Izolovanje iste kulture bakterija

Ivana Mladenovi
ista kultura vodi poreklo od jedne elije, sve njene kolonije su jednake veliine,
boje, oblika i imaju iste Gram reakcije. Da bi se iz uzorka koji sadri meovitu kulturu
izolovala ista kultura bakterija, potrebno je izolovati populaciju bakterija koja vodi poreklo
od jedne elije. Za izolovanje iste kulture, u ovoj vebi koriena je metoda iarane ploe, a
kao uzorak bakterije koriena je prekonona kultura Escherichia coli. Ova metoda, koja se
jo naziva i metoda iscrpljivanja, slui za dobijanje iste bakterijske kulture koja se koristi u
daljem radu. Ovom metodom se ne moe utvrditi broj elija u Petrijevoj olji. U vebi je
koriena i metoda razreivanja. Ova metoda zahteva vie pribora i materijala od prethodne.
Metodom razreenja se najpre dobija prebrojiv broj kolonija, a zatim se odreuje broj elija u
Petrijevoj olji. Za metodu razreivanja potrbno je pripremiti decimalna razreenja. (J.
Kneevi-Vukevi, 2006)
Materijal i metode
tri Petrijeve olje
epruveta sa prekononom kulturom Escherichia coli
eza
aa sa 96% rastvora etanola
stakleni tapi
piritusna lampa
dve automatske pipete
epruveta sa 0,01M magnezijum-sulfatom (MgSO4)
4 ependorf epruvete
inkubator
vorteks
U vebi je najpre koriena metoda iarane ploe. Ova metoda je zasnovana na tome
da se broj naneenih bakterija smanjuje, to jest iscrpljuje sa svakim novim potezom eze, kako
bi se nakon inkubacije izolovale pojedinane kolonije. Ezom je zahvaena bakterijska kultura
Escherichia coli iz epruvete. Zatim je ezom naneta bakterijska kultura etiri puta u vidu
paralelnih linija. U sledeem koraku eza je sterilisana pomou piritusne lampe. Nakon
sterilizacije, ezom je zahvaena prethodno naneta koliina bakterijske kulture, ali tako da je sa
prethodne prve i druge linije iscrpljena koliina nanete kulture, dok su druge dve linije
povuene paralelno. Ovaj korak je ponovljen etiri puta. Izmeu svaka dva povlaenja
paralelnih linija, eza je sterilisana opaljivanjem do usijanja. Prilikom etvrtog iscrpljivanja
vodilo se rauna da ne doe do spajanja sa prvim nanosom. Nakon obavljene vebe, Petrijeve
olje su odnete na prekononu inkubaciju.
Metoda razreivanja obavljena je tako to je broj bakterija u uzorku smanjivan
pravljenjem serije razreenja 10-2, 10-4, 10-5 i 10-6. Ovom metodom je odreen najpre broj
kolonija, a zatim i broj elija u Petrijevoj olji putem sledee formule:
broj elija/ml= broj kolonija/r*V
gde je r korieni rastvor, a V zapremina od 0,1ml.
U metodi je najpre je obeleena svaka ependorf epruveta odgovarajuim brojem (sa -2,
-4, -5, -6). Iz epruvete sa MgSO4 sipano je automatskom pipetom u svaku ependorf epruvetu
po 990l, osim u ependorf epruvetu -5 gde je sipano 900l. Iz epruvete sa bakterijom

Escherichia coli izvueno je 10l bakterije, a zatim je sipano u ependorf epruvetu -2. Nakon
ovoga, sadraj u ependorf epruveti je izmean pomou vorteksa. Ovaj postupak je neophodan
za ravnomerno rasporeivanje bakterija u ependorf epruveti. U sledeem koraku je iz
ependorf epruvete -2 prebaeno automatskom pipetom 10l u ependorf epruvetu -4. Zatim je
iz te ependorf epruvete preuzeto 100l i presipano u ependorf epruvetu -5, dok je iz iste
ependorf epruvete u sledeem koraku presipano 10l u ependorf epruvetu -6. Nakon svakog
presipanja ependorf epuveta je vorteksovana. Jedna Petrijeva olja obeleena je sa -5, a druga
sa -6. U prvu je na LB medijum sipano 100l razreenja iz ependorfa -5, a u drugu 100l
razreenja iz ependorfa -6. Zatim je staklenim tapiem premazivana koliina u razblaenju
10-5 i 10-6 metodom utrljavanja. Po zavreku vebe obe Petrijeve olje su odnete na
prekononu inkubaciju.
Rezultati
Metodom iarane ploe dobijene su 3 bakterijske kolonije, a metodom razblaenja, u 10-6
razblaenju dobijena je etrdeset i jedna kolonija. Sve kolonije su iste morfologije, to znai
da je kultura ista i da je rezultat ispravan. Broj bakterija po mililitru, koji je izraunat po
gorenavedenoj formuli, iznosi 4,1*108.
Literatura
J. Kneevi Vukevi, D. Simi, 2006. Metode u mikrobiologiji, Odabrane vebe za predmet
mikrobiologija, Univerzitet u Beogradu, Bioloki fakultet