1u Bioteknologi A Se på DNA

Baseret på Edvo-kit 130

CSI - find gerningsmanden

CASE
I forrige weekend skulle Helge holde stor fest for hele familien. I den anledning skulle der selvfølgelig stilles
an med den fineste og dyreste kage fra Lagkagehuset. Marianne Westergaard blev fredag morgen sendt i
byen for at hente kagen, og placerede den i køleskabet på lærerværelset. Da Helge skulle hjem sent fredag
eftermiddag var der en dyb rille ned igennem cremen – nogen havde spist af kagen!!
I løbet af ugen har alle ansatte på skolen måtte gøre rede for deres færden i løbet af fredagen, og det er nu
lykkedes at komme ned på kun tre personer, nemlig Christine, Axel og Bente. Men herfra er
efterforskningen gået i stå, alle fire benægter hårdnakket, at de har haft fingrene i kagen.
Helge har nu bedt jer om hjælp, der er nemlig fundet DNA spor på kagen, og de mistænkte har modvilligt
afgivet en DNA prøve.

Formål
At finde gerningsmanden ved hjælp af PCR og en STR/VNTR-analyse.

Baggrund
Når man skal lave en retsgenetisk undersøgelse for at kunne fastslå hvem der er gerningsmand fra et
gerningsted hvor man har fundet DNA laver man det man kalder ne ”DNA profil”. Når man skal DNA
profilere har man ofte en meget lille DNA prøve, som man ønsker at profilere. Derfor kan man lave PCR for
at få mere DNA. Den del af DNA’et der typisk undersøges her, er nogle områder, hvor den samme sekvens
gentages forskellige antal gange (læs mere om VNTR nedenfor). Dette anvendes generelt fordi, der er mere
variation i VNTR-områder fra person til person, end der er i gener. I virkelige cases undersøges typisk
minimum 13 forskellige områder i genomet og dette forøger sandsynligheden for et definitivt match. Da
DNA-områderne har forskellige længder (pga. gentagelserne) kan de adskilles og analyseres ved en DNA
gelelektroforese. Resultatet af denne bruges i retten til at sandsynliggøre hvem der er gerningsmanden.

Variable Number of Tandem Repeats (VNTR-regioner)

Mange tusind steder i det menneskelige DNA, findes områder med gentagne sekvenser af variabel længde.
F.eks. er sekvensen GATGATGAT en region, hvor GAT-sekvensen gentages flere gange.

Områderne med de gentagede sekvenser kaldes på engelsk og i dansk genetisk fagsprog en gentaget
sekvens - et repeat - og de områder af kerne-DNA, hvor der forekommer en sådan variation af et antal
gentagelser betegnes VNTR områder (variable
number of tandem repeats) dvs. et varierende antal
gentagne sekvenser lige efter hinanden. Et givent
VNTR-område på et bestemt kromosom vil således
have en bestemt længde, der afhænger af, hvor
mange basepar, der er i den gentagede sekvens og
hvor mange gentagelser der er tale om. Ved en
DNA-profilanalyse bestemmer man længderne af et
antal forskellige VNTR-områder vha. PCR. De senere
år har man opdaget eksistensen af et meget stort
antal VNTR-områder med kun 2-4 basepar per
gentaget sekvens og hvor der er 5 til 15 gentagelser.
Det er nogle af disse såkaldte STR-områder (short
tandem repeats) der undersøges i nutidens

1
1u Bioteknologi A Se på DNA
Baseret på Edvo-kit 130

avancerede retsgenetiske DNA-profilanalyser. Ved at undersøge flere forskellige VNTR'er eller STR'er fra det
samme individ opnår efterforskerne en unik DNA-profil for det pågældende individ, der er ulig nogen anden
persons (undtagen for identiske tvillinger).

https://youtu.be/9bEAJYnVVBA

Fremgangsmåde (flowchart)
I vores forsøg er trin 1, 2 og 3 udført. Dvs. DNAet er oprenset og PCR reaktionen der amplificerer ét bestemt
VNTR område (polymorphic region) er udført. I skal dernæst køre gelelektroforesen og analysere resutatet.

CRIME SUSPECT SUSPECT

SCENE #1 #2
Skin
Cells Blood Draw Blood Draw
Hair

Biologica
l Stain

Treat to release
DNA

Perform PCR to
amplify specific
polymorphic
regions

Crime Suspect Suspect

Scene#1#2

Gel Analysis - Suspect #2 matches Crime

Scene

Figure 1:
Comparison of a crime scene DNA
fingerprint with those of two
suspects.

2
1u Bioteknologi A Se på DNA
Baseret på Edvo-kit 130

LAB 1 – Støbning af 0,8% agarose gel – er udført

LAB 2 - Gelektroforese

Materialer (fælles)
 Elektroforesekar + strømforsyning
 Buffer (1xTAE)
 Agarose geler (0,8 % i 1xTAE buffer)

Materialer pr. gruppe

 Prøver med PCR resultat
 Mikropipetter (20-200 μL) med pipettespidser

Fremgangsmåde
1. Placere gelen i elektroforesekarret og fyld med buffer.

2. Overfør 35 µL fra hvert rør til brøndene i gelen. HUSK at skifte pipettespids mellem alle prøver

Rækkefølge
1 A DNA standard markør:DNA-stykker af kendt størrelse

2 B Gerningssted PCR reaktion

3 C Christine PCR reaktion
4 D Aksel PCR reaktion

3
1u Bioteknologi A Se på DNA
Baseret på Edvo-kit 130

5 E Bente PCR reaktion

3. Sæt låg på elektroforesekarret og tilslut til strømforsyningen.

4. Tænd strømforsyningen på 150V, sæt timeren 30 minutter, tjek ind i mellem at den farven ikke
løber ud af gelen (så skal elektroforesen stoppes så prøverne ikke løber ud). Farven skal gerne have
bevæget sig mindst 3 cm fra brøndene før elektroforesen stoppes.

5. Farv gelen og analysér resultaterne

Farvning af gel
DNA er farveløst og kan derfor ikke ses med det blotte øje, og derfor er det nødvendigt at farve DNA’et i
gelen, før resultaterne kan analyseres. Der findes mange forskellige metoder og nedenfor beskrives nogle
af dem.

Metode 1: SYBR® safe

SYBR safe er en ikke-toksisk fluorescerende DNA-farve, som binder

specifikt til DNA dobbelt helix. Når gelen belyses med UV eller blåt
lys, vil det SYBR safe farve, som er bundet til DNA fluorescere grønt.
(se billede). Metoden er særligt anvendeligt efter PCR reaktioner,
hvor mængden af DNA er lille. Farven kan støbes ind i agarosegelen
og resultaterne kan derved visualiseres umiddelbart efter
gelelektroforesen.

1. Fremstil agarosegelen efter øvelsens opskrift

2. Tilsæt SYBR safe til den afkølede agarosegel
SYBR safe leveret som 10.000x koncentrat à ex. 5 μL SYBR safe til 50 mL agarosegel

Metode 2: Fast BlastTM DNA-farve

Fast Blast er en ikke-toksisk DNA-farve, som farver DNA’et mørkeblåt, hvilket kan ses uden brug af lyskilder
(som er nødvendigt ved fravning med SYBR safe). Fast Blast DNA-farve indeholder et positivt ladet stof, som
tiltrækkes af og binder til det negativt ladede phosphatgrupper i DNA’et. Fast Blast kan yderligere også
anvendes til at farve cellekerne ved mikroskopering.

4
1u Bioteknologi A Se på DNA
Baseret på Edvo-kit 130

Langsom farvning – anbefales.

1. Tilsæt 120 mL 1x Fast Blast DNA-farve til farvekarret.
Karret kan indeholde 2 geler

2. Lad farven virke i 4-24 timer. Ryst let undervejs, hvis det
er muligt

3. Hæld farven fra. Gelen er nu klar, idet det ikke er

nødvendigt at affarve.

4. Hæld farven fra og skyld efter med demineraliseret vand.

5. Notér og analysér resultaterne.

Resultater

1. Vis billede/skitse af gelen med angivelse af hvad der er i brøndende

Efterbehandling

 Numrene på DNA markøren indikerer hvor mange basepar DNA stykkerne indeholder

1. Analyser gelen ved at sammenligne de amplificerede DNA-fragmenter for hver af de mistænkte og

crime scene.

Antal bånd i Identificer bånd ved sammenligning med DNA

Prøve
gelen standard markør
DNA standard
markør:DNA-
7 6751, 3652, 2827, 1568, 1118, 825, 630 bp
stykker af kendt
størrelse
A – PCR på DNA fra
gerningssted
A – PCR på DNA fra
Christine
B – PCR på DNA fra
Aksel
C – PCR på DNA fra
Bente

2. Hvem er den skyldige? Begrund

3. Forklar teorien om STR-områder, hvorfor er disse områder gode at anvende? Diskuter og vurder
hvorfor at forskellige mennesker typisk får forskellige båndmønstre i DNA-profiler.

- Forklar kort hvad teorien går ud på.

5
1u Bioteknologi A Se på DNA
Baseret på Edvo-kit 130

4. Hvordan kan man gøre metoden mere sikker end den profil vi har lavet her?
-
Bruge flere steder fra DNAet

Efterbehandling - fortsat

Bestem størrelserne af DNAet amplificeret ud fra DNAet

fra gerningsstedet

Dette gøres vha. en standardkurve, samt viden om

hvordan migrationslængde hænger sammen med
størrelsen på DNA stykket.

Agarosegelelektroforese adskiller DNA ud fra størrelse, da

store molekyler ikke kan passere gennem kanalerne i gelen
med lethed, og derfor vil migrerer en kortere afstand i
gelen, end mindre DNA molekyler. Altså – jo kortere DNA
stykke, jo længere migrerer DNAet i gelen. Jo længere/større DNA stykke, jo kortere migrerer det i gelen.

For at have noget at sammenligne med, kørte vi en prøve, der indeholder bånd af kendte længder kaldet en
"standard". Ved at måle afstanden, som hver af disse bånd har migreret kan vi lave en graf, også kaldet en
"standard-kurve”, som viser sammenhængen mellem migrationslængde og DNA størrelse. Denne kan
derefter bruges til at bestemme størrelsen af ukendte DNA molekyler.

1. Mål afstanden tilbagelagt af hvert standard DNA-fragment fra den nedre kant af prøvebrønden til
den nedre ende af hvert bånd. Notér afstanden i millimeter). Gentag dette for hvert DNA-fragment
i standarden.

2. Undersøg den matematiske sammenhæng mellem migrationslængde (på x-aksen) og DNA længden
(på y-aksen)

3. Bestem forskriften for denne sammenhæng

6
1u Bioteknologi A Se på DNA
Baseret på Edvo-kit 130

4. Mål migrationsafstandene for hvert af fragmenterne i prøven fra gerningsstedet på samme måde
som du målte standardbåndene.

5. Bestem længden af DNA stykkerne fra prøven fra gerningsstedet vha. standardkurven (anvend
forskriften for standardkurven bestemt i punkt 4)