Bioloka kontrola

lekova
Bioloki testovi
prof.dr Mira Zeevi

Sterilnost
Primenjuje se na stupstance za koje
farmakopeje trae da budu sterilni
Zadovoljavajui rezultat ukazuje da u
ispitivanom uzorku nije naen
kontaminirajui mikroorganizam pod
uslovima testa
Prenoenje rezultata testa na celu
proizvedenu seriju zahteva dokaz da je
proizvod proizveden u homogenim uslovima

 Fiziki dokazi zasnovani na biolokim

principima i automatski dokumentovani koji
pokazuju korektan tretman cele
proizvedene serije tokom sterilizacije
imaju veu vrednost od testa sterilnosti.
Test sterilnosti je jedini analitiki metod
koji postoji za ispitivanje kvaliteta
proizvoda pripremljenih u aseptinim
uslovima

Mere predostronosti
kontaminaciom mikroorganizmima
(MO)
Izvodi se u aspetinim uslovima, npr. u
komori sa laminarnim protokom vazduha
Aseptini uslovi ne ometaju otkrivanje MO
testom
Radni uslovi u kojima se test izvodi redovno
se prate uzimanjem uzorka vazduha i sa
radnih povrina, kao i izvoenjem
kontrolnih testova sa preparatima za koje
se zna da su sterilni

Izbor hranljivih podloga

Biraju se u zavisnosti da li se rade
ispitivanja aerobnih i anaerobnih
bakterija ili gljivica
Podloga mora biti sterilna i da ima
hranljiva svojstva za datu vrstu MO

Ispitivanje podloga
Sterilnost: Inkubiraju se podloge za
izolaciju bakterija na 30- 50C, a za
izolaciju gljivica na 20- 25C
najmanje 7 dana
Rezultat: Ne treba da bude bilo
kakvog rasta MO

 Hranljiva svojstva: inokulie se

izabrana hranljiva podloga sa
otprilike 100 ivih MO i inkubira na
pomenutim temepraturama ne vie od
7 dana.
Rezultat: Podloge odgovaraju ukoliko
doe do ranog i obilnog porasta MO

Ispituju se na prisustvo:

Staphylococcus aureus (Aerobne)

Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes (Anaerobne)
Candida albicans

Efikasnost hranljivih
podloga
Ispituju se:
a) u prisustvu i odsustvu proizvoda koji
se ispituje na sterilnost za
bakterijsku sterilnost i
b) na isti nain posebno za test
sterilnosti na gljivice

a) za bakterijsku sterilnost:
4 epruvete za svaku podlogu koja e se
koristiti u testu za bakterijsku sterilnost
U svaku se dodaje ispitivani proizvod
Inokulie se polovina epruveta sa 0,1 ml
suspenzije odgovarajueg soja aerobnog MO
razblaene da sadri oko 1000 ivih MO po
ml (odnosno inokulacija oko 100 MO) i na isti
nain inokulie ostatak epruveta sa sporama
odgovarajurg soja anaerobnih MO
Za antibiotike se biraju sojevi osetljivi na
antibiotik

 Pripremi se isti komplet epruveta bez

proizvoda koji se ispituje i inokulie
na isti nain
Inkubiraju se sve epruvete na 3035C ne vie od 7 dana

b) Za sterilnost na gljivice
Pripreme se najmanje dve epruvete sa
podlogom koja se koristi u testu stabilnosti
za izolaciju gljivica i u svaku doda ispitivani
proizvod
Inokuliu se epruvete sa 0,1 ml suspenzije
odgovarajueg soja Candide albicans
razblaene da sadri oko 1000 ivih MO po
ml (odnosno inokulacija oko 100 MO).

 na isti nain pripreme se dve epruvete

bez proizvoda, inokuliu na isti nain.
Inkubiraju se sve epruvete na 20-25C
ne vie od 7 dana
Ukoliko je podloga namenjena u isto
vreme za ispitivanje i gljivica i
bakterija ona se mora ispitati na obe
vrste MO

Tumaeneje rezultata:
Ukoliko je tokom inkubacije, porast
MO u prisustvu i odsustvu proizvoda
koji se ispituje slian, proizvod nema
antimikrobnu aktivnost i test na
sterilnost se moe izvesti bez
modifikacije

 Ukoliko kulture koje sadre proizvod koji

se ispituje na sterilnost pokau slabiji rast,
odloen porast ili uopte ne pokau rast
MO, kada se uporede sa kulturama koje ne
sadre ispitivani proizvod, PROIZVOD
poseduje antimikrobnu aktivnost koja se
mora otkloniti filtriranjem, razbalivanjem
ili neutralizacijom pre ili tokom testa na
sterilnost.
Test se ponavlja i odredi se efikasnost ove
eliminacije

Test sterilnosti
Dva naina izvoenja:
a) Membranska filtracija (preporuljiva
uvek kada priroda proizvoda to dozvoljavavodeni, alkoholni uljani preparati)
b) Direktna inokulacija hranljive podloge
proizvodom kiji se ispituje

Membranska filtracija
koriste se menbranski filtri koji imaju
veliinu pora ne veu od 45m.
celulozni nitratni filtri za vodene, uljane i
razb. alkoholne rastvore i
celulozni acetatni filtri za konc. alkoholne
rastvore
Aparat i menbrana se steriliu pomou
odgovarajueg sredstva a napravljeni su
tako da se rastvor koji se ispituje moe
uneti i filtrirati u aseptinim uslovima

 U farmakopejama su date tane

koliine proizvoda koji se ispituje u
testu sterilnosti kako za
parenteralnu tako i za ispitivanje
sterilnosti preparata koji nisu za
parenteralnu upotrebu kao i propisi
za njihova ispitivanja a prema vrsti
preparata.

Direktna inokulacija hranljive

podloge
Prenese se preporuena koliina
ispitivanog preparata direktno u
hranljivu podlogu tako da odnos
proizvod prema podlozi bude 1:10 za
tenosti i 1:100 za vrste materije
Posebno je propisan je nain
ispitivanja za uljane tenosti i masti
kreme

Tumaeneje rezultata
Kada proizvod koji se ispituje ima
antimikrobno dejstvo, test sterilnosti se
izvodi nakon neutralisanja sa odgovarajuom
supstancom ili razbalivanjem u dovoljnoj
koliini hranljive podloge
Podloge se inkubiraju najmanje 14 dana na
ve pomenutim temperaturama za bakterije i
gljivice
Kulture se posmatraju nekoliko puta u toku
perioda inkubacije i svaki dan blago
promeaju ako nisu potrebni anaerobni uslovi
(podloga tioglikolat)

 Ukoliko nema dokaza u rastu proizvod

je u skladu sa zahtevima sterilnosti
Ukoliko postoji rast MO proizvod ne
odgovara testu za stabilnost, pod
uslovom da rezultat nije proizaao iz
kontaminacije tokom izvoenja testa

Provera
Prvi ponovljeni test: Sprovodi se na isti
nain kao prvi i kontaminati uporede sa
prvim testom. Ukoliko kontaminati ne
mogu odmah da se diferenciraju,
proizvod koji se ispituje nije u skladu
sa zahtevima testa sterilnosti, a ako se
kont. odmah diferenciraju moe se
uraditi drugi ponovljeni test.

 Drugi ponovljeni test: Upotrebi se

dvostruko vei broj uzoraka od onog
koji je testiran u prvobitnom testu na
sterilnost
Ukoliko nema dokaza o rastu MO,
proizvod koji se ispituje u skladu sa
zahtevima testa na sterilnost
Ukoliko doe do rasta MO proizvod ne
odgovara zahtevima za sterilnost
preparata

Ispitivanja preparata
Farmakopeja posebno propisuje
primenu testa sterilnosti na
preparate za parenteralnu upotrebu,
oftalmoloke i druge preparate
neinjekcione preparate, hirurke
zavoje.

 Propisan je minimalan broj uzoraka koji se

preporuuje za testiranje a u vezi sa
brojem pakovanja u seriji, da bi se dobio
odgovarajui stepen pouzdanosti rezultata
Uslov je iskljuena kontaminaciju prilikom
proizvodnje i rukovanja
Serija: homogena kolekcija zapeaenih
sudova pripremljenih na takav nain da je
rizik od kontaminacije isti za sve jedinice
koje se u njoj nalaze

Preporuene hranljive
podloge
teni tioglikolat - anaerobne
bakterije, otkriva i aerobne bakterije
hidrolizat kazeina i hidrolizovanog
soinog zrna - za aerobne bakterije i
gljivice
Ove podloge su sloenog sastava koji
se navodi u farmakopejama i nain
njihove pripreme

Mikrobioloka istoa preparata za

koje se na zahteva da budu sterilni
-ukupan broj ivih aerobnih MO
Odredi seu ukupan broj ivih aerobnih MO
metodom menbranske filtracije, metode
brojanja na ploi ili metode seriskih
razbalenja
Postupak: upotrebi se10g ili 10ml uzorka tako
to se pomea nekoliko delova nasumice
izabranih iz celog proizvoda, ako je potrebno
rastvori, razblai, suspenduje ili emulguje
pomou odgovarajue tenosti (zavisi od vrste
proizvoda).
Eliminiu se prethodno bilo kakva
antimikrobna svojstva proizvoda koji se

Menbranske filtracije
menbrane prenika 50mm.
Aparat mora biti mogue koristiti u
aseptinim uslovima i mora omoguiti
uklanjanje menbrane radi prenoenja u
hranljivu podlogu.
prenese se koliina koja odgovara 1g
proizvoda na svaki od dva menbranska
filtra i odmah filtrira. Ispere se svaka
menbrana tako da kroz filtar proe
najmanje tri koliine od po 100ml
odgovarajue tenosti, npr. puferovan
rastvor NaCl ili peptona pH 7.0.

 Filtri se prenesu na odgovarajue

podloge za brojanje bakterija
(agar B) i gljivica (agar C) i ploa
inkubira 5 dana na preporuenim
temperaturama. Prebroje se
kolonije koje se pojave i izrana
se broj MO po gramu ili ml
proizvoda.

Brojanje na ploi
Koriste se Petrijeve olje 9-10cm u preniku
U svaku olju se doda 1ml pripremljenog uzorka i
15ml otopljene podloge agara B, na temp. do 45C
Uzorak se ako je potrebno razblai da broj
kolonija ne bude vei od 300
Koriste dve petrijeve olje, vri se inkubiranje na
30-35C 5 dana, ako se pouzdan broj ne pojavi pre
Prebroje se kolonije koje se prebroje i rezulati
izraunaju koristei podatak da je 300 kolonija po
ploi maksimum korektan za dobru procenu.

za gljivice:
Postupak je isti ali se koristi agar C
kao podloga, inkubacija vri na temp.
20-25 C 5 dana, uz razblaenje
uzorka da broj kolonija koji se
oekuje bude ne vie od 100.

Serijsko razbalenje
Priprema se serija od 12 epruveta od kojih
svaka sadri 9ml do 10ml podloge A.
Na prethodno opisan nain u prve tri
epruvete se napravi razblaenje ispitivanog
proizvoda 1:10, u druge tri 1:100, a u tree
tri 1:1000.
U poslednje tri epruvete doda se
razblaiva i one ne treba da imaju rast
MO
Inkubiraju se epruvete na 30-35 C 5 dana

 Ukoliko se rezultati ne mogu jasno

oitatai uzorak se preseje na tenu
ili vrstu podlogu, inkubira i oita
Odredi se broj MO po gramu ili ml
proizvoda iz odgovarajue tabele koja
se nalazi u farmakopeji

Interpretacija rezultata
Ukoliko postoji limit u monografiji
treba ga interpretirati na sledei
nain:
102 MO maksimalni prihvatljiv limit
5x102
103 MO maksimalni prihvatljiv limit
5x103 itd...

Mikrobioloka istoa preparata za koji ne

moraju da budu u skladu sa testom za
sterilnost -test na specifine MO
Enterobakterije, Escherichia
coli,Salmonella, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Clostridija
Za ove bakterije nije dozvoljeno prisustvo
u farmaceutskim preparatima i sirovinama,
a ispituju se prema pojedinanim
farmakopejskim propisima za svaku
bakteriju

Bakterijski endotoksini
za neke preparate propisuje se
ispitivanje bakterijski endotoksina
pomou LAL testa (lizat amebocita
potkoviastog raia -Limulus
polyphemus).
Kada se uzorak koji sadri
endotoksine doda rastvoru lizata
nastaje zamuenje, precipitacija ili
geliranje smee.

 Ispitivanje se vri prema graninim

vrednostima i preparat je ispravan
ukoliko konc. endotoksina nije vea od
granine vrednosti

Mikrobioloko odreivanje
antibiotika-odreivanje aktivnosti
procenjuje se poreenjem inhibicije rasta
osetljivih MO pod dejstvom poznatih konc.
ispitivanog antibiotika standardnog
rastvora
koncentracije standardne supstance se
odreuju na osnovu internacionalnih
standarda (referentnih).

 Aktivnost mora biti u granicama 95-105%

za verovatnou P = 0.95
A. Metoda difuzije
B. Metoda turbidmetrije

A. Metoda difuzije
Potrebna koliina odgovarajue podloge se
rastopi i zaseje na pogodnoj
temperaturi:npr. 48-50C za vegetativne
oblike, poznatom koliinom suspenzije MO
osetljivih na antibiotik.
Pod dejstvom antibiotika potrebno je da se
formiraju jasno definisane zone inhibicije

 Podloga se promea i odmah razlije u

Petrijeve olje kada se formira sloj
podloge debljine 2-5mm.
Druga mogunost je upotreba
dvoslojnih podloga kada se zasejava
samo jedan sloj -gornji.

 Prema propisu pripreme se standardni i

ispitivani rastvori u poznatim konc.
pretpostavljajui da su istih aktivnosti
Rastvori se nanose pomou sterilnih
cilindara od porcelana ili nerajurg
elika u rupe iseene u podlozi. U svaku
rupu unosi se ista zapremina rastvora.

 Mogu se koristiti i papirnati diskovi od

sterilnog apsorbujueg papira koji se
impregniraju rastvorima standardnog
preparata ili ispitivanog antibiotika i
reaju na povrinu zasejane hranljive
podloge
Za procenu validnosti odreivanja koriste
se najmanje tri doze standardnog
preparata - za procenu linearnosti

 Pripremljeni rastvori se nanose u

Petrijeve olje prema odreenom
dizajnu
Vreme inkubacije na propisanoj
temperaturi je 18 h.
Mere seprenici zona inhibicije sa
preciznou od 0.1mm.

B. metoda turbidimetrije
Tena hranljiva podloga se zaseje
suspenzijom odgovarajueg MO
osetljivog na ispitivani AB.
Period inkubacije 4h
Podloga se inokulie neposredno pred
upotrebu

 Prema propisu pripreme se standardni

i ispitivani rastvori u poznatim konc.
pretpostavljajui da su istih
aktivnosti
Za procenu linearnosti koriste se
najmanje tri doze standardnog
preparata

 Stave se jednake zapremine od

svakog rastvora u identine testepruvete i u svaku epruvetu doda ista
zapremina inokulisane hranljive
podloge (npr. 1ml rastvora i 9ml
podloge)
U isto vreme se pripreme dve
kontrolne epruvete koje ne sadre
antibiotik

 Epruvete se rasporede prema odreenom

dizajnu i prenesu u vodeno kupatilo na
odreenu temperaturu 3-4h inkubacije.
Nakon inkubacije rast MO se zaustavlja
dodatkom 0.5ml formaldehida R u svaku
epruvetu ili pak zagrevanjem
Meri se zamuenje na tri decimale
Odreivanja moraju imati odreen broj
ponavljanja radi preciznosti