Nakon napravljenog gradijenta, u svaki bunari se dodaje po
80 l LB i 20 l pripremljenih bakterijskih suspenzija.
Finalna zapremina u svakom bunariu je 200 l.

Kontrola rastvaraa
U prvi bunari (A red) razliva se 160 l LB i 40 l
metanola, a u ostale (B-G) samo po 100 l LB. Gradijent se
pravi kao i u prethodnom sluaju i dodaje ostatak medijuma i
bakterija. Finalna koncentracija rastvaraa u prvim
bunariima ne sme da pree 10%.



Negativna (bakterijska) kontrola: U dva bunaria
razliva se 180 l LB i 20 l bakterija.


Blank: 200 l LB
Pozitivna (antibiotska) kontrola
U prvi bunari (A red) razliva se 200 l odgovarajueg
antibiotika koncentracije 400 mg/ml (prethodno
pripremljenog u LB medijumu), a u ostale bunarie po
100 l LB. Gradijent se pravi kao i u prethodnom
sluaju i dodaje ostatak medijuma i bakterija.
Resazurin Sodium Salt finalna koncentracija
0.675 mg/ml

Nakon zavretka punjenja ploa, u sve bunare
se dodaje rezazurin po 22 l finalne
koncentracije.
Ploe se obmotavaju parafilmom i inkubiraju
24h na 37 C.
Nakon inkubacije ploa potrebno je zasejati na
hranljive podloge u obliku zmijica, sve uzorke iz
bunaria koji nisu promenili boju. Zasejane olje
inkubirati preko noi na 37 C.
Sutradan odrediti MIC i MBC.
MIC ESEJ - metodologija
Antibiogram
Odreivanje otpornosti mikroorganizama
prema antibioticima
Metoda koja slui za odreivanje odnosa mikroorganizma
prema antibiotiku.

bakterijska
kultura
100l, utrljati
staklenim tapiem
C R
obeleiti pozicije antibiotika na
pozadini petri olje
Pincetom koju ste sterilisali na
plamenu, postaviti tablete antibiotika
na obeleena mesta.
Antibiogram
T
Prenik zone inhibicije rasta MO oko antibiotske
tablete se meri lenjirom (od ivice tablete do kraja zone
u dva pravca i uzima se srednja vrednost) i rezultat
odreuje po uputstvu proizvoaa.
Zona inh.(mm) Osetljiv (S) Prelazan (I) Otporan (R)
Methicillin 14 10 - 13 9
Cefpodoxime 21 19 - 20 17
Rifampicin 22 14 - 21 13
Tetraciklin 26 18 - 25 17
Hloramfenikol 28 21 - 27 20