5.

Jonizacija aminokiselina

Aminokiseline sadrze amino (NH2) i karboksilnu grupu (COOH) koje mogu

disosovati kao slabe baze i kiseline. Neke aminokiseline imaju dodatne
kisele ili bazne grupe u svojim bocnim grupama koje se mogu jonizovati.

Glicin- ako se rastvori u kiselom rastvoru (pH1-visak protona), amino

grupa ce primiti H+ i preci ce iz NH2 u NH3+, forma amonijum jona . Ako se
sada povecava pH, dodavanjem baze, desavace se postepena jonizacija
karboksilne grupe (prelazak u COO-). Na pH 6, glicin je ‘’zwitterion’’, sto
znaci da je neto naelektrisanje glicina jednako nuli (izoelektricna tacka)
jer ima jedno pozitivno (potice od NH3+) i jedno negativno naelektrisanje
(potice od COO-). Dodatnim povecavanjem pH, protonovana amino
grupa se sada jonizuje i prelazi nazad u NH2, a glicin dobija strukturu
karboksilatnog jona. Iznad izoelektricne tacke, glicin se ponasa kao
kiselina (donira proton) i dobija neto negativno naelektrisanje, a ispod
izoelektricne tacke se ponasa kao baza-prima proton i postaje pozitivno
naelektrisan-amfolit. Ovo prikazujemo krivom titracije aminokiseline:
grafik koji pokazuje zavisnost pH od ekvivalenti dodate baze OH-.

Shema jonizacije glicina:

Primenom Henderson-Haselbahove jednacine moze se izvesti formula za

izracunavanje izoelektricne tacke glicina:

pKa1  pKa 2
pI 
2
Pri cemu je:

pKa1- negativni logaritam konstante disocijacije karboksilne grupe

pKa2- negativni logaritam konstante disocijacije protonovane amino

grupe

U oblastima pKa1 I pKa2 glicin ima puferske sposobnosti.

Kod glutaminske kiseline (koja u bocnoj grupi ima dodatnu COOH grupu),
za pKa vrednosti se uzimaju one koje su na shemi jonizacije levo i desno
od forme cije je neto naelektrisanje nula. Uvek prvo disosuje alfa
karboksilna grupa pa nakon toga bocna amino ili karboksilna grupa.(?)
Ovo se moze primeniti na lizin, guanidinsku grupu arginina, sulfhidrilna
grupa cisteina, imidazolna grupa histidina.

6. Principi izolovanja nukleinskih kiselina

Izbor metode za izolovanje nukleinskih kiselina zavisi od tipa, izvora

velicine i kolicine nukleinskih kiselina kao i od kvaliteta koji je potreban
za dalju upotrebu nukleinske kiseline.

Izolovanje nukleinskih kiselina ukljucuje fenolsku ekstrakciju I etanolsku

precipitaciju.

Osnovni koraci u izolovanju nukleinskih kiselina:

1) Liza celija i solubilizacija nukleinskih kiselina

2) Hemijske I enzimske metode za odstranjivanje kontaminacije

Liza celije i oslobadjanje molekula nukleinskih kiselina (DNK ili RNK) se
moze obaviti na razlicite nacine, u zavisnosti od organizma; celije
bakterija se najcesce sonifikuju ili tretiraju lizozimom, a primenom
deterdzenta, SDS-a na primer, takodje se mogu razbiti celijske
membrane.

Celijski lizat se tretira smesom fenola (denaturise proteine I odvaja ih od

nukleinskih kiselina), hloroforma (denaturise proteine, stvara se gornja
vodena faza-RNK i donja organska faza-DNK I proteini) i izoamilalkohola
(guanil izotiocijanat). Guanil izotiocijanat efikasno preciscava RNK jer
suprimira aktivnost RNaza.

Precipitacija alkoholom (najcesce hladnim 95% etanolom ili

izopropanolom) se zasniva na agregaciji molekula DNK ili RNK (jer su
nerastvorni u alkoholu) i formiranju taloga nakon centrifugiranja. Za
efikasniju precipitaciju, pre dodavanja alkohola dodaju se soli kao sto su
amonijum ili natrijum acetat. Za precipitaciju RNK se koristi litijum hlorid.
Za odstranjivanje kontaminacija (proteina) iz izolata nukleinskih kiselina
mogu se koristiti enzimi kao sto je proteinaza K.

Pored ovih osnovnih postoje i dodatni koraci pri izolovanju DNK, kao sto
su dodavanje helikirajucih agenasa za dvovalentne jone (Mg2+ i Ca2+)
cime se sprecava degradovanje DNK od strane DNaza, dok se RNK
odstranjuje degradacijom pomocu RNaza. ((Posle precipitacije, DNK se
moze rastvoriti u blago alkalnim rastvorima (npr TAE) ili u vodi. Procena
cistoce izolovane DNK se vrsi merenjem odnosa A260/A280. Za cistu DNK,
ovaj odnos treba da iznosi 1.8-1.9.))

Za izolovanje i preciscavanje nukleinskih kiselina mogu se primeniti i

jonoizmenjivacka i ekskluziona hromatografija, centrifugiranje u CsCl I
ekstrakcija iz agaroznog gela. Metodom centrifugiranja DNK u gradijentu
CsCl postize se veliki prinos DNK velike cistoce, s tim sto je ovo jako
skupa metoda. Cesce se koriste ‘’kitovi’’ za izolovanje DNK iz odredjenih
izvora i kolicine tkiva. Izolovanje DNK iz plazmidske celije se naziva mini
prep metodom. Za odvajanje genomske DNK od plazmidne moze se
primeniti metoda hromatografije, sedimentacije ili elektroforeza na gelu.