Vjebe iz predmeta

Kultura elija (stanica)

kolska godina 2010/2011

Uvod
Definicija: Kultura elija podrazumijeva odravanje elija u vjetaki kontroliranoj sredini koja pogoduje njihovom rastu. Prvo uspjeno kultiviranje animalnih elija je uspjeno izvrio Ross Harrison 1907 godine kada je pokuavajui posmatrati razvoj nervnih vlakana uspio kultivirati tkivo embriona abe 1-4 sedmice. ira upotreba ove tehnike u nauci poela je tek kasnih 1940. i ranih 1950. godina.

Uvod

U ranom periodu tehnike kulture elija uglavnom se radilo na iznalaenju naina prevazilaenja problema kontaminacije elijskih kultura (razvoj antibiotika). U novije vrijeme glavno obiljeje razvoja ove tehnike kulture elija je njena komercijalizacija.

Uvod
Tehnikom kulture elija se kultiviraju pojedinane elije ije su veze sa okolnim elijama pokidane. Kultiviranje tkiva oznaava se pojmom kultura tkiva Tehnika kultiviranja cijelih organa s ciljem praenja njihove kontinuirane funkcije ili razvoja zove se

kultura organa.

Uslovi uspostavljanja kulture elija

Za uspjean rast humanih elijskih kultura neophodno je obezbijediti sljedee uslove: Sterilnost Temperatura Koncentracija CO2 pH Adekvatnost sadraja i koliine hranljivog medija Posude za kultivaciju

Sterilnost
Mnogi mikroorganizmi rastu intenzivnije i bre od humanih elija u kulturi, a veina njih proizvodi toksine koji tete kultiviranim elijama i na kraju mogu uzrokovati totalno unitenje kulture. Kontaminanti elijskih kultura mogu voditi porijeklo iz organizma ije se elije kultiviraju ili iz okolne sredine (obino iz zraka).

Sterilnost
Postoji vie naina da se smanji rizik uvoenja kontaminanata u kulture, a najvaniji je dobra aseptina tehnika. Osnovna pravila aseptine tehnike podrazumijevaju izbjegavanje: kontakta sterilnog pribora ili posua koji dolaze u direktni dodir s uzorkom i nesterilnog pribora ili golih ruku, kaljanje, kihanje, prianje ili disanje direktno nad sterilnim priborom koji dolazi u direktni kontakt sa uzorkom.

Sterilnost
Pored ovoga pravila aseptine tehnike obavezuju na adekvatnu upotrebu odgovarajue opreme. Rad sa elijskim kulturama iskljuivo se odvija u vertikalnom ili horizontalnom laminaru sa protokom sterilnog zraka. Osoba koja radi sa elijama u kulturi mora biti adekvatno odjevena (mantil, rukavice i maska za lice) pribor se sterilie upotebom autoklava i suhog sterilizatora ili se koristi plastini sterilni materijal za jednokratnu upotrebu.

Sterilnost
Smanjenje mogunosti kontaminacije samih kultura postie se i dodavanjem antibiotika u medije. Antibiotici su komercijalno dostupni i pripremljeni za elijske kulture, a obino sadre: penicilin, streptomicin, kanamicin ili gentamicin. Prilikom uspostavljanja primarnih elijskih kultura neophodno je u medij dodati i odreene fungicide kako bi se sprijeila kontaminacija gljivicama od kojih je najea Candida albicans (npr. nistatin, fungizon).

Sterilnost

Kontaminacija primarnih elijskih kultura virusima obino je posljedica prisustva virusa u elijama prije biopsije virusne infekcije kulture su obino hronine i ne ubijaju domainske elije u kulturi.

Temperatura
Optimalna temperatura za humane kulture elija je 37C Blago poveanje temperature poveava stopu multiplikacije elija do odreenog nivoa. Kada se dostigne gornji prag daljnje poveanje temperature djeluje inhibitorno na elijski rast. Temperature nie od 37C djeluju depresorno na elijski metabolizam i umanjuju elijski rast. Veoma je vano da temperatura u inkubatoru ne varira vie od 0.25C.

Temperatura
Generalno se smatra da vie temperature djeluju tetnije na rast elija u kulturi nego nie. Kratko izlaganje temperaturi vioj za 3C od normalne, moe dovesti do smrti cijele kulture Iste kulture mogu preivjeti kratkotrajna izlaganja temperaturi nioj za 10C od normalne. elijske kulture izvedene iz odreenih tkiva, kao i pojedine elijske linije mogu zahtjevati neto drugaiju temperaturu za optimalan rast.

Temperatura
Primjer: Normalna temperatura testisa je znaajno nia od tjelesne temperature i iznosi 33C, zato prilikom rada sa elijskim kulturama dobivenim iz tkiva testisa, spermatogeneza in vitro se nee odvijati normalno na 37C. Za dobijanje elijskih linija koriste se mnogi sisari (npr. mievi, takori, make, psi) koji imaju temperaturu znaajno drugaiju od ovjekove. elije insekata, crva ili riba zahtjevaju znaajno nie temperature i ne mogu se kultivirati na 37C.

pH medija
Optimalan pH medija u kojem se kultiviraju elije je 7 7.4. Ovakav pH medija se u kulturi odrava zahvaljujui puferima koje medij sadri i koncentraciji gasova u inkubatoru. Uobiajeno je da se za najvei broj elijskih kultura u inkubatoru odrava mjeavina gasova: 5% CO2 i 95% atmosferski zrak.

Adekvatnost sadraja i koliine hranljivog medija

Da bi elije bile sretne u mediju u kojem se kultiviraju, medij mora biti podeen za odreeni tip elija. Najee se koriste mediji na bazi RPMI 1640, MEM-a (minimal essential medium) ili angovog medija. Ovi osnovni mediji sadre veliki broj materija koje elije trebaju za uspjean rast u kulturi, kao to su: neorganske soli, aminokiseline i vitamini. Nezaobilazan dodatak koji umanjuje mogunost kontaminacije je antibiotik (najee se koristi penicilin/streptomicin).

Adekvatnost sadraja i koliine hranljivog medija

Nezaobilazan dodatak hranjivih medija je L- glutamin, a za kulture limfocita periferne krvi neophodan je mitogeni stimulator fitohemaglutinin. U kompletnom mediju za elijsku kulturu obavezan sastojak je i serum (najee BSA). Uloga seruma nije do kraja razjanjena, ali je dokazano da bez njega elije u kulturi ne mogu preivjeti dugo. Odravanje pH kompletnog medija obezbjeuje prisustvo puferskih soli.

Adekvatnost sadraja i koliine hranljivog medija

Primjer: Sastav medija za kultivaciju epitelnih elija ml RPMI 1640 (bazalni medij) ml serum (govei fetalni) ml L-glutamin otopina penicilin/streptomicin

200 42.5 2.5 5 ml

Posude za kultivaciju
U zavisnosti od tipa elija koji se kultivira, potrebe kultiviranja u otvorenom ili zatvorenom sistemu, kao i specifinosti eksperimenta koji se izvodi bira se adekvatna posuda za kultivaciju. Danas se preferira upotreba plastinih sterilnih posuda koje su namijenjene za jednokratnu upotrebu. U in vitro tehnici kultiviranja elija najee se koriste T-flaskovi zapremine 25-75 ml, Petri posudice i tubice za centrifugiranje sa konusnim dnom zapremine 15 ml.

Posude za kultivaciju

15 ml i 50 ml tubice Multiwell plejtovi

15 ml tubice

Petri posude

Flaskovi

Primarne elijske kulture i subkultiviranje

Primarne elijske kulture

Kada se iz nekog organizma biopsijom ili hirurki odstrane fragmenti odreenog tkiva, a zatim stave u odgovarajuu vjetaki kontroliranu sredinu za kultiviranje, elije e se vezati za podlogu, dijeliti se i rasti. Ovo je primarna elijska kultura. elijska kultura se moe smatrati primarnom do njenog prvog subkultiviranja (pasairanja). Termin kratkotrajne kulture se koristi za primarne elijske kulture koje se ne mogu subkultivirati.

Primarne elijske kulture

Primarne elijske kulture koje su dobijene od jedne ili nekoliko elija i koje su vezane za podlogu rastu tako da formiraju koloniju nazivaju se primarnim kolonijama. Dvije osnovne metode dobijanja primarnih elijskih kultura su: Kulture eksplantata mali komadii tkiva se uronjeni u medijum veu za dno plastine ili staklene posude, a zatim se kroz nekoliko dana pojedinane elije izdvajaju iz tkivnih eksplantata i veu za podlogu posude ili ostaju u mediju (zavisno od tipa elija), gdje poinju da se dijele i rastu.

Primarne elijske kulture

Enzimatska disocijacija ovo je raireniji i bri metod koji podrazumijeva disocijaciju tkiva na pojedinane elije proteolitikim enzimima kolagenazom, dispazom ili tripsinom. Ovim se dobija suspenzija pojedinanih elija koje se zatim stavljaju u posude sa kultivacijskim medijem u inkubator gdje se dijele i rastu.

Uzimanje uzorka

Digestija tkiva sa proteolotikim enzimima

Kultiviranje elija

Subkultiviranje (pasairanje)
Kada elije u primarnoj kulturi ispune sav raspoloivi prostor (dno posude ili medij) potrebno je premjestiti elije u nove posude s svjeim medijem. Ovaj postupak oznaen je terminom pasairanje. Odvajanje kultiviranih elija od dna posude postie se kratkotrajnim izlaganjem djelovanju tripsina ili veoma njenim struganjem specijalnim spatulama.

Subkultiviranje (pasairanje)
Ostatak elija u suspenziji moe se krioprezervirati uz pomo dimetilsulfoksida ili glicerola na -130C Kasnije po potrebi odlediti i ponovno kultivirati. Dimetilsulfoksid i glicerol pomau odravanje elija vijabilnim tokom procesa zamrzavanja i odmrzavanja.

Sistemi elijskih kultura

Dva su osnovna sistema elijskih kultura. Razlika izmeu ovih sistema zasnovana je na sposobnosti elija da se veu za podlogu staklene ili plastine posude. Sistemi jednoslojnih elijskih kultura: u ovim sistemima kultiviraju se elije koje imaju sposobnost vezanja za podlogu, gdje rastu u jednom sloju. Jednoslojne kulture se uglavnom odravaju u T-flaskovima, Petrijevim posudicama, multiwell-plate posudama ili tubicama. Na ovaj nain kultiviraju se fibroblasti, epitelne elije, amniociti, veina tumorskih elija itd.

Sistemi elijskih kultura

Sistemi elijskih kultura u suspenziji : obino se kultiviraju uz mukanje u Erlenmajer posudama. U nekim sluajevima se kultiviraju bez mukanja u tubicama i T-flaskovima. U sistemima elijskih kultura u suspenziji kultiviraju se limfociti, kotana sr, kao i neki tipovi tumora (npr. neuroblastomi i limfomi). Neki tipovi uzoraka kao to su elije limfnih vorova i odreenih tumora mogu biti kultivirani na oba navedena naina.

Sistemi elijskih kultura

Sistemi elijskih kultura dalje mogu biti otvoreni i zatvoreni Ovo zavisi od toga da li je ep posude zavrnut potpuno ili djelimino U otvorenim sistemima elijske kulture razmjenjuju gasove sa okolnom atmosferom, dok zatvoreni sistemi nemaju tu mogunost. Zatvoreni sistemi imaju manju vjerovatnou kontaminacije mikroorganizmima, ali zato gomilaju produkte elijskog metabolizma koji mogu biti toksini.

Tipovi elija u kulturi i elijske linije

Tipovi elija u kulturi

Kultivirane elije se na osnovu njihove morfologije, oblika i izgleda mogu podijeliti u tri osnovna tipa. 1. Epitel sline elije (E-tip): rastu vezane za podlogu, izgledaju pljosnato i poligonalnog su oblika.

Tipovi elija u kulturi

2. Limfoblast sline elije (L-tip): u kulturi nisu vezane za podlogu, ostaju u suspenziji ili semisuspenziji taloei se na dnu posude i sferinog su oblika.

Tipovi elija u kulturi

3. Fibroblast sline elije (F-tip): rastu vezane za podlogu, izgledaju izdueno i bipolarne su.

Amniociti (AF-tip) predstavljaju zaseban tip elija. To su elije fetalnog porijekla koje se kultiviraju iz amnionske tenosti, pleomorfne su i multinukleirane.

elijske linije
elijske linije nastaju od primarnih elijskih kultura nakon njihovog prvog subkultiviranja. elijske linije su omoguile veliki napredak u istraivanju i kontroli elijskog ciklusa, proizvodnji vakcina i rekombinantnih proteina. Neke elijske linije vremenom poinju pokazivati znakove starenja i prestaju da se dijele, pa se nazivaju ogranienim elijskim linijama. Termin elijska linija ukazuje da kultura vodi porijeklo od brojnih elija prisutnih u primarnoj kulturi.

elijske linije
Ukoliko je poznato da elijska linija vodi porijeklo od jedne jedine elije tada se naziva klonalnom elijskom linijom. Sojevi elijskih linija predstavljaju linije elija koje imaju neke specifine ili unikatne osobine. Veina elijskih linija se moe dijeliti neogranieno i nazivaju se trajnim ili besmrtnim elijskim linijama. Da bi ograniena elijska linija postala trajna ona mora proi proces imortalizacije ili transformacije, to se in vitro moe desiti spontano ili pod dejstvom odreenih lijekova, zraenja ili virusa.

elijske linije
Pionirske elijske linije su izvedene iz normalnih adultnih animalnih tkiva. Jedna od najpoznatijih trajnih animalnih elijskih linija, koja se danas iroko koristi je izvedena iz elija ovarija adultnog kineskog hrka 1959. (CHO-eng. Chinese hamster ovary). Veina danas poznatih elijskih linija izvedene su iz tumora ili in vitro transformiranih elija ima i elijskih linija koje se takoer iroko koriste a izvedene su iz normalnih humanih tkiva, kao npr. linija normalnih fibroblasta WI38, koje imaju ogranien ivotni vijek in vitro.

elijske linije primjer: elijska linija HeLa

HeLa najpoznatija tumorska elijska linija 1952. Georg i Margaret Gey su tragali za humanim elijama koje e preivjeti izvan tijela neogranieno, i dobili su elijsku liniju koja se dijelila kao ni jedna do tada, a uspostavili su je iz elija cervikalnog kancera Henriette Lacks. Henrietta Lacks je umrla u 32. godini ivota, a HeLa elijska linija postala je poznata irom svijeta . Danas se koristi kao model u mnogim laboratorijama prilikom istraivanja elijskih efekata lijekova i zraenja, a zasluna je i za razvoj vakcine Polio.

elijske linije primjer: elijska linija HeLa

Iako zbog dugotrajnog kultiviranja postoji mnogo sojeva HeLa elija svi vode porijeklo od istih tumorskih elija gospoe Lacks.

elijske linije primjer: elijska linija HeLa

Definitivnu citogenetiku karakterizaciju HeLa elija kao hipertriploida (3n+) utvrdili su Macville et al. 1999. Horizontalni transfer gena sa humanog papilloma virusa 18 (HPV18) na cervikalne elije od kojih je nastala HeLa linija uzrokovao je njihovu transformaciju uz modifikaciju broja hromosoma. HeLa elije u svom genomu imaju 20 klonalnih abnormalnih hromosoma (poznatih kao HeLa hromosomski potpis ili HeLa markeri) i multiple kopije HPV18 integrirane na specifinim mjestima u genomu.

Primjena kulture elija

Primjena kulture elija

Kultura elija se primjenjuje u nekoliko oblasti:

Istraivanja kancera Genetiko savjetovanje Genetiko inenjerstvo Kulture elija kao fabrike Genska terapija Testiranje toksinosti

Primjena kulture elija istraivanje kancera

U citogenetikim istraivanjima kancera neophodno je prethodno in vitro uzgojiti elije istraivanog kancera kako bi se mogle dobiti metafazne elije sa hromosomima pogodnim za analizu. Brojne hromosomske aberacije, kako strukturne tako i numerike detektovane su u razliitim tipovima kancera. Hromosomska nestabilnost je karakteristina za sve kancere, a neke tipove kancera karakteriu posebni kariotipovi (npr. Ph hromosom hronina mijeloina leukemija). Takoer, kulture tumorskih elija mogu se koristiti kao test sistemi za in vitro testiranja potencijalnih antitumorskih supstanci i antitumorskih lijekova.

Primjena kulture elija genetiko savjetovalite

Dobivanje kariograma iz kultiviranih amniocita (fetalnih elija koje se nalaze u plodovoj vodi) omoguava ranu i egzaktnu detekciju irokog spektra genetikih poremeaja fetusa.

Primjena kulture elija genetiko inenjerstvo

Mogunost transfera genetikog materijala na elije u kulturi omoguila je molekularnim biolozima istraivanja gena od interesa i proteina koje ovi geni kodiraju. Ova tehnika je omoguila dobijanje velikih koliina ovih novih proteina za dalja istraivanja.

Primjena kulture elija kultura elija kao fabrike

Kulture elija mogu se koristiti u proizvodnji mnogih vanih produkata, ali tri su oblasti posebno interesantne: Masovna proizvodnja virusa: uzgojem virusa in vitro i njihovih produkata u kulturi elija omogueno je dobijanje vakcina za: pljuskavice, veliki kaalj, bjesnilo, hepatitis B,.... Masovna proizvodnja proteina: genetiki transformirane elije u kulturi mogu proizvoditi medicinski ili komercijalno znaajne proteine (npr. insulin). Proizvodnja tkiva ili itavih organa: vjetaki uzgojena tkiva koe danas se masovno koriste kod pacijenata sa tekim opekotinama, a vjetaka proizvodnja organa kao to su pankreas, jetra i bubrezi je u fazi istraivanja.

Primjena kulture elija genska terapija

elije uzete iz organizma pacijenta kojem nedostaje funkcionalni gen mogu biti uzgojene u kulturi, a zatim tehnikama genetike transformacije oteeni gen moe biti zamjenjen funkcionalnim. Takve elije mogu se uzgojiti u kulturi u velikom broju a zatim vratiti u organizam pacijenta.

Primjena kulture elija testiranje toksinosti

In vitro testovi na kultiviranim elijama se esto koriste sami ili uz in vivo testove na ivotinjama prilikom istraivanja bioaktivnosti novih lijekova, kozmetike, hemikalija, ili biolokih materija. Pozitivni ili negativni efekti koje ovi agensi mogu ispoljiti na kulturama elija obino se dijele na: - efekte na nivou elija citotoksinost i - efekte na nivou genetikog materijala genotoksinost.

Primjena kulture elija testiranje toksinosti

U istraivanjima ovoga tipa veoma su znaajne kulture elija izvedene iz jetre ili bubrega, ali ipak prilikom testiranja toksinosti (naroito genotoksinosti) najee koriteni model su humani limfociti periferne krvi. Najee analize koje se koriste za testiranje toksinosti su: analiza hromosomskih aberacija, citokineza-blok mikronukleus esej, test izmjene sestrinskih hromatida, itd. Meutim, nita manje nisu znaajni ni Allium test, Tradescantia test, kao i mnogi drugi testovi za dokazivanje genotoksinosti na biljnom materijalu.

Primjena kulture elija testiranje toksinosti

Bez obzira na irok izbor testova mutagenosti, niti jedan od njih pojedinano ne moe obuhvatiti sve nivoe i specifine aspekte moguih efekata odreenih mutagenih supstanci, odnosno genotoksikanata. Ipak, ovi testovi, primjenjeni u razliitim kombinacijama, u manjoj ili veoj mjeri omoguavaju praenje i detekciju mutagenosti na razliitim nivoima njihovog ispoljavanja.

Kultura elija u citogenetici

Standardne citogenetike metode podrazumijevaju analizu metafaznih hromosoma, te se preparati mogu praviti samo sa elijama koje su u mitozi. Kultivacija elija predstavlja integralan i nezamjenjiv dio rada svake citogenetike laboratorije i prvi korak u svim citogenetikim analizama. Zavisno od vrste citogenetike analize i tipa analiziranih elija kulture se mogu odravati krai ili dui vremenski period. Kratkotrajne elijske kulture se obino odravaju 24-96 sati i odnose se na perifernu krv, kotanu sr, amnionsku tenost i horionske rese.

Dugotrajne elijske kulture mogu se odravati od nekoliko sedmica do nekoliko mjeseci, a najee koritene i najbolje poznate su kulture fibroblasta. elije brojnih tkiva sa zadovoljavajuom proliferativnom sposobnou, kao to su koa, korijen kose, kotana sr i druge, mogu se koristiti za hromosomska ispitivanja. Najee se koristi in vitro kultura limfocita periferne krvi. Od otkria mitogenih svojstava fitohemaglutinina (PHA), limfociti su zbog jednostavnosti njihovog uzimanja, najbolji materijal za dobijanje hromosomskih preparata.

Mnogim od spomenutih tkiva i elija komplikovaniji je pristup, a uz to esto imaju i visok procenat elija asinhronog ciklusa. Jedna od prednosti kultiviranja humanih limfocita periferne krvi, u citogenetikoj dijagnostici, sadrana je u injenici da je to jedno od rijetkih tkiva ije se elije mogu kultivirati do 48 sati post-mortem.

Humani limfociti periferne krvi se kod zdravih odraslih osoba normalno ne dijele (miruju u G0 stadiju interfaze), te se u kulturi stimuliraju na diobu dodavanjem mitogenih stimulatora kao to je fitohemaglutinin (mukoproteid izolovan iz crvenog graha). Stimuliranjem limfocita na diobu, oni dobivaju sposobnost intenzivne proliferacije i prolaze kroz sve faze elijskog ciklusa: DNK presintetsku (G1), DNK sintetsku (S), DNK postsintetsku (G2), te mitotsku (M) fazu. Dvadesetetiri sata nakon dodatka mitogena veina stanica je u S fazi.

Tokom inicijalna 24 sata limfociti proizvode interleukin2 (IL2), faktor rasta limfocita, koji omoguava odvijanje mitoze u neprestanim lananim reakcijama. U naredna 24 sata poinje odvijanje mitoze. Iako postoje individualne varijacije u vremenu zapoinjanja mitoze, 48 sati po dodatku mitogenog stimulatora, u in vitro uslovima, najvei broj limfocita je u prvoj metafazi, a broj aktiviranih elija zavisi od vie faktora: individualnih razlika izmeu ispitanika, uslova kultiviranja itd.

Kultivacija humanih limfocita periferne krvi

Kultivacija periferne krvi danas se izvodi standardnim postupkom kojeg je utemeljio Moorhead (1960) Za kultiviranje se najee koristiti kompletni medij PBMAXTM Karyotyping Medium (Gibco). Bitno je napomenuti da je ovaj medij specijalno dizajniran za kultivaciju limfocita periferne krvi. Takoer se za kultiviranje limfocita esto spravlja podloga na bazi RPMI 1640 medija (Gibco) uz dodatak L-glutamina, 20% fetalnog goveeg seruma, fitohemaglutinina i otopine penicilina i streptomicina.

Kultivacija humanih limfocita periferne krvi

U 5 ml medija zasijava se 400 ml pune krvi i kultivira u sterilnim, plastinim, koso postavljenim tubicama zapremine 15 ml sa konusnim dnom (Gibco) u inkubatoru na 37C. Limfociti se kultiviraju u zatvorenim tubicama koje se postavljaju u kosi poloaj kako bi se maksimalno poveala dodirna povrina istaloenih elija sa medijem u kojem se kultiviraju Zavisno od potrebe limfociti se mogu kultivirati 48, 72 ili maksimalno 96 sati.

Kultivacija humanih limfocita periferne krvi

Prvi korak u veini procedura dobivanja elija za standardnu citogenetiku analizu je blokiranje diobe u metafazi, to se postie dodavanjem kolcemida ili kolhicina u kulture 30 do 180 minuta prije fiksacije elija. Efekat kolcemida (sintetiki analog kolhicina) koji se u te svrhe najee koristi je spreavanje formiranja diobenog vretena. Kolcemid takoer uzrokuje kondenzaciju hromosoma, koja zavisi od duine ekspozicije i koncentracije kolcemida.

Kultivacija humanih limfocita periferne krvi

Neke elije su osjetljivije na koncentraciju kolcemida od drugih, ali openito, poveana koncentracija kolcemida poveava mitotiki indeks, pojaava konture hromosoma, nazubljuje ivice hromatida i poboljava rasprivanje hromosoma. Iako se kolcemid iroko upotrebljava, neke laboratorije i dalje preferiraju kolhicin (derivat biljke Colchicum autumnale), koji je toksiniji i stoga moe uticati na brzinu elijskog ciklusa, te rezultirati duim hromosomima, koji su pogodniji za citogenetiku dijagnostiku.

Izvoenje kulture limfocita i pravljenje preparata za citogenetiku analizu

Po isteku odreenog vremena kultivacije limfocita, tubice sa elijskim kulturama se promukaju, a zatim centrifugiraju 10 minuta na 1100 obrtaja/min. Supernatant se paljivo odstrani Pasterovom pipetom. Talog se izmjea u ostatku tene faze. U izmjeani sadraj se lagano dodaje 6 ml hipotonine otopine 0,56% (0,075M) KCl-a uvanog na sobnoj temperaturi ili na 37C.

U hipotoninoj otopini se poveava volumen elija usljed ega se hromosomi bolje rasporede. Zagrijavanje hipotonine otopine na 37C moe poveati efikasnost, ubrzavajui transport vode kroz elijsku membranu i smekavajui citoplazmatsku membranu, to joj poveava sposobnost rastezanja. Vrsta soli koritena u hipotoniku moe uticati na irinu a ponekad i duinu hromatida.

Nakon inkubacije u hipotoninoj otopini u trajanju od 25 minuta uzorci se centrifugiraju 10 minuta na 1100 obrtaja/min. Supernatant se ponovno odstrani, a izmjeanom talogu se dodaje fiksativ (apsolutni etanol i glacijalna siretna kiselina u omjeru 3:1) ohlaen na 4C. Fiksacija elija ponavlja se 3 puta, dok uzorci ne postanu prozirni. Nakon treeg fiksiranja uzorci se centrifugiraju i supernatant maksimalno odstrani, a talog ponovo suspendira u 0,5 ml svjeeg ohlaenog fiksativa.

Tokom fiksacije viak vode se uklanja iz elija, a elije gube vijabilnost i prezerviraju se. Hladan fiksativ poboljava vidljivost kontura hromosoma, te neki protokoli sugeriraju da prva fiksacija i/ili zadnja fiksacija traje 124 sata u friideru ili zamrzivau. Preparati se prave tako to se suspenzija limfocita u fiksativu Pasterovom pipetom nanosi na oprana i u friideru ohlaena predmetna stakla. Preparati se sue na sobnoj temperaturi najmanje 24 sata. Osueni preparati su spremni za bojenje, koje prethodi mikroskopskoj analizi.

Kultivacija amniocita

Amniociti su elije amnionske tenosti fetalnog porijekla koje najee vode porijeklo od tkiva koe i urinarnog trakta fetusa. Uzorci amnionske tenosti za citogenetiku analizu se uzimaju procedurom koja se naziva amniocenteza. Preporuljivo je prikupljanje uzorka u dvije sterilne posudice od 15 do 20 ml, zavisno od gestacijskog perioda. S obzirom na osjetljivost amniocita preferira se to je mogue bri transport uzorka amnionske tenosti u citogenetiki laboratorij. Amniociti se veoma uspjeno kultiviraju u AmnioMax ili Chang D mediju, u T-flaskovima zapremine 25 ml, formirajui jednoslojne kolonije vezane za dno posude

Pravila rada sa kulturama elija

1. Uvijek nositi mantil i rukavice 2. Prije rada sa kulturama elija, sredstvom za dezinfekciju potrebno je obrisati radne povrine laminara u sterilnim uslovima i sue koje se u njega unosi. 3. Paljivo obiljeiti hranljive podloge za odreenu kulturu elija. Navesti naziv hranljive podloge i datum njene pripreme. Bilo bi najbolje da se za svaku elijsku liniju koristi zasebna boca sa hranljivom podlogom. 4. Ne raditi istovremeno sa vie elijskih linija kako bi se izbjegla mogunost njihove zamjene.

5. Svaki dan posmatrati elije (paziti na zagaenje) 6. Provjeravati redovno kulture elija na prisutnost mikoplazmi. 7. Osigurati redovno ienje i dezinfekciju cijelog laboratorija, ukljuujui inkubator, vodeno kupatilo, kao i redovno mjenjanje filtera u laminarima. 8. Redovno mjenjati UV svjetiljke. 9. Dnevno prazniti posudu za teni otpad u laminaru. 10. S oprezom koristiti elijske linije dobivene iz neprovjerenih izvora.

11. Prilikom svakog odmrzavanja elija treba na ampulama napisati broj pasaa elija kako bi im se mogla odrediti starost. 12. Alternativno se elije mogu uvati i na 80 oC (ne due od nekoliko mjeseci). 13. Izbjegavati uzgoj elija do visoke popunjenosti. 14. Ne koristiti tekue hranljive podloge nakon isteka trajanja jer je veina hemikalija u hranljivim podlogama nestabilno.

Uslovi koje treba ispuniti prije uspostavljanja primarne kulture elija

1. Prije poetka rada sa ljudskim ili ivotinjskim tkivima, treba biti siguran da su potovana medicinska etika pravila i vaei zakoni o eksperimentima na ivotinjama. 2. Masno i nekrotino tkivo treba ukloniti prilikom mehanikog usitnjavanja tkiva. 3. Tkivo treba mehaniki usitniti uz minimalno oteenje elija.

4. Enzime, upotrebljene za usitnjavanje, treba ukloniti centrifugiranjem. Enzimi koje se najee koriste su: tripsin, kolagenaza, elastaza, hijaluronidaza, DNAza, pronaza i dispaza, a koriste se pojedinano ili u kombinacijama. 5. Broj elija koriten za pripremu primarne kulture elija treba biti mnogo vei nego onaj koji se inae koristi za nasaivanje u kulturama elija. Procenat elija koje preive postupak pripreme primarne kulture moe biti prilino mali.

6. Kombinacija bogate podloge za uzgoj elija i serum goveeg fetusa esto daju dobre rezultate u uzgoju primarnih kultura. Naravno, odreene vrste elija zahtjevaju specifine hranljive podloge za uzgoj . 7. Embrionalna tkiva lake je usitniti, daju vei prinos elija, a elije se umnaaju bre nego primarne kulture tkiva odraslih jedinki.

Uspostavljanje primarnih kultura fibroblasta i keratinocita iz uzoraka ljudske koe

Uvod
Zbog jednostavnog uzgoja i brzog rasta, fibroblasti su esto koritena primarna kultura elija. Koriste se za prouavanje funkcije i metabolizma proteina izvanelijskog matriksa, modulacije imunolokog odgovora i upalnog procesa, te za prouavanje niza drugih temeljnih procesa elije. Za uspostavljanje kulture ljudskih fibroblasta najee se koriste uzorci zdrave koe dobivene prilikom obrezivanja novoroenadi, uzorci uzeti nakon biopsije, plastinih operacija, i drugih tipova hirurkih zahvata.

Uvod
Primarne kulture keratinocita koriste se u medicini za pripremu autolognih konih transplantata u tretiranju dubokih opeklina. Uz ostalo, ljudski keratinociti koriste se za prouavanje biologije elija, za ispitivanje uinka raznih alergena, antibiotika i topikih terapeutskih agenasa Takoer se koriste u naunim istraivanjima procesa diferencijacije i proliferacije, te ekspresiji antigena kod tumora koe, imunolokom odgovoru koe i sl.

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture fibroblasta

Uzorak ljudske koe DMEM hranljiva podloga (Dulbeccos modified Eagles medium) sa visokom koncentracijom glukoze (4500 mg/L) i Ca+2 (1.2 mM) L-glutamin 200 mM PBS (phosphate buffered saline) bez Mg+2 i Ca+2, pH 7,3 0,25% tripsin / 1mM EDTA otopina Otopina antibiotika i antimikotika (ABAM antibiotic antimycotic) (penicilin, streptomicin i amfotericin B otopljeni u 1 ml PBS-a)

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture fibroblasta

5% ABAM / PBS otopina Serum goveeg fetusa (fetal bovine serum /FBS/) inaktiviran zagrijavanjem u vodenom kupatilu pri 56oC u trajanju od pola sata. Dispaza, matina otopina 3.4 U/ml HAM F-12 hranljiva podloga Adenin 2,43 mg/ml Hidrokortizon 0,2 mg/ml Trijodtironin 1,36 g/ml Inzulin 5 mg/ml

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture fibroblasta

Kolera toksin 0,1 M EGF epidermalni faktor rasta (10 g/ml) ddH2O (pH 2,0) FM hranljiva podloga:

250 ml hranljive podloge DMEM 25 ml FBS 2,5 ml L glutamin 2,5 ml ABAM Nakon dodavanja svih reagenasa sterilizirati hranljivu podlogu kroz filtar veliine pora 0,22 m.

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture fibroblasta

GM hranljiva podloga (pH 7,4)

150 ml hranljive podloge DMEM 75 ml HAM F-12 podloge 25 ml FBS 5 ml L glutamin 2,5 ml ABAM 2,5 ml adenin 0,5 ml hidrokortizon 0,250 ml trijodtironin 0,250 ml inzulin 0,250 ml kolera toksin 0,250 ml EGF Nakon dodavanja svih reagenasa, podesiti pH sa ddH2O, pH 2, (podloga postaje tamno crvena), te sterilno filtrirati.

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture fibroblasta

Petrijevke za uzgoj kulture elija promjera 10 cm Epruvete za centrifugiranje od 15 ml i 50 ml. Nekoliko otrih makazica ili skalpela Nekoliko pinceta sa tupim i zakrivljenim vrhom Staklene ae od 50 ml.

Aparati potrebni za uspostavljanje kulture fibroblasta

Inkubator za uzgoj kultura elija pri 37oC s 5% CO2 Laminar Magnetna mjealica Centrifuga Spremnik sa tekuim nitrogenom Fazno kontrastni mikroskop Vodeno kupatilo Analitika vaga preciznosti do 0,0001 g

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

1. Uzorak cjelovite ljudske koe preuzet nakon operacije i transportiran u GM hranljivoj podlozi pri 4 oC najbolje je odmah obraditi.

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

Ovisno o veliini uzoraka koe, pripremiti 5 staklenih aica od 50 ml sa 10 ml otopine 5% ABAM/PBS bez Mg+2 i Ca+2. Uzorak koe prebaciti u aicu, priekati 10 minuta, zatim prebaciti u drugu itd (sveukupno 40 tak minuta ispiranja. Izmeu svakog ispiranja odstraniti masno tkivo (ako ga ima) koristei makazice i pincetu.

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

2. Isprani uzorak pincetom prebaciti u petrijevku s predhodno pripremljenom matinom otopinom dispaze. Paziti da uzorak koe u posudi bude okrenut tako da je epidermis dolje, a dermis gore.

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

Petrijevku s uzorkom koe u dispazi paljivo obloiti aluminijskom folijom koja je kratko drana nad plamenikom te uzorak prebaciti u hladnjak pri 4 oC preko noi.

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

3. Sutradan, premjestiti petrijevku s uzorkom koe u laminar. U petrijevki paljivo odvojiti epidermis od dermisa koristei pincete (prekonono djelovanje dispaze omoguiti e lako odvajanje slojeva koe).

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

4. Pripremiti novu petrijevku s 4 ml PBS-a. U nju treba prebaciti dermis da bi se uzorak isprao od dispaze. U posudi nasjeckati dermis na to manje komadie (2-3 mm veliine) koristei otre makazice ili skalpel i pincetu. Komadie ravnomjerno rasporediti na dno nove, suhe petrijevke.

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

5. Petrijevku sa nasjeckanim tkivom (bez hranljive podloge) staviti 30 minuta u inkubator pri 37oC. 6. Nakon 30 minuta petrijevku sa tkivom prebaciti u laminar te vrlo paljivo dodavati 5 ml FM hranljive podloge. Petrijevku vratiti u inkubator i ostaviti preko noi.

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

7. Sutradan, u petrijevku sa komadiima dermisa dodati jo 5 ml svjee FM hranljive podloge. Hranljivu podlogu mjenjati svaka 2 dana. Nakon 7 dana, pod mikroskopom bi se trebao bi se trebao zamjetiti vidljiv izrast fibroblasta.

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

8. Kada fibroblasti narastu dovoljno gusto, obino nakon 2 3 sedmice, tripsinizirati elije.

Postupak uspostavljanja kulture fibroblasta

9. Nakon odvajanja elija od hranljive podloge, djelovanje tripsina zaustaviti dodatkom jednake koliine FM hranljive podloge. Suspenziju elija centrifugirati pri 800 x g, 4 minute. Ukloniti supernatant, a talog elija resuspendirati u FM hranljivoj podlozi. elije rasaditi u gustoi od 2,5 x 105 elija po 10 ml hranljive podloge (pasaa broj 1). Hranljivu podlogu mjenjati svaka 2 3 dana, elije dalje odravati u kulturi, a suviak svake pasae smrznuti kada popunjenost povrine posude elijama dostigne 60 70 %.

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture keratinocita

Uzorak ljudske koe 3T3 miji fibroblasti pripremljeni kao elije hranilice. L-glutamin 200 mM PBS (phosphate buffered saline) bez Mg+2 i Ca+2, pH 7,3 0,25% tripsin / 1mM EDTA otopina Otopina antibiotika i antimikotika (ABAM antibiotic antimycotic) (penicilin, streptomicin i amfotericin B otopljeni u 1 ml PBS-a)

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture keratinocita

5% ABAM / PBS otopina Serum goveeg fetusa (fetal bovine serum /FBS/) inaktiviran zagrijavanjem u vodenom kupatilu pri 56oC u trajanju od pola sata. SFM bazalna definisana hranljiva podloga za keranocite bez seruma SFM dodatak za rast keranocita: 0,2% ekstrakt hipofize teleta 0,2 ng/ml epidermalni faktor rasta 0,18 g/ml hidrokortizon 5 g/ml inzulin 5 g/ml transferin 0,1% FAF-BSA/PBS otopina Dispaza, matina otopina 0,77 U/ml

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture keratinocita

HAM

F-12 hranjljiva podloga Adenin 2,43 mg/ml Hidrokortizon 0,2 mg/ml Trijodtironin 1,36 g/ml Inzulin 5 mg/ml otopina 10 g/ml epidermalnog faktora rasta u 0,1% FAF-BSA/PBS otopini 1M NaOH

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture keratinocita toksin 0,1 M Tripansko plavo za bojenje elija ddH2O (pH 2,0) SFM kompletna hranljiva podloga
Kolera

- 500 ml SFM bazalne definirane hranljive podloge - 1 ml SFM dodatka za rast keranocita - 5 ml ABAM otopine

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture keratinocita

GM hranljiva podloga (pH 7,4)

150 ml hranljive podloge DMEM 75 ml HAM F-12 podloge 25 ml FBS 5 ml L glutamin 2,5 ml ABAM 2,5 ml adenin 0,5 ml hidrokortizon 0,250 ml trijodtironin 0,250 ml inzulin 0,250 ml kolera toksin 0,250 ml EGF Nakon dodavanja svih reagenasa, podesiti pH sa ddH2O, pH 2, (podloga postaje tamno crvena), te sterilno filtrirati.

Materijali potrebni za uspostavljanje kulture keratinocita

Petrijevke za uzgoj kulture elija promjera 10 cm Epruvete za centrifugiranje od 15 i 50 ml Staklene ae od 50 ml Nekoliko otrih makazica ili skalpela Nekoliko pinceta sa zakrivljenim i tupim vrhom Sito za elije pricaljka

Aparati potrebni za uspostavljanje kulture keratinocita

Inkubator za uzgoj kultura elija pri 37oC s 5% CO2 Laminar Magnetna mjealica Centrifuga Spremnik sa tekuim nitrogenom Fazno kontrastni mikroskop Vodeno kupatilo Analitika vaga preciznosti do 0,0001 g Friider +4oC Hemocitometar

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

1. Uzorak cjelovite ljudske koe preuzet nakon operacije i transportiran u GM hranljivoj podlozi pri 4 oC najbolje je odmah obraditi.

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

Ovisno o veliini uzoraka koe, pripremiti 5 staklenih aica od 50 ml sa 10 ml otopine 5% ABAM/PBS bez Mg+2 i Ca+2. Uzorak koe prebaciti u aicu, priekati 10 minuta, zatim prebaciti u drugu itd (sveukupno 40 tak minuta ispiranja. Izmeu svakog ispiranja odstraniti masno tkivo (ako ga ima) koristei makazice i pincetu.

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

2. Isprani uzorak pincetom prebaciti u petrijevku s predhodno pripremljenom matinom otopinom dispaze. Paziti da uzorak koe u posudi bude okrenut tako da je epidermis dolje, a dermis gore.

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

Petrijevku s uzorkom koe u dispazi paljivo obloiti aluminijskom folijom koja je kratko drana nad plamenikom te uzorak prebaciti u hladnjak pri 4 oC preko noi.

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

3. Sutradan, premjestiti petrijevku s uzorkom koe u laminar. U petrijevki paljivo odvojiti epidermis od dermisa koristei pincete (prekonono djelovanje dispaze omoguiti e lako odvajanje slojeva koe).

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

4. U staklenu au od 50 ml dodati 15 ml 0,25% tripsin / 1mM EDTA. Ubaciti magnet. Koristei makaze i pincetu u staklenoj ai s tripsinom nasjeckati epidermis na to je mogue manje komadie (3 4 mm). au pokriti aluminijskom folijom zagrijanom nad plamenikom 5. Prebaciti au sa uzorkom na magnetnu mjealicu u predhodno zagrijan termostat pri 37 oC i ostaviti 40 minuta uz sporo okretanje.

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

6. Nakon 40 minuta prebaciti au u laminar i zaustaviti djelovanje tripsina dodavanjem 15 ml GM hranljive podloge. 7. Sakupiti suspenziju elija u 50 ml epruvetu za centrifugiranje i centrifugirati pri 800 x g, 4 minute.

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

8. Ukloniti paljivo supernatant (masnoe), koristei pipetu, od taloga (elije), kako se ne bi povukle i elije koje su istaloene na dnu epruvete. 9. Talog elija resuspendirati u 8 ml GM hranljive podloge i promjeati pipetiranjem. 10. Propustiti itav uzorak kroz sito za elije kako bi se dobila jednolina suspenzija elija. Suspenziju elija sakupiti u epruvetu te ponovo centrifugirati pri 800 x g, 4 minute.

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

11. Ukloniti supernatant i talog resuspendirati u 2 ml GM hranljive podloge. Izbrojiti elije koristei tripansko plavo i hemocitometar

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

12. Ovisno o koliini dobivenih keratinocita, elije rasporediti na pripremljene elije hranilice tako da se u svaku petrijevku u 10 ml GM hranljive podloge, doda otprilike 5 x 106 izdvojenih keratinocita. Petrijevke lagano protresti nekoliko puta kako bi se elije ravnomjerno rasporedile i prihvatile za dno posude. Petrijevke sa nasaenjim keranocitima ostaviti u inkubatoru s 5 % CO2 pri 37 oC tijekom 48 sati. U meuvremenu ne dirati elije.

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

13. Prvi poeci proliferacije keratinocita trebali bi se primjetiti trei dan nakon nasaivanja elija. Zamjeniti GM hranljivu podlogu sa KGM kompletnom hranjljivom podlogom. Uzgajati elije u KGM hranljivoj podlozi uz mjenjanje podloge svaka dva dana.

Postupak uspostavljanja kulture keratinocita

14. Kada primarna kultura keratinocita postigne popunjenost od 60 %, obino nakon 7 10 dana, elije je potrebno tripsinizirati koritenjem 5 ml otopine 0,25 % tripsin / 1mM EDTA (pasaa broj 1). 15. Kada se elije odvoje od podloge, djelovanje tripsina treba zaustaviti jednakom koliinom GM hranljive podloge, a zatim suspenziju elija centrifugirati pri 800 x g, 4 minute. Ukloniti supernatant, a talog resuspendirati u KGM hranljivoj podlozi i zasaditi u petrijevke promjera 10 cm. Mjenjati hranljivu podlogu svaka 2 dana, , a suviak svake pasae smrznuti kada popunjenost povrine posude elijama dostigne 60 70 %.

Materijali potrebni za pripremu elija hranilica

elije hranilice (feeder layer) se pripremaju prema metodi Rheinwald i Green, 1975. To su miji fibroblasti (poznatiji pod nazivom 3T3 elije), ozraeni smrtonosnom dozom gama zraka. Ovde emo koristiti mitomicin C umjesto gama zraka.

Materijali potrebni za pripremu elija hranilica

1. 3T3 elije 2. PBS pufer bez Mg+2 i Ca+2 (pH 7,3) 3. 0,25% tripsin / 1mM EDTA otopina 4. Mitomicin C 1,5 mM 5. FM hranljiva podloga 6. GM hranljiva podloga 7. Petrijevke za uzgoj kulture elija promjera 10 cm 8. Epruvete za centrifugiranje od 15 i 50 ml

Priprema elija hranilica

1. 3T3 elije zasaditi u petrijevku sa FM hranljivom podlogom i uzgajati u inkubtoru. Hranljivu podlogu mjenjati svaka 3 dana

Priprema elija hranilica

2. Kada elije popune oko 60% povrine posude, ukloniti FM hranljivu podlogu sa elija i dodati 9,8 ml svjee FM hranljive podloge. Dodati 200 l mitomicina C i sadraj petrijevke promjeati naginjanjem pa ostaviti u inkubatoru 1 sat.

Priprema elija hranilica

3. Ukloniti hranljivu podlogu sa mitomicinom, isprati 3T3 elije sa 10 ml PBS a tri puta i tripsinizirati ih. Suspenziju elija centrifugirati pri 800 xg, 4 miuta. Ukloniti supernatant, a talog resuspendirati u FM hranljivoj podlozi i izbrojati elije.

Priprema elija hranilica

4. 3T3 elije nasaditi u petrijevke (1 x 106 elija u petrijevku promjera 10 cm) u FM hranljivoj podlozi te ih do upotrebe za uspostavljanje primarne kulture keratinocita drati u inkubatoru.

Odreivanje elijske vijabilnosti i proliferacije

Brojenje elija na brojau elija i bojenje nigrozinom

Mjerenje elijske vijabilnosti i proliferacije neophodno je u radu sa kulturama elioja bez obzira da li se mjeri broj dioba elija nakon djelovanja odreenog stimulansa ili se mjeri uinak citotoksine tvari na preivljenje elija. Pri mjerenju citotoksinog uinka neke tvari neophodno je imati na umu na emu se odreena metoda temelji, odnosno koje elijske funkcije mjeri. Poeljno je koristiti najmanje dvije razliite metode.

Brojenje elija na brojau elija i bojenje nigrozinom

Ovaj postupak koristi se za mjerenje proliferacije elija, kao i za ispitivanje toksinog uticaja nekog spoja odreivanjem broja elija i vitalnim bojenjem elija pomou nigrozina (anilinska boja). Nigrozin ulazi samo u mrtve elije ije su membarne izgubile svoju cjelovitost i boji ih tamno plavo.

Brojenje elija na brojau elija i bojenje nigrozinom - materijali

PBS pufer pH 7,5 Otopina tripsina Tekua hranljiva podloga za uzgoj elija Otopina nigrozina

Brojenje elija na brojau elija i bojenje nigrozinom - oprema

Inkubator Laminar Svjetlosni mikroskop Hemocitometar ili automatski broja elija

Brojenje elija na brojau elija i bojenje nigrozinom - postupak

1. elije zasaditi 24 sata prije obrade u ploicu za uzgoj elija sa 24 well-a. 2. Za krivulju rasta elije brojiti svaka 24 sata, a za test toksinosti 24 sata nakon zasaivanja izloiti elije djelovanju razliitih koncentracija istaivanog agensa (etiri paralelne reakcije za svaku koncentraciju)

Brojenje elija na brojau elija i bojenje nigrozinom - postupak

3. Nakon inkubacije eljenog trajanja ili proliferacije tripsinizirati elije koje se nalaze u well ovima. 4. elije dobro resuspendirati u tripsinu te cijeli sadraj well a prebaciti u epruvetu i izbrojiti bar 2 puta. 5. Iz well-ova ostavljenih za odreivanje vijabilnosti elija izvaditi tekuu hranljivu podlogu, dodati 300 mikrolitara otopine nigrozina i ostaviti 10 min na 37oC da se elije oboje.

Brojenje elija na brojau elija i bojenje nigrozinom - postupak

6. Prije brojenja obojenih elija izvaditi otopinu nigrozina tako da ostane mala koliina tekuine i brojiti mrtve (plave) i ive elije. Izbrojiti ukupno najmanje 300 elija. Obrada podataka za test citotoksinosti: Izraunati srednju vrijednost broja ivih elija u well-ovima obraenih istom koncentracijom istraivanog agensa. Broj ivih elija = ukupan broj elija u well-u izbrojen brojaem * postotak ivih elija u well-u obojenih nigrozinom.

Brojenje elija na brojau elija i bojenje nigrozinom - postupak

Na osnovu dobivenih podataka odrediti postotak preivljenja elija za svaku koritenu koncentraciju agensa u odnosu na neobraenu kontrolu. % preivljavanja za odreenu koncentraciju agensa = srednja vrijednost broja ivih elija iz well-a obraenog tom koncentracijom / srednja vrijednost broja ivih elija iz neobraenih well ova * 100.

Bojenje elija bojom tripan plavo spektrofotometrijsko bojenje

Ovo je pouzdana kolorimetrijska metoda kojom se mjeri vijabilnost i proliferacija elija. Temelji se na injenici da mrtve elije akumuliraju boju tripan plavo, dok ive elije aktivno izbacuju boju putem membranskih pumpi pa ostaju neobojene. Klasina metodapoboljana je spektrofotometrijskim mjerenjem inteziteta bojenja tripanskim plavilom.

Bojenje elija bojom tripan plavo spektrofotometrijsko bojenje materijal

PBS pufer 0,25% otopina tripan plave boje 0,1% Triton X-100 Ploice za uzgoj kulture elija sa 96 wellova

Bojenje elija bojom tripan plavo spektrofotometrijsko bojenje oprema

Inkubator Laminar ita mikrotitarskih (spektrofotometar)

ploica

Bojenje elija bojom tripan plavo spektrofotometrijsko bojenje - procedura

1. Na elije, predhodno nasaene u plaice sa 96 well-ova, dodati 50 mikrolitara otopine tripansko plavo i inkubirati pri 37oC. 2. Nakon 15 minuta, boju iznad elija ukloniti naglim preokretanjem ploice iznad posude za skupljanje otpada, ili usisavanjem pomou vakuum pumpe, pa ploicu ocjediti pritiskajui je na upijajui papir. Paljivo isprati elije ledeno hladnim PBS-om.

Bojenje elija bojom tripan plavo spektrofotometrijsko bojenje - procedura

3. elije lizirati sa 200 mikrolitara 0,1% otopine Triton x-100 po well-u te njeno vie outa promjeati viekanalnom pipetom. Paziti da ne neastanu mjehurii. Oitati apsorbancu tripanskog plavila pomou spektrofotometra pri talasnoj duini od 590 nm. Od dobivenih vrijednosti mjerenja oduzeti vrijednost nespecifinog signala (apsorbancija well-a napunjenog samo tripanskim plavilom). Dobiveni podaci mogu se izraziti kao postotak od neobraenih, kontrolnih elija kojima se pripisuje vijabilnost 100% ili od elija obraenih visokom koncentracijom nekog agensa kojima se pripisuje vijabilnost 0%.

Bojenje elija bojom kristal ljubiasto

Ovaj kolorimetrijski test temelji se na vezanju boje kristal ljubiasto na genomsku DNK i proteine elija, odraavajui tako gustou elija u uzorku.

Bojenje elija bojom kristal ljubiasto - materijal

PBS pufer pH 7,5 Tekua hranljiva podloga za rast elija Kristal ljubiasto 0,2% 1% SDS (sodium dodecil sulfat) Ploice sa 96 well-ova

Bojenje elija bojom kristal ljubiasto - postupak

1. elije zasaditi u tekuoj hranljivoj podlozi na ploice sa 96 well-ova. Jedan well ostaviti prazan za slijepu probu. 2. Nakon odgovarajueg inkubacijskog perioda, ukloniti tekuu podlogu. 3. Isprati elije PBS-om 4. Ukloniti PBS i dodati 50 mikrolitara otopine kristal ljubiastog 5. Inkubirati 10 minuta pri sobnoj temperaturi 6. Isprati 3 puta sa po 200 mikrolitara ddH2O i osuiti na zraku.

Bojenje elija bojom kristal ljubiasto - postupak

7. Dodati 100 mikrolitara 1% otopine SDS-a i inkubirati ploicu dok se boja u potpunosti ne otopi. 8. Oitati apsorbancu na 595 nm spektrofotometrom. Od dobivene apsorbance pojedinog well-a sa elijama oduzeti apsorbancu slijepe probe kako bi se dobila konana vrijenost koja je proporcionalna broju elija u tom well-u. Izraunati relativni broj elija u odnosu na kontrolu.

MTT test
Ova kolorimetrijska metoda temelji se na mjerenju metabolike aktivnosti elija U ivim elijama dolazi do redukcije tetrazolijeve soli (MTT) u plavo obojene kristale formazana pomou elijskih dehidrogenaza. Postoje dvije metode ovog testa: A - prva metoda pogodna je za elije koje se prihvataju za podlogu (adherentne elije) B druga metoda pogodna je za elije koje se ne prihvataju za podlogu nego ive u suspenziji (neadherentne elije).

MTT test za adherentne elije materijal

PBS pufer pH 7,5 Tekua hranljiva podloga za rast elija Matina otopina MTT (12.1 mM, 3-(4,5dimetiltiazol 2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid) DMSO dimetilsulfoksid Ploice za uzgoj elija sa 96 well-ova

MTT test za adherentne elije postupak

1. elije zasaditi u tekuoj hranljivoj podlozi na ploice sa 96 well-ova. Jedan well ostaviti prazan za slijepu probu. 2. Nakon odgovarajueg inkubacijskog perioda, ukloniti tekuu podlogu. 3. Razrijediti matinu otopinu MTT-a 10 puta u tekuoj hranljivoj podlozi zagrijanoj pri 37oC i dodati 40 mikrolitara radne otopine u svaki well. 4. Inkubirati elije 3 sata pri 37oC

MTT test za adherentne elije postupak

5. U digestoru dodati 170 mikrolitara DMSO u svaki well kako bi se otopio formazan. 6. Inkubirati ploicu na sobnoj temperaturi 5 min 7. Oitati apsorbancu na 570 nm spektrofotometrom. Od dobivene apsorbance pojedinog well-a sa elijama oduzeti apsorbancu slijepe probe kako bi se dobila konana vrijenost koja je proporcionalna broju metaboliki aktivnih elija u tom well-u. Izraunati relativni broj elija u odnosu na kontrolu.

MTT test za elije u suspenziji materijal

PBS pufer pH 7,5 Tekua hranljiva podloga za rast elija Matina otopina MTT (12.1 mM, 3-(4,5dimetiltiazol 2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid) Otopina 2- propanola Ploice za uzgoj elija sa 96 well-ova

MTT test za elije u suspenziji procedura

1. elije koje rastu u suspenziji treba istaloiti centrifugiranjem (1000xg, 5 min) i resuspendirati u hranljivoj podlozi pa napraviti razblaenja u ploicama za uzgoj kuture elija sa 96 well-ova u volumenu od 100 mikrolitara po well-u. 2. Odmah ili nakon odgovarajueg inkubacijskog vremena dodati elijama po 20 mikrolitara MTT otopine po well-u i vratiti ploice u inkubator pri 37oC, 50-70 minuta 3. Dodati po 150 mikrolitara otopine 2propanola po well-u kako bi se otopio formazan. Ploice ostaviti na +4oC, 1-2 sata.

MTT test za elije u suspenziji procedura

4. Promjeati mikropipetom sadraj u well-u pa izmjeriti apsorbancu pri 595 nm i od tih vrijednosti oduzeti vrijednosti nespecifiog signala izmjerenog pri 690 nm. Od tih vrijednosti oduzeti vrijednosti slijepe probe i tako dobiti konanu vrijednost koja je proporcionalna broju metaboliki aktivnih elija u tom well-u.

Metoda praenja vijabilnosti elija mjerenjem aktivnosti laktat dehidrogenaze

Laktat dehidrogenaza (LDH) je enzim koji se nalazi u elijskoj citoplazmi, a koji prilikom oteenja elijske membrane izlazi iz elije. Mjerenjem LDH u tekuoj hranljivoj podlozi u kojoj elije rastu kvantitativno se odreuje gubitak vijabilnosti elija.

Metoda praenja vijabilnosti elija mjerenjem aktivnosti laktat dehidrogenaze - materijal

100 mM Tris HCl, pH 7,1 Nikotinamid dinukleotid (NADH) 5 mM otopina NADH 0,6 mM otopina Piruvat 100 mM otopina Piruvat 3 mM otopina Ploice za uzgoj kulture elija sa 96 wellova Tekua hranljiva podloga za uzgoj kulture elija Mikrotitarske ploice sa 96 well-ova

Metoda praenja vijabilnosti elija mjerenjem aktivnosti laktat dehidrogenaze - postupak

1. Skupiti hranljivu podlogu u kojoj rastu elije i centrifugirati je 5 min pri 1000 x g i 4oC, odvojiti supernatant i drati ga na ledu do mjerenja. 2. Prije zapoinjanja enzimske reakcije, otopine ugrijati pri sobnoj temperaturi. Pripremu uzoraka raditi u zamraenom prostoru blizu itaa mikrotitarskih ploica. U ploice staviti 50 mikrolitara piruvata i 50 mikrolitara NADH i promjeati.

Metoda praenja vijabilnosti elija mjerenjem aktivnosti laktat dehidrogenaze - postupak

3. Na to brzo dodati 50 mikrolitara supernatanta elija i izmjeriti apsorbancu u spektrofotometru pri talasnoj duini od 340 nm. Reakciju mjeriti svake minute

Metoda praenja vijabilnosti elija mjerenjem aktivnosti laktat dehidrogenaze - postupak

4. Mjeriti reakciju 5-10 minuta, odnosno dok traje linearna promjena apsorbancije. 5. Izraunati aktivnost LDH enzima koristei se:

Aktivnost = VT/6.22*d*Vs

(Areakcije/t

Anespec./t)

Neradioaktivna metoda praenja proliferacije elija pomou bromodeoksiuridina

Bromodeoksiuridin (BrdU) se umjesto timina ugrauje u DNK, a njegovo prisustvo se moe odrediti pomou specifinog antitijela. Ova metoda slui kao neradioaktivna zamjena metodi praenja sinteze DNK pomou radioaktivnog timina. Koristi se za kvantitativno mjerenje proliferacije kulture elija

BrdU

Neradioaktivna metoda praenja proliferacije elija pomou bromodeoksiuridina - materijal

Hranljiva podloga Serum goveeg fetusa - FBS PBS pufer pH 7,4 Fiksativ 100 mikromolarni BrdU Anti BrdU antitijelo obiljeeno peroksidazom 10 mg/ml tetrametilbenzidin (TMB) Stop otopina 1M H2SO4 Ploice za uzgoj kulture elija sa 96 well-ova

Neradioaktivna metoda praenja proliferacije elija pomou bromodeoksiuridina - procedura

1. elije razrijediti u hranljivoj podlozi i nasaditi u ploice za uzgoj kulture elija sa 96 well-ova 2. U well-ove sa elijama dodati spoj iji uinak elimo ispitati i FBS do konanog volumena od 200 mikrolitara 3. Ploicu sa elijama inkubirati 24 sata pri 37oC i 5% CO2 4. elijama dodati 20 mikrolitara BrdU i inkubirati 24 sata

Neradioaktivna metoda praenja proliferacije elija pomou bromodeoksiuridina - procedura

1. elije razrijediti u hranljivoj podlozi i nasaditi u ploice za uzgoj kulture elija sa 96 well-ova 2. U well-ove sa elijama dodati spoj iji uinak elimo ispitati i FBS do konanog volumena od 200 mikrolitara 3. Ploicu sa elijama inkubirati 24 sata pri 37oC i 5% CO2 4. elijama dodati 20 mikrolitara BrdU i inkubirati 24 sata

Neradioaktivna metoda praenja proliferacije elija pomou bromodeoksiuridina - procedura

5. Po isteku inkubacije elijama ukloniti hranljivu podlogu. Ukoliko se radi o elijama koje se prihvaaju za podlogu, podlogu odliti brzim zamahom ruke u posudu za otpad ili ukloniti vakuum pumpom, a ukoliko elije rastu u suspenziji, ploicu centrifugirati 10 min pri 300 xg, a zatim hranljivu podlogu ukloniti na isti nain. 6. Na elije dodati 200 mikrolitara fiksativa i inkubirati 30 minuta pri sobnoj temperaturi.

Neradioaktivna metoda praenja proliferacije elija pomou bromodeoksiuridina - procedura

7. Po isteku inkubacije elijama ukloniti fiksativ i isprati tri puta sa po 300 mikrolitara PBS-a kao to je opisano u taki 5. 8. U uzorke dodati 100 mikrolitara anti BrdU antitijela koje prepoznaje BrdU ugraen u novostvorenu genomsku DNK i inkubirati 90 minuta pri sobnoj temperaturi. 9. Ukloniti antitijelo kao u taki 5. 10. elije isprati tri puta s po 300 mikrolitara PBS-a, kao u taki 7.

Neradioaktivna metoda praenja proliferacije elija pomou bromodeoksiuridina - procedura

11. Uzorcima dodati 100 mikrolitara boje (TMB) i inkubirati 5-30 minuta 12. Kada se razvije plava boja zaustaviti reakciju dodatkom 25 mikrolitara stop otopine, pri emi se boja mjenja u utu. Protresti ploicu da se boja izjednai i priekati 5 minuta 13. Apsorbanciju mjeriti pri 450 nm. Vrijednosti apsorbancije su u direktnoj ovisnosti o sintezi DNK, a time i broju proliferirajuih elija u kulturi jer se BrdU ugrauje samo u elije u kojima se dogaa DNK sinteza.