Modul 3 - Bio14: DNA teknikker i molekylær medicin

Instruktor vil gennemgå/repetere PCR og DNA sekventering.

Opg. 1 Hvilke af de følgende udsagn er korrekte med hensyn til gelelektroforese af DNA-
fragmenter?
(a) DNA migrerer gennem en matrix indeholdende et mikroskopisk netværk af porer
(b) DNA migrerer mod en negativt ladet elektrode
(c) DNA kan visualiseres uden farver eller indmærkninger
(d) DNA separeres på basis af deres sekvens

Opg.2 Et laboratorium har etableret en teknik til undersøgelse af DNA-replikation i et

cellulært ekstrakt. Dette cellulære ekstrakt indeholder alle de nødvendige proteiner til
at lave DNA-replikation i et reagensglas, mens alle andre nødvendige reagenser skal
tilsættes. Til dette cellulære proteinekstrakt tilføjer du nukleotider, en lille mængde
radioaktivt mærket 32P-dGTP til hjælp til visualisering af det syntetiserede DNA og
et 4000-basepar lineært dobbeltstrenget DNA-molekyle, der indeholder et
replikationsorigin i midten. Efter at reaktionen har fået lov at fortsætte i 30 minutter
ved 30 °C koger du blandingen for at denaturere proteinerne og DNA-strengene,
hvorefter du adskiller komponenterne på en acrylamidgel og detekterer de radioaktivt
mærkede DNA-produkter. Denne fuldstændige reaktion er vist i bane 2 på gelen i
nedenstående figur.

A. Du udfører analysen selv for første gang, mens ingen andre er i laboratoriet. Røret
mærket "nukleotidblanding" har kun nok til en enkelt reaktion, men du finder et rør
med en etiket, der læser "dATP, dTTP, dGTP, dCTP", og du bruger dette i en anden
reaktion. Du finder at den første reaktion ligner bane 2, mens den anden reaktion
ligner bane 3. Hvorfor blev der ikke syntetiseret DNA i den anden reaktion?

B. Din lab partner har for nylig isoleret en mutant stamme, der kan replikere sit DNA
normalt ved 30 °C, mens der ingen DNA replikation ses ved 40 °C. Han kalder
mutanten tsr1, for temperaturfølsom replikation. Vildtypestammen replikerer effektivt
ved begge temperaturer. Du tror, at du kan bruge det biokemiske assay af
celleekstrakter til at identificere, hvilke gener der er defekte i mutanten. Du dyrker
vildtypeceller og tsr1-celler ved 40 °C, laver ekstrakterne, inkuberer DNA-
replikationsreaktionen ved 40 °C og kører produkterne på en gel. Du observerer
mønsteret vist i banerne 4 og 5. Du er så begejstret over de resultater, at du fortæller
til din lab-partner, at du ved, hvilket enzym der er defekt. Han er glad for dine
resultater, men siger, at der er tre forskellige enzymer, der kan redegøre for dine
resultater. Hvilke er de?
Opg. 3. Du har isoleret et tilfældigt dobbeltstrenget DNA fragment fra et genom, der blandt
andet indeholder sekvensen .......ATCGCGTAACATGGAATTCGG...........
a. Har de to komplementære DNA strenge i det isolerede fragment den samme base
sammensætning?
b. Er A+G indholdet det samme som C+T indholdet i DNA fragmentet?
c. Restriktions enzymet EcoRI genkender GAATTC og HindIII genkender
AAGCTT. Vil nogen af disse enzymer skære i fragmentet?

Opg. 4 Ved et uheld har du tabt mærkaterne på to opbevaringsrør der indeholder hvert sit
plasmid, og nu ved du ikke hvilket plasmid, der er i hvilket rør. Heldigvis har du
“restriction maps” for begge plasmider (vist i figuren nedenfor). Du har mulighed for
at teste en (og kun en) prøve fra hvert rør. Du har agarose gel elektroforese, DNA-
størrelses markører og de viste restriktionsenzymer til din rådighed.
 Forklar det eksperiment du vil udføre for at bestemme hvilket plasmid, der er i hvilket
rør og hvilke restriktionsenzymer, du vil bruge til dette eksperiment?

Opg. 5 Hvilket udsagn er forkert vedrørende dideoxy DNA sekventering?

A. Sekventeringen kræver normale deoxyribonukleotider
B. En primer er nødvendig for at DNA polymerasen kan starte
C. Man kan sekventere dobbeltstrenget DNA
D. En DNA polymerase med proof-reading aktivitet er nødvendig for at få den
korrekte sekvens

Opg. 6 Hvilke(t) af de følgende udsagn om PCR er falsk?

(a) PCR bruger en DNA-polymerase fra en termofil bakterie.
(b) PCR er særligt kraftfuld, fordi der efter hver replikationscyklus er en lineær
forøgelse af mængden af DNA, der er til rådighed.
(c) Hver runde af replikation starter med denaturering af de fordoblede DNA-strenge.
(d) PCR-reaktionen vil danne en pulje af dobbeltstrengede DNA-molekyler, hvor de
fleste strenge vil have DNA fra primere ved 5'-enderne

Opg. 7 In situ hybridisering kan bruges til at bestemme

(a) sekvens af et klonet gen.
(b) distribution af proteiner i væv.
(c) position af et klonet fragment af DNA på et plasmid.
(d) størrelsen af et gen.
(e) fordeling af en given type mRNA i forskellige væv
Opg. 8

Nedenstående figur illustrerer den første cyklus i PCR teknikken. Beskriv de angivne tal og
bogstaver på følgende vis:

a) Hvad symboliserer markeringerne A, B og C?

b) Beskriv kort, hvad der sker ved pilene 1 og 2

c) Hvilke reagenser anvendes ved pil 3 for at omdanne ”B” til ”C”?

Opg. 9

En kvinde indlægges på hospitalet efter længere tids sygdom med en lungeinfektion. Der
tages en ekspektorat prøve (sekret fra nedre luftveje) for at identificere bakterien. Bakterier
kan skelnes fra hinanden, da de hver især indeholder unikke gener med kendt DNA sekvens.

1. Der anvendes PCR til at bestemme hvilken bakterie, der er skyld i infektionen. Beskriv PCR
teknikken, og gør kortfattet rede for, hvorfor identifikation af bakterier med denne teknik er
velegnet til diagnostisk anvendelse.

2. Nedenfor ses en del af sekvensen for det unikke gen:

5’- ATTGATGCTAGCTTAGG …………. GTAAAGTTCGGATCATGCT -3’

3’- TAACTACGATCGAATCC …………. CATTTCAAGCCTAGTACGA -5’

Angiv hvilke to af nedenstående primere, der skal anvendes til PCR.

a) 5’-GTAAAGTTCGGATCATGCT-3’
b) 5’-AGCATGATCCGAACTTTAC-3’
c) 5’-ATTGATGCTAGCTTAGG-3’
d) 5’-TAACTACGATCGAATCC-3’
e) 5’-TCGTACTAGGCTTGAAATG-3’
f) 5’-CATTTCAAGCCTAGTACGA-3’
3. PCR-produktet køres bagefter på en agarose gel. Gør rede for hvorledes PCR-produktet
bevæger sig i en agarose gel.

Opg. 10

Forklar princippet bag Next generation DNA sequencing.