Bioloka kontrola lekova

Bioloki testovi
prof.dr Mira Zeevi

Sterilnost
Primenjuje se na stupstance za koje
farmakopeje trae da budu sterilni
Ispitivani uzork ne sme da sadri
kontaminirajui mikroorganizam pod
uslovima testa
Prenoenje rezultata testa na celu
proizvedenu seriju zahteva dokaz da
je proizvod proizveden u homogenim
uslovima

 Potrebni fiziki dokazi zasnovani na

biolokim principima i automatski
dokumentovani koji pokazuju korektan
tretman cele proizvedene serije tokom
sterilizacije i izrade u aseptinim uslovima,
(Imaju veu vrednost od testa sterilnosti).
Test sterilnosti je jedini analitiki metod
koji postoji za ispitivanje kvaliteta
proizvoda pripremljenih u aseptinim
uslovima

Mere predostronosti
kontaminaciom mikroorganizmima
(MO)
Test sterilnosti se izvodi u aspetinim
uslovima, npr. u komori sa laminarnim
protokom vazduha
Aseptini uslovi ne ometaju otkrivanje MO
testom u proizvodu koji se ispituje
Radni uslovi u kojima se test izvodi redovno
se prate uzimanjem uzorka vazduha i sa
radnih povrina, kao i izvoenjem
kontrolnih testova sa preparatima za koje
se zna da su sterilni

Izbor hranljivih podloga

Biraju se u zavisnosti da li se rade
ispitivanja aerobnih i anaerobnih
bakterija ili gljivica
Podloga mora biti sterilna i da ima
hranljiva svojstva za datu vrstu MO

Ispitivanje podloga
Sterilnost: Inkubiraju se podloge za
izolaciju bakterija na 30- 50C, a za
izolaciju gljivica na 20- 25C
najmanje 7 dana
Rezultat: Ne treba da bude bilo
kakvog rasta MO

 Hranljiva svojstva: inokulie se

izabrana hranljiva podloga sa
otprilike 100 ivih MO i inkubira na
pomenutim temepraturama ne vie od
7 dana.
Rezultat: Podloge odgovaraju ukoliko
doe do ranog i obilnog porasta MO

Ispituju se na prisustvo:

Staphylococcus aureus (Aerobne)

Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes (Anaerobne)
Candida albicans

Efikasnost hranljivih podloga,

ispitivanje proizvoda na sterilnost
Ispituju se:
a) u prisustvu i odsustvu ispitivanog
proizvoda za bakterijsku sterilnost i
b) na isti nain posebno za test
sterilnosti na gljivice

a) za bakterijsku sterilnost:
4 epruvete za svaku podlogu koja e se
koristiti u testu
U svaku se dodaje ispitivani proizvod
Inokulie se polovina epruveta sa 0,1 ml
suspenzije odgovarajueg soja aerobnog MO
razblaene da sadri oko 1000 ivih MO po
ml (odnosno inokulacija oko 100 MO) i na isti
nain inokulie ostatak epruveta sa sporama
odgovarajurg soja anaerobnih MO
Za antibiotike se biraju sojevi osetljivi na
antibiotik

 Pripremi se isti komplet epruveta bez

proizvoda koji se ispituje i inokulie
na isti nain
Inkubiraju se sve epruvete na 3035C ne vie od 7 dana

b) Za sterilnost na gljivice
Pripreme se najmanje dve epruvete sa
podlogom koja se koristi u testu sterilnosti
za izolaciju gljivica i u svaku doda ispitivani
proizvod
Inokuliu se epruvete sa 0,1 ml suspenzije
odgovarajueg soja Candide albicans
razblaene da sadri oko 1000 ivih MO po
ml (odnosno inokulacija oko 100 MO).

 na isti nain pripreme se dve epruvete

bez proizvoda, inokuliu na isti nain.
Inkubiraju se sve epruvete na 20-25C
ne vie od 7 dana
podloge namenjene u isto vreme za
ispitivanje i gljivica i bakterija se
ispituju na obe vrste MO

Tumaenje rezultata:
Ukoliko je tokom inkubacije, porast
MO u prisustvu i odsustvu proizvoda
koji se ispituje slian, proizvod nema
antimikrobnu aktivnost i test na
sterilnost se moe izvesti bez
modifikacije

 Ukoliko kulture koje sadre proizvod koji

se ispituje na sterilnost pokau slabiji rast,
odloen porast ili uopte ne pokau rast
MO, kada se uporede sa kulturama koje ne
sadre ispitivani proizvod, PROIZVOD
poseduje antimikrobnu aktivnost koja se
mora otkloniti filtriranjem, razblaivanjem
u podlozi ili neutralizacijom nekom
supstncom pre ili tokom testa na sterilnost.
Test se ponavlja i odredi se efikasnost ove
eliminacije

Test sterilnosti
Dva naina izvoenja:
a) Membranska filtracija (preporuljiva
uvek kada priroda proizvoda to dozvoljavavodeni, alkoholni uljani preparati)
b) Direktna inokulacija hranljive podloge
proizvodom koji se ispituje

Membranska filtracija
koriste se menbranski filtri veliine
pora do 45m.
celulozni nitratni filtri za vodene,
uljane i razb. alkoholne rastvore i
celulozni acetatni filtri za konc.
alkoholne rastvore

 Aparat i membrana se steriliu pomou

odgovarajueg sredstva a napravljeni su
tako da se rastvor koji se ispituje moe
uneti i filtrirati u aseptinim uslovima
U farmakopejama su date tane koliine
proizvoda koji se ispituje na sterilnost a
prema vrsti preparata.

Direktna inokulacija hranljive

podloge
Prenese se preporuena koliina
ispitivanog preparata direktno u
hranljivu podlogu tako da odnos
proizvod prema podlozi bude 1:10 za
tenosti i 1:100 za vrste materije
Posebno je propisan nain ispitivanja
za uljane tenosti, masti kreme

 Podloge se inkubiraju najmanje 14 dana

na propisanim temperaturama za
bakterije i gljivice
Kulture se posmatraju nekoliko puta u
toku perioda inkubacije i svaki dan
blago promeaju ako nisu potrebni
anaerobni uslovi (podloga tioglikolat)

Tumaeneje rezultata
Ukoliko nema dokaza u rastu proizvod
je u skladu sa zahtevima sterilnosti
Ukoliko postoji rast MO proizvod ne
odgovara testu za sterilnost, pod
uslovom da rezultat nije proizaao iz
kontaminacije tokom izvoenja testa

Provera
Prvi ponovljeni test: Sprovodi se na isti
nain kao prvi i ukoliko doe do rasta
MO, kontaminati uporede sa prvim
testom. Ako kontaminati ne mogu
odmah da se razlikuju, proizvod koji se
ispituje nije u skladu sa zahtevima
testa sterilnosti, a ako se kont. odmah
diferenciraju moe se uraditi drugi
ponovljeni test.

 Drugi ponovljeni test: Upotrebi se

dvostruko vei broj uzoraka od onog
koji je testiran u prvobitnom testu na
sterilnost
Ukoliko nema dokaza o rastu MO,
proizvod koji se ispituje je u skladu sa
zahtevima testa na sterilnost
Ukoliko doe do rasta MO proizvod ne
odgovara zahtevima za sterilnost
preparata

Ispitivanja preparata
Farmakopeja posebno propisuje
primenu testa sterilnosti na
preparate za parenteralnu upotrebu,
oftalmoloke i druge preparate
neinjekcione preparate, hirurke
zavoje.

 Propisan je minimalan broj uzoraka koji se

preporuuje za testiranje a u vezi sa
brojem pakovanja u seriji, da bi se dobio
odgovarajui stepen pouzdanosti rezultata
Uslov je iskljuena kontaminaciju prilikom
proizvodnje i rukovanja
Serija: homogena kolekcija zapeaenih
sudova pripremljenih na takav nain da je
rizik od kontaminacije isti za sve jedinice
koje se u njoj nalaze

Preporuene hranljive
podloge
teni tioglikolat - anaerobne
bakterije, otkriva i aerobne bakterije
hidrolizat kazeina i hidrolizovanog
soinog zrna - za aerobne bakterije i
gljivice
Ove podloge su sloenog sastava koji
se navodi u farmakopejama i nain
njihove pripreme

Mikrobioloka istoa preparata za

koje se ne zahteva da budu sterilni
-ukupan broj ivih aerobnih MO

Odredi se ukupan broj ivih aerobnih MO metodom:

membranske filtracije,
brojanja na ploi ili
serijskih razblaenja

Postupak:
upotrebi se10g ili 10ml uzorka tako to se
pomea nekoliko delova nasumice izabranih
iz celog proizvoda, ako je potrebno
rastvori, razblai, suspenduje ili emulguje
pomou odgovarajue tenosti (zavisi od
vrste proizvoda).
Eliminiu se prethodno bilo kakva
antimikrobna svojstva proizvoda koji se
ispituje

Metoda membranske
filtracije
membrane prenika 50mm, izvodi se u
aseptinim uslovima kao i uklanjanje
membrane radi prenoenja u hranljivu
podlogu.
prenese se koliina koja odgovara 1g
proizvoda na svaki od dva membranska
filtra i odmah filtrira.
Ispere se svaka membrana 3 puta sa po
100ml odgovarajue tenosti, npr.
puferovan rastvor NaCl ili peptona pH 7.0.

 Filtri se prenesu na odgovarajue podloge

za brojanje bakterija (agar B) i gljivica
(agar C) i ploa inkubira 5 dana na
preporuenim temperaturama.
Prebroje se kolonije koje se pojave i
izrauna se broj MO po gramu ili ml
proizvoda.

Brojanje na ploi
Koriste se Petrijeve olje 9-10cm u preniku
U svaku olju se doda 1ml pripremljenog uzorka i
15ml otopljene podloge agara B, na temp. do 45C
Uzorak se ako je potrebno razblai da broj
kolonija ne bude vei od 300
Koriste se dve petrijeve olje, vri se inkubiranje
na 30-35C 5 dana, ako se pouzdan broj ne pojavi
pre
Prebroje se kolonije i rezulati izraunaju koristei
podatak da je 300 kolonija po ploi

za gljivice:
Postupak je isti ali se koristi agar C
kao podloga, inkubacija vri na temp.
20-25 C 5 dana, uz razblaenje
uzorka da broj kolonija koji se
oekuje ne bude vie od 100.

Serijsko razblaenje
Priprema se serija od 12 epruveta od kojih
svaka sadri 9-10ml podloge A.
Na prethodno opisan nain u prve tri
epruvete se napravi razblaenje ispitivanog
proizvoda 1:10, u druge tri 1:100, a u tree
tri 1:1000.
U poslednje tri epruvete doda se samo
razblaiva i one ne treba da imaju rast
MO
Inkubiraju se epruvete na 30-35 C 5 dana

 Ukoliko se rezultati ne mogu jasno

oitatai uzorak se preseje na tenu
ili vrstu podlogu, inkubira i oita
Odredi se broj MO po gramu ili ml
proizvoda iz odgovarajue tabele koja
se nalazi u farmakopeji

Interpretacija rezultata
Ukoliko postoji limit u monografiji
treba ga interpretirati na sledei
nain:
102 MO maksimalni prihvatljiv limit
5x102
103 MO maksimalni prihvatljiv limit
5x103 itd...

Mikrobioloka istoa preparata za koji ne

moraju da budu u skladu sa testom za
sterilnost -test na specifine MO
Enterobakterije, Escherichia
coli,Salmonella, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Clostridija
Za ove bakterije nije dozvoljeno prisustvo
u farmaceutskim preparatima i sirovinama,
a ispituju se prema pojedinanim
farmakopejskim propisima za svaku
bakteriju

Bakterijski endotoksini
za neke preparate propisuje se
ispitivanje bakterijskih endotoksina
pomou LAL testa (lizat amebocita
potkoviastog raia -Limulus
polyphemus).
Kada se uzorak koji sadri
endotoksine doda rastvoru lizata
nastaje zamuenje, precipitacija ili
geliranje smee.

 Ispitivanje se vri prema graninim

vrednostima i preparat je ispravan
ukoliko konc. endotoksina nije vea od
granine vrednosti

Mikrobioloko odreivanje
antibiotika-odreivanje aktivnosti
Procenjuje se poreenjem inhibicije rasta
osetljivih MO pod dejstvom poznatih konc.
ispitivanog antibiotika i standardnog
rastvora
Koncentracije standardne supstance se
odreuju na osnovu internacionalnih
standarda (referentnih).

 Aktivnost mora biti u granicama 95-105%

za verovatnou P = 0.95
A. Metoda difuzije
B. Metoda turbidmetrije

A. Metoda difuzije
Potrebna koliina odgovarajue podloge se
rastopi i zaseje na pogodnoj temperaturi:
(npr. 48-50C za vegetativne oblike),
poznatom koliinom suspenzije MO
osetljivih na antibiotik.
Pod dejstvom antibiotika potrebno je da se
formiraju jasno definisane zone inhibicije

 Podloga se promea i odmah razlije u

Petrijeve olje da se formira sloj
podloge debljine 2-5mm.
Druga mogunost je upotreba
dvoslojnih podloga kada se zasejava
samo jedan sloj-gornji.

 Prema propisu pripreme se standardni i

ispitivani rastvori u poznatim konc.
pretpostavljajui da su istih aktivnosti
Rastvori se nanose pomou sterilnih
cilindara od porcelana ili nerajueg
elika u rupe iseene u podlozi. U svaku
rupu unosi se ista zapremina rastvora.

 Mogu se koristiti i papirnati diskovi od

sterilnog apsorbujueg papira koji se
impregniraju rastvorima standardnog
preparata ili ispitivanog antibiotika i
reaju na povrinu zasejane hranljive
podloge
Za procenu validnosti odreivanja koriste
se najmanje tri doze standardnog
preparata - za procenu linearnosti

 Pripremljeni rastvori se nanose u

Petrijeve olje prema odreenom
dizajnu
Vreme inkubacije na propisanoj
temperaturi je 18 h.
Mere se prenici zona inhibicije sa
preciznou od 0.1mm.

B. metoda turbidimetrije
Tena hranljiva podloga se zaseje
suspenzijom odgovarajueg MO
osetljivog na ispitivani AB.
Period inkubacije 4h
Podloga se inokulie neposredno pred
upotrebu

 Prema propisu pripreme se standardni

i ispitivani rastvori u poznatim konc.
pretpostavljajui da su istih
aktivnosti
Za procenu linearnosti koriste se
najmanje tri doze standardnog
preparata

 Stave se jednake zapremine od

svakog rastvora u identine testepruvete i u svaku epruvetu doda ista
zapremina inokulisane hranljive
podloge (npr. 1ml rastvora i 9ml
podloge)
U isto vreme se pripreme dve
kontrolne epruvete koje ne sadre
antibiotik

 Epruvete se rasporede prema odreenom

dizajnu i prenesu u vodeno kupatilo na
odreenu temperaturu 3-4h inkubacije.
Nakon inkubacije rast MO se zaustavlja
dodatkom 0.5ml formaldehida R u svaku
epruvetu ili pak zagrevanjem
Meri se zamuenje na tri decimale
Odreivanja moraju imati odreen broj
ponavljanja radi preciznosti