Grundlæggende Analyseteknik 2 Og 3

Laborantuddannelsen
Grundlæggende
analyseteknik
Øvelsesvejledninger
Efterår 2020 2. og 3. runde

Indholdsfortegnelse
Fordeling af studerende til øvelser (Se under øvelsesvejledning fra 1.
runde)
Generel og basal laboratorieteknik (Se under øvelsesvejledning fra 1.
runde)
Skråplan til øvelser på 2. sal

Øvelse 1 Klargøring og arbejde i LAF-bænk
Øvelse 2 Dyrkning og subkultivering af adherente cellekulturer
Øvelse 3 Farvning af adherente mammale celler
Øvelse 4 Nedfrysning af mammale celler og viabilitetstest
Øvelse 5 Celletælling ved hjælp af NucleoCounter og tællekammer
Exercise 6 Protein quantification in beer using the Biuret Method
Øvelse 7 Bestemmelse af proteinkoncentration i æggehvider ved UV-metoden
Øvelse 8 Celletælling, OD-måling og pladespredning
Øvelse 9 Introduktion til DNA arbejde, PCR og gelelektroforese
Øvelse 10 Gramfarvning
Skråplan til øvelser på 1. sal (2. runde)

Øvelse 13 AAS I
Øvelse 14 AAS II
Øvelse 20 Gaschromatografi I
Øvelse 21 Gaschromatografi II - Kvantitativ bestemmelse af ethanol i spiritus
Øvelse 22 Indledende HPLC
Øvelse 23 Kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af coffein ved HPLC
Ekstra øvelser E1, E2, E3, E4 (Se under øvelsesvejledning fra 1. runde)
Grundlæggende
analyseteknik Lab - dag
2. sal Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag 5 Dag 6
Skråplan Obs. 4 timer
Øv. 1, 2, 4, 5 Øv. 3 Øv. 8 Øv. 8 Øv. 9 Øv. 6
Celledyrkning I Farvning af celler Pladespredning og Aflæs plader PCR: Elektroforese + Proteinbestemmelse
celletælling foto Biuret
Studie gr. 1 Øv. 4 + (øv. 5) Øv. 9
Nedfrysning og PCR-opsætning + gel Øv. 7 Øv. 10
celletælling Proteinbestemmelse Gramfarvning
UV
Øv. 2
Tjek konfluens
Øv. 1, 2, 4, 5 Øv. 4 +(øv. 5) Øv. 6 Øv. 8 Øv. 8 Øv. 9

Celledyrkning I Nedfrysning og Proteinbestemmelse Pladespredning og Aflæs plader PCR: Elektroforese +
celletælling Biuret celletælling foto
Studie gr. 2 Øv. 9
Øv. 3 Øv. 10 PCR-opsætning + gel Øv. 7
Farvning af celler Gramfarvning Proteinbestemmelse
UV
Øv. 2
Tjek konfluens
Øv. 1, 2, 4, 5 Øv. 9 Øv. 9 Øv. 6 Øv. 8 Øv. 4+ (øv. 5)

Celledyrkning I PCR-opsætning + gel PCR: Elektroforese + Proteinbestemmelse Pladespredning og Nedfrysning og
foto Biuret celletælling celletælling
Studie gr. 3 Øv. 3
Farvning af celler Øv. 7 Øv. 10 Øv. 8
Proteinbestemmelse Gramfarvning Aflæs plader
Øv. 2 UV
Tjek konfluens
Grundlæggende analyseteknik
Laborantuddannelsen
Øvelse 1: Klargøring og arbejde i LAF-bænk Institut f or Teknologiske
Øvelse 1
Klargøring og arbejde i LAF-bænk
Estimeret tidsbrug: 0,5 lektioner
Mål:
At klargøre og lære at arbejde sterilt i LAF-bænk
Princip:
Princippet i en LAF-bænk bygger på at der arbejdes i et område med sterilfiltreret luft.
Relevant teori:
• Praktisk mikrobiologi: Kap. 10
• Arbejdsmiljø i laboratoriet: Kap. 11
Reagenser og kemikalier:
• 70% Ethanol
Materialer og apparatur:
• LAF-bænk
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier:
• 70 % Ethanol
Udarbejdet af: BOGR Dato: ikke oplyst side 1 af 3

Sidst revideret af: SUSU Dato: 29.10.2020
Laborantuddannelsen
Fremgangsmåde:
Før arbejdet påbegyndes
1. Ca. 10 min før arbejdet påbegyndes tændes for ventilatoren på LAF-bænken ved
fuld hastighed.
2. Arbejdskammeret på LAF-bænken desinficeres omhyggeligt med 70% Ethanol.
• Ved alt arbejde i en LAF-bænk skal det tilstræbes at man opnår så aseptiske
arbejdsforhold som muligt. Brug af handsker kan derfor efterfølgende være
hensigtsmæssigt. Som alternativ kan man ’vaske’ sine hænder og underarme i
70% Ethanol.
• Spray 70% Ethanol på alle sider og på arbejdsbordet inde i LAF-bænken

og benyt en papirklud til omhyggeligt at fordele Ethanol ud i alle hjørner
og flader [NB: Følg vejledning opsat på LAF-bænk].
3. Placér alle nødvendige utensilier i LAF-bænken efter de er desinficeret med 70 %

Ethanol udvendig. (Nye flasker, pipetter, mediekomponenter, trypsin -opløsning,
buffer og lign. sprayes med 70% Ethanol efterhånden som de føres ind i LAF-
bænken).
4. Frontruden skal være i arbejdsstilling og holdes i denne stilling under hele
arbejdsprocessen.
Under arbejde med celledyrkning
1. Arbejdet i LAF-bænken må aldrig udføres med reduceret ven tilatorhastighed

2. Frontruden holdes hele tiden i arbejdsstilling under arbejdet.
3. Utensilier m.m. placeres tilstrækkeligt langt tilbage i LAF-bænken.
4. Arbejd med rolige bevægelser.
5. Overfyld aldrig LAF-bænken.
6. Minimér antallet af transporter ind og ud af LAF-bænken.
Efter afsluttet arbejde i LAF-bænken
1. Arbejdskammer rengøres og desinficeres grundigt med 70% Ethanol.

2. Lad ventilatoren køre i 15 minutter [NB: tiden kan afkortes hvis der ikke er arbejdet
med bakterier i bænken].
3. Lad evt. ventilatoren køre på reduceret hastighed når bænken ikke benyttes.

Laborantuddannelsen
Affald:
Handsker og papirklude til almindeligt affald.
Rapportering og resultatbehandling i journalbog:

LAF-bænkens nummer noteres.

Laborantuddannelsen
Øvelse 2: Dyrkning og subkultivering af adherente cellekulturer Institut f or Teknologiske
Øvelse 2
Dyrkning og subkultivering af adherente
cellekulturer
Estimeret tidsbrug: 2 + 0,25 lektioner
Mål:
At opnå kendskab til arbejde med adherente mammale cellekulturer.
At indøve arbejdsteknikker i forbindelse med subkultivering af adherente cellekulturer.
Princip:
Hvis man ønsker at vedligeholde en adherent mammal cellekultur i vækst, må cellerne
tilses jævnligt for at kontrollere væksten og undersøge for kontaminering.
Ligeledes skal væksten tilses for at undersøge om der behov for at skifte medie eller
om cellekulturen skal subkultiveres (overføres til frisk medie), fordi celletætheden er
blevet så stor at væksten er gået i stå.
Relevant teori:
• Kompendie i celledyrkning
Substrater, reagenser, kemikalier og kultur:

• Ethanol 70%
• Ham´s F-12 dyrkningsmedie
• DMEM dyrkningsmedie
• Newborn Calf Serum (NCS)
• L-glutamin opløsning
• Pen/strep opløsning
• Trypsin-opløsning
• DPBS buffer
• Cellekultur: Vero-celler dyrket i T-175 flaske
• A100 til nucleocounter
• B100 til nucleocounter
Udarbejdet af: SUSU Dato: 02.11.20 side 1 af 6

Sidst revideret af: Dato:
Laborantuddannelsen
• Spildflaske (T-75 eller T-175)
• T-75 dyrkningsflaske til færdigblandet medium
• T-75 dyrkningsflaske til subkultivering
• 2 stk. TC-disk
• Omvendt fasekontrastmikroskop
• CO2 - inkubator
• 1 NucleoCounter kassette
• NucleoCounter
• Automatisk pipettesuger
• Engangspipetter 1 mL, 5 mL, 10 mL (Sterile)
• 1 stk. Centrifugerør 50 mL (Sterile)
Gravide og ammende:
• 70 % Ethanol
Fremgangsmåde:
Dag 1 (subkultivering):
1. Inden arbejdet påbegyndes i LAF-bænken skal denne klargøres - se øvelse 1.
2. Fremstil celledyrkningsmedie i en T-75 flaske ved at blande:
50 ml Ham’s F12
50 ml DMEM
10 ml newborn calf serum
1 ml L-glutamin
1 ml pen/strep
(husk at blande godt og skriv navn og dato på flasken , samt markere at mediet er
færdigblandet)
3. Skriv dato og navn på en ny T-75 flaske og på 2 stk. TC-disk.
4. Du skal bruge den samme 20 mL engangspipette til pkt. 5, 6 og 7.
5. Overfør 20 ml celledyrkningsmedie til den nye T-75 flaske. (Skal bruges i pkt. 22a).
6. Overfør 2,4 mL celledyrkningsmedium til hver af de to stk. TC-disk (Skal bruge i pkt.

Laborantuddannelsen
22b).
7. Overfør 20 ml celledyrkningsmedium til et tomt 50 ml centrifugerør. (Skal bruges i pkt.

16).
8. Udtag cellekulturen fra CO2 - inkubatoren og undersøg væksten ved omvendt

fasekontrast-mikroskopi. Noter i skema 1 om der er synlige tegn på infektion, samt en
ca. % konfluens.
9. Hæld dyrkningsmediet fra kulturen over i spildflasken. Her er det vigtig at

flaskemundingerne ikke rører hinanden, for at minimere muligheden for
kontaminering.
10. Rens cellelaget ved tilsætning af 20 ml DPBS-buffer. Vug flasken roligt frem og
tilbage og hæld fra i spildflasken.
11. Gentag punktet 10 og frasug afslutningsvis det sidste af DPBS-bufferen med pipette.
12. Tilsæt 12 ml trypsin-opløsning til cellekulturen og gå hurtigt til næste punkt.
13. Anbring flasken ved 37C i 2-4 min i inkubatoren. Noter i skema 2 starttid for
inkubation.
14. Udtag flasken af inkubatoren (Noter tidspunkt i skema 2) og undersøg cellelaget ved
omvendte fasekontrastmikroskop. Cellerne skal være ”rundet op”, dvs. blive
kugleformede og slippe flaskens bund. Slå evt. let på siden af flasken for at løsne
cellerne.
15. Hvis cellerne ikke er ”rundet op” inkuberes yderligere indtil cellerne har sluppet
flaskens bund. Husk også at noter tiden, hvis yderligere inkubation kræves.
16. Vip cellesuspensionen i T-175 flasken et par gange. Hæld dernæst forsigtig
cellesuspensionen over i centrifugerøret med de 20 ml færdigblandet medium (fra
pkt. 7).
17. Centrifugér cellesuspensionen i 5 min ved 700 rpm.
18. Hæld forsigtigt mediet fra cellerne ned i spildflasken. Det er vigtigt at dette foretages i
én bevægelse uden at der vippes frem og tilbage – da cellerne ellers kan løsne sig.
19. Tilsæt 6 mL celledyrkningsmedie til centrifugerøret og resuspendér cellerne i mediet

(sug op og ned et par gange med pipetten).
20. Bestem cellekoncentrationen vha. NucleoCounter (Total cell) – se øvelsesvejledning

5 – der måles kun på totale celler. Noter resultatet i skema 3.

Laborantuddannelsen
21. Fortynd cellesuspensionen i centrifugerøret med celledyrkningsmedie så der opnås

en konc. på ca. 1 x106 celler/ml. Se beregninger under resultatskema.
22. Sørg for at cellerne er i suspension og overfør dernæst:
a. 0,2 ml til T-75 flasken med celledyrkningsmedie (fra pkt. 5).
b. 0,1 mL til hver af de 2 TC-disk med dyrkningsmedie (fra pkt. 6)
23. Inkubér T-75 flasken og de 2 TC-disk i CO2 - inkubatoren ved 37C.
24. Resten af cellerne i 50 ml centrifugerøret bruges til øvelserne øvelse 4: Nedfrysning

af mammale celler og viabilitetstests.
Dag 2 (Tjek af subkultiveringen):
1. Udtag T75 flasken med den subkultiveret cellekulturen fra inkubatoren og undersøg
væksten ved omvendt fasekontrast-mikroskopi. Noter observationerne i skema 4.
Affald:
Affald fra spildflaske håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende vejledning

Laborantuddannelsen
Rapportering og resultatbehandling i journalbogen:
Følgende spørgsmål skal besvares i journalbogen FØR øvelsen udføres:

• Beskriv hvad der menes med adherente celler.
• Beskriv hvad der menes med konfluens.
• Beskriv hvorfor skal der vaskes med DPBS-buffer inden trypsineringen.
• Beskriv hvad der sker under trypsineringen.
Følgende spørgsmål skal besvares i journalbogen efter øvelsen udføres:

• Ved en normal celle-densitet af Vero celler (ca. 90% konfluente) burde man få ca. 20
mio. celler fra en T-175 flaske.
o Hvordan stemmer dette overnes med jeres celleantal?
o Hvis det ikke stemmer overens, hvordan kan det så forklares?
• Hvis celler er meget tætte (95% konfluente eller mere) bliver cellelaget så tæt, at
trypsinen kan have svært ved at ”komme til” og løsne cellerne, dvs. jo længere
inkubation med trypsin skal man have før cellerne runder op.
o Hvordan passer jeres konfluens overens med jeres inkubationstid?
o Sammenlign med de andre hold.

Laborantuddannelsen
Resultatskemaer
Resultatskemaer til journalbog. Klip ud og sæt ind FØR, der indsættes resultater.
Skema 1: Vurdering af vækst før subkultivering
Er der synlige tegn på infektion?

Konfluens %
Skema 2: Tiden for inkubation med trypsin
Start tidspunkt for inkubation Slut tidspunkt for inkubation Inkubation i alt
Skema 3: Celletælling ved NucleoCounter

Målt antal celler (C Total) Fortyndings faktor (MTotal) Beregnet antal celler
(Celler/mL) (Celler/mL)
Beregningseksempel:
Beregning af fortynding af cellesuspension:

𝐶𝑓ø𝑟 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑦𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔 ∙ 𝑉𝑓ø𝑟 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑦𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔
𝑉𝑒𝑓𝑡𝑒𝑟 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑦𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔 = =
𝐶𝑒𝑓𝑡𝑒𝑟 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑦𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔
𝑉𝑡𝑖𝑙𝑠æ𝑡𝑡𝑒𝑠 = 𝑉𝑒𝑓𝑡𝑒𝑟 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑦𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔 − 𝑉𝑓ø𝑟 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑦𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔 =
Skema 4: Vurdering af vækst før subkultivering
Tid efter subkultivering (timer)

Har cellerne hæftet bunden?
Er der synlige tegn på infektion?
Konfluens %

Laborantuddannelsen
Institut f or Teknologiske
Øvelse 3: Farvning af adherente mammale celler
Øvelse 3
Farvning af adherente mammale celler
Estimeret tidsbrug: 2 lektioner
Mål:
At få kendskab til farveteknik af adherente cellekultur
Princip:
Cellekulturer kan farves med fluorescensfarvestofferne Acridin Orange og
Bisbenzamid (Hoechts).
Acridin Orange binder sig til cellernes DNA og RNA. dsDNA vil ved belysning med
UV-lys fremstå lysende grønne (500-526 nm), mens ssDNA og RNA vil lyse
rødt/orange (460-650 nm).
Hoechts-farve binder sig også til cellernes DNA. Cellekernen og kromosomer vil ved
belysning ved UV-lys fremstå lysende blå (460-490 nm).
Relevant teori:
Kompendie i celledyrkning.

• 2 stk. TC-disk med vero-celler fra øvelse 2
• DPBS-buffer
• Ethanol 96%
• Fiksativ: DPBS :Ethanol i forholdet 1:1
• Acridin Orange farveopløsning
• Hoechst farveopløsning
• Spildflaske (T-75 eller T-175) med 4 % diversol
• 1 stk. plastikrør 10 mL (Sterilt)
• Mikropipetter
• Omvendt fasekontrastmikroskop
• Mikroskop med tilhørende UV- lamper, kamera og PC
Udarbejdet af: SUSU/PESA Dato:02.11.2020 side 1 af 3

Laborantuddannelsen
Gravide og ammende:
• 70 % Ethanol
• 96 % Ethanol
• Fiksativ: DPBS:96 % Ethanol i forholdet 1:1
Fremgangsmåde:
Forberedelse til begge farvninger:
1. Tilse de to TC-disk for vækst ved omvendt fasekontrastmikroskopi.

2. Fremstil 10 mL fiksativ (PBS:ethanol i forholdet 1:1) i 10 mL plastikrør.
Acridin Orange-farvning:
1. Frasug dyrkningsmedium fra TC-disk til spildflaske med 4 % diversol.

2. Vask cellelaget med 2,5 mL DPBS-buffer.
3. Frasug DPBS-buffer til spildflaske med 4% diversol.
4. Gentag punkt 2. og 3.
5. Tilsæt 2,5 mL fiksativ, og lad det stå 5 min. ved rumtemperatur.
6. Frasug fiksativ til spildflaske med 4% diversol
7. Tilsæt 2,5 mL 96% ethanol, og lad det stå 10 min. ved rumtemperatur.
8. Frasug 96% ethanol til spildflaske med 4% diversol.

9. Tilsæt 2,0 mL Acridin Orange 1% opløsning
10. Efter 2 min. tilsættes 1,5 mL ionbyttet vand. Bland forsigtigt og lad det stå i 2 min. ved
rumtemperatur.
11. Frasug farveopløsningen til spildflaske med 4% diversol
12. Skyl med ionbyttet vand og hæld i spildflaske med 4% diversol.
13. Mikroskopér præparatet og tag et billede. Følg vejledningen ved mikroskopet.
(Medbring en USB-nøgle hvis du vil have et billede elektronisk)
Hoechts-farvning:

Laborantuddannelsen
1. Frasug dyrkningsmedium fra TC-disk til spildflaske med 4 % diversol.

2. Vask cellelaget med 2,5 mL DPBS-buffer.
3. Frasug DPBS-buffer til spildflaske med 4% diversol.
4. Gentag punkt 2. og 3.
5. Tilsæt 2,5 mL fiksativ, og lad det stå 5 min. ved rumtemperatur.

6. Frasug fiksativ til spildflaske med 4% diversol.
7. Gentag pkt. 5 og 6.
8. Tilsæt 2,0 mL Hoechts-brugsopløsning og lad det stå 10 min. ved rumtemperatur.
9. Skyl med ionbyttet vand og hæld i spildflaske med 4% diversol.

10. Mikroskopér præparatet og tag et billede. Følg vejledningen ved mikroskopet.
(Medbring en USB-nøgle hvis du vil have et billede elektronisk)
Affald:
Affald fra spildflaske håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende vejledning

• Sæt billederne af jeres farvninger ind i journalbogen.
• Beskrives hvad der kan identificeres af strukturer på de to billeder.

Laborantuddannelsen
Øvelse 4: Nedfrysning af mammale celler og viabilitetstest
Øvelse 4
Nedfrysning af mammale celler og viabilitetstest
Estimeret tidsbrug: 0,5 + 2 lektioner
Mål:
At få kendskab til procedurer i forbindelse med opbevaring og vibilitetstests-
undersøgelser af cellekulturer
Princip:
Hvis man vil nedfryse en cellekultur, er det nødvendigt at fjerne en stor del af den
mængde vand, som findes i cellerne. Dette gøres ved at erstatte vandet med
kryokonserverende stoffer som fx dimethylsulfoxid (DMSO) eller Glycerol. DMSO og
Glycerol nedsætter muligheden for krystaldannelsen af vandet i cellerne.
DMSO og glycerol kan ved længere tids påvirkning af celler, reducerer overlevelsen
af cellerne. Derfor er det vigtigt, at cellerne nedfryses hurtigt og ved en tidsafhængig
proces, hvor man afkøler materialet langsomt i det temperaturinterval, hvor risikoen
for fryseskader er størst.
En cellesuspension nedfryses i ampuller (kryorør). Volumet skal være så lille, at
varmetransporten gennem suspensionen er så hurtig at der opnås et jævnt
temperaturfald i hele cellesuspensionen.
Viabilitets-test på cellekulturer udnytter forskelle i intakte og beskadigede
cellemembraners evne til at lade stoffer passere cellemembranen.
For udregning af viabilitets % se øvelse 5.
Relevant teori:
Kompendie i celledyrkning.

• Glycerol-opløsning
• Celledyrkningsmedie (fra øvelse 2)
• Vero-cellekultur 1x106 celler/mL (fra øvelse 2)
Udarbejdet af: SUSU Dato:29.10.2020 side 1 af 5

Laborantuddannelsen
• Spildflaske (T-75 eller T-175)
• 1 stk. plastikrør 10 mL (Sterilt)
• 1 stk. Kryorør
• Nedfrysningsboks
• Mikropipetter
Gravide og ammende:
• 70 % Ethanol
Fremgangsmåde:
Dag 1:
Nedfrysning af celler og viabilitetstest
1. De resterende celler fra øvelse 2 bruges til nedfrysning.

2. I et sterilt 10 mL plastikrør blandes forsigtigt 2,5 mL celler med en konc. på 1x106
celler/mL (fra øvelse 2) + 2,0 mL færdigblandet dyrkningsmedium (fra øvelse 2) + 0,5
mL glycerol. Dette er nedfrysningsblandingen.
3. Bestem cellekoncentrationen i nedfrysningsblandingen (total antal celler og antal døde
celler) ved hjælp af NucleoCounteren. Se øvelse 5.
4. Overfør 1,0 mL cellesuspension til et kryorør.
5. Lad røret henstå i min. 5 min. ved rumtemperatur.
6. Anbring røret i nedfrysningsboksen og sæt boksen ved ÷ 80C (alle hold benytter
samme nedfrysningsboks).

Laborantuddannelsen
Dag 2:
Optøning af celler og viabilitetstest.
1. Kryorøret tøs op (kan opvarmes forsigtigt i hånden eller stilles kortvarigt i en inkubator
ved 37C).
2. Bestem cellekoncentrationen (total antal celler og antal døde celler) ved hjælp af
NucleoCounteren. Se øvelse 5.
3. Bestem cellekoncentrationen (total antal celler og antal døde celler) ved hjælp af
tællekammer. Se øvelse 5.
Affald
Affald fra spildflasker håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende vejledning

Laborantuddannelsen

• Beskriv hvilken funktion glycerol har i nedfrysningen af Vero-celler.

• Vurder om celledøden er acceptabel – brug værdierne fra NucleoCounter.
Gennemsnitlig celledød ved korrekt nedfrysning med glycerol er op til 15-20%. Hvis
jeres celledød ligger højere end 20%, beskriv da hvor I vil optimere til næste gang.
• Sammenlign viabilitets % bestemt efter nedfrysning ved henholdsvis NucleoCounter

og tællekammer.
• Angiv hvor stort et volumen der måles på ved henholdsvis Trypanblå og

NucleoCounteren metoden og gør rede for hvilken af de to målemetoder du vil anse
for den mest nøjagtige (begrund svaret).

Laborantuddannelsen
Resultatskemaer
Skema 1 Viabilitet %:
Total celler Døde celler Viabilitet
(celler/mL) (celler/mL) (%)
Før nedfrysning
talt med NucleoCounter
Efter nedfrysning
talt med NucleoCounter
Efter nedfrysning
talt med tællekammer
Beregningseksempler:
NucleoCounter:
• Total celler = CTotal x MTotal
• Døde celler = C NV x MNV
• Viabilitet (%) er udregnet under øvelse 5
Tællekammer:
• Total celler =
Gennemsnit Cellekonc. (Levende celler) + Gennemsnit Cellekonc. (Døde celler)
• Viabilitet (%) er udregnet under øvelse 5

Laborantuddannelsen
Øvelse 5: Celletælling vha. NucleoCounter og tællekammer Institut f or Teknologiske
Øvelse 5
Celletælling vha. NucleoCounter og tællekammer
Estimeret tidsbrug: 2 x 0,5-1 lektioner
Mål:
At bestemme antallet af celler (evt. døde og levende) i et givent volumen.
Princip:
De anvendte farvninger af celler udnytter forskelle i intakte og beskadigede
cellemembraners evne til at lade farvestoffer passere cellemembranen.
NucleoCounter:
Princip for farvning og måling ses i bilag 1.
Tællekammer:
For at skelne mellem levende og døde celler anvendes trypan-blå. Levende celler vil
forblive ufarvede, da trypan-blå ikke kan trænge gennem den intakte cellemembran ,
hvorimod døde celler bliver blåfarvede, da trypenblå kan trænge gennem den
beskadige cellemembran.
Princip for måling med tællekammer ses i bilag 2.
Relevant teori:
• Kompendie i celledyrkning
• Bilag 1
• Bilag 2
Reagenser:
• Cellesuspension fra øvelse 2 og øvelse 4
• Reagens A100 til nucleocounter
• Reagens B til nucleocounter
• Trypan-blå opløsning
• 70% Ethanol

Laborantuddannelsen
• NuleoCounter
• NucleoCounter kassetter
• Whirlingmixer
• Mikroskop
• Tællekammer med dækglas (Fuchs-Rosenthals)
• Vatpind
• Eppendorfrør
• Pasteurpipetter
• Mikropipette
Gravide og ammende:
• 70% Ethanol
Fremgangsmåde:
NucleoCounter (se også bilag 1):
Bemærk:
Ved bestemmelse af celletallet til øvelse 2 skal der kun udføres Total Cell, dvs.
eppendorfrør 1. Resultaterne noteres i skema 3 under øvelse 2.
Ved bestemmelse af celletal til øvelse 4 skal der både tælles Total Cell og Non-viable
cell, dvs. både eppendorfrør 1 og 2. Resultaterne noteres i skema 1 under denne
øvelse.
Prøveforberedelse:
1) Mærk to eppendorfrør med henholdsvis 1 og 2.
2) Sørg for at cellerne er i suspension og overfør 200 µL cellesuspension til hver af de
to eppendorfrør.
3) Til eppendorfrør 1 (Total Cell):
a. Tilsættes 200 µL reagens A100 og bland grundigt med whirlingmixer.
b. Tilsæt derefter 200 µL reagens B og bland grundigt med whirlingmixer.
4) Eppendorfrør 2 (Non-viable cell = døde celler)
a. Der skal ikke tilsættes nogle reagenser

Laborantuddannelsen
Tælling:
5) Tænd for NucleoCounteren.
6) Ved håndtering af Nucleocasetten er det vigtig at du ikke rører ved målecellen
(measurement chamber).
7) Dyp spidsen af Nuclecasetten ned i eppendorfrør 1 (Total cell) og tryk stemplet
(piston) ned – vent i 10 sekunder, så cellesuspensionen kan nå at blive suget op i
kassetten.
8) Placer kassetten i NucleoCounter- apparatet og tryk run.
9) Noter antal celler i skema 1. (Ved måling af celletal til øvelse 2 noteres resultatet
under øvelse 2).
10) Kasser kassetten.
11) Gentag pkt. 7) -10) med eppendorfrør 2 (Non-viable cell = Døde celler).
Tællekammer (Se også bilag 2):
Prøveforberedelse (farvning af celler):

1) Overføre 0,5 mL cellesuspension til et eppendorfrør og tilsæt 0,5 mL 0,1 % trypanblå
opløsning.
2) Vent 3 - 4 min.
3) Hver studerende skal herefter udføre pkt. 4) -10)
Fyldning af tællekammer:
4) Et dækglas (specielt beregnet til tællekammer) anbringes på Fuch-Rosenthals
tællekammeret.
5) Sug herefter lidt cellesuspension aseptisk op i en pasteurpipette.
6) Pasteurpipettens spids sættes ved randen af tællekammerets dækglas, og væske
med cellesuspension vil trækkes ind i tællekammeret på grund af vandets
overfladespænding.
Tælling:
7) Der skal tælles både levende celler (ufarvet) og døde celler (blå).
8) Ved mikroskopi (anvend fasekontrastmikroskopi) med passende forstørrelse, tælles
cellerne i et antal ruder (lille kvadrat) til der opnås et celletal på mindst 100 celler
(samlede celletal).
Celler på øverste streg og celler på højre streg tælles med, medens celler på
nederste og venstre streg ikke tælles med (se bilag 2).
9) Noter i skema 2 både hvor mange ruder der er talt samt antal celler.
10) Tællekammeret og dækglasses renses med en vatpind dyppet i sprit og lægges
tilbage i æsken.

Laborantuddannelsen
Affald:
Affald håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende vejledning.

• Beskriv kort farve-princippet der benyttes ved NucleoCounter.
• Beskriv kort farve-princippet der benyttes ved trypan-blå.
• Sammenlign jeres celletælling vha. tællekammer (1. og 2. tælling) og vurder derudfra
om der er store udsving i jeres måde at tælle celler på (jeres tal bør ligge inden for et
interval på +/- 10%).
Resultatskemaer
NucleoCounter:
Skema 1: Celletælling før og efter nedfrysning (til øvelse 4):
Antal celler Fortyndings Antal døde Fortyndings Viabilitets %
total faktor celler faktor
(CTotal ) (MTotal ) (CNV) (MNV)
Før
nedfrysning
Efter
nedfrysning

Laborantuddannelsen
Tællekammer:
Rude type der er talt i (Hel kammer / stort kvadrat / lille kvadrat):_______________________.
Rudens volumen (3,200 µL /0,200 µL / 0,0125 µL):______________________.
Skema 2: Celletælling efter nedfrysning (til øvelse 4):

Antal talte Antal talte Cellekonc. Gennemsnit Viabilitets %
celler ruder (Celler/mL) Cellekonc.
(Celler/mL)
Levende
1.
celler
tælling
2.
tælling
Døde
1.
celler
tælling
2.
tælling

Laborantuddannelsen
Bilag 1: Om NucleoCounter
NuleoCounter: Cell viability – How it works:
The cell viability of a sample is determined using the total cell count and the count of non -
viable cells (see the figure below).
When a sample is mixed with Reagent A-100 and Reagent B, a lysis of the viable cell
membrane takes place rendering all the cell nuclei susceptible to staining with propidium
iodide (PI) resulting in a total cell count.
Non-viable cells are permeable without treatment and are therefore stained directly with
PI, resulting in a non-viable cell count.

Laborantuddannelsen

Laborantuddannelsen
Calculation of Vialility
The percentage of viable cells (%viability) can be
calculated from following equation.
𝐶𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 ∗ 𝑀𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝐶𝑁𝑉 ∗ 𝑀𝑁𝑉

𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡𝑦 (%) = 100%
𝐶𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 ∗ 𝑀𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙
C: Cell Count M: Multiplikationsfactor NV: Non-viable
Multiplikationsfactor svarer til fortyndingsfaktor

Laborantuddannelsen
Bilag 2: Om tællekammeret
Fuchs-Rosenthals tællekammer består af et tykt objektglas med et lavere midterfelt, der
fungerer som kammer. Kammerhøjden er 0,2 mm, og det er angivet ved dybden af kammeret
(tiefe).
I det lave midterfelt er indridset to tællefelter omgivet af afløbsbrønde. Tællefelterne kan uden
forstørrelse skimtes som to små kryds.
De to små kryds, der består af meget fint indridsede streger, afskærer et tællefelt på 16 mm2,
som inddeles i 400 små kvadratiske felter.
Dersom kammerdybden er 0,2 mm vil et tællefelt rumme 0,2mm*16mm2 = 3,2mm3 = 3,2L
Tællefelt
Tællekammer
Forstørret tællefelt

Laborantuddannelsen
Fuchs-Rosenthals tællekammer
Netinddeling i Fuchs-Rosenthals tællekammer

Kammerets Længde Areal Højde Volumen
dimensioner mm mm 2 mm μL
Hele kammeret 4,00 16,000 0,2 3,200
Stort kvadrat 1,00 1,000 0,2 0,200
Lille kvadrat 0,25 0,0625 0,2 0,0125
Antal talte celler x 1000 µL⁄mL

Cellekoncentration ( Celler⁄mL) =
Antal talte ruder x Rudens Volumen
Viabilitets % = (Total antal celler – antal døde celler)/Total antal celler x 100%

Laborantuddannelsen
Exercise 6: Protein quantification in beer using the Biuret Method Institut f or Teknologiske
Exercise 6
Protein quantification in beer using the Biuret
Method
Estimated time: 2 lessons
Aim:
To quantify the amount of protein in beer.
Principle:
Biuret is a chemical test used to quantify the amount of protein. The test is based on the
ability of Cu 2++ ions to form complexes with peptide bonds, which are present in all
proteins. The Cu2++-peptide bond complex is blue which has an absorption maximum at
approximately 550nm. The intensity of the formed colour is directly proportional with the
protein concentration.
Caution: Several compounds and substances may interfere with the quantification such
as ammonia, amines (including tris) as well as amino acids as these also forms blue
complexes with Cu 2++. EDTA, sucrose and other compounds such as detergents must
not be present in the sample and measurements will also be affected by ammonium
sulphate at concentrations > 15%
Relevant Theory:
From textbook: “Kemiske enhedsoperationer”
• Mikropipette
From textbook: “Laboratoriebegninger”
• Fortyndinger
• Standardkurve, kurveaflæsning
From textbook: “Analyse teknik”
• Lambert Beers lov
• UV-VIS-spektrofotometri
Developed by: DAKE

Translated by: TORS Date: 13.03.2019 Page 1 of 6
Last revision by: SUSU Date: 19.03.2020
Laborantuddannelsen
Reagents and Chemicals

• Sample: light beer
• Stock solution: 10 mg/mL bovine serum albumin (BSA) in H 2O (stored in the freezer)
• Control solution: 6 mg/mL BSA (stored in the freezer)
• Biuret reagents
Materials and Apparatus:

• Büchner funnel; 70 mm
• Whatman filter - Grade 6: 70 mm
• Micropipettes (adjustable)
• Microtiter-plate
• Plate-reader
• Spectrophotometer
• VIS - cuvettes
• Plastic tubes with lids (15 mL)
• Pipette tips
Pregnant and nursing:

Pregnant and nursing women must not work with or handle the following:
• no comments in this exercise
Procedure:
Sample (beer) preparation:
1. Place a Büchner funnel, equipped with a Whatman filter (Grade 6), on a flask with
suction.
2. An appropriate volume of beer is filtered.
3. Transfer an appropriate volume of filtered beer to a beaker.
4. To degas the beer, place the beaker in an ultrasound bath for at last 10min.
Sample dilution:
5. The concentration range of measurement is between 1–10 mg/mL and beer contains
approximately 0,5g protein/100 mL.
6. Choose a suitable dilution of the beer. If the beer is to be diluted, this must be done in
dem. H2O.
Developed by: DAKE

Laborantuddannelsen
Preparation of standard series

7. Mark 11 tubes from A to K.
8. Prepare the standards by mixing stock BSA solution with dem. H 2O according to the
below table (tubes A-K), using a micropipette.
10mg/ml Stock BSA

Dem. H2O
Standard solution
(µL)
(µL)
A 0 1000
B 100 900
C 200 800
D 300 700
E 400 600
F 500 500
G 600 400
H 700 300
I 800 200
J 900 100
K 1000 0
9. Mix all the standards (A-K) thoroughly using a whirlimixer.

10. Mark 6 tubes from L to Q (tables 1&2).
11. Tubes L, M and N are added 1,00 mL control solution.
12. Tubes O, P and Q are added 1,00 mL (possibly diluted) sample.
13. Add 5,0 mL Biuret reagent to all the tubes (A to Q) and mix thoroughly using a
whirlimixer.
14. Leave the solutions for minimum 10min before proceeding with the measurements as
described below.
Plate reader measurement:

15. Transfer 200µL from each solution to a well in a 96-well microtiter plate.
16. Measure the absorbance at 540nm using the method; Protein i ol.
Spectrophotometer measurement:
Developed by: DAKE

Laborantuddannelsen
17. Adjust the spectrophotometer to measure absorbance at 540nm.

18. Reset to zero using dem. H 2O.
19. Measure each of the solutions (A to Q) using a suitable cuvette.
Trash:
Samples and chemicals may be disposed of directly in the sink.
Reporting and data treatment in the journal book
Before the exercise:

• calculate the concentrations of the solution s in the standard series (tubes A-K)
After completion of the exercise, the below point must be addressed/answered in

the journal book:
Measurements using the plate reader and spectrophotometer:
• Subtract the absorbance obtained in the blind (tube A) from the absorbance
obtained from the solutions in the standard series, controls as well as samples
• Plot a calibration curve with the absorbance as a function of the (calculated)
concentration using Excel
• Assess the linearity of both of the calibration curves
• Calculate the concentration in both the controls and the samples using the
calibration curve (either Tendens-funktion in Excel or via the equation of the
straight line)
• Plot the calibration curves (including the formula for the straight line and
correlation coefficient in the journal book)
• Calculate %CV for the samples and assess which protein quantification method
has the best precision
• Calculate GF% for the control
Developed by: DAKE

Laborantuddannelsen
Results:
BEFORE the tables are filled out with the obtained exercise data, the below tables (1&2) are
to be cut out and glued into your journal book.
Table 1: Plate reader measurement
Calculated
Solution Solution - Blind
concentration
(Absorbance) (Absorbance)
(mg/mL)
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K Concentration.
L
M Control
%CV
N
O
Sample
P
(beer)
Q
Developed by: DAKE

Laborantuddannelsen
Table 2: Spectrophotometer measurement

Calculated
Solution Solution - Blind
concentration
(Absorbance) (Absorbance)
(mg/mL)
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K Concentration.
L
M Control
%CV
N
O
Sample
P
(beer)
Q
Developed by: DAKE

Øvelse 7: Bestemmelse af proteinkoncentration i æggehvide ved UV- Laborantuddannelsen

metoden
Øvelse 7
Bestemmelse af proteinkoncentration i æggehvide
ved UV-metoden
Mål:
• at bestemme koncentrationen af protein i æggehvide.
Princip:
De aromatiske aminosyrer tyrosin og tryptofan absorbere UV-lys med et
absorptionsmaksimum ved 280 nm. Denne egenskab anvendes til en hurtig og ikke
destruktiv metode til bestemmelse af proteinkoncentrationen. Nukleinsyrer – DNA og
RNA – har et absorptionsmaksimum ved 260 nm, men har også en lysabsorption ved
280 nm. Dette kan man korrigere for ved en samtidig måling ved 260 nm.
Proteinkoncentrationen kan bestemme med følgende formel:
Proteinkoncentration (mg/mL) = (1.55 x A280) - (0.76 x A260)
Relevant teori:
Fra lærebog: “Analyse teknik”
• Lambert Beers lov
• UV-VIS-spektrofotometri
• Hønseæg
• Dem. vand
• UV-Spektrofotometer
• Nanofortometer
• UV-plastkuvetter
• Bægerglas
• Glastragt
• Osteklæde
• Mikropipette med egnede pipettespidser
Udarbejdet af: DAKE Dato: 09.05.2018 Side 1 af 4


metoden
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalie:
• Der er ingen bemærkninger til denne øvelse.
Fremgangsmåde:
Prøveforberedelse
1) Knæk et æg over et 250 mL bægerglas (1 æg pr. studiegruppe).
2) Skil æggehviden fra blommen ved forsigtigt at hælde blommen frem og tilbage
mellem de to skal halvdele.
3) Anbring en glastragt med 2 lag våd og opvredet osteklæde over et bægerglas.
4) Hæld forsigtigt æggehviden op i tragten og lad den filtrere forsigtigt. Det er vigtigt
ikke at presse hviden igennem, men blot lade den løbe af sig selv (kan tage lidt
tid). Evt. kan man forsigtigt løfte osteklædet og slå det forsigtigt imod tragten. Hele
ægget behøver ikke at blive filtreret, da der kun skal anvendes en lille del.
5) Fortynd prøven: Æggehviden fra hønseæg indeholder 10-11g protein/100 mL (≈
100 mg/mL) og den skal fortyndes til ca. 1mg/mL med dem. vand.
Måling vha. spektrofotometer

6) Følg vejledning til apparatet.
7) Indstil spektrofotometeret til at måle ved bølgelængde på 280 nm.
8) Fyld 2 UV-plastkuvetter med dem. vand og nulstil spektrofotometeret.
9) Fyld prøveopløsning i en UV-plastkuvette og mål opløsningen.
10) Hvis absorbansen > 2 skal prøven fortyndes med dem. vand og måles på ny.
11) Foretag en triple måling af prøven.
12) Gentag punkt 7) -11) ved en bølgelængde på 260 nm
Måling vha. Nanofotometer

13) Følg vejledning til apparatet.
14) Følgende indstillinger skal benyttes:
Lid Factor: 50 A260 Factor: 0,760
Delution Factor: 1,000 A280 Factor: 1,550
Background: On Units: mg/mL
15) Der nulstilles på dem. vand.
16) Foretag en triplemåling af prøven.


metoden
Affald:
Al affald kan hældes i vasken.

• Beskriv hvorfor der anvendes UV-plastkuvetter ved måling vha. spektrofotometer.
• Beskriv hvorfor der måles ved 2 bølgelængder ved måling vha. spektrofotometer.
• Beskriv hvorfor prøven skal fortyndes, hvis absorbansen er over 2 ved måling vha.
spektrofotometer.

• Vis beregningen af proteinkoncentrationen for spektrofotometer-metoden.
• Beregn %RSD for hver af metoderne og vurder, hvilken metoder, der har størst
præcision.


metoden
Resultatskemaer
Skema 1: Spektrofotometer
Konc. af Konc. i Konc. i

Abs280 Abs260 Fortyndings-
Måling fortynding æggehvide æggehvide %RSD
faktor
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
Skema 2: Nanofotometer
Indstillingsparameter:
Lid Factor: A260 Factor:
Delution Factor: A280 Factor:
Background: Units:
Konc. af Konc. i Konc. i

Fortyndings-
Måling fortynding æggehvide æggehvide %RDS
faktor
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)

Laborantuddannelsen
Øvelse 8: Celletælling, OD-måling og pladespredning Institut f or Teknologiske
Øvelse 8
Celletælling, OD-måling og pladespredning
Estimeret tidsforbrug: 5 timer + 1 time
Mål:
• At kunne vurdere statistisk sikkerhed på kimtællingsresultater.
• At kunne vurdere egne laboratoriefærdigheder m.h.t. fremstilling af
fortyndingsrække og udpladning.
• At kunne foretage en celletælling ved brug af et tællekammer.
• Bestemme sammenhængen mellem den optiske densitet og celletallet
• på en E. coli kultur.
Princip:
Kimtalsbestemmelse ved pladespredning: Ved kimtalsbestemmelse efter
pladespredning på agarplader og inkubation, tælles kimene makroskopisk på
pladerne, idet man forudsætter at ét kim efter inkubation frembringer én synlig koloni
 én Colony Forming Unit (CFU).
Ved metoden tælles kun levende kim.
Da en prøves kimtal oftest ikke engang kendes tilnærmelsesvis er det nødvendigt at
foretage fortyndinger af prøven med meget store fortyndingfaktorer for at kunne
opnå et acceptabelt kolonital på nogle af pladerne.
Fortyndingen foregår ved aseptisk at udtage 1 mL prøve som overføres til et rør med
9 mL steril fortyndingsvæske. Der blandes omhyggeligt og 1 mL blanding overføres
til et nyt rør med 9 mL fortyndingsvæske .... osv., indtil ønsket fortyndingsgrad er
opnået (Se skitse under fremgangsmåde for pladespredning).
Celletælling: Ved anvendelse af et tællekammer er det muligt at tælle små objekter i
et veldefineret volumen.
Ud fra det opnåede tælletal i tællekammeret, kan koncentrationen af de talte objekter
bestemmes. (Se desuden nærmere i afsnittet om tællekammer).
OD-måling: OD-måling er en turbidimetrisk måling, der udnytter det forhold at
tilstedeværelse af mikroorganismer i en suspension vil svække det lys der passerer
gennem suspensionen.
OD-målingen foretages med brug af et spektrofotometer. Den anvendte
bølgelængde til målingen kan være bestemt af hvilken organisme des måles på. Her
anvendes bølgelængden 600 nm.
Udarbejdet af: TOSK Dato: 14.05.2018 side 1 af 10

Sidst revideret af: BOGR Dato: 29.10.2020
Laborantuddannelsen
Substrater og kulturer:
• Overnight (ON)-kultur af E. coli i LB-medium
• Saccharomyces cerevisiae (Bagegær)
• 250 mL PCA – smeltet (deles mellem 2 studerende)
• 6 støbte PCA plader (støbt under Indledende laboratoriearbejde)
• 10 x 9 mL Sterilt 0,9% NaCl-opløsning i rør
• 10 x 5 mL Sterilt 0,9% NaCl-opløsning i rør
• 200 mL Sterilt 0,9% NaCl-opløsning (pr. studiegruppe)
• Petriskåle
• Mikropipetter (1000 μL og 100 μL)
• Sterile spidser til mikropipetter
• Drigalskispatel
• Whirlingmixer
• Teknisk vægt
• Thoma´s tællekammer
• Mikroskop (med fasekontrast)
• 2 stk Pasteurpipetter
• Spektrofotometer
• Kuvetter (VIS)
Gravide og ammende:

Laborantuddannelsen
Fremgangsmåde:
Kimtalsbestemmelse af E.coli ved pladespredning
Øvelsen udføres individuelt.
Udpodning:
1) Indret først arbejdspladsen med nødvendige utensilier, rør, petriskåle,
mikropipetter og sterile spidser. Støb straks 6 PCA-plader og lad dem størkne
(eller brug allerede støbte plader).
2) Til fortyndingsrækken mærkes 9 stk. 9 mL NaCl-rør 10-1 → 10-9. (fremstillet på
Indledende laboratoriearbejde)
Anbring rørene i rækkefølge i et reagensglasstativ (se nedenstående fig.).
3) Petriskåle/støbte plader mærkes på siden af pladen langs kanten med småskrift,
Substratforkortelse, bakterieart, fortyndingsgrad, dato for udsæd og initialer.
a. Mærk 6 tomme petriskåle efter ovenstående med fortynding 10 -5 → 10-9 og
kontrol.
b. Mærk på samme måde de 6 støbte plader 10 -5 → 10-9 og kontrol. Brug evt. de
plader i har støbt under ”indledende laboratoriearbejde”.
ON kultur 1 mL fortynding
af E. coli Dybdeudsæd: -5 -6 -7 -8 -9 opblandes i ca. 15 mL
agar
0,1 mL fortynding spredes

Overf ladeudsæd: - 5 -6 -7 -8 -9 med drigalskispatel
4) Fra prøvekulturen (Overnight (ON)-kultur af E. coli i LB-medium) fremstilles en

fortyndingsrække som vist i ovenstående figur. Der benyttes en ny pipettespids
ved hver udtagning og indholdet blandes omhyggeligt på whirlingmixeren inden
udtagningen til det næste rør.

Laborantuddannelsen
5) Udsæd:
a. Dybdeudsæd foretages fra rørene 10-5 → 10-9
Rørene whirliemixes og der overføres 1 mL til den tilhørende tomme petriskål.
Du kan benytte den samme pipettespids, hvis du starter med den mest
fortyndet dvs. 10-9
Medtag en sterilitetskontrol ved at afpipettere 1 mL sterilt saltvand i en tom
petriskål.
Efter alle afpipetteringerne påhældes hver skål med ca. 15 mL smeltet PCA
(ca. 45C) og indholdet blandes grundigt, men forsigtigt ved rotation af
skålen.
b. Overfladeudsæd foretages fra rørene 10-4 → 10-8
Hvis pladerne er støbt samme dag, skal de tørres i varmeskab (37 C) i
minimum 15 min.
Udsæden skal fortages fra ét fortyndingsrør af gangen.
Røret whirliemixes og der overføres 0,1 mL med mikropipette til overfladen af
den støbte PCA plader. Med en steril drigalskispatel stryges væsken grundigt
over hele pladens overflade. Sørg for at have kontakt med agaren hele vejen
rundt.
Medtag en sterilitetskontrol ved at afpipettere 0,1 mL steril saltvand til
overfladen af en støbt PCA plader og stryg med drigalskispatlen.
Lad alle pladerne tørre ca. 15 min. inden inkubation.
Bemærk at en udsæd af 0,1 mL, – fx fra fortyndingen 10-4, medfører at den
tilhørende plade skal være mærket 10 -5!
Inkubation:
6) Pladerne (inkl. kontrolpladerne) inkuberes ved 37C med bunden opad i 1
døgn.
Aflæsning:
7) Læg pladerne fra de to metoder i rækkefølge 10 -9 – 10-5 + kontrol
8) Antallet af kolonier på de enkelte plader tælles og noteres i skemaet. Start med
10-9 pladen.
For de plader hvor kolonitallet er så højt, at det ikke er praktisk muligt at tælle
antallet, noteres det med TNTC.

Laborantuddannelsen
Celletælling af Saccharomyces cerevisiae (Bagegær):

Prøveforberedelse:
1) Fremstil en gæropslemning ved at afveje 0,2 g bagegær, som opslemmes i 200
mL sterilt 0,9% NaCl-opløsning. Der fremstilles kun én gæropslemning til hele
studiegruppen.
Fyldning af tællekammer:
2) Et dækglas (specielt beregnet til tællekammer) anbringes på tællekammeret.
3) Sug herefter lidt gæropslemning op i en pasteurpipette.
4) Pasteurpipettens spids sættes ved randen af tællekammerets dækglas, og
væske med gærsuspension vil trækkes ind i tællekammeret på grund af vandets
overfladespænding.
5) Begge tællefelter fyldes.
Tælling:
6) Ved mikroskopi (anvend evt. fasekontrastmikroskopi) med passende forstørrelse,
tælles cellerne i en B-rude. Hvis der opnås et celletal, som er mindre end 100
celler, tælles endnu en B-rude.
7) Celler på øverste streg og celler på højre streg tælles med, medens celler på
nederste og venstre streg ikke tælles med (se bilag 1).
8) Gentag tælling af celler i det andet tællefelt på tællekammeret.
9) Notere tællekammerets højde.
10) Tællekammeret og dækglasses renses med en vatpind dyppet i sprit og lægges
tilbage i æsken.
Optisk densitet og celletal (E.coli):

Fortyndingsrække:
1) Mærk 10 sterile 5 mL NaCl-rør nr. 1 til 10.
2) Udtag 5 mL E.coli kultur til rør mærket nr. 1.
3) Foretag en tofolds-fortynding af E.coli- kulturen med udgangspunkt i rør nr. 1.
Der benyttes en ny pipettespids ved hver udtagning og indholdet blandes
omhyggeligt på whirlingmixeren inden udtagningen til det næste rør dvs.
Whirling-mix rør 1 og overfør 5 mL fra rør 1 til rør 2. Whirling-mix rør 2 og
overfør 5 mL fra rør 2 til rør 3 osv.

Laborantuddannelsen
Celletælling vha. tællekammer:

4) Foretag en celletælling på ét af fortyndingsrørene med E. coli- kulturen.
5) Se fremgangsmåden under Celletælling af Saccharomyces cerevisiae
(Bagegær)
6) Hvis celletætheden vurderes som værende for høj eller for lav, vælges et andet
fortyndingsrør til celletællingen.
Optisk densitet vha. spektrofotometer:

7) Indstil spektrofotometret til måling ved 600 nm.
8) Nulstil på 0,9% NaCl-opløsning og mål OD på alle fortyndingerne i rørerne
mærket 1 til 10.
Affald:
Mikrobiologisk affald behandles i henhold til SOP nr. 04.01.3 Håndtering af biologisk
affald.

• Fremstil et skema til ”optisk densitet og celletal”, som du skal skrive de målte
absorbanser i. Find evt. inspiration i skema 1 og skema 2 under
”Resultatskemaer”. Skemaet skal minimun in deholde: fortyndingsnumre samt
blind, absorbanser, målt bølgelængde samt celletællings resultat.

Laborantuddannelsen
Resultatbehandling af kimtalsbestemmelse af E.coli ved pladespredning:

• Beregn kimtallet af de 2 udpladninger hver for sig:
- Hvis der kun er ét kolonital inden for tællegrænserne (idet der benyttes
tællegrænser på 20 – 200 kolonier) angives kimtallet på sædvanlig vis. (med
2 betydende cifre).
C1
Kim = ,
V1
- Hvis der er to forskellige fortyndinger med kolonital inden for tællegrænserne
for samme udpladningsmetode, udregnes der et vægtet kimtal. (med 2
betydende cifre). Kimtallet beregnes ved:
C 1 + C 2 + .....+ C n
Kim = ,
V 1 + V 2 + .....+ V n
hvor C 1, C2, ..... C n er antallet af kolonier talt i fortyn dingerne V 1, V2, ..... Vn .
• Kommenter de 2 sterilitetskontroller.
Resultatbehandling Celletælling af Saccharomyces cerevisiae (Bagegær):

• Udregn sum af celletal i de talte B-ruder samt gennemsnit af celletal i én B-rude fra
hver af de to tællefelter på samme tællekammer.
• Beregn koncentrationen af antal gærceller/mL fra hver af de to tællefelter på
samme tællekammer. Benyt formlen:
Gennemsnit af celletal i en B −rude 1000L / mL

Anta l gærceller / mL gærsuspension =
B−rude volumen( L)
• Udregn gennemsnit af koncentrationen af antal gærceller/mL samt %RSD.

• Udregn antallet gærceller pr. pakke gær.
Resultatbehandling af optiske densitet og celletal (E.coli):

• Beregn celletallet i de enkelte fortyndingsrør ud fra den ene celletælling der er
foretaget (punkt 5-7).
• Foretag en grafisk afbildning af OD som funktion af celletallet (y-aksen: OD, x-
aksen: celletallet).
• Vurder, om der er linearitet mellem celletal og optisk densitet for E. coli kulturen.

Laborantuddannelsen
Resultatskemaer
Skema 1: Kimtalsbestemmelse af E.coli ved pladespredning
Antal kolonier
Kim/mL
10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
Dybdeudsæd
Overfladeudsæd
Sterilitetskontrol dybdeudsæd: Antal kolonier
Sterilitetskontrol overfladeudsæd: Antal kolonier
Skema 2: Celletælling af Saccharomyces cerevisiae (Bagegær)

Tællekammerets højde:______________.
Celletal i en B-rude
Sum af celletal i de
Rude Rude Rude Rude
talte B-ruder
1 2 3 4
1. tællefelt
2. tællefelt
Gennemsnit Gennemsnit
Konc. Antal gærceller pr.
af celletal i af konc. %RSD
celler/ mL celler/ mL gram gær
én B-rude
1. tællefelt
2. tællefelt
Skema 3: Optiske densitet og celletal (E.coli)

Skema udarbejdes af studerende selv.

Laborantuddannelsen
BILAG 1
Om tællekammeret
Et tællekammeret består af et tykt objektglas med et lavere midterfelt, der fungerer som
kammer. Kammerhøjden kan være 0,1mm eller 0,05 mm, og er angivet som dybden af
kammeret (tiefe).
I det lave midterfelt er indridset to tællefelter omgivet af afløbsgrøfter. Tællefelterne kan
uden forstørrelse skimtes som to små kryds.
De to små kryds, der består af meget fint indridsede streger, afgrænser et tællefelt på 1
mm2, som inddeles i mindre kvadratiske eller rektangulære felter.
Hvis kammerdybden er 0,1 mm vil et tællefelt med siderne 1 mm rumme 0,1 mm x 1 mm2
= 0,1 mm3 = 0,1 L= A-rude (se skitsen side 10 for andre kammerdimensioner)
Hvis kammerdybden er 0,05 mm vil et tællefelt rumme 0,05 mm x 1 mm2 = 0,1 mm3 =
0,05 L = A-rude.
Tællefelt
Thoma´s tællekammer

Laborantuddannelsen
Forstørret tællefelt
← 0.25 mm → Lille kvadrat
B-rude
←
← 0.25 mm →
0.25 mm →
BB-rude
B
-
r
← u mm
0.25 →
d
e
← 1.00 mm ~ A-rude →
A-rude : 1 x 1 mm B-rude: 0,25 x 0,25 mm Lille kvadrat: 0,050 x 0,050 mm
Kammerets dimensioner Længde Areal Højde Volumen

mm mm2 mm μL
Hele kammeret = A-rude 1,00 1,000 0,05 0,05000
Stort kvadrat = B-rude 0,25 0,0625 0,05 0,003125
Lille kvadrat 0,050 0,0025 0,05 0,000125
Hele kammeret = A-rude 1,00 1,000 0,10 0,10000

Stort kvadrat = B-rude 0,25 0,0625 0,10 0,006250
Lille kvadrat 0,050 0,0025 0,10 0,000250

Laborantuddannelsen
Øvelse 9: Introduktion til DNA-arbejde, PCR og gelelektroforese Institut f or Teknologiske
Øvelse 9
Introduktion til DNA-arbejde, PCR og
gelelektroforese
(Estimeret tidsbrug: 6 lektioner)
Mål:
Målet med øvelsen er at stifte bekendtskab med DNA-arbejde, herunder brug af PCR-
metoden til opformering (amplifikation) af DNA, gelelektroforese til visualisering af DNA
og Nanodrop til kvantificering af DNA.
Princip:
”Polymerase Chain Reaction”, som forkortes PCR, er en metode til amplifikation af et
bestemt fragment af DNA fra lav koncentration til en koncentration, der kan detekteres.
Metoden har mange anvendelsesmuligheder, fx detektion af specifikke gener,
bakterieidentifikation, kloning mv.
To primere, en buffer og et mix af de fire forskellige nukleotider (dNTP-mix), som DNA
består af, blandes sammen i et PCR-rør med varmestabilt enzym og DNA-template.
Røret placeres i et PCR-apparat, som kører et temperaturprogram, hvorved der sker en
in vitro DNA-syntese i røret. På denne måde kan man i løbet af få timer fremstille
millioner af kopier af sit udgangsmateriale.
Gelelektroforese er en metode til visualisering af DNA og bestemmelse af DNA-
fragmenters størrelse (fx fra en PCR-reaktion). Ved påsætning af DNA på en
agarosegel, og påvirkning af et elektrisk felt, adskilles DNA-fragmenterne efter størrelse,
idet de mindre molekyler bevæger sig hurtigere i gelens netværksstruktur end større
molekyler. Et fluorescerende farvestof i gelen binder specifikt til DNA, således at man
ved belysning af gelen med UV lys vil kunne se fragmenterne som lysende bånd på
gelen.
Nanofotometer er et spektrofotometer, der kan måle på meget små voluminer (1-5 µL).
Bestemmelsen af DNA-koncentrationen vha. Nanofotometer bygger på UV
spektrofotometri, idet DNA har et absorptionsmaximum ved 260 nm.
Relevant teori:
Fra lærebogen: ”Molekylæbiologi og biokemi”:
• Genteknologiske metoder: Bestemmelse af DNA-koncentration, PCR-metoder,
agarose gelelektroforese.
Udarbejdet af: JAKN/LIDV Dato: 29.08.2018 side 1 af 11

Laborantuddannelsen
PCR:
• PCR-buffer (10X) uden MgCl 2
• MgCl 2 opløsning (10X) 25 mM
• dNTP mix (10 mM af hhv. dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
• Template 1: pUC18 DNA 1 ng/L opløst i sterilt vand.
• Template 2: -DNA (Lambda-DNA) 1 ng/L opløst i 1x TE-buffer
• Varmestabilt enzym (Taq polymerase, 5 units/μL)
• Sterilt vand
• Primere:
- amp1: (5´ GAT ACG GGA GGG CTT ACC AT 3´) 10μM
- amp2: (5´ CCG AAG AAC GTT TTC CAA TG 3´) 10μM
- KP 1: (5´ GAT GAG TTC GTG TCC GTA CAA CTG G 3´) 10μM
- KP 2: (5´ GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CGC C 3´) 10μM
Elektroforese:
• Elektroforesebuffer: 1 X TAE som fremstilles ud fra 10 X TAE (10 X TAE buffer købes
færdigblandet: 200 mM Tris-acetat, 10 mM EDTA, pH 8,0)
• Agarosegeler: 1 % agarosegel, 1 X TAE-buffer, GelRed (10000X) i mikrocentrifugerør
• DNA loading buffer (købes færdigblandet):
• Molekylvægt standard : 100 bp Ladder, 0,1 g/L
Apparatur og materialer:
• Pipetter og spidser
• Eppendorfrør
• PCR rør
• PCR-termocycler
• Elektroforesekar + strømforsyninger
• Mini centrifuger
• Fotoudstyr
• Nanofotometer
Gravide og ammende:

Laborantuddannelsen
Fremgangsmåde:
I denne øvelse skal I vha. PCR-metoden identificere et ampicillin-resistensgen (bla),
som sidder på et plasmid kaldet pUC18. Et plasmid er oftest et lille ringformet DNA-
molekyler, som ikke er knyttet til genomet hos bakterier. Bakterier, som bærer pUC18, er
resistente over for antibiotikummet ampicillin.
I øvelsen benyttes specifikke primere, som forventes at amplificere et DNA-fragment på
590 basepar (bp) fra bla-genet på pUC18. Amplifikatet verificeres efterfølgende ved
agarose-gelelektroforese.
Som kontrol for at reaktionsbetingelserne under PCR-forløbet er i orden medtages
kontrolprimere og kontroltemplate (-DNA som er virus DNA). Amplifikationen af denne
kontrol skal give et amplifikat på 500 bp under de givne PCR-betingelser.
DAG 1.
Opsætning af PCR-reaktion og PCR-kørsel
Fremstilling af PCR-master mix og opsætning af PCR:
1) Øvelsen udføres parvis, og der benyttes handsker ved håndtering af alle reagenser.
2) Det er vigtigt at alle afpippeteringen foretages visuelt dvs.:
- ved udtag fra et rør holdes røret i hånden, og det observeres at der suges reagens
op i pipettespidsen.
- ved tømning af pipettespidsens indhold til det nye rør holdes røret i hånden, og det
observeres af reagenset udskydes til det nye rør.
3) Alle reagensblandinger til PCR udleveres af en tekniker eller en underviser.
4) Reagensblandingerne centrifugeres kortvarigt (1-2 sek.) for at samle indholdet på
bunden af rørene og sættes op på is
5) I et Eppendorfrør fremstilles et mastermix til 4 prøver. I skal køre 3 prøver, men
pga. forventet ”spild” ved pipettering mm. fremstiller man typisk et mastermix til det
antal prøver, man vil undersøge + en ekstra prøve (eller evt. + 10%).
Nedenstående komponenter blandes til fremstilling af mastermix:
- 4 μL dNTP-mix (10 mM af hver dNTP)
- 20 μL 10X PCR buffer (uden MgCl2)
- 20 μL MgCl 2 (25 mM)
- 2 μL Taq polymerase (5 units/μL)
- 130 μL sterilt vand.
6) Mærk 3 PCR rør 1-3 og overfør 44 μL mastermix til hvert af de 3 PCR-rør
7) Til hvert af PCR rørerne 1 og 2 tilsættes 2,5 μL primer amp1 (10 μM) og 2,5 μL
primer amp2 (10 μM)
8) Til PCR rør 3 tilsættes 2,5 μL primer KP1 (10 μM) og 2,5 μL primer KP 2 (10 μM)

Laborantuddannelsen
9) Til PCR rør 1 tilsættes 1 μL Template 1: pUC18 DNA (1 ng/μL)

10) Til PCR rør 2 tilsættes 1 μL sterilt vand (No Template Control, NTC)
11) Til PCR rør 3 tilsættes 1 μL Template 2: λ-DNA (1 ng/μL)
12) Luk rørerne og centrifuger rørene kortvarigt (1-2 sek.) for at samle prøverne på
bunden af rørene og fjerne evt. bobledannelse
13) Sørg for at rørene er ordentligt lukket og pres rørene godt ned i brøndene i PCR-
apparatet
14) Sæt rørene i et for-programmeret PCR apparat (se nedenfor)
Efter opsætning af prøverne vil den endelige koncentration af reagenser i hvert PCR
rør (i 50 μl) være:
MgCl2: 2,5 mM
dNTP: 200 M af hver base
DNA-polymerase: 2,5 units
Primere: 0,5 M af hver primer
DNA-template: 0,02 ng/µL pUC18

eller
0,02 ng/µL λ DNA
Tabel 1. Endelige koncentration af reagenser i hvert PCR rør (i 50 μl)
Programmering af PCR apparatet:

Ved programmeringen af PCR-apparatet skal I følge apparatvejledningen.
Programmeringen skal kontrolleres af underviser/tekniker.
Følgende temperatur- og tidsprofil anvendes ved opformeringen af DNA:

Trin 1 Trin 2 Trin 3 Trin 4
Indledende Denaturering, primer annealing Af sluttende Opbevaring
og polymerisering (30 gange)
denaturering polymerisering
Tid i min. 5 1 ½ 1 5 Max

Temp. i °C 94 94 57 72 72 4
Tabel 2. Temperatur- og tidsprofil

Laborantuddannelsen
Fremstilling og støbning af 1% agarosegel til elektroforese af PCR produktet

1) Der fremstilles en 1% agarosegel ved at opslæmme 0,35 g agarose NA i 35 mL 1 X
TAE- buffer i en BlueCap flaske.
2) Opslæmningen opløses herefter ved opvarmning til kogning i en skål med vand i en
mikrobølgeovn. Husk at låget til BlueCap-flasken ikke skal være skruet helt på, samt
at flasken og dampen efter opvarmning er meget varm.
3) Fyld op med 1 X TAE-buffer, hvis noget af væsken er fordampet.
4) Anbring støbeformen på et vandret indstillet n iveaubord.
5) Anbring kammen i den ene ende af støbeformen med tænderne mod midten.
Kammens tænder må ikke berøre bunden af støbeformen.
6) Den flydende gel afkøles til ca. 60C, der tilsættes 4 μL af nukleinsyrefarven GelRed
(10000X), og gelen hældes i gelformen.
7) Når gelen er størknet, lægges den i et fugtigt kammer til næste dag.
DAG 2.
Elektroforese af PCR produkt
1) Gelen placeres i elektroforesekarret, så prøverne vandrer mod den positive pol (rød).
2) Kammen trækkes forsigtigt op, og der påfyldes buffer, til bufferen lige netop dækker
hullerne efter kammen.
3) Prøverne forberedes til elektroforese (punkt 4-7). Dernæst loades prøver og markør.
4) Fra hvert af de 3 PCR rør udtages 10 μL prøve i et nyt rør, som efterfølgende
tilsættes 3 μL loadingbuffer. Der blandes forsigtigt ved pipettering. Husk at gemme
PCR rørene til DNA-koncentrationsbestemmelsen, se nedenfor.
5) Som markør benyttes molvægtstandarden 100 bp Ladder (se fragmentstørrelserne i
bilag 2). 5 L molvægtstandard (0,1 μg/μL) blandes med 5 μL sterilt vand og 3 L
loadingbuffer i et nyt rør. Bland ved pipettering.
6) Centrifuger kort for at spinne prøverne ned i bunden af rørene og fjerne en evt.
bobledannelse.
7) For at træne prøvepåsætning til gelen (kaldet loading) afpipetteres 10 μL
loadingbuffer til de yderste gelbrønde.
8) 10 µL af hver prøve og markør påsættes gelen.
9) Spændingen sættes til 80V, og elektroforesen kører i ca. 90 min. Sæt elektroforesen
i gang straks efter påsætning af prøver og kontrol på gelen.
10) Strømmen slukkes, og gel og støbeform tages forsigtigt op af karret. Pas på at gelen
ikke falder på gulvet.
11) Gelen fotograferes under UV-lys. Få hjælp at en tekniker eller underviser.

Laborantuddannelsen
Følgende resultat forventes af elektroforesen:

- PCR rør 1: pUC18 som template. Her forventes et bånd på 590 bp.
- PCR rør 2: Reagenskontrol (prøve uden template DNA). Her forventes der ikke
noget bånd.
- PCR rør 3: λ-DNA som template (kontrol). Her forventes der et bånd på 500 bp.
Bestemmelse af DNA koncentrationen ved Nanofotometer:

1) DNA-koncentrationen for PCR-rørene 1 og 3 fra Dag 1 måles vha. Nanofotometer.
2) Ved måling af DNA-koncentration på Nanofotometer følges vejledning for måling af
”nukleinsyrer, dobbelt strenget DNA” (dsDNA) i apparatmappen.
3) Alle indstillinger af apparatet noteres i skema 1.
4) Målingerne udfyldes i skema 2.
Affald:
Biologisk aktivt materiale må ikke hældes i vasken.
Brugt engangsudstyr opsamles i plastdunke med passende desinfektionsmiddel.
Dunkene bortskaffes som biologisk affald.
Handsker smides i biologisk affald.
Geler lægges i en pose og smides til biologisk affald.

• Vis ved beregninger at koncentrationerne angivet i tabel 1 er rigtige.
• Udfyld skema 1: Noter indstilling af Nanofotometer.

• Udfyld skema 2: Noter de målte DNA-koncentrationer i PCR-rørene 1 og 3 efter PCR-
reaktionen. Beregn total DNA (ng i 50 µL) i de forskellige rør og kommenter på
forskelle i DNA-koncentrationer i PCR-rørene før og efter PCR-reaktionen.
• Udfyld skema 3: Indsæt gelbillede og husk at markere brøndene med nr. direkte på
gelbilledet. Angiv indhold af prøven påsat gelen i hver brød. (f.eks pUC18).
• Udfyld skema 4: Angiv vandringslængde for hver af Ladderens bånd (mål direkte på
gelbillede med en lineal). Udarbejd en standardkurve. (X-aksen = vandringslængde af
DNA-fragmenter i markøren, Y-aksen = logaritmen til molvægten (i bp) for DNA-
fragmenterne (se bilag 2).

Laborantuddannelsen
• Udfylde skema 5: Angiv vandringslængde for hvert PCR-produkt (mål direkte på gel-
billede med en lineal). Bestem ved hjælp af ovenstående standardkurve PCR-
produkternes størrelse i pb. Angiv om resultaterne passer med det forventede.
Resultatskemaer:
Resultaterne skal indføres i skemaer i journalbogen. Resultatskemaer klippes ud og
sættes ind i journalbogen FØR, der indføres resultater.
Skema 1. Indstilling af Nanofotometer
Lid Factor: Units:
Dilution Factor: Factor:
Background:
Skema 2. DNA koncentrationen målt ved Nanofotometer
DNA-template: Målt DNA- Total volumen i Total DNA i PCR-rør Beregnet

koncentration i PCR-rør PCR-rør: (ng) efter PCR- koncentration i PCR
efter PCR-reaktionen reaktionen rør før PCR-
reaktionen
PCR-rør 1
(pUC18)
PCR-rør 3
(λ-DNA)

Laborantuddannelsen
Skema 3. Gel-billede af PCR-produkter

Gel-billede: Indsæt billede af gelen her. Husk at markere Gel brønd Indhold af prøven påsat
brøndene med nr. på billedet. nr. gelen
Skema 4. Markørens vandringslængde i gelen
Markøren: Forventede log (f ragmentstørrelse i Målt vandringslængde i gelen (mm)

bånd samt bp)
100 bp Ladder
størrelse (bp)
Brønd nr. i 1500
gelen:
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100

Laborantuddannelsen
Skema 5. PCR produkternes størrelse bestemt ved gelelektroforese:
Gel brønd Hvad Forventet PCR- Målt PCR- Kommenter

nr. indeholder produkt samt vandringslængde produktstørrelse i resultaterne og
prøven? størrelse. i gelen (mm) bp (bestemt ud fra angiv om de
Fx PCR-rør 1 (DNA-
standardkurve for passer med det
template pUC18) markøren). f orventede.

Laborantuddannelsen
Bilagsoversigt:
Bilag 1: pUC18 vektorkort

Bilag 2: Molekylevægt standard (100 bp ladder)
Bilag 1
Plasmidet pUC18 er et lille, cirkulært DNA-molekyle, som indeholder forskellige gener, herunder genet
for ampicillin resistens (bla). Plasmidet er kunstigt fremstillet og benyttes i kloningssammenhænge. De
farvede forkortelser øverst til højre er eksempler på enzym-skæringssteder i MCS-sitet på plasmidet.

Laborantuddannelsen
Bilag 2:
100 bp Ladder (DNA-markør) fra Promega. De lysende bånd repræsenterer forskellige

fragmenter af DNA, fra 100 basepar (bp) til 1500 bp.

Laborantuddannelsen
Øvelse 10: Gramfarvning Institut f or Teknologiske
Øvelse 10
Gramfarvning
Estimeret tidsbrug: 1 lektion
Mål:
At kunne fremstille mikroskopiske præparater og udføre en gramfarvning af disse.
Princip:
Gram-farvning: En farvning hvor de Gram-positive bakterier farves blå, og de Gram-
negative farves røde.
Relevant teori:
Praktisk mikrobiologi: Kap. 3.11, 3.12.3
Mikrobiologi: Kap. 3.6.2
Reagenser, kemikalier og kultur:

• Krystalviolet opløsning (solution 1)
• Lugol’s opløsning (solution 2)
• Decolorisation opløsning (solution 3+4)
• Safranin opløsning 1 % (solution 5)
• Natriumthiosulfat
• Der udleveres 2 bakterier i renkultur:
Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) på PCA
Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) på PCA
• Øje-podenål 1 µL
• Bunsenbrænder
• Træklemme
Udarbejdet af: BOGR Dato: vides ikke side 1 af 3

Laborantuddannelsen
Gravide og ammende:
• Decolorisation opløsning
Fremgangsmåde:
Fiksering
1. Lidt kolonimasse udrøres med podenål i en lille dråbe vand på et objektglas.
2. Fordel på så stort areal som muligt og lad det lufttørre til vandet er fordampet.
3. Præparatet fikseres ved at objektglasset, med præparatsiden opad, føres 3 gange
gennem en gasflamme, ca. 1 sek. pr. gang. Brug en træklemme til at holde
objektglasset.
4. De fikserede præparater farves og undersøges i mikroskop.
Gramfarvning
Bemærk at nedenstående opskrift er lidt forskellig fra opskriften angivet i praktisk mikrobiologi.
1. Lidt natriumthiosulfat hældes i farvebakken.
2. Objektglasset placeres ved hjælp af et par glasstænger oven på farvebakken. Brug en
træklemme til at hold objektglasset.
3. Det fikserede område dækkes af Krystalviolet (solution 1) og henstår i 90 sek.
4. Solution 1 hældes ned i farvebakken og der skylles med lidt vand og henstår i 30 sek.
5. Lugol’s opløsning (solution 2) tilsættes og henstår i 3 minutter.
7. Decolorisation opløsning (solution 3+4) tilsættes og henstår i 5 – 10 sekunder.
8. Solution 3+4 hældes ned i farvebakken og der skylles med lidt vand og henstår i 30
sek.
9. Safranin opløsning (solution 5) tilsættes og henstår i 1 minut.
11. Vandet afdryppes og objektglasset tørres på underside og kanter.
12. Objektglasset lufttørres i 5 minutter før mikroskopering.
Aflæsning ved mikroskopi:

Laborantuddannelsen
1. Mikroskopér præparatet ved alm. mikroskopi og en passende forstørrelse.

2. Noter form og farve.
3. Tag evt. et billede af præparatet gennem mikroskopet.
Affald:
Objektglas og podenåle håndteres som Klinisk Risikoaffald ifølge tilhørende
vejledning.
Væsken i farvebakken opsamles i affaldsdunk mærket Affald H.

Angiv om farvningen gav det ventede resultat og beskriv bakteriernes form.
Vedhæft eventuelt et billede af de mikroskoperede præparater.
Resultatskema:
Skema 1: Gramfarvning af bakterier:
Bakterie Form Farve Konklusion

Skråplan: 1. sal – 2 forløb
Grundlæggende
analyseteknik
Lab - dag
2. runde 1. sal
Skråplan
Dag 6
Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag 5
HPLC I /HPLC II
Studiegr. 1 AAS I AAS II GC I GC II HPLC I /HPLC II
Øv. 22 el. Øv. 23
Øv. 13 Øv. 14 Øv. 20 eller øv. 21 Øv. 20 eller øv. 21 Øv. 22 el. Øv. 23
Rengøring
Dag 6
GC II
Studiegr. 2 HPLC I /HPLC II HPLC I /HPLC II AAS I AAS II GC I
Øv. 20 eller øv. 21
Øv. 22 el. Øv. 23 Øv. 22 el. Øv. 23 Øv. 13 Øv. 14 Øv. 20 eller øv. 21
Rengøring
Dag 6
AAS II
Studiegr. 3 GC I GC II HPLC I /HPLC II HPLC I /HPLC II AAS I
Øv. 14
Øv. 20 eller øv. 21 Øv. 20 eller øv. 21 Øv. 22 el. Øv. 23 Øv. 22 el. Øv. 23 Øv. 13
Rengøring
HPLC ER ALTID ANSVARSGRUPPE
Fordel jer på øvelser internt i studiegrupperne ved HPLC og GC

Laborantuddannelsen
Øvelse 13: Indledende AAS Institut for Teknologiske
Øvelse 13
Indledende AAS – Kalium i ice tea
Estimeret tidsforbrug: 5 lektioner, enkeltmandsøvelse, dog enkelte aktiviteter som studiegruppe
Mål:
At blive fortrolig med brugen af AAS apparatur.
At opnå en forståelse af, hvilke indvirkning ændring af forskellige parametre har på et
måleresultatet.
At sikre at AAS apparaturet er optimeret korrekt.
At fremstille en standardrække og en standardkurve.
At kontrollere standardkurvens validitet.
At kvantificere metalindholdet i en prøve.
Princip:
Atomabsorptionsspektrofotometri (AAS) er en metode til kvantitativ bestemmelse af
metaller i organisk/uorganisk opløsning.
AAS er opbygget af en lyskilde (hulkatodelampe), atomiseringsenhed (forstøverenhed
og brænderhoved), monochromator, detektor (fotomultiplikator) samt en
signalforstærker.
Prøven suges op i forstøverenheden og blandes med oxidant (atm. luft) og fuel
(acetylen). I flammen bringes metalionerne på atomform. Hulkatodelampen, der er
belagt med det metal, der ønskes detekteret, udsender en lysstrøm med tilstrækkelig
energi til at exciterer metalatomerne i flammen. Lysstrømmen, der ikke absorberes af
metalatomerne, passere monochromatoren og registreres af detektoren.
Måleprincippet i AAS bygger på Beers lov: A = konstant x C. Der er lineær
sammenhæng mellem absorbans og koncentration i et givent koncentrationsområde.
Forudsætningen for denne sammenhæng er bl.a., at AAS apparatet er korrekt
optimeret. Dette undersøges ved at foretage et sensitivity check (karakteristisk
koncentrations check). Den målte opløsning skal give en absorbans ≥ 0,2.
Udarbejdet af: TIPE Dato: 26.06.2018 Side 1 af 10

Sidst revideret af: HMAR Dato: 24.02.2020
Laborantuddannelsen
Relevant teori:
Analyseteknik 4. udgave; Jeppesen H.; Bergsøe M.N; Simonsen F.
 AAS – ”Analyse teknik” s. 271-283
 Opbygning og analyseprincip
 Optimering – herunder sensitivity
 Måleprocedure
 Resultatbehandling
 65% HNO3
 0,1 M HNO3 (opløsningsmiddel/reagens)
 1000 mg K/L (stamopløsning)
 10 mg K/L (standard A opløsning – fremstilles af studerende)
 1,0 mg K/L (kontrol – fremstillet af tekniker)
 2,0 mg K/L (sensitivity check – fremstillet af tekniker)
 Fersken ice tea
Apparatur og materiale:
 AAS
 Målekolber
 Fuldpipetter
 Bægerglas
 10 mL engangssprøjter
 0,45 µm membranfilter
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier
 Intet at bemærke

Laborantuddannelsen
Fremgangsmåde:
Indledende
 Anvend dobbelt demineraliseret vand til fremstilling af 0,1 M HNO3.
 Alt anvendt glasudstyr skal skylles med 0,1 M HNO3 inden brug. Dette gøres
for at minimere risikoen for kontaminering med uønskede metaller såsom Na
og Ca.
 Som opløsningsmiddel anvendes 0,1 M HNO3.
 Følg apparatvejledningen ved opstart. For korrekt bølgelængde og slit se
”Standard Conditions for the determination af individual elements” Perkin
Elmer (ligger ved AAS apparatet og er vedlagt apparatvejledning).
 Som udgangspunkt vælges de parametre indstillinger der, samlet set,
angives ved lavest ”Relative Noise”.
 Korrekt lampestrøm ses på hulkatodelampen og/eller lampens
opbevaringskasse.
 Betjeningsvejledning punkt 1.12 INT.TIME: anbefales 3 sec.
 Betjeningsvejledning punkt 1.14 REPLICATES: anbefales 3.
 Betjeningsvejledning punkt 1.22 READ DELAY: anbefales 3 sec.
 For at sikre at brænderhovedet er gennemvarm inden måling, skal AAS
apparatet være opstartet ca. 10 min. inden måling.
Lysudsendelse
(fælles for studiegruppen)
1. Opsug hhv. alm. ledningsvand, demineraliseret vand og dobbelt demineraliseret
vand.
2. Noter flammefarve.
3. Med en finger røres rundt i dobbelt demineraliseret vand.
4. Opsug opløsningen.
5. Noter flammefarve.
Sensitivity check
1. Nulstil apparatet på det reagens sensitivity check opløsninger er fremstillet på.

2. Mål sensitivity check opløsningen.
3. Hvis den målte opløsning ikke giver en absorbans ≥ 0,2. Tilkald
underviser/tekniker. (der må under ingen omstændigheder indstilles på
lampe/brænderhoved position).

Laborantuddannelsen
Standardrække og standardkurve
Ud fra standard A opløsningen (10 mg K/L) fremstilles en standardrække med følgende
K-indhold:
Opløsning nr. 1: 0,4 mg K/L
1. Nulstil apparatet på det reagens standardopløsningen er fremstillet på.

2. Mål på standardopløsningerne.
3. Vurder standardkurven visuelt.
4. Krav til korrelationskoefficienten: r ≥ 0,999
Kontrol af standardkurvens validitet
1. Nulstil apparatet på det reagens kontrolopløsningen er fremstillet på.

2. Mål kontrolopløsningen to gange.
3. Krav til præcision: %RSD < 1%
4. Krav til nøjagtighed: relativ målefejl fra kontrolkoncentrationen < 5%
Kvantitativ bestemmelse af K i ice tea
Alle gruppemedlemmer fremstiller tre uafhængige prøveopløsninger.
1. Filtrer ice tea’en gennem filterpapir og derefter gennem 0,45 µm membranfilter

2. Overfør 5 mL ice tea kvantitativt til 50 mL målekolbe.
3. Efterfyld med 0,1M HNO3 til mærket og omryst.
Kørsel af prøver
4. Sensitivity check udføres endnu engang for at tjekke apparatets stabilitet.

Absorbansen noteres i skema 5
5. Mål prøverne og noter absorbanserne i skema 6
6. Prøverespons skal ligge inden for standardkurvens lineære del.
7. Ved yderlig fortynding skal prøven fortyndes med 0,1 M HNO3.

Laborantuddannelsen
Ændring af forskellige parametre på AAS apparatet

(fælles for studiegruppen, hvis der er tid til det)
Anvend den fremstillede standardopløsning på 1,0 mg K/L. Mellem hver ændring af

parametre, suges der kortvarigt på 0,1 M HNO3.
Apparatindstillingen:
Punkt 1.12 INT.TIME: 3 sec.
Punkt 1.14 REPLICATES: 3.
Punkt 1.22 READ DELAY: 3 sec.
Mål standardopløsningen seks gange uafhængig af hinanden.
2. Apparatindstillingen:
Mål standardopløsningen seks gange uafhængig af hinanden.
3. Ændre apparatindstillingerne:
Ændre slit indstillingen til 2 nm og mål standardopløsningen seks gange

uafhængig af hinanden.
4. Sæt slit indstillingen tilbage på standard conditions.
Ændre bølgelængden til 769,9 nm og mål standardopløsningen seks gange

uafhængig af hinanden.
Nedlukning
Apparatet nedlukkes som beskrevet i betjeningsvejledningen.
Affald:
Klassificering:
Saltpetersyre…% (kilde: C&L - forordningen)
Ox. Liq. 2; H272
Laborantuddannelsen
Skin corr. 1A, H314

Egne grænser:
Ox. Liq. 2; H272: C ≥ 99%
Ox. Liq. 3; H272: 65 % ≤ C < 99%
Skin Corr. 1A; H314: C ≥ 20%
Skin Corr. 1B; H314: 5 % ≤ C < 20%
Konklusion:
Affaldet kan bestå af koncentreret og fortyndet syre (under 1 w/w%).
På laborantuddannelsen ved Københavns Professionshøjskole hældes koncentrerede
syrer og baser i vasken i et stinkskab. Der efterskyldes med vand.
(Laborantuddannelsen Københavns Professionshøjskole har en syrebrønd i kælderen).
Fortyndet syre (under 1 w/w%) og fortyndet base (under 0,5 w/w%) hældes i vasken i
laboratoriet. Der efterskyldes med vand.

Før øvelsen skal følgende være besvaret i journalen:
1. Skitser kort princippet bag følgende funktionelle enheder: Hulkatodelampen,

atomiseringsenhed og monochromator.
2. Forklar kort forskellen mellem begreberne sensitivity og sensivity check.
3. Beregn sensitivity check koncentrationen (mg/L) for kalium, når sensitivity
koncentrationen er angivet til 0,028 mg/L.
4. Overvej, hvordan du vil omregne din fundne koncentration (mg K/L) i ice
tea’en til at kunne sammenligne med referenceværdien (mg K/100 g).
5. Lav en reagensseddel klar for fremstilling af 20L 0,1M HNO3 ud fra en 65%
HNO3. Der laves en reagensseddel for hele studiegruppen
Under/efter øvelsen skal følgende spørgsmål besvares og resultatskemaerne udfyldes:
1. Standardkurven laves i Excel med linjens ligning og korrelationskoefficient. Kurven

vedlægges journalbog.
2. Der laves et 95% konfidensinterval for resultaterne for den kvantitative

bestemmelse af K i ice tea, ved at anvende følgende formel:
Et 95% konfidensinterval er det interval omkring gennemsnittet, hvor den ”sande”

middelværdi for stikprøven med 95% sandsynlighed befinder sig.

Laborantuddannelsen
3. Beregn %RSD på forsøg 1, på forsøg 2 og på forsøg 3 (skema 7). Kommenter på

resultaterne fra forsøg 1 og 2 ift. hinanden. Kommenter på forsøg 1 og 3 ift.
hinanden. Kommenter på resultaterne fra forsøg 1 og 4 ift. hinanden.
4. Der kommenteres og konkluderes på alle resultater. Desuden inkluderes

beregningseksempler
5. Sammenhold sensitivity check koncentrationen af kalium, med tabelværdierne for

standard conditions
6. Omregn koncentrationen af kalium fra mg K/L til mg K/100 g for at kunne

sammenholde resultaterne for kalium i ice tea med relevante reference værdier.
COOP oplyser at deres ice tea fersken indeholder mellem 1-10mg K/100 g

Laborantuddannelsen
Resultatskemaer:
Klippes ud og limes ind i journalbogen før det praktiske arbejde. Resultatskemaerne udfyldes
med rådata under det praktiske arbejde. Resultatbehandling under og efter det praktiske
arbejde.
Skema 1: Lysudsendelse
Dobbelt Dobbelt demi.-

Demineraliseret
Prøvetype Ledningsvand demineraliseret vand (rørt rundt
vand
vand med en finger)
Flammefarve
Skema 2: Sensitivity check
Sensitivity koncentration (mg K/L)
Abs.
Angivet krav
Krav overholdt
Skema 3:Standardrække og standardkurve
Standardopløsning 1 2 3 4 5
Koncentration
mg K/L
Abs.
Krav til
standardkurve
Resultat/Krav
overholdt

Laborantuddannelsen
Skema 4: Kontrol af standardkurvens validitet
Beregnet Beregnet
Kontrol Abs. 1 Abs.2
koncentration koncentration
mg K/L
Krav til Resultat/krav Krav til Resultat/krav

præcision overholdt nøjagtighed overholdt -
(n=2) (n=2)
/ /0 -
Skema 5: Sensitivity check (før prøve kørsel)
Sensitivity koncentration (mg K/L)
Abs.
Angivet krav
Krav overholdt
Skema 6: Kvantitativ bestemmelse af K i ice tea
Koncentration Resultat/krav
Beregnet mg K/L overholdt
Krav til
Prøve Abs. koncentration FF
præcision
mg K/L
Ufortyndet prøve (n=3)

Laborantuddannelsen
Skema 7: Ændring af forskellige parametre på AAS apparatet
INT.TIME:3; REPLICATES:3; READ DELAY:3
Forsøg 1: Abs. 1 Abs. 2 Abs. 3 Abs. 4 Abs. 5 Abs. 6

Standardopløsning
mg K/L
Forsøg 2 Abs. 1 Abs. 2 Abs. 3 Abs. 4 Abs. 5 Abs. 6

Standardopløsning
mg K/L

Ændret slit indstilling til 2nm
Standardopløsning
mg K/L

Ændret bølgelængde: 769,9 nm
Standardopløsning
mg K/L

Laborantuddannelsen
Øvelse 14: AAS II Institut for Teknologiske
Øvelse 14
AAS II - Calcium og magnesium i øl
Estimeret tidsbrug: 5 lektioner, enkeltmandsøvelse
Mål:
At blive fortrolig med brug af AAS apparatur
At fortynde prøver til relevant koncentration
At kvantificere metalindholdet i en prøve vha. ekstern standard og fremstilling af en
standardrække.
Princip:
Atom aborption spektrometri (AAS) er en metode til bestemmelse af spormetaller i
en organisk/uorganisk opløsning.
Fra en hulkatodelampe udsendes lys af en passende bølgelængde. Dette lys
sendes gennem en acetylenflamme. Metalioner i opløsning forstøves i flammen.
Derved omdannes ionerne til gasformige atomer. Metalatomerne vil da absorbere
energi i form af lys. Reduktionen i lysenergien er proportional med indholdet at
metalatomer på gasform i flammen. Lysstrømmen, der ikke absorberes af
metalatomerne, passerer monochromatoren og registreres af detektoren.
Måleprincippet i AAS bygger på Beers lov: A = konstant x C. Der er lineær
sammenhæng mellem absorbans og et givent koncentrations område.
Forudsætningen for denne sammenhæng er bl.a., at AAS apparatet er korrekt
optimeret. Dette undersøges ved at foretage et sensitivity check (karakteristisk
koncentrations check). Den målte opløsning skal give en absorbans ≥ 0,2.
Relevant teori:
Analyseteknik 4. udgave; Jeppesen H.; Bergsøe M.N; Simonsen F.
 AAS – herunder opbygning og analyseprincip
 Optimering – herunder sensitivity
 Måleprocedure
 Resultatbehandling
Laboratorieberegninger 5. udgave; Ethelberg U.

 Fortyndinger
 Standardisering
Udarbejdet af: JSPE Dato: 03.07.2018 side 1 af 10

Laborantuddannelsen
 65% HNO3
 0,1 M HNO3 (opløsningsmiddel/reagens)
 1000 mg Ca/L (stamopløsning)
 10 mg Ca/L (standard A - Ca opløsning – fremstilles af studerende)
 4,0 mg Ca/L (sensitivity check – fremstillet af tekniker)
 1000 mg Mg/L (stamopløsning)
 10 mg Mg/L (standard A - Mg opløsning – fremstilles af studerende)
 0,25 mg Mg/L (kontrol – fremstillet af tekniker)
 0,3 mg Mg/L (sensitivity check – fremstillet af tekniker)
 Prøve: Alm øl – afgasset på ultralydsbad
 Prøveopløsninger (P – Ca). Opløsningerne skal indeholde en 20X fortynding
af prøven (afgasset øl). Fortyndingen skal laves med 0,1 M HNO3.
 Prøveopløsninger (P – Mg). Opløsningerne skal indeholde en 200X
fortynding af prøven (afgasset øl). Fortyndingen skal laves med 0,1 M
HNO3 ud fra de gemte prøveopløsninger fra tidligere (P – Ca) som
fortyndes yderligere 10X
Apparatur og materiale:
 AAS
 100 mL målekolber
 Fuldpipetter
 Mikropipetter
 Bægerglas
 Ultralydsbad
 10 mL engangssprøjter
 0,45 µm membranfilter
Gravide og ammende:
Gravide og ammende må ikke arbejde med/håndtere følgende kemikalier
 Intet at bemærke
Fremgangsmåde:
Indledende
 Alt anvendt glasudstyr skal skylles med 0,1 M HNO3 inden brug. Dette
gøres for bl.a. at minimere risikoen for kontaminering med uønskede
metaller såsom Na og Ca.
 Som opløsningsmiddel anvendes 0,1 M HNO3.
 Følg apparatvejledningen ved opstart. For korrekt bølgelængde og slit se
”Standard Conditions for the determination af individual elements” Perkin
Elmer (ligger ved AAS apparatet og er vedlagt apparatvejledning).
 Korrekt lampestrøm ses på hulkatodelampen og/eller opbevaringskasse.
 Betjeningsvejledning punkt 1.12 INT.TIME: anbefales 3 sec.
 Betjeningsvejledning punkt 1.14 REPLICATES: anbefales 3.

Laborantuddannelsen
 Betjeningsvejledning punkt 1.22 READ DELAY: anbefales 3 sec.

 For at sikre at brænderhovedet er gennemvarm inden måling, skal AAS
apparatet være opstartet ca. 10 min. inden måling.
Calcium
Sensitivity check
1. Nulstil apparatet på det reagens sensitivity check opløsninger er fremstillet
på.
underviser/tekniker. (der må under ingen omstændigheder indstilles på
Ekstern standard
1. Ud fra standard A – Ca opløsningen (10 mg Ca/L) fremstilles en standard
med en koncentration på 2,5 mg/L
3. Mål på standardopløsningen.
Kvantitativ bestemmelse af Ca i alm. øl ud fra ekstern standard
Prøveforberedelse:
 Alle gruppemedlemmer fremstiller tre uafhængige prøveopløsninger (P –
Ca). Hver opløsning skal indeholde en 20X fortynding af prøven (afgasset og
filtreret øl). Fortyndingen skal laves med 0,1 M HNO3.
 Ifølge DTU fødevaredatabase
https://frida.fooddata.dk/ShowFood.php?foodid=198&1 er der ca. 6,5 mg
Ca/100g øl.
1. Mål på alle 3 prøveopløsninger (P – Ca). Opløsningerne gemmes til videre

brug.
Magnesium
Sensitivity check
1. Nulstil apparatet på det reagens sensitivity check opløsninger er fremstillet
på.
underviser/tekniker. (der må under inden omstændigheder indstilles på
Ekstern standard
1. Ud fra standard A – Mg opløsningen (10 mg Mg/L) fremstilles en standard
med en koncentration på 0,2 mg/L

Laborantuddannelsen
3. Mål på standardopløsningen.
Kvantitativ bestemmelse af Mg i alm. øl ud fra ekstern standard.
Prøveforberedelse:
 Alle gruppemedlemmer fremstiller tre uafhængige prøveopløsninger (P –
Mg) baseret på de første prøveopløsninger (P – Ca).
Hver opløsning skal indeholde en 200X fortynding af prøven (afgasset øl)
hvilket betyder at (P – Ca) skal fortyndes yderligere 10X for at fremstille
(P – Mg). Fortyndingen skal laves med 0,1 M HNO3.
 Ifølge DTU fødevaredatabase
https://frida.fooddata.dk/ShowFood.php?foodid=198&1 er der ca. 7,5 mg
Mg/100g øl.
1. Mål på prøveopløsningerne (P – Mg). Opløsningerne gemmes til videre

brug.
2. Mål desuden på den ene af prøveopløsningerne 3 gange yderligere.
Standardrække
Alle gruppemedlemmer fremstiller en standardrække.
Ud fra standard A - Mg opløsningen (10 mg Mg/L) fremstilles en standardrække
bestående af 5 opløsninger, i henhold til Standard Conditions for Mg, der findes i
bilag 1 og apparatmappen.

2. Mål på standardopløsningerne.
3. Vurder standardkurven visuelt.
4. Krav til korrelationskoefficienten: r ≥ 0,999
Kontrol af standardkurvens validitet

1. Nulstil apparatet på det reagens kontrolopløsningen er fremstillet på.
2. Mål kontrolopløsningen for Mg 2 gange.
4. Krav til nøjagtighed: relativ målefejl for kontrolkoncentrationen < ±5%
Kvantitativ bestemmelse af Mg i øl ud fra standardrække.
1. Alle gruppemedlemmer måler på prøveopløsningerne (P – Mg), som

tidligere er fremstillet.
Nedlukning
Apparatet nedlukkes som beskrevet i betjeningsvejledningen.

Laborantuddannelsen
Affaldshåndtering:
Klassificering:
Saltpetersyre…% (kilde: C&L - forordningen)
Ox. Liq. 2; H272
Skin corr. 1A, H314
Egne grænser:
Ox. Liq. 2; H272: C ≥ 99%
Ox. Liq. 3; H272: 65 % ≤ C < 99 %
Skin Corr. 1A; H314: C ≥ 20 %
Skin Corr. 1B; H314: 5 % ≤ C < 20 %
Konklusion:
Affaldet kan bestå af koncentreret og fortyndet syre (under 1 w/w %).
På laborantuddannelsen ved Københavns Professionshøjskole hældes
koncentrerede syrer og baser i vasken i et stinkskab. Der efterskyldes med vand.
(Laborantuddannelsen Københavns Professionshøjskole har en syrebrønd i
kælderen).
Fortyndet syre (under 1 w/w %) og fortyndet base (under 0,5 w/w %) hældes i
vasken i laboratoriet. Der efterskyldes med vand.

Før øvelsen skal følgende være besvaret i journalen:
1. Forklar kort forskellen mellem ekstern standard og en standardkurve.
2. Hvad forventer du af resultaterne – hvilken kvantitativ bestemmelse er mest

nøjagtig, ekstern standard eller måling ud fra standardrækken (begrund)?
3. Udfør alle beregninger til fremstilling af standard A, P – Ca og P – Mg.

Inkluder beregningseksempler.
4. Vis ud fra beregninger hvordan de eksterne standarder og standardrækken

for Mg skal fremstilles.
5. Forklar hvorfor der medtages en kontrol af standardkurven for Mg
6. Overvej, hvordan du vil omregne din fundne koncentration (mg Ca /L og mg

Mg/L) i øl’en til at kunne sammenligne med referenceværdien (mg /100 g).
7. Lav en reagensseddel klar for fremstilling af 20 L 0,1 M HNO3 ud fra en

65% HNO3. Der skal laves en reagensseddel for hele studiegruppen

Laborantuddannelsen
1. Kommenter på resultaterne af koncentrationen af Ca i den ufortyndede prøve
2. Beregn 95% konfidensinterval på de 3 Mg-prøver og på den samme Mg-prøve

målt 3 gange (Skema 4):
Et 95% konfidensinterval er det interval omkring gennemsnittet, hvor

den ”sande” middelværdi for stikprøven med 95% sandsynlighed
befinder sig.
Udregn et 95% konfidensinterval for de 3 prøver samt for en
udvalgt prøve målt 3 gange, ved at benytte følgende formel:
3. Kommenter på de 2 konfidensintervaller.
4. Standardkurven for Mg laves i Excel med linjen ligning og korrelations-koefficient.

Kurven vedlægges journalbogen.
5. Kommenter på resultaterne og præcisionen af koncentrationen af Mg i den

ufortyndede prøve (skema 8).
6. Kommenter på de beregnede resultater af Mg i øl – beregnet ved hhv. ekstern

standard og vha. standardkurven.
7. Generelt: Der kommenteres og konkluderes på alle resultater. Desuden

inkluderes beregningseksempler.

Laborantuddannelsen
Resultatskemaer:
Klippes ud og limes ind i journalbogen før det praktiske arbejde. Resultatskemaerne
udfyldes med rådata under det praktiske arbejde. Resultatbehandling under og efter det
praktiske arbejde.
Skema 1: Ca - Sensitivity check

Sensitivity koncentration
(mg Ca/L)
Abs.
Angivet krav
Krav overholdt
Skema 2: Kvantitativ bestemmelse af Ca i øl ud fra ekstern standard
Koncentration
Beregnet (mg Ca/100 mL)
Abs. koncentration FF
(mg Ca/L)
Ufortyndet prøve
Eks. st.
1. prøve
2. prøve
3. prøve
Skema 3: Mg - Sensitivity check
(mg Mg/L)
Abs.
Angivet krav
Krav overholdt

Laborantuddannelsen
Skema 4: Kvantitativ bestemmelse af Mg i øl ud fra ekstern standard
Beregnet Koncentration
Abs. koncentration FF (mg Mg/100 mL)
(mg Mg/L) Ufortyndet prøve
Eks. st.
1. prøve
2. prøve
3. prøve
Nr.____
Nr.____
Nr.____
Skema 5: Mg - Sensitivity check (før kørsel af prøven)
(mg Mg/L)
Abs.
Angivet krav
Krav overholdt
Skema 6: Mg - Standardrække
Standardopløsning 0 1 2 3 4 5
Koncentration
(mg Mg/L)
Abs.
Krav til
standardkurve
Resultat/Krav
overholdt

Laborantuddannelsen
Skema 7: Mg - Kontrol af standard kurvens validitet
Beregnet
Beregnet
Kontrol Abs. 1 Abs.2 koncentration
koncentration
(mg Mg/L) (mg Mg/mL)
Krav til Resultat/krav Krav til Resultat/krav

præcision overholdt nøjagtighed overholdt -
(n=2) (n=2)
/ / -
Skema 8: Kvantitativ bestemmelse af Mg i øl ud fra standardrækken
Beregnet Koncentration Resultat/krav

Krav til
Prøve Abs. koncentration FF (mg Mg/100 mL) overholdt
præcision
(mg Mg/L) Ufortyndet prøve (n=3)

Laborantuddannelsen
Bilag 1. Standard conditions for magnesium ved AAS
Ved øvelsen benyttes bølgelængden 285,2 nm. Standard conditions kan også findes i
apparatmappen.

Laborantuddannelsen
Øvelse 20: GC I – Temperaturprogrammering og præcision Institut for Teknologiske
Øvelse 20
Gaschromatografi I
Temperaturprogrammering og præcision
Estimeret tidsbrug: 5 lektioner, 2-mandsøvelse
Mål:
At blive fortrolig med brug af gaschromatografen og tilhørende software, og at indøve
præcision ved manuel injektion. At forstå hvordan en ændring af ovntemperaturen
under chromatograferingen har indflydelse på adskillelsen af en alkoholblanding med et
bredt kogepunktsområde.
Gravide og ammende:
 Standardblanding 1 (fremstilles af de studerende)
 Standardblanding 2
 Methanol
 Ethanol
 Propan-1-ol
 Butan-1-ol
 Pentan-1-ol
 Acetone
Princip:
Gaschromatografi (GC) er en analytisk teknik til separation, kvalitativ og kvantitativ
bestemmelse af analytter i en prøve. Analytterne i en prøveblandning separeres ved at
bringe dem på gasform, og lade dem passerer en kolonne. Analytternes kogepunkt
spiller en afgørende rolle for hvilken rækkefølge de kommer ud i. Til kvalitativ
bestemmelse kan retentionstider for en analyt enten sammenlignes med retentionstiden
for en standard eller prøven kan spikes med standard for at se et forøget areal ved den
givne retentionstid.
Temperaturprogrammeringen er en kontrolleret ændring af ovntemperatur under
chromatograferingen. Det benyttes med fordel når de analytter der analyseres er fordelt
over et meget bredt kogepunkts område. Det vil i den situation være svære at
chromatografere med både tilfredsstillende retentionstider og topadskillelse for de
første og de sidst analytter (laveste og højeste kogepunkt).
Udarbejdet af: JASA Dato: 07-08.2018 side 1 af 9

Laborantuddannelsen
Relevant teori:
Fra lærebog: “Analyse teknik” og Almen, Uorganisk og organisk kemi.
 GC – herunder princip og opbygning (bestanddele af apparatur).
 Optimering af separation
 GC præcision
 Kvalitativ bestemmelse ved GC
 Polaritet
 Standardblanding 1: Ethanol i acetone (fremstilles af studerende)
 Standardblanding 2: Methanol, ethanol, propan-1-ol, butan-1-ol, pentan-1-ol opløst

i acetone. (1:1:1:1:2:4). Indhold angivet i w/w % på flasken.
 Prøve: indeholdende en eller flere af alkoholerne fra standardblandingen.
Methanol Ethanol
Propan-1-ol
Butan-1-ol
Pentan-1-ol Propanon/Acetone

Laborantuddannelsen
 GC
 Polær kolonne: DB-WAX
 Injektionssprøjte, 1 l
 Acetone til rensning af sprøjte
Fremgangsmåde:
1) Start med at fremstille Standard 1, ved at indveje ca. 0,1 ml ethanol 99,9 % med
ca. 0,6 ml acetone i et hætteglas med parafilm eller gummilåg
2) Opstart GC apparaturet: Anvend nedenstående parametre.

Flow: 1,0 ml/min
Injektortemperatur: 250 oC (Inlet/heater)
Detektortemperatur: 250 oC (Heater)
Injektionsvolumen: 0,5 L
Der anføres prøveoplysninger f.eks. temperatur og prøve-id i programmet ved alle
injektioner jvf. vejledningen i apparatmappen ” Prøve info”
Splitforhold 100:1
Håndtering af injektionssprøjten i forbindelse med injektion af standarder/prøver

Standarder og prøver påsættes gaschromatografen med stempelsprøjter, med et
volumen fra ca. 0,1 - 1 L. De er yderst sarte og meget dyre, - og kræver omhu og
koncentration ved brug. Kanyledelen skal altid støttes ved injektion gennem septum i
gaschromatografen samt ved udtagning af prøver fra hætteglas med plast eller
gummilåg. Stemplet må aldrig trækkes længere tilbage end max. volumen ved
udluftning/fyldning, idet man derved risikerer at stempel eller injektortråd deformeres.
VÆR FORSIGTIG !!
 Injektionsprøjten skylles med acetone 2 gange, idet sprøjten tømmes for

acetone på et stykke papir for hver opsugning.
 Injektionsprøjten skylles dernæst 3 gange med prøveopløsningen, på
samme måde som ved acetonen.
 For at undgå luft i sprøjten trækkes prøven hurtig op og ned nogle gange i
væsken.
 Herefter suges prøveopløsningen langsomt op til et volumen et stykke over
det ønskede.
 Sprøjten vendes og evt. luft ”bankes” op i toppen af nålen
 Med sprøjten i omvendt stilling, presses evt. luft og overskydende væske
ud, så stemplet står på det ønskede volumen.

Laborantuddannelsen
 Stemplet trækkes tilbage til 1µl, så der suges luft ind i spidsen, før der
injiceres. Det tilstræbes at der trækkes samme mængde luft op hver gang.
Del 1: Præcision ved injektion
Isotermisk chromatografering ved 85C.
3) Undersøg nu Hamiltonsprøjten, dens inddeling og virkemåde, - prøv at suge væske
op i sprøjten og se om kanylen er stoppet; - selv 0,5 L kan ses som en lille dråbe
når stemplet trykkes ned.
4) Injicér 0,5 µL Standard 1. Hvis toppene ikke adskilles tilfredsstillende kan
ovntemperaturen nedsættes yderligere.
5) For at indøve injektionsteknik og præcision udfører hvert holdmedlem 7 kørsler med

0,5 µL Standard 1. De individuelle resultater for retentionstider og arealer for
ethanol noteres i resultatskema.
Del 2: Temperaturprogramering
Forsøg 1: Isotermisk chromatografering

Kolonne temperatur konstant 60C
1. Injicer standardblanding 2, en gang. Vent på at alle toppe er kommet ud.
Det kan tage op til 17 min.
2. Hvis der er toppe, der ikke adskilles tilfredsstillende, kan ovntemperaturen
nedsættes yderligere.
Forsøg 2: Isotermisk chromatografering

Kolonne temperatur konstant 100C
1. Injicer standardblanding 2, en gang ved en ovntemperatur på 100C.
2. Højere ovntemperatur kan også prøves.
Forsøg 3: Temperaturprogrammering
Sammensæt ud fra forsøg 1 og 2 og prøvekørsler et optimalt temperaturprogram. I
denne sammenhæng betragtes et program med basislinjeadskillelse, der tager op til 7
min., som optimalt program.
HUSK AT notere programmets indstillinger under ”comments” i ”sample info” da dette
ikke vil fremgå automatisk af jeres rådata
1. Injicer standardblanding 2 to gange ved det optimale temperaturprogram
og identificer toppene. Identifikation af toppen skrives på chromatogram her
under øvelsen eller ved databehandling.
Forsøg 4: Prøve

Laborantuddannelsen
1. Prøven Injiceres to gange under samme omstændigheder som i forsøg 3. Er der tvivl om
identifikationen af analytterne i prøven, kan der tilsættes standard til prøven for at se om
toppen derved bliver højere eller om der kommer en ekstra top. Dette kaldes spiking.
Identifikation af toppen skrives på chromatogram her under øvelsen eller ved
databehandling.
Affaldshåndtering:
I denne øvelse produceres farligt affald, som skal opsamles.
Indhold og koncentration:
Alle former for rester af analytterne; acetone, ethanol, propan-1-ol, butan-1-ol, pentan-
1-ol og methanol opsamles i affaldsdunk.
Brugte hætteglas dampes af i stinkskab og smides i glasaffald.
Klassificering:
Acetone (Kilde: C&L – forordningen)
Flam. Liq. 2; H225
Eye Irrit. 2; H319
STOT SE 3; H336
Ethanol (Kilde: C&L – forordningen)

Flam. Liq. 2; H225
Propan-1-ol (Kilde: C&L – forordningen)

Flam. Liq. 2; H225
Eye dam. 1; H318
STOT SE 3; H336
Butan-1-ol (Kilde: C&L – forordningen)

Flam. Liq. 3; H226
Acute Tox. 4; H302
Skin Irrit. 2; H315
Eye Dam. 1; H318
STOT SE 3; H335
STOT SE 3; H336
Pentan-1-ol (Kilde: C&L – forordningen)

Flam. Liq. 3; H226
Acute Tox. 4; H332
Skin Irrit. 2; H315
STOT SE 3; H335
Methanol (Kilde: C&L – forordningen)

Flam. Liq. 2; H225
Acute Tox. 3; H331
Acute Tox. 3; H311

Laborantuddannelsen
Acute Tox. 3; H301

STOT SE 1; H370
Egne grænser
STOT SE 1; H370: C ≥ 10%
STOT SE 2; H371: 3% ≤ C < 10%
Konklusion:
Affaldet opsamles i en affaldsdunk mærket ”Affaldsgruppe C – Brandfarligt organisk
affald uden halogen og svovl”
Resultatbehandling og rapportering i journalbogen:

Før øvelsen skal følgende være besvaret i journal (klippes ud og limes i eller overføres til
journalbog)
1. Hvad betyder isotermisk?
2. Forklar med egne ord hvad begrebet temperaturprogrammering betyder?
3. Injektortemperaturen sættes ofte mellem 200-250°C, hvorfor sætter man

temperaturen så højt. Forklar kort.
4. Ved denne øvelse benyttes gaschromatograf med en FID detektor. Bemærk at FID
ikke kan detektere vand (vindestillat). Hvad står FID for og hvorfor kan FID detektoren
ikke detektere vand?
5. Find kogepunkterne for nedenstående Analytter og opstil dem i en tabel, som

nedenstående:
Komponent Kogepunkt °C
Methanol
Ethanol
Propan-1-ol
Butan-1-ol

Laborantuddannelsen
Pentan-1-ol
Propanon/acetone
6. I hvilken rækkefølge chromatograferes analytterne i?

Laborantuddannelsen

1. Beregn koncentrationen af ethanol i Standard 1 i w/w%.
Del 1: Præcision
2. Udfyld skema 1 og beregn RSD% for retentionstid (tr) og areal
Del 2: Temperaturprogrammering
3. Forsøg 1 og 2:
a. Retentionstiderne for de enkelte Analytter (sat i relation til kogepunkterne) og
chromatogrammets udseende (topadskillelse) kommenteres.
4. Forsøg 3:
a. Det valgte temperaturprogram begrundes ud fra forsøg 1 og 2 og kørslerne
under forsøg 3. Chromatogrammernes udseende kommenteres. Identifikation
af toppen skrives på chromatogram her hvis dette ikke er gjort under øvelsen.
5. Forsøg 4:
a. Analytterne i prøven identificeres ud fra retentionstiderne på
standardchromatogrammet i forsøg 3 og evt. spiking. Identifikation af toppen
skrives på chromatogram her hvis dette ikke er gjort under øvelsen.
6. Alle chromatogrammerne sorteres efter løbenummer og vedlægges som bilag i
journalbogen.

Laborantuddannelsen
Resultatskemaer:
Resultatskemaer klippes ud og limes ind i journalbogen FØR øvelsen påbegyndes.
Efter/under øvelse skal resultatskemaer udfyldes.
Skema for 1 person: Præcision ved injektion- retentionstid og areal for ethanol
Chromatogramnr. tr i min Areal
Gennemsnit
Standardafvigelse
%RSD
Retentionstid Krav opfyldt: Underskrift/dato

%RSD krav: ≤2 %
Areal Krav opfyldt: Underskrift/dato

%RSD krav: ≤10 %

Laborantuddannelsen
Øvelse 21: GC II – Kvantitativ bestemmelse af ethanol i spiritus Institut for Teknologiske
Øvelse 21
Gaschromatografi II
Kvantitativ bestemmelse af ethanol i spiritus
Mål:
At blive fortrolig med at bruge gaschromatografen med autosampler og tilhørende
software
At fremstille en standardrække ved indvejning
At bestemme indholdet af ethanol i spiritus
Princip:
Gaschromatografi (GC) er en metode til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse. For
udstyrerets opbygning, se ”Analyseteknik” - bogen.
Til kvantitativ bestemmelse af ethanol i spiritus, benyttes her en standardkurve.
Standardkurven fremstilles ved måling på standardopløsninger i forskellige
koncentrationer. Herved fås nogle toparealer, der afbildes som funktion af
koncentrationerne.
Kurvens validitet kontrolleres visuelt, samt ved brug af korrelationsfaktoren (r), linjens
skæring med y-aksen (~ 0,0) og måling på en kontrol.
Relevant teori:
Fra lærebog: “Analyseteknik”
 Gaschromatografi
 Kvantitativ bestemmelse
 Standardkurve
Fra lærebog: ”Laboratorieberegninger”
 Standardrække
 Standardkurve
 Pentan-1-ol, p. a.
 Ethanol 99,9 %
 Spiritus
 Pentan-1-ol til rensning af sprøjte
 Kontrol: ~50 w/w% EtOH opløst i Pentan-1-ol
Udarbejdet af: MHAA Dato: 30.08.2018 side 1 af 6

Laborantuddannelsen
 GC, AGILENT 6850
 Polær kolonne: HP-1
 Autosampler til GC, AGILENT 6850
 Engangssprøjter med kanyler 1 mL
 Hætteglas
 Analysevægt
Gravide og ammende:
 Ethanol
 Pentan-1-ol
 Spiritus
Fremgangsmåde:
Opstart af GC’en
1) Opstart hele programmet inden i går videre til fremstilling af standardopløsninger. Følg
apparatmappen til og med ”programmering af autosampler”
2) GC’en opstartes iflg. apparatvejledning. Flow sættes til 1,0 ml/min. Splitforholdet sættes til
100:1. Ovntemperatuen sættes til 100C, injektor- og detektortemperatur sættes til 250
C. Lad gaschromatografen stabilisere sig i ca. 10 min før første kørsel.
Fremstilling af standardopløsninger
1) I mellemtiden fremstilles standardopløsningerne med ethanol fortyndet i pentan-1-ol i
følgende koncentrationer: 20, 40, 50, 60 og 80 w/w%. Indvejningen udføres på
analysevægt ud fra de masser, der er fundet under forberedelsen af øvelsen. Husk at
notere de nøjagtigt afvejede masserr i tilhørende resultatskema.
2) Da de benyttede kemikalier let fordamper, er det nødvendigt altid at holde standarder og
prøver tæt tillukkede. Indvejning bør derfor foregå med sprøjter og kanyler ned i
hætteglas.
Prøveforberedelse
1) Overfør ca. 1 mL prøve til et hætteglas.

Laborantuddannelsen
Kørsel af standarder og prøve på GC’en.

1) Følg apparatvejledningen for at opsætte en kørsel med brug af autosampler, idet der skal
foretages dobbeltbestemmelse og injiceres 1 µL af hver standard, blindprøve, kontrol og
prøve. Sæt ”hold” til 3,5 minutter
2) Imens analyserne køres, beregnes den nøjagtige koncentration af de indvejede
standarder.
Databehandling i GC-software (offline)

3) Skriv navne på toppene på chromatogrammet, følg apparatvejledningen.
4) Hvis der på nogle af chromatogrammerne er nogle små ubetydelige toppe kan disse
fjernes ved at bruge ”area reject”, følg apparatvejledningen.
Indtegning af standardkurve, kontrol af validitet og beregning af ethanol i prøven

1) Arealet af standarderne indtegnes som funktion af koncentrationerne i Excel.
2) Vurdér standardkurven visuelt og derefter ud fra korrelationskoefficienten, skæring med
y-aksen og %RSD på kontrollen.
3) Beregn indholdet af ethanol i prøven ved brug af linjens ligning.
Affaldshåndtering:
I denne øvelse produceres der farligt affald, som skal opsamles.
Alle former for rester af komponenterne pentan-1-ol og ethanol opsamles i affaldsdunk.
Brugte hætteglas dampes af i stinkskab og smides i glasaffald.
Klassificering:
Pentan-1-ol (Kilde: ”C&L – forordningen)
Flam. Liq. 3; H226
Skin Irrit. 2; H315
Acute tox. 4; H332
STOT SE 3; H335
Ethanol (Kilde: ”C&L – forordningen)

Flam. Liq. 2; H225
Konklusion:
Affaldet opsamles i en affaldsdunk mærket ”Affaldsgruppe C – Brandfarligt organisk
affald uden halogen og svovl”.

Laborantuddannelsen

Før øvelsen skal følgende være besvaret i journalen. (Klippes ud og limes i eller overføres til
journalbog)
1. Der skal fremstilles standarder med koncentrationer som angivet i skemaet nedenfor.
Udfyld skemaet med hvor meget Pentan-1-ol og ethanol der skal anvendes til
fremstilling af standarderne.
Angiv et eksempel på beregning af mængder der skal afvejes for at fremstille
standardopløsningen der indeholder 60 w/w% ethanol.
Mængder der skal afvejes til fremstilling af standardopløsninger

20 w/w% 40 w/w% 50 w/w% 60 w/w% 80 w/w%
Ethanol (g) 0,2 0,5
Pentan-1-ol (g) 0,6 0,2
Total masse (g) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
2. Hvad er forskellen på en kontrol og en prøve?
1. Angiv et eksempel på beregning af koncentrationen af ethanol i én af standarderne.
2. Angiv et eksempel på beregning af den fundne koncentration af ethanol i kontrollen.
3. Vis beregning af ethanol i prøven.
4. Angiv et eksempel på beregning af GF%.
5. Vis beregning af %RSD for prøven.
6. Kommentér på den målte koncentration af ethanol i prøven

Laborantuddannelsen
Resultatskemaer
Resultatskemaer klippes ud og limes i journalbogen før øvelsen påbegyndes.
Efter/under øvelsen skal følgende udfyldes:
Skema 1: Faktiske mængder der er afvejet til fremstilling af standardopløsninger
20 w/w% 40 w/w% 50 w/w% 60 w/w% 80 w/w%
Ethanol (g)
Pentan-1-ol (g)
Total masse (g)

Koncentration af
ethanol (w/w%)
Skema 2: Fundne arealer for standarder
20 w/w% 40 w/w% 50 w/w% 60 w/w% 80 w/w%
Areal 1
Areal 2
Skema 3: Kontrol
Middel Påståede sande

Fundet konc.
koncentration værdi Krav til
Areal ethanol GF%
Konc. ethanol GF%
(w/w%)
(w/w%)
95-105
Ethanol
%

Laborantuddannelsen
Skema 4: Standardkurvens validitet
Angiv værdi
/ Krav Vurdering
Ja/Nej
Bøjer kurven af
Skæring med y-aksen
Korrelationskoefficient 0,999
GF% på kontrollen 95-105%

Konklusion: (Er standardkurven valid?)
Skema 5: Prøve
Konc. ethanol Middel Krav til

Areal %RSD
(w/w%) koncentration %RSD
Ethanol ≤5%

Laborantuddannelsen
Øvelse 22: Indledende HPLC Institut for Teknologiske
Øvelse 22
Indledende HPLC
Mål:
At blive fortrolig med brug af HPLC apparatur og tilhørende software – herunder lave
en kolonnetest, ændring af eluent sammensætning
At udføre en kvalitativ analyse
At forstå hvilken indvirkning ændringer af forskellige parametre har på et
chromatogram/resultatet.
Princip:
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er en analytisk teknik til
separation, kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af analytter i en prøve. Ved hjælp
af en pumpe bliver en eluent/mobil fase sammen med en prøve eller standard ført
gennem en kolonne fyldt med stationær fase. Hver komponent i prøven vil have
forskellig affinitet til den stationære fase, hvorved de vil elueres med forskellig
hastighed og en separation af stofferne finder sted. Til kvalitativ bestemmelse kan
retentionstider for en standard og analyt sammenlignes eller prøven kan spikes med
standard. For at undersøge kolonnens effektivitet/selektivitet udføres en
kolonnetest, hvorved antal teoretiske bunde (N), asymmetrifaktor (As) og
kapacitetsfaktor kan bestemmes.
Ved denne øvelse skal der laves chromatografiske undersøgelser vedr.
konserveringsmidlerne benzoesyre, ethylparahydroxybenzoat og
propylparahydroxybenzoat (de to sidstnævnte er måske bedre kendt som eksempler
på parabener):
O O CH3 O O
HO O CH3
OH OH
Benzoesyre Ethylparahydroxybenzoat Propylparahydroxybenzoat
4-hydroxy ethylbenzoat 4-hydroxy propylbenzoat
Relevant teori:
 HPLC – herunder princip og opbygning (bestanddele af apparatur).
 Typer af stationær og mobil fase
 Selektivitets – parametre
 Kvalitativ bestemmelse
Udarbejdet af: DALI Dato: 21.05.2018 side 1 af 9

Laborantuddannelsen
 Methanol, HPLC grade, til rensning af sprøjte
 60:40 methanol:phosphatbuffer til fortynding af prøve
 Mobile faser:
 A: Til rensning af kolonne: 80:20 methanol:vand
 B: Til rensning af kolonne: 50:50 methanol:vand
 C: 1 L methanol
 D: 1 L phosphatbuffer
(fremstillet af 1,0 mL konc. H3PO4 og 33 g NaH2PO4, 2H2O til 1 liter)
 Bestemmelse af dødtid
 0,2 g natriumnitrat/100 mL
 Kolonnetestblanding:
 100 µg/mL phenol, 775 µg/mL toluen og 8 µg/mL antracen i
methanol:vand 80:20.
 Opløsning af konserveringsmidler:
 0,2 % benzoesyre, 0,01 % ethylparahydroxybenzoat og 0,01%
propylparahydroxybenzoat opløst i 60:40 methanol:vand
 Prøve:
 Sukkerfri læskedrik indeholdende et eller flere af konserveringsmidlerne
 HPLC og PC med tilhørende printer
 Kolonne med C18 (ODS)-materiale
 1 mL sprøjte med stump kanyle
 Engangsmembranfilter 0,45 μm
 Engangssprøjte 10 mL
 Ultralydsbad
 Præparatglas med skruelåg
Gravide og ammende:
 Methanol

Laborantuddannelsen
Fremgangsmåde:
Indledende
 Vedrørende start og betjening af apparatur henvises til apparatvejledningen
 Tjek at affald/spild flasken på eluenthylden ikke er fuld. Er den fuld skal
denne først tømmes i ”affald C”
 Alle eluenter skal afgasses i ultralydsbad inden de anvendes (Dette er gjort af
tekniker)
 Flowet af eluent A (80:20 methanol:vand) sættes til 1,0 mL/min
 Bølgelængden på detektoren sættes til 254 nm
Chromatogrammer skal indklæbes i journalbog og af hvert chromatogram skal det

fremgå:
 Hvilken eluent, der er anvendt

 Hvilken kolonne, der er anvendt (dimensioner, kornstørrelse og
materiale af stationær fase)
 Hvilken prøve/standard
 Flow
 Bølgelængde
Disse oplysninger kan skrives ind i HPLC-software, således at de udskrives

sammen med chromatogrammerne
A
Bestemmelse af dødtid
1) Eluent A (80:20 methanol:vand) anvendes med et flow på 1 mL/min
2) Injicer opløsningen af natriumnitrat én gang
3) Chromatogrammet udskrives
4) Udfyld skema for kapacitetsfaktor i software (se apparatvejledning)
5) Gem metoden
B
Kolonnetest med standardblanding (phenol, toluen og anthracen)
1) Eluent A (80:20 methanol:vand) anvendes med et flow på 1 mL/min
2) Injicér kolonnetestblandingen én gang
3) Der skal anvendes automatisk beregning af antal teoretiske bunde,
asymmetrifaktor, resolution og kapacitetsfaktor. Chromatogrammet
udskrives. Udskriv datarapporten som ”performence” i stedet for ”short”
C
Optimering af mobil fase
1) Skift eluent – således at forholdet mellem eluent C (100%methanol) og
D (phosphatbuffer) er 80:20 med et flow på 1 mL/min
2) Lad systemet ækvilibrere ca. 10 min. (i mellemtiden sættes prøven til
afgasning i ultralydsbad)

Laborantuddannelsen
3) Når basislinien er stabil injiceres opløsningen af konserveringsmidler én

gang
4) Chromatogram udskrives med antal teoretiske bunde,
asymmetrifaktorer, resolution og kapacitetsfaktorer
5) Skift eluent – således at forholdet mellem eluent C (100%methanol) og
D (phosphatbuffer) er 60:40 med et flow på 1 mL/min
6) Lad systemet ækvilibrere ca. 10 min.
7) Når basislinien er stabil injiceres opløsningen af konserveringsmidler én
gang
D
Kvalitativ analyse
1) Prøveforberedelse:
Den afgassede prøve fortyndes 1:1 med 60:40 eluent C:D og filtreres
gennem membranfilter ned i et lille præparatglas med skruelåg
2) Prøveblandingen injiceres 1 gang.
3) Chromatogrammer udskrives med antal teoretiske bunde,
4) Hvis der er nogle små irrelevante toppe på chromatogrammerne – forsøg
da at fjerne resultaterne for disse i HPLC-software, således at de ikke
medtages i chromatogramrapporten
E
Ændring af bølgelængde
1) Brug den eluent sammensætning, der er optimal og skift bølgelængden
til 220 nm
2) Injicer opløsningen af konserveringsmidler én gang
3) Chromatogrammer udskrives med antal teoretiske bunde,

F
Optimering af mobil fase for prøve
1) Skift evt. forholdet mellem eluent C og D for at opnå optimal separation
og kørselstid. HUSK at ækvilibrere efter skift af eluent
2) Prøveblandingen injiceres 1 gang.
G
Nedlukning

Laborantuddannelsen
 Apparatet nedlukkes som beskrevet i apparatvejledningen – vær

opmærksom på at der er først skal renses med eluent B (50:50
methanol:vand og derefter A (80:20 methanol:vand)
Affald:
Alle former for mobil fase og restindhold med methanol opsamles efter behov i
affaldsdunk. Brugte hætteglas dampes af i stinkskab og smides i glasaffald.
Klassificering:
Methanol (Kilde: ”C&L – forordningen)
Flam. Liq. 2; H225
Acute Tox. 3; H331
Acute Tox. 3; H311
Acute Tox. 3; H301
STOT SE 1; H370
Egne grænser
STOT SE 1; H370: C ≥ 10 %
STOT SE 2; H371: 3 % ≤ C < 10 %
Denne klassificering gælder også for den svageste mobil fase 60:40 C:B
Flam. Liq. 2 nedskrives dog til Flam. Liq. 3; H226 (Kilde: Kemibrug)
Konklusion: Affaldet opsamles i en affaldsdunk mærket ”Affaldsgruppe C –

Brandfarligt organisk affald uden halogen og svovl”.

Før øvelse skal følgende være besvaret i journal (klippes ud og limes i eller overføres til
journalbog):
1) Opstil stofferne i kolonnetesten i rækkefølge, således at det mest polære står
først
2) Bliver der gennem denne øvelse anvendt normal fase eller omvendt fase
chromatografi? (svaret begrundes)

Laborantuddannelsen
3) I hvilken rækkefølge forventes de 3 konserveringsmidler at blive elueret? Det

antages, at det mest polære elueres først. Diskuter svaret i studiegruppen og
med en underviser.
4) Hvilken af eluenterne – A eller B – er mest polær?
5) Opskriv formlerne til beregning af antal teoretiske bunde (N), asymmetri faktor
(As), resolution (Rs) og kapacitetsfaktor (k)
6) Hvad forstås ved dødtid?
7) Forklar hvad det betyder at kapacitetsfaktoren k = 2

Laborantuddannelsen
Resultatskemaer:
A) Skema 1: Bestemmelse af dødtid

Stof Dødtid – tm (min)
Natriumnitrat
B) Skema 2: Kolonnetest med standardblanding
Stof Retentionstid N As k Rs
(min)
Phenol -
Toluen
Anthracen

Laborantuddannelsen
C) Skema 3: Optimering af mobilfase

As benzoesyre As ethylparahydroxybenzoat As propylparahydroxybenzoat
Mobil fase
C:D = 80:20
Mobil fase
C:D = 60:40
Mobil fase
C:D = :
Nbenzoesyre Nethylparahydroxybenzoat Npropylparahydroxybenzoat
Mobil fase
C:D = 80:20
Mobil fase
C:D = 60:40
Mobil fase
C:D = :
k benzoesyre k ethylparahydroxybenzoat k propylparahydroxybenzoat
Mobil fase
C:D = 80:20
Mobil fase
C:D = 60:40
Mobil fase
C:D = :
t benzoesyre t ethylparahydroxybenzoat t propylparahydroxybenzoat
(min) (min) (min)
Mobil fase
C:D = 80:20
Mobil fase
C:D = 60:40
Mobil fase
C:D = :
Rs
Rs Rs ethylparahydroxybenzoat/
Benzoesyre benzoesyre/ ethylparahydroxybenzoat propylparahydroxybenzoat
Mobil fase -
C:D = 80:20
Mobil fase -
C:D = 60:40
Mobil fase -
C:D = :

Laborantuddannelsen
D) Skema 4: Kvalitativ analyse

Anvendt mobil fase Retentionstid af toppe Konklusion
C:D = :
(min) Indeholder prøven
konserveringsmidler?
Hvilket/hvilke?
Er de deklareret?
Prøve:
E) Skema 5: Ændring af bølgelængde

Beskriv hvad der iagttages
på chromatogrammet, når
bølgelængden ændres fra
254 nm til 220 nm. Er der
sket nogen ændring i
arealer og de
chromatografiske
parametre?
Forklar de observerede
ændringer vha. øvelse 11-
spektrofotometri I

Laborantuddannelsen
Øvelse 23: Kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af koffein ved HPLC Institut for Teknologiske
Øvelse 23
Kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af koffein
ved HPLC
Mål:
At blive fortrolig med brug af HPLC apparatur og tilhørende software – herunder lave
metodeafhængig kolonnetest og bestemme arbejdsbølgelængde
At lave en kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af koffein i forskellige prøver.
Princip:
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er en analytisk teknik til
separation, kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af Analytter i en prøve. Ved hjælp
af en pumpe bliver en eluent/mobil fase sammen med en prøve eller standard ført
gennem en kolonne fyldt med stationær fase. Hver komponent i prøven vil have
forskellig affinitet til den stationære fase, hvorved de vil elueres med forskellig
hastighed og en separation af stofferne finder sted. For at undersøge kolonnens
effektivitet/selektivitet udføres en metodeafhængig kolonnetest, hvorved antal
teoretiske bunde (N) og asymmetrifaktor (As) kan bestemmes.
For at få størst mulig respons for en komponent når der anvendes UV-detektor i
HPLC, er det vigtigt at den optimale bølgelængde (arbejdsbølgelængde)
bestemmes og indstilles.
Til kvalitativ bestemmelse kan retentionstider for en standard og en analyt
sammenlignes eller prøven kan spikes med standard. Til kvantitativ bestemmelse
kan forskellige metoder anvendes. Ved denne øvelse laves en standardrække
(standarder med forskellig koncentration af koffein) ud fra en stamopløsning. Koffein
har en kort levetid i lys, så stamopløsninger og standarder opbevares koldt og mørkt
i laboratoriefryseren. Hver standard injiceres, hvorved areal for toppene registreres.
Toparealerne afsættes som funktion af de respektive koncentrationer til konstruktion
af en standardkurve. Prøven injiceres og ud fra analyttens topareal kan
koncentrationen bestemmes ved lineær regression – det forudsættes at
standardkurven er lineær (korrelationskoefficient r  0,995), hældningen på
standardkurven er acceptabel (undersøges ved at medtage en kontrol) og skæring
med y-akse er tilstrækkelig lille.
O CH3
H3C N
N
O N N
CH3

Laborantuddannelsen
Koffein
Relevant teori:
 HPLC – herunder princip og opbygning (bestanddele af apparatur).
 Typer af stationær og mobil fase
 Selektivitets – parametre
 Kvalitativ bestemmelse
 Kvantitativ bestemmelse
 Standardkurve
Fra lærebog: ”Laboratorieberegninger”

 Fortyndinger
 Standardrække
 Standardkurve
 Methanol, HPLC grade til rensning af sprøjte
 Vand, HPLC grade til fortynding
 Mobile faser:
 A: Til rensning af kolonne: 80:20 methanol:vand
 B: Til rensning af kolonne: 50:50 methanol:vand
 C: Til forsøg: 1 L methanol
 D: Til forsøg: 1 L HPLC vand
 Bestemmelse af dødtid
 0,001 g tartrazin/100 mL
 Stamopløsning
 1000 mg koffein/L – er fremstillet
Skal opbevares koldt og mørkt, så kan dermed hentes i fryseren
 Kontrol og metodeafhængig kolonnetest

 100 mg koffein/L – er fremstillet
Skal opbevares koldt og mørkt, så kan dermed hentes i fryseren
 Prøver
 Prøver indeholdende koffein

Laborantuddannelsen
 HPLC og PC med tilhørende printer
 Kolonne med C18 (ODS)-materiale
 UV-spektrofotometer
 Kuvetter til måling i UV-området
 1 mL sprøjte med stump kanyle
 Membranfilter 0,45 μm og engangssprøjte 10 mL
 Transfer pipette
 Ultralydsbad
 Præparatglas med skruelåg
 Mikropipetter: 20-5000µl
 50 og 200 mL bægerglas
 5 og 100 mL glas fuldpipette
 Urglas
Gravide og ammende:
 Methanol
Fremgangsmåde:
Indledende
 Vedrørende start og betjening af apparatur henvises til apparatvejledningen
 Tjek at affald/spild flasken på eluenthylden ikke er fuld. Er den fuld skal
denne først tømmes i ”affald C”
 Alle eluenter skal afgasses i ultralydsbad inden de anvendes (Dette er gjort af
tekniker)
Chromatogrammer skal indklæbes i journalbog og af hvert chromatogram skal det

fremgå:
 Hvilken eluent, der er anvendt

 Hvilken kolonne, der er anvendt (dimensioner, kornstørrelse og
materiale af stationær fase)
 Hvilken prøve/standard
 Flow
 Bølgelængde
Disse oplysninger kan skrives ind i HPLC-software, således at de udskrives

sammen med chromatogrammerne
A
Metodeafhængig kolonnetest og dødtid
1) Skift eluent og flow hastighed til de anbefalede værdier for apparatet
(se computerskærmen)

Laborantuddannelsen
2) Lad systemet ækvilibrere i ca. 10 min. (i mellemtiden udføres punkt B og

prøveforberedelse under punkt E)
3) Indstil bølgelængden til den fundne under punkt B
4) Dødtid: Injicer opløsningen af tartrazin 1 gang
5) Chromatogrammet udskrives.
6) Udfyld skema for kapacitetsfaktor i software (se apparatvejledning)
7) Injicér kolonnetest 1 gang (Koffein standard med konc. = 100 mg/L)
3) Chromatogrammet som ”performence” i stedet for ”short” med
automatisk beregning af antal teoretiske bunde og asymmetrifaktor og
chromatogrammet
B
Bestemmelse af arbejdsbølgelængde
1) Overfør med transfer pipette én dråbe af stamopløsningen af koffein
(1000 mg/L) til en egnet kuvette og tilsæt vand. Bland ved at suge og
puste opløsningen forsigtigt ud med transfer pipette. Som blindprøve
anvendes vand.
2) Indstil spektrofotometret til at scanne i bølgelængdeområdet 220-400 nm
3) Udskriv scanningsspektret med tilhørende arbejdsbølgelængde
C
Standardrække og standardkurve
1) Ud fra stamopløsningen af koffein (1000 mg/L) fremstilles 6 standarder
inklusive en blindprøve i koncentrationsområdet 0 – 300 mg/L. Der
fremstilles 5,00 mL af hver ved brug af mikropipetter. Der anvendes
HPLC-grade vand til fortyndinger. Standarderne laves i præparatglas
2) Hver standard og blindprøven (HPLC-grade vand) injiceres
randomiseret en gang
3) Chromatogrammer udskrives med antal teoretiske bunde og
asymmetrifaktorer
D
Kontrol (holdes koldt og mørkt)
1) Injicer kontrollen (100 mg koffein/L) én gang
2) Chromatogram udskrives med antal teoretiske bunde og

asymmetrifaktorer
E
Kvalitativ og kvantitativ bestemmelse
1) Prøveforberedelse:
Kaffe:

Laborantuddannelsen
5 g kaffe afvejes og overføres til et 200 mL bægerglas. 100 mL HPLC-

grade vand afmåles til kaffen. Bægerglasset med urglas over opvarmes
på varmeplade til ca. 95 oC, varmepladen slukkes og bægerglasset tages
af varmepladen. Til tiden nul efter opvarmning udtages ca. 5 mL
kaffeprøve til et bægerglas (t0). Prøven filtreres gennem en groft filter og
derefter gennem et 45 µm membranfilter over i et prøveglas. Prøven
injiceres en enkelt gang og resultatet sammenholdes med
standardkurven. Ligger prøven uden for standardkurvens lineære
område, fortyndes prøven til en passende koncentration. Der udtages
yderligere en prøve efter 20 minutter (t20), som filtreres og fortyndes med
en tilsvarende fortyndingsfaktor.
2) Begge prøver (t0 fortyndet og t20 fortyndet) injiceres hver to gange.
Øvrige prøver:
Skal eventuelt afgasses på ultralydsbad og filtreres gennem
membranfilter
F
Nedlukning
Apparatet nedlukkes som beskrevet i apparatvejledningen
Affald:
Alle former for mobil fase og restindhold med methanol opsamles efter behov i
affaldsdunk. Brugte hætteglas dampes af i stinkskab og smides i glasaffald.
Klassificering:
Methanol (Kilde: ”C&L – forordningen)
Flam. Liq. 2; H225
Acute Tox. 3; H331
Acute Tox. 3; H311
Acute Tox. 3; H301
STOT SE 1; H370
Egne grænser
STOT SE 1; H370: C ≥ 10%
STOT SE 2; H371: 3% ≤ C < 10%
Denne klassificering gælder også for den svageste mobil fase 30:70 C:D
Flam. Liq. 2 nedskrives dog til Flam. Liq. 3; H226 (Kilde: Kemibrug)
Konklusion:
Affaldet opsamles i en affaldsdunk mærket ”Affaldsgruppe C – Brandfarligt
organisk affald uden halogen og svovl”.

Laborantuddannelsen

Før øvelsen skal følgende være besvaret i journalen (klippes ud og limes i eller
overføres til journalbog)
1) Øvelsen har mange dele, så planlæg din dag i detaljer sammen med din
partner
2) Bliver der gennem denne øvelse anvendt normal fase eller omvendt fase
chromatografi? (svaret begrundes)
3) Nævn mindst en anden metode ud over brug af standardkurve til kvantitativ

bestemmelse og forklar princippet
4) Overvej hvordan du vil beregne koncentrationen af koffein i w/w%
5) Forklar kort hvad der forstås ved arbejdsbølgelængde
6) Udfyld følgende skema i forbindelse med standardrække:
Skema 1: Fremstilling af standarder
Standard Afpipetteret Afpipetteret vand Koncentration af

# stamopløsning standard
(μL)
(μL) (mg/L)
Blind 0 5000 0
5 300

Laborantuddannelsen
Efter/under øvelsen skal resultatskemaer udfyldes og følgende spørgsmål

besvares:
1) Scanningskurven med tydelig angivelse af arbejdsbølgelængden
indsættes i journalbog (fundet under B)
2) Der optegnes en standardkurve vha. Excel, og der laves lineær
regression. Korrelationskoefficienten, skæring med y-aksen og
linearitetsområde vurderes. Standardkurve lavet i Excel med linjens
ligning og korrelationskoefficient limes ind
3) Overholdes kravet om at korrelationskoefficienten skal være  0,995 og

er skæring med y-akse tilstrækkelig lille ?
4) Beregn ved hjælp af linjens ligning (fundet under C) koncentration af

koffein i kontrollen. Giv et beregningseksempel
5) Beregn relativ målefejl for kontrollen (100 mg koffein/L).

Krav: relativ målefejl < ±5%. Giv et beregningseksempel. Er kravet om
en relativ målefejl på mindre end 5% overholdt?
6) Koncentrationen (mg/L) af koffein i prøven kvantificeres ved brug af

linjens ligning fundet under punkt C.
7) Beregn %RSD for den fundne koffein koncentration. Krav: %RSD <5%
8) Forklar med egne ord hvorfor det var nødvendigt at fortynde

kaffeprøven
9) Reduceres eller øges koffein indholdet i kaffe over tid? Hvad kan dette
skyldes?
10) Beregn koncentrationen af koffein i kaffe i w/w% og sammenhold denne

med den opgivne reference værdi: Café Noir® produceres af JDE
professional, der oplyser at kaffen indeholder 1,2 w/w% koffein
11) Beregningseksempel på beregning af koncentrationen af koffein i kaffe

(og den valgte prøve). Hvad kan konkluderes?

Laborantuddannelsen
Resultatskemaer:
A) Skema 2: Metodeafhængig kolonnetest
Stof Retentionstid N As
(min)
Koffein
C) Skema 3: Standardrække og standardkurve
Standard # Koncentration (mg/L) Topareal

Blind 0
D) Skema 4: Kontrol
Angivet Topareal Beregnet Relativ

koncentration koncentration målefejl
(mg/L) (mg/L) (%)

Laborantuddannelsen
E) Skema 5.1: Kvalitativ og kvantitativ bestemmelse: Kaffe
Fortyndet Ufortyndet Gennemsnit af

Prøve Topareal Koncentration FF Koncentration koncentrationer %RSD
(mg koffein/L) (mg koffein/L) (mg/L)
t0
Ufortyndet
- - - - -
Kaffeprøve
E) Skema 5.2: Kvalitativ og kvantitativ bestemmelse: Andre prøver

Gennemsnit af
Tid Koncentration (mg
Topareal koncentrationer %RSD
(min) koffein/L)
(mg/L)
Andreprøver


Grundlæggende Analyseteknik 2 Og 3

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Grundlæggende Analyseteknik 2 Og 3

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Laborantuddannelsen

Efterår 2020 2. og 3. runde

Skråplan til øvelser på 2. sal

Skråplan til øvelser på 1. sal (2. runde)

Øv. 1, 2, 4, 5 Øv. 4 +(øv. 5) Øv. 6 Øv. 8 Øv. 8 Øv. 9

Øv. 1, 2, 4, 5 Øv. 9 Øv. 9 Øv. 6 Øv. 8 Øv. 4+ (øv. 5)

Udarbejdet af: BOGR Dato: ikke oplyst side 1 af 3

• Spray 70% Ethanol på alle sider og på arbejdsbordet inde i LAF-bænken

3. Placér alle nødvendige utensilier i LAF-bænken efter de er desinficeret med 70 %

1. Arbejdet i LAF-bænken må aldrig udføres med reduceret ven tilatorhastighed

1. Arbejdskammer rengøres og desinficeres grundigt med 70% Ethanol.

Udarbejdet af: BOGR Dato: ikke oplyst side 2 af 3

Rapportering og resultatbehandling i journalbog:

Udarbejdet af: BOGR Dato: ikke oplyst side 3 af 3

At indøve arbejdsteknikker i forbindelse med subkultivering af adherente cellekulturer.

Substrater, reagenser, kemikalier og kultur:

Udarbejdet af: SUSU Dato: 02.11.20 side 1 af 6

1. Inden arbejdet påbegyndes i LAF-bænken skal denne klargøres - se øvelse 1.

2. Fremstil celledyrkningsmedie i en T-75 flaske ved at blande:

3. Skriv dato og navn på en ny T-75 flaske og på 2 stk. TC-disk.

4. Du skal bruge den samme 20 mL engangspipette til pkt. 5, 6 og 7.

Udarbejdet af: SUSU Dato: 02.11.20 side 2 af 6

7. Overfør 20 ml celledyrkningsmedium til et tomt 50 ml centrifugerør. (Skal bruges i pkt.

8. Udtag cellekulturen fra CO2 - inkubatoren og undersøg væksten ved omvendt

9. Hæld dyrkningsmediet fra kulturen over i spildflasken. Her er det vigtig at

12. Tilsæt 12 ml trypsin-opløsning til cellekulturen og gå hurtigt til næste punkt.

17. Centrifugér cellesuspensionen i 5 min ved 700 rpm.

19. Tilsæt 6 mL celledyrkningsmedie til centrifugerøret og resuspendér cellerne i mediet

20. Bestem cellekoncentrationen vha. NucleoCounter (Total cell) – se øvelsesvejledning

Udarbejdet af: SUSU Dato: 02.11.20 side 3 af 6

21. Fortynd cellesuspensionen i centrifugerøret med celledyrkningsmedie så der opnås

22. Sørg for at cellerne er i suspension og overfør dernæst:

a. 0,2 ml til T-75 flasken med celledyrkningsmedie (fra pkt. 5).

b. 0,1 mL til hver af de 2 TC-disk med dyrkningsmedie (fra pkt. 6)

23. Inkubér T-75 flasken og de 2 TC-disk i CO2 - inkubatoren ved 37C.

24. Resten af cellerne i 50 ml centrifugerøret bruges til øvelserne øvelse 4: Nedfrysning

Dag 2 (Tjek af subkultiveringen):

Udarbejdet af: SUSU Dato: 02.11.20 side 4 af 6

Rapportering og resultatbehandling i journalbogen:

Følgende spørgsmål skal besvares i journalbogen FØR øvelsen udføres:

Følgende spørgsmål skal besvares i journalbogen efter øvelsen udføres:

Udarbejdet af: SUSU Dato: 02.11.20 side 5 af 6

Skema 1: Vurdering af vækst før subkultivering

Er der synlige tegn på infektion?

Skema 2: Tiden for inkubation med trypsin

Skema 3: Celletælling ved NucleoCounter

Beregning af fortynding af cellesuspension:

𝑉𝑡𝑖𝑙𝑠æ𝑡𝑡𝑒𝑠 = 𝑉𝑒𝑓𝑡𝑒𝑟 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑦𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔 − 𝑉𝑓ø𝑟 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑦𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔 =

Skema 4: Vurdering af vækst før subkultivering

Tid efter subkultivering (timer)

Udarbejdet af: SUSU Dato: 02.11.20 side 6 af 6

Substrater, reagenser, kemikalier og kultur:

Udarbejdet af: SUSU/PESA Dato:02.11.2020 side 1 af 3

1. Tilse de to TC-disk for vækst ved omvendt fasekontrastmikroskopi.

1. Frasug dyrkningsmedium fra TC-disk til spildflaske med 4 % diversol.

8. Frasug 96% ethanol til spildflaske med 4% diversol.

Udarbejdet af: SUSU/PESA Dato:02.11.2020 side 2 af 3

1. Frasug dyrkningsmedium fra TC-disk til spildflaske med 4 % diversol.

5. Tilsæt 2,5 mL fiksativ, og lad det stå 5 min. ved rumtemperatur.

9. Skyl med ionbyttet vand og hæld i spildflaske med 4% diversol.

Rapportering og resultatbehandling i journalbogen:

Udarbejdet af: SUSU/PESA Dato:02.11.2020 side 3 af 3

For udregning af viabilitets % se øvelse 5.