Machine Translated by Google
Bài báo
CRISPR-Cas9 Chỉnh sửa gen của họ gen Sal1 trong lúa mì
Toni Mohr 1 , James Horstman 1
Trích dẫn: Mohr, T.; Horstman, J .; Gu, YQ;
Elarabi, NI; Abdallah, NA; Thilmony, R.
CRISPR-Cas9 Chỉnh sửa gen của họ gen Sal1 ở
lúa mì. Cây 2022, 11, 2259. https: //
doi.org/10.3390/plants11172259
Biên tập viên học thuật: Fangpu Han
Nhận: ngày 5 tháng 8 năm 2022
Được chấp nhận: ngày 26 tháng 8 năm 2022
Xuất bản: 30 tháng 8 năm 2022
Lưu ý của nhà xuất bản: MDPI vẫn tiếp tục
liên quan đến các tuyên bố về quyền tài
phán trong các bản đồ và tổ chức đã xuất bản
các chi nhánh.
Bản quyền: © 2022 bởi các tác giả. Li
censee MDPI, Basel, Thụy Sĩ.
Bài viết này là một bài viết truy cập mở
phân phối theo các điều khoản và con
phần của Creative Commons Tại
giấy phép tri ân (CC BY) (https: // cre
ativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Plants 2022, 11, 2259. https://doi.org/10.3390/plants11172259
, Yong Q. Gu 1 , Nagwa I. Elarabi 2 , Naglaa A. Abdallah 2 và Roger Thilmony 1, *
1 USDA-ARS, Đơn vị cải tiến cây trồng và di truyền, Albany, CA 94710, Hoa Kỳ
2 Bộ môn Di truyền, Khoa Nông nghiệp, Đại học Cairo, Giza 12613, Ai Cập
* Thư từ: roger.thilmony@usda.gov; ĐT: + 1- (510) -559-5761
Tóm tắt: Sal1 được bảo tồn cao mã hóa một enzym đa chức năng với inositol polyphosphat-1-
hoạt động của phosphatase và 3 ′ (2 ′), 5′-bisphosphate nucleotidase và đã được chứng minh là làm thay đổi
khả năng chống chịu stress phi sinh học ở thực vật khi bị gián đoạn. Các kỹ thuật chỉnh sửa gen chính xác
đã được sử dụng để tạo ra đột biến sal1 trong lúa mì bánh mì lục bội. Hệ thống Cas9 CRISPR (Clustered
Regulatory Interspaced Short Pal indromic Repeats) với ba RNA dẫn đường (gRNA) được sử dụng để bất hoạt sáu Sal1
các gen tương đồng trong bộ gen lúa mì Bobwhite. Kết quả là các cây lúa mì đột biến bị vô hiệu hóa tất cả
các gen Sal1 của chúng có thân mảnh hơn, sinh khối giảm nhẹ và sinh trưởng chậm hơn trong điều kiện hạn
chế nước, nhưng không cho thấy năng suất được cải thiện trong điều kiện khô hạn.
Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các gRNA đa bội cho phép chỉnh sửa gen mục tiêu hiệu quả của họ gen
Sal1 trong lúa mì lục bội. Những cây lúa mì đột biến sal1 này sẽ là nguồn lực để nghiên cứu sâu hơn về
chức năng của họ gen này trong lúa mì.
Từ khóa: CRISPR; lúa mì; Sal1; Hạn hán; Triticum aestivum; chỉnh sửa gen
1. Giới thiệu
Lúa mì là nguồn lương thực cực kỳ quan trọng và là một trong những loại cây trồng được trồng
rộng rãi nhất trên thế giới, chiếm khoảng 17% diện tích đất canh tác trên thế giới và sản lượng toàn
cầu khoảng 700 triệu tấn (https://www.fao.org/3/ y4011e / y4011e04.htm; truy cập 30
Tháng 5 năm 2022). Nó cung cấp trung bình 19% tổng lượng calo trong chế độ ăn uống của chúng ta và
là một trong những nguồn protein thực vật quan trọng nhất. Lúa mì làm bánh mì đặc biệt nhất trong số
các loại cây ngũ cốc ở chỗ nó có chứa gluten cho phép sản xuất bánh mì có men và là thành phần chính
trong nhiều loại thực phẩm khác [1].
Chênh lệch giữa cung và cầu đối với lúa mì, là một mặt hàng chiến lược, khiến nó bắt buộc phải
tăng sản lượng tổng thể, bao gồm cả những khu vực chiếm ưu thế dưới mức tối ưu, tức là thiếu nước,
nhiễm mặn và nhiệt độ cao. Khi nguồn nước tưới ngày càng khan hiếm, việc phát triển các giống cây
trồng cải thiện khả năng thích ứng với hạn hán là một mục tiêu chính trong các chương trình cải
tiến lúa mì. Biến đổi khí hậu toàn cầu đã dẫn đến tình trạng ấm lên nói chung và sự xuất hiện thường
xuyên hơn của hạn hán và các căng thẳng phi sinh học khác trên toàn thế giới trở thành mối đe dọa
lớn đối với an ninh lương thực quốc tế, vì nó làm giảm sản lượng nông nghiệp tới 50% [2,3]. Việc
phát triển các giống lúa mì chịu hạn là một thách thức quan trọng và cần thiết để đảm bảo an ninh
lương thực trong tương lai [3–6]. Hạn hán là một đặc điểm phức tạp, khiến sự phát triển của các
giống lúa mì chịu hạn gặp nhiều thách thức, nhưng các công nghệ mới đang cung cấp những cơ hội mới
để cải thiện di truyền của lúa mì [4,5].
Một hệ thống chỉnh sửa bộ gen hiệu quả được gọi là Clustered Regulatory Interspaced Short
Palindromic Repeats, với liên kết Cas9 nuclease (CRISPR / Cas), đã nổi lên như một công cụ mạnh mẽ
để thao tác chính xác các bộ gen của sinh vật nhân chuẩn bao gồm cả bộ gen của các cây trồng không
tốt [7–14]. Hệ thống CRISPR / Cas là một công cụ định hướng RNA để tạo ra các đoạn DNA đích chính
xác. Các điểm ngắt này được sửa chữa bằng cách nối đầu không tương đồng, có thể gây ra lỗi chèn hoặc
xóa nhỏ trong mục tiêu
www.mdpi.com/journal/plants
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 2 trên 17

sự phối hợp. Do đó, hệ thống CRISPR / Cas là một cách hiệu quả để tạo ra các gen có mục tiêu [7,9,14].
Trình tự nhắm mục tiêu cụ thể của nuclease Cas9 được cung cấp bởi sự liên kết của một RNA tổng hợp
nhỏ được gọi là RNA dẫn đường đơn (gRNA). Kể từ khi được phát hiện, hệ thống CRISPR / Cas đã được
chứng minh là làm trung gian hiệu quả cho các đứt gãy sợi kép được nhắm mục tiêu trong một loạt các
loài bao gồm cả thực vật [7,8,11–14].
Hệ thống CRISPR / Cas ban đầu được chứng minh là làm trung gian hiệu quả cho các đứt gãy sợi kép
có mục tiêu ở các cây mô hình như Arabidopsis và thuốc lá [15,16], nhưng tiện ích của nó đối với các
loài cây trồng quan trọng như lúa và lúa mì ngay sau đó [12–14,17–23 ]. Khả năng của hệ thống này
trong việc tạo ra các đột biến có mục tiêu một cách hiệu quả đặc biệt hữu ích trong các loại cây trồng
như lúa mì có chứa bộ gen rất lớn và phức tạp. Việc sử dụng hệ thống này trong việc khám phá các chức
năng gen và khả năng kỹ thuật khả năng chống chịu stress hoặc tín hiệu phi sinh học / hạn hán ở lúa
mì có thể sẽ tỏ ra hữu ích trong việc tạo ra các kiểu gen mới với các đặc điểm mong muốn trong tương
lai [12–14,24].

Gen Sal1 mã hóa một enzym đa chức năng với inositol polyphosphat-1-phos phatase và hoạt động
của enzym nucleotidase 3 ′ (2 ′), 5'-bisphosphat được giả thuyết là một cảm biến ứng suất oxy hóa cục
bộ plastid [25–29]. Nghiên cứu được thực hiện trên Arabidopsis
đã chỉ ra rằng cây đột biến thiếu SAL1 chức năng (còn được gọi là FRY1, HOS2, ALX8, OLD101), có khả
năng chịu hạn [25–30]. Các cây sal1 thể hiện quá trình trao đổi chất của chúng lặp lại, dẫn đến sự
gia tăng các hợp chất bảo vệ thẩm thấu và axit abscisic hormone gây căng thẳng, biểu hiện của khả
năng chịu stress phi sinh học [27–29].

Gen SAL1 cũng có liên quan đến việc kiểm soát mức độ oxy phản ứng của các loài và sự già đi của lá ở
cây Arabidopsis [30]. Sự im lặng tạm thời của sự biểu hiện Sal1 trong lúa mì mà chúng ta sử dụng một
hệ thống biểu hiện dựa trên virus đã gợi ý rằng lúa mì thiếu hoặc giảm hoạt tính Sal1 cũng thể hiện
khả năng chịu hạn dưới áp lực nước ngắn hạn [31].
Để điều tra vai trò của Sal1 trong lúa mì bánh mì lục bội, chỉnh sửa gen CRISPR đã được sử dụng
để đưa ra các đột biến trong họ gen. Thế hệ của cây lúa mì trắng Bob chuyển gen, đặc điểm phân tử của
chúng bao gồm việc xác định các đột biến nhiễm hắc ín và đặc điểm của sự tăng trưởng, hình thái và
phản ứng với stress abi otic ở các đột biến được trình bày.

2. Kết quả

2.1. Họ gen Sal1 trong lúa mì

Sal1 là một gen sao chép đơn được bảo tồn cao trong bộ gen của các cây mô hình Ara bidopsis
thaliana và Brachypodium distachyon [32]. Tuy nhiên, lúa mì bánh mì hiện đại là một loại lục bội tái
phát, trải qua quá trình tiến hóa bộ gen nhanh chóng và phức tạp. Chúng tôi đã thực hiện phân tích
công thức bioin bằng cách sử dụng các trình tự bộ gen có sẵn công khai để điều tra số lượng và chức
năng của gen Sal1 trong lúa mì.
Trong Mùa xuân Trung Quốc, phân tích sơ bộ đã phát hiện ra bảy nguyên lý học khác nhau của Sal1:
5ABD, 7AD và hai gen trên 4A (4A-1, 4A-2). Các cặp gen trên 4A cách nhau ít hơn 50 cặp kilobase (kb)
và rất giống nhau ngoại trừ việc mất một cặp base duy nhất ở exon thứ bảy gây ra hiện tượng lệch khung
và codon dừng sớm ở alen 4A-1. Thay vào đó, mặc dù đây là gần cuối của trình tự mã hóa, nhưng mức độ

cao của quá trình tiến hóa trong khu vực này ngụ ý rằng 4A-1 có thể là một gen giả. Tất cả các chất
đồng vị Sal1 khác dường như mã hóa một trình tự protein chức năng.

Để điều tra sự tiến hóa của họ gen nhỏ này trong các giống lúa mì khác, một đoạn 203 cặp bazơ
được bảo tồn của alen Trung Quốc Spring Sal1 5D bao gồm các axit amin được bảo tồn trong exon thứ tư
đã được BLAST tìm kiếm dựa trên một số bộ gen lúa mì có sẵn khác (Bảng 1). Bộ gen Aegilops tauschii D
mang hai alen Sal1 có mặt trên chro mosomes 5 và 7. Ở lúa mì tứ bội (Triticum turgidum, AABB), loài
phụ chưa được nuôi cấy dicoccoides (gia nhập Zavitan) có ba bản sao trên nhiễm sắc thể 7A, 5A và chỉ
có một chức năng duy nhất. sao chép trên 4A (4A-2), trong khi phân loài được nuôi trồng là durum (cv.
Svevo và Kronos) cũng có gen 5B và 4A-1. Triticum spelta (gia nhập PI190962) và Triticum aestivum cv.
Tuy nhiên, Norin 61 có cùng bảy alen với Chinese Spring,
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 3 trên 17

hầu hết các giống cây trồng khác của Triticum aestivum đã mất 5A homeolog của Sal1. Các
giống cây trồng của Canada được lai tạo gần đây CDC Landmark và CDC Stanley có năm giống
vi khuẩn Sal1 ; chúng thiếu 4A-2 và thay vào đó có 4A-1 homeolog không có sự xóa cặp bazơ
duy nhất được tìm thấy trong các bộ gen lúa mì khác.

Bảng 1. Họ gen Sal1 ở lúa mì và họ hàng với lúa mì.

Tên gia nhập (Trình tự năm được phát hành) Sal1

Loài Bộ gen
[Trích dẫn] 5A 5B 5D 4A-1 4A-2 7A 7D

Aegilops tauschii DD AL8 / 78, AY61, AY17, XJ02, T093 (2021) [33,34] + +

Triticum turgidum + + +
AABB Zavitan (2019) [35,36]
subsp. dicoccoides
Triticum turgidum + + + + +
AABB Svevo (2019) [37]
subsp. Lúa
mì cứng + + + + +
AABB Kronos (2017)
subsp. Ngô
lúa mì Durum AABBDD Lúa PI190962 (2020) [38] + + + + + + +
mì mùa xuân AABBDD Mùa xuân Trung Quốc (2021) [39]
+ + + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD Norin 61 (2020) [38] + + + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD ArinaLrFor (2020) [38] + + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD Jagger (2020) [38] + + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD Julius (2020) [38] + + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD LongReach Lancer (2020) [38] + + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD Phụ nữ (2020) [38] + + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD SY Mattis (2020) [38] + + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD Thợ hàn (2021) [40] + + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD Bobwhite (nghiên cứu này)
+ + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD CDC Landmark (2020) [38] + + + + +
Lúa mì mùa hè AABBDD CDC Stanley (2020) + + + + +

[38] + = gen hiện tại; hộp màu xám đậm = không có gen, hộp màu xám nhạt cho biết gen 4A-1
bị đột biến lệch khung dẫn đến codon dừng sớm.

Một cuộc điều tra về dữ liệu biểu hiện gen có sẵn công khai trên Genevestigator cho
thấy rằng tất cả các nguyên lý Sal1 của lúa mì đều có dữ liệu biểu hiện ngoại trừ 7D, không
được ghi chú trong bộ dữ liệu có sẵn. Hơn nữa, 5D là gen biểu hiện cao nhất và 5A có biểu
hiện thấp nhất, các gen khác là gen trung gian (Hình S1). Mức độ biểu hiện rõ ràng thấp của
5A trong bộ dữ liệu có thể là do thực tế là vi lượng nội địa bị thiếu trong nhiều giống lúa
mì.
Để mô tả đặc điểm của họ gen trong bộ gen Bobwhite, các gen Sal1 đã được khuếch đại
PCR bằng cách sử dụng các đoạn mồi dựa trên các trình tự được bảo tồn trong họ gen được gửi
trước vào Mùa xuân Trung Quốc (Bảng S1). Các sản phẩm khuếch đại được nhân bản và các dòng
riêng lẻ được giải trình tự (Hình S2). Mặc dù hầu hết các homeolog đã được khuếch đại dễ
dàng, nhưng gen 5A Sal1 không được khuếch đại từ Bobwhite, cho thấy rằng giống lúa này
cũng thiếu homeolog như một số giống lúa mì khác (Bảng 1). Phân tích trình tự cũng cho
thấy rằng các trình tự Bobwhite Sal1 được nhân bản rất giống với bộ gen tham chiếu Mùa xuân
của Trung Quốc. Chỉ có một số đa hình nucleotide được quan sát thấy ở Bob trắng, dẫn đến
bốn thay đổi axit amin khiêm tốn trong các protein Sal1 được mã hóa. Sự liên kết giữa các
trình tự một phần protein Bobwhite Sal1 với trình tự A. thaliana và B. distachyon cũng cho
thấy mức độ bảo tồn cao giữa Bobwhite và các loài mô hình này (Hình S3).
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 4 trên 17

2.2. Thiết kế và chuyển đổi cấu trúc CRISPR-Cas9 Sal1 Knockout

Để tối đa hóa xác suất tạo ra các cây lúa mì lục bội loại Sal1 hoàn chỉnh , ba RNA
dẫn đường đơn (gRNA) (Bảng S2) nhắm mục tiêu các chuỗi nucleotide được bảo tồn trong các
gen giống Sal1 của lúa mì đã được thiết kế bằng cách sử dụng công cụ web CRISPR
MultiTargeter [41]. Các trình tự mục tiêu này hầu như được bảo tồn hoàn toàn trong các
alen Bob trắng Sal1 (Hình 1A), chỉ có một sự không khớp chức năng duy nhất được thấy trong
mục tiêu 7D 5 ′. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng vì Sal1 được bảo tồn nhiều trong thực
vật [32], các đột biến ở các vị trí đích exon 4, 5 và 7 (Hình 1B) có thể sẽ gây ra các
thay đổi axit amin hoặc dịch chuyển khung tạo ra một protein không có chức năng.

Một

Hình 1. Các vùng nhắm mục tiêu của CRISPR trong họ gen Sal1 của lúa mì . (A) Các vùng bảo tồn gen Sal1 của
lúa mì được nhắm mục tiêu bởi chỉnh sửa CRISPR. Phần dư được gạch dưới trong hộp chỉ ra sự trùng khớp sai 1
độ bazơ trong trình tự vị trí đích Sal17D 5 ′. (B) Sơ đồ hiển thị vị trí của các vị trí đích trong sáu gen
Bobwhite Sal1 . Các đường màu đen biểu thị các intron và các hộp biểu thị các exon. Sal14A 1 và Sal14A 2
các gen nằm song song trên nhiễm sắc thể 4A, cách nhau khoảng 48 kilobase (kb). Dấu hoa thị cho biết sự
không khớp với chuỗi mục tiêu Sal17D 5 ′.

Trong cấu trúc nhắm mục tiêu Sal1 , các RNA dẫn đường được bao bọc bởi các bộ đệm RNA
vận chuyển (tRNA) và được biểu hiện bằng cách sử dụng promoter switchgrass Ubiquitin1
(PviUbi1) với trình kết thúc phiên mã nopaline synthase (nos) [42]. Gen Cas9 được cấu tạo
xuất ngoại dưới sự kiểm soát của promoter ngô Ubiquitin 1 (ZmUbi1) và nos terminator (Hình
S4). Cấu trúc CRISPR nhắm mục tiêu Sal1 được kết hợp với plasmid thứ hai
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 5 trên 17

mang gen đánh dấu chọn lọc cây thanh tạo khả năng kháng thuốc diệt cỏ bi alaphos và biến đổi
lưỡng tính thành Bobwhite. Tổng cộng có khoảng 3000 phôi imma ture đã bị bắn phá trong nhiều
thí nghiệm độc lập trong khoảng thời gian hơn 6 tháng. DNA bộ gen được chiết xuất từ những cây
lúa mì tái sinh chịu được thuốc trừ cỏ và sự hiện diện của trình tự promoter Cas9, bar và
PviUbi1 được củng cố bằng sự khuếch đại PCR trong 32 sự kiện chuyển gen độc lập (các đoạn mồi
sàng lọc được trình bày trong Bảng S2).

2.3. Xác định các dòng đột biến lúa mì Sal1

Vị trí đích Sal1 3 ′ gRNA chứa vị trí nhận dạng XcmI nội sinh cho phép sử dụng xét nghiệm
Trình tự đa hình đã được khuếch đại (CAPS) để xác định các đột biến được tạo ra bên trong (Hình
2A). Vị trí nhận dạng cho XcmI là bốn cặp bazơ ở phía trên và phía dưới của vị trí đứt gãy sợi
kép Cas9 có khả năng xảy ra, vì vậy hầu hết các trường hợp chèn, xóa nhỏ và một số đột biến
điểm được nhắm mục tiêu sẽ ngăn cản quá trình tiêu hóa XcmI (Hình 2B). Hai cặp mồi được thiết
kế để PCR khuếch đại trình tự bao trùm vùng này: một cho các nội chất của nhiễm sắc thể 5, và
một cho các nội chất của nhiễm sắc thể 7 và 4 (Hình 2C). Xét nghiệm CAPS được sử dụng để sàng
lọc các đột biến trong 32 gen T0 chuyển gen độc lập
sự kiện. Kết quả đã xác định được bảy sự kiện có đột biến ngăn cản quá trình tiêu hóa XcmI
(15,6% các sự kiện chuyển gen độc lập) và năm sự kiện trong số này tạo ra T1 prog eny nơi các
đột biến được di truyền. Ba sự kiện mang đột biến trong cả hai xét nghiệm CAPS (gợi ý đột biến
trong nhiều chất đồng căn Sal1 ). Các sự kiện được chọn này sau đó được truyền sang thế hệ T2
và T3 để mô tả thêm (Bảng S4
và S5).

Hình 2. Màn hình xác định các đột biến Sal1 được nhắm mục tiêu . (A) Vị trí của vị trí cắt XcmI trong vùng
được nhắm mục tiêu 3 ′ gDNA (các nucleotide CCA ……… TGG bóng mờ biểu thị vị trí nhận dạng). (B)
Điện di trên gel agarose cho thấy sản phẩm PCR của cặp mồi sàng lọc nhiễm sắc thể số 5 ở kiểu hoang dại
Bobwhite (WT) và các dòng chuyển gen đột biến trước và sau khi tiêu hóa XcmI . Sản phẩm Wildtype PCR bị
XcmI cắt hoàn toàn, trong khi những sản phẩm có đột biến ở vị trí 3 ′ hiển thị các dải lớn hơn và / hoặc
không bị cắt. Dòng chuyển gen 2a và 2b là dòng anh em thừa hưởng cùng một đoạn DNA 56 bp chèn vào vị trí 3
′ của 5D, xuất hiện ở đây như một dải lớn hơn trong xét nghiệm PCR. (C) Các đoạn mồi được sử dụng trong quá
trình khuếch đại PCR của các vùng mục tiêu 3 ′ được sàng lọc trong thử nghiệm.

Một trong những sự kiện di truyền xuất hiện là một cây T0 chimeric , vì thế hệ con cháu
T1 là sự kết hợp giữa kiểu dại và cây đột biến dựa trên sàng lọc CAPS. Thế hệ con cháu T2 từ
một trong những cây T1 kiểu dại này đã được xác nhận là không chuyển gen và không di truyền ở
các vị trí mục tiêu của Sal1 và sau đó được sử dụng làm mẫu kiểm soát tái sinh / nuôi cấy mô
(RC) trong các thí nghiệm về kiểu hình.
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 6 trên 17

Sử dụng xét nghiệm sàng lọc CAPS, ba sự kiện độc lập được xác định là có đột biến hoàn
toàn hoặc gần như hoàn toàn trong các vị trí mục tiêu 3 ′. Những sự kiện này cũng dẫn đến
việc có nhiều locus chuyển gen, vì không có con không chuyển gen nào được phục hồi trong các
thế hệ tiếp theo. Hai cá thể từ các sự kiện độc lập, sau đây được gọi là 6KO1 (6 Knock-Out
1) và 6KO2, mang đột biến ở mọi vị trí đích Sal1 được giải trình tự , ngoại trừ vị trí 7D
chứa một điểm không khớp với 5 ′ gRNA.
Một số sự sắp xếp lại chính trong hai sự kiện này bao gồm việc chèn DNA chuyển gen (Hình
S5). Việc kết hợp các mảnh cấu trúc biến nạp vào các vị trí lấy nhựa Cas9 đã được mô tả trước
đây ở lúa mì, khoai tây và gạo được biến đổi lưỡng tính [43–
45]. Một đột biến bất thường được tìm thấy trong hai sự kiện độc lập là sự hợp nhất gen của
hai alen 4A, cho thấy sự xóa bỏ một vùng khoảng 48 kb nằm giữa các alen 4A (Hình S5A). Những
đột biến này có khả năng xuất hiện ngay sau cuộc bắn phá (Milner et al. 2020), điều này phù
hợp với quan sát rằng một phần của cấu trúc biến đổi được tích hợp trong vị trí mục tiêu.
Nhiều đột biến được phát hiện ở các vị trí mục tiêu khác là những đoạn chèn / xóa nhỏ
(indels) hoặc không được xác minh với nhiều cặp mồi khác nhau, cho thấy có sự xóa bỏ hoặc
sắp xếp lại lớn.
Sự kiện biến đổi độc lập thứ ba có một số vùng bị thiếu trong các alen Sal1 5B và 5D,
nhưng mặt khác lại mang các indels nhỏ ở hầu hết các vị trí đích. Thực vật T0 nhỏ hơn và kém
sinh sản hơn so với các thể biến nạp khác, có thể là kết quả của sự biến đổi thể bội hoặc
sự hiện diện của các đột biến độc nhất. Không giống như 6KO1 và 6KO2, không phải tất cả các
vị trí đích của Sal1 đều bị đột biến trong dòng này; tuy nhiên, tất cả các gen được giải
trình tự dường như tạo ra một protein không có chức năng. Đột biến duy nhất trong dòng này
không dẫn đến hiện tượng lệch khung xảy ra trong 4A-1 (có thể là gen giả) và dẫn đến mất một
axit amin được bảo tồn cao duy nhất cũng có thể ảnh hưởng đến chức năng. Dòng đột biến này
được gọi là MM (dành cho nhiều thể đột biến).
Hai sự kiện chuyển gen độc lập khác dường như có một vị trí chuyển gen duy nhất, vì
chúng có sự phân li gần đúng 3: 1 của con cái chuyển gen. Một số con cái trong số này thừa
hưởng một số đột biến Sal1 (dựa trên xét nghiệm CAPS sàng lọc), nhưng nhạy cảm với thuốc
diệt cỏ và thiếu các gen chuyển có thể phát hiện được. Vì Cas9 không còn hiện diện để tạo ra
các đột biến nữa, chúng tôi sử dụng các dòng này để điều tra tác động của các đột biến cụ
thể trong phần này của họ gen Sal1 . Các dòng đột biến sal1 không chuyển gen này được đặt
tên là PM1 (Đột biến một phần 1) và PM2. PM1 có hai đột biến khác nhau trên alen 7A và các
mục tiêu của gen 4A-1 không thể được khuếch đại. Sự kiện PM2 bị thiếu cả hai vị trí đích
4A-1 và 4A-2 và gen 7D có sự chèn 1 bp trong vị trí đích 5D 3 ′. Do đó, các gen 7A và 5B là
các gen đồng căn duy nhất không bị thay đổi trong PM2, trong khi PM1 có các gen 5B, 5D, 4A-2
và 7D Sal1 nguyên vẹn (Bảng 2 và S4).
Để mô tả thêm đặc điểm của các dòng đột biến, chúng tôi thiết kế mồi qPCR và phân tích
sự biểu hiện của Sal1. Do mức độ bảo tồn trình tự cao trong gen này, chúng tôi không thể
thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu cho bản chất; tuy nhiên, một cặp mồi đặc trưng cho gen nhiễm
sắc thể 5 và một cặp mồi đặc trưng cho nhiễm sắc thể một số gen 7 và 4 đã được phát triển.
Kết quả từ phân tích này cho thấy rằng không đáng kể
mức độ của bảng điểm Sal1 được phát hiện trong các dòng đột biến 6KO của chúng tôi so với
các dòng đối chứng (Hình S6). Kết quả này phù hợp với kết luận rằng các đột biến 6KO1 và
6KO2 là các dòng đột biến hoàn toàn không có khả năng biểu hiện một gen Sal1 chức năng .
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 7 trên 17

Bảng 2. Kiểu gen và kiểu hình của các dòng lúa mì dùng trong thí nghiệm.

Tên của Sal1 Chuyển gen

Mô tả dòng Kiểu gen Phương pháp Kiểu hình
Hàng 5B 5D 4A-1 4A-2 7A 7D Hiện nay

CHỮ HOA và se
Kiểu đại diện WT Bobwhite WT WT WT WT WT WT WT không

quence
Điều khiển tái sinh RC WT WT WT WT WT WT Điều khiển chuyển gen 1 WT WT WT WT WT WT CHỮ HOA WT không

TC1 CHỮ HOA WT Vâng

Kiểm soát chuyển gen TC2 2 WT WT WT WT WT WT CHỮ HOA WT Vâng

không phải
* CHỮ HOA và se
PM1 đột biến một phần 1 WT WT WT đột biến WT thân cây đột biến không

khuếch đại quence

không phải không phải không phải CHỮ HOA và se
PM2 đột biến một phần đột biến 2 WT WT WT không

khuếch đại khuếch đại khuếch đại quence

CHỮ HOA và se
MM nhiều đột biến đột biến đột biến đột biến * đột biến đột biến đột biến thân cây đột biến Vâng
quence
CHỮ HOA và se
6KO1 loại 6 gen 1 đột biến đột biến đột biến đột biến đột biến đột biến đột biến thân cây đột biến Vâng
quence
CHỮ HOA và se
Đột biến gen 6KO2 6 đột biến đột biến đột biến đột biến đột biến đột biến đột biến đột biến thân cây đột biến Vâng
quence

*: sự xóa hoặc thay thế axit amin đơn lẻ mà không tạo ra codon chuyển đổi khung hoặc dừng.

2.4. Đặc điểm hình thái của cây đột biến Sal1

Cây lúa mì được trồng trong nhà kính đến thế hệ T3 cho hầu hết các dòng (T2
đối với dòng PM2) và sự tăng trưởng của chúng được đo lường và theo dõi trong quá trình
phát triển (Bảng 2). Để đảm bảo rằng các quan sát của chúng tôi về các dòng đột biến
không bị sai lệch bởi những thay đổi điển hình pheno gây ra bởi quá trình biến nạp và /
hoặc nuôi cấy mô, chúng tôi đã đưa vào một loạt các dòng kiểm soát bao gồm hai dòng kiểm
soát chuyển gen (TC1 và TC2) (đã được chuyển gen nhưng có không có đột biến Sal1 được
phát hiện ,) và dòng kiểm soát tái sinh (RC, một dòng không di truyền, không biến đổi
gen có nguồn gốc từ cây T0 chimeric được mô tả trong Bảng S4). Các dòng 6KO, MM và PM1
được quan sát thấy có thân nhỏ hơn các dòng điều khiển (Hình 3). Điều này được phục vụ
một cách đáng kể và nhất quán trong vùng lóng giữa nút đầu tiên và nút thứ hai của bộ xới chính.
Điều thú vị là kiểu hình này không có ở bất kỳ dòng đối chứng nào (RC, TC1, TC2, WT)
hoặc PM2. Nó cũng được quan sát một cách nhất quán ở tất cả các cây T3 6KO1, 6KO2, MM
và PM1, do đó (các) gen đột biến gây bệnh không phân ly ở những cây này. Cho rằng PM1
chỉ có các đột biến đích ở các gen 7A và 4A-1, và dòng PM2 không có kiểu hình phe (và có
một gen nội địa 7A đầy đủ chức năng, nhưng một gen 4A-1 đột biến), điều này cho thấy
rằng gen nội địa Sal1 7A có thể có một vai trò trong sự phát triển và hình thái thân của
lúa mì Bobwhite. Mặc dù kiểu hình phát triển này được quan sát một cách nhất quán (Hình
3B, C), chúng tôi không quan sát thấy sự khác biệt đáng kể về chiều cao cây, số lá, số
nhánh, chiều cao củ hoặc số nhánh sinh sản giữa đột biến sal1 và dòng đối chứng.
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 8 trên 17

Hình 3. Kiểu hình thân ở cây Bobwhite đột biến Sal1 . (A) Sơ đồ thân lúa mì với các bộ phận được
dán nhãn. (B) Chiều rộng (mm) của lóng 2 và 3 của thân chính của cây được tưới nước tốt (xem Bảng 2
để biết mô tả của từng dòng). Các chữ cái cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <0,01; n = 5). (C)
Hình ảnh mặt cắt ngang của lóng 1 và lóng 2.

2.5. Đặc điểm của khả năng chịu căng thẳng của cây đột biến Sal1

Một loạt các thí nghiệm cũng được thực hiện để điều tra xem liệu các đột biến sal1 có
phát triển khác nhau trong các điều kiện hạn hán khác nhau và được tưới hay không. Điều này
bao gồm căng thẳng khô hạn nhẹ hoặc thiếu sắt bằng cách sử dụng cây con nảy mầm trong "cuộn
xì gà" của giấy trộn mầm, căng thẳng muối từ nhẹ đến nặng trong quá trình nảy mầm bằng cách
sử dụng lên đến 200 mM NaCl trong môi trường MS, nảy mầm trên môi trường MS có tẩm polyethylene
glycol lên đến 15% , và ươm mầm trên môi trường có bổ sung các hormone thực vật axit abscisic
và axit gibberellic. Không quan sát thấy sự khác biệt đáng kể giữa cây giống đối chứng và bất
kỳ cây giống đột biến sal1 nào (dữ liệu không được hiển thị). Cả dòng đột biến và dòng đối
chứng cũng phát triển sim rất tốt trong điều kiện tưới nước tốt (Hình S7) và không khác biệt đáng kể
đối với hầu hết các tính trạng đo được (Hình 4). Tuy nhiên, chúng tôi đã nhận thấy rằng các
dòng đột biến có kiểu hình thân (6KO1, 6KO2, MM và PM1) xuất hiện không đều so với các dòng
đối chứng và hai dòng (6KO2 và MM) tạo ra sinh khối trên mặt đất ít hơn một chút (Hình 4A).
Các dòng đối chứng trong các thí nghiệm này đều tăng trưởng tốt một cách nhất quán và không
thể phân biệt được về mặt thống kê. Dòng MM cũng có số hạt và trọng lượng hạt tổng thể thấp
hơn đáng kể trong điều kiện tưới nước tốt (Hình 4B, C).
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 9 của 17

Hình 4. Sự phát triển của các dòng lúa mì được tưới nước tốt. (A) Khối lượng trung bình của sinh khối khô
trên mặt đất (g), (B) số hạt và (C) tổng khối lượng hạt (g) trên mỗi cây. Kết quả được tính trung bình từ
3 chu kỳ cũ màu
độc trắng
lập. *chỉ
chỉcây
ra có
sự kiểu
khác hình
biệt thân
có ý đột
nghĩa
biến;
thống
cáckêthanh
so với
màuđối
xámchứng
đậm cho
(p <0,05;
biết thực
n = vật
14).cóVạch
thân
kiểu dại.

Hạn hán trên đồng ruộng thường xảy ra nhất trong giai đoạn lúa mì ra hoa và hạt
phát triển, vì vậy chúng tôi đã kiểm tra hiệu suất của các đột biến sal1 trong điều
kiện hạn hán giai đoạn cuối bằng cách giữ lại nước bổ sung từ chậu 5,5 tuần sau khi
trồng. Tất cả các cây trồng thử nghiệm đều được tưới bằng tay đến hết dung tích đất
khi bắt đầu xử lý này để giảm thiểu sự khác biệt về hàm lượng nước giữa các chậu. Trong
điều kiện này, các dòng đột biến sal1 (đặc biệt là 6KO2 và MM) vẫn xanh tươi lâu hơn
các dòng đối chứng và đất trong chậu của chúng có vẻ khô chậm hơn (Hình S7D). Tất cả
các dòng đều giảm sinh khối, số hạt và trọng lượng hạt trong các điều kiện này so với
các cây được tưới nước tốt, ngoại trừ MM có số hạt thấp như nhau trong cả hai điều kiện
(Hình 5). Những kết quả này cho thấy rằng cây đột biến Bobwhite sal1 không cho thấy
năng suất được cải thiện so với cây kiểu dại trong điều kiện hạn chế nước này. Phép đo
Porometry được thực hiện trong ba tuần trong thí nghiệm này và mặc dù các cây được xử
lý khô hạn có độ dẫn khí khổng thấp hơn so với các cây được tưới nước tốt, không có sự
khác biệt đáng kể nào được quan sát thấy giữa các đối chứng và các dòng đột biến khác
nhau (dữ liệu không cho xem).
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 10 của 17

Hình 5. So sánh sự phát triển của cây được tưới nước tốt (rắn) và cây xử lý khô hạn nhẹ (kiểu đường
chéo) trên mỗi cây: (A) sinh khối khô trên mặt đất (g), (B) số hạt, (C) tổng trọng lượng hạt (g) .
Vạch màu trắng chỉ cây có kiểu hình thân đột biến; các thanh màu xám đậm cho biết thực vật có thân
kiểu dại. Các thanh lỗi chỉ ra độ lệch chuẩn (n = 4). Dữ liệu đại diện cho 3 thí nghiệm độc lập.

Để thẩm vấn sâu hơn về sinh lý của các dòng đột biến sal1 , sự phát triển của chúng đã
được giải thích khi được trồng trong cùng một chậu với một số lượng bằng nhau của các cây
Bobwhite kiểu dại, cả trong điều kiện đủ nước và khô hạn. Trong những điều kiện này, các cây
trong chậu đang cạnh tranh cho các nguồn tài nguyên giống nhau và phải chịu mức độ căng thẳng
của nước như nhau. Các dòng 6K01, 6KO2, MM và PM1 được trồng cùng với Bob trắng kiểu dại trong
chậu chung có sinh khối trên mặt đất ít hơn đáng kể so với khi trồng trong chậu riêng của
chúng, trong khi mức sinh khối của Bobwhite không thay đổi trong chậu chung hoặc chậu đơn
(Hình 6). Sự khác biệt về tăng trưởng này, không có gì đáng ngạc nhiên, cũng mở rộng đến số
lượng hạt và trọng lượng hạt của cây được tưới nước tốt (Hình S8 và S9) và sinh khối trên mặt
đất của cây được xử lý khô hạn (Hình S10). Các đột biến sal1 cũng có sinh khối ít hơn trong
các chậu chung được xử lý hạn hán so với các chậu một dòng được xử lý khô hạn (Hình S10).
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 11 của 17

Hình 6. Sự phát triển của kiểu dại được tưới nước tốt (WT) và các dòng đột biến trong chậu đơn (màu trắng)
và chậu chung (kiểu đường chéo). Sinh khối khô trung bình trên mặt đất (g) đối với kiểu dại và (A). 6KO1 (B).
6KO2 (C) MM và (D). Cây đột biến PM1. ** = p <0,01; n ≥ 3.

3. Thảo luận

Việc tạo ra loại gen khó hơn nhiều trong các bộ gen đa bội lớn, phức tạp như lúa mì bánh
mì so với các hệ thống mô hình thực vật. Chiến lược gRNA CRISPR-Cas9 đa mục tiêu mà chúng tôi sử
dụng đã thành công trong việc tạo ra nhiều loại đột biến Sal1 di truyền trong một số dòng lúa mì
độc lập. Sự phức tạp của các đột biến có khả năng được nhấn mạnh bằng cách sử dụng biolistics để
biến nạp, dẫn đến nhiều đoạn DNA chuyển gen có sẵn để kết hợp vào các đứt gãy bộ gen. Tuy nhiên,
chiến lược này cũng tạo ra các đột biến cho phép chúng tôi điều tra một số đột biến một phần và
toàn bộ mà không cần phải sàng lọc rộng rãi nhiều thế hệ thực vật. Cũng rất thú vị khi lưu ý
rằng không có đột biến nào được xác định ở một vị trí đích có chứa sự không phù hợp với trình tự
gRNA được sử dụng (vị trí 5 ′ của Sal1 7D), đây là một dấu hiệu đáng khích lệ rằng sự nhận dạng
trình tự CRISPR Cas9 trong nghiên cứu được trình bày là vẫn có tính đặc hiệu cao.

Kiểu hình thân hẹp được quan sát thấy ở một số đột biến đã phục hồi ngụ ý rằng Sal1 7A có
thể có một vai trò quan trọng trong sự phát triển của thân ở Bobwhite. Điều thú vị là, mặc dù
Sal1 7A không được biểu hiện mạnh mẽ trong mô phân sinh đỉnh chồi so với một số đồng nguyên khác
(Hình S1), và trình tự protein cốt lõi của nó gần như giống với các đồng phân khác trong lúa mì
(Hình S2), nó dường như là chịu trách nhiệm về sự khác biệt kiểu hình thân cây được quan sát
thấy. Nghiên cứu sâu hơn sẽ được yêu cầu để xác định chắc chắn liệu Sal1 7A có một vai trò duy
nhất trong sự phát triển của thân cây hay sự mất mát của nó chỉ đơn giản là thay đổi tổng lượng
hoạt động của Sal1 trong các mô đang phát triển. Mặc dù chúng tôi không nhận thấy bất kỳ sự khác
biệt nào về phát triển rễ ở các cây con đột biến sal1 , nhưng sự khác biệt về sinh khối trên mặt
đất cũng có thể mở rộng sang sinh khối rễ. Tuy nhiên, khả năng có những vai trò chức năng duy
nhất trong một họ gen được bảo tồn cao như vậy mang lại sự quan tâm tiềm năng khi hiểu sâu hơn
về chức năng của các chất đồng căn Sal1 trong bộ gen đa bội.
Các cây đột biến sal1 của chúng tôi nhỏ hơn một chút và biểu hiện sự lão hóa chậm trong
điều kiện khô hạn. Điều này phù hợp với một nghiên cứu trước đó về khả năng chống chịu stress do
hạn hán bằng cách sử dụng gen làm im lặng của virus gây ra ở lúa mì, trong đó mô tả rằng cây có
Sal1 si được rào nhỏ hơn so với đối chứng hoặc dòng im lặng với các cấu trúc khác [31]. Tuy nhiên,
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 12 trên 17

các cây nhỏ hơn sử dụng ít nước hơn trong thí nghiệm hạn hán so với các cây lớn hơn, điều này có thể
dẫn đến ấn tượng sai về “khả năng chống chịu stress do hạn hán” [46].

Vì lý do này, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu hạn hán của mình bằng cách sử dụng các điều

kiện cuối tương tự như điều kiện được tìm thấy trên đồng ruộng, trong đó số lượng và / hoặc trọng

lượng hạt được cải thiện là thước đo chính để chống chịu hạn hán thành công. Thật không may, chúng tôi

không thấy chứng minh năng suất của cây đột biến so với dòng đối chứng. Sự giảm tốc độ tăng trưởng khi
các cây được trồng chung trong chậu chung với Bobwhite hoang dại cho thấy rằng các cây đột biến không

thể cạnh tranh để chia sẻ tài nguyên của chúng, cho thấy rằng lúa mì Bobwhite hoàn toàn có hại cho sức
khỏe.

Tuy nhiên, do sự phức tạp của quá trình tiến hóa Sal1 trong họ lúa mì, chúng ta không thể loại

trừ rằng việc xóa bỏ gen cụ thể có thể dẫn đến kiểu hình chống chịu stress phi sinh học thuận lợi ở
các giống cây trồng hoặc nguồn gốc di truyền khác nhau. Sự khác nhau về số lượng alen Sal1 giữa các

giống lúa mì gợi ý rằng vai trò của bất kỳ thành viên nào trong gia đình phải được xác định trước.

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1. Nhận dạng, nhân bản và xác định trình tự của Bobwhite lúa mì Sal1

Phân tích tin sinh học về trình tự bộ gen lúa mì được công bố công khai ban đầu xác nhận lại

bảy loại tương đồng Sal1 trong bộ gen của Trung Quốc tham khảo T. aestivum bằng cách tìm kiếm BLAST

với trình tự protein Arabidopsis . Phân tích dữ liệu biểu hiện có sẵn công khai (dữ liệu RNAseq từ

Genevestigator) cho thấy rằng ít nhất sáu trong số bảy alen đã được biểu hiện; 7D không được chú thích

là một gen và không có bằng chứng về sự phiên mã của nó.

Dữ liệu biểu hiện (Hình S1) được truy cập từ Genevestigator (www.genevestiga tor.com) vào ngày 19

tháng 4 năm 2022. Một đoạn 216 cặp cơ sở của T. aestivum Chinese Spring Sal1

Alen 5D bao gồm Exon 4, bao gồm cả vị trí đích 5 ′ gRNA, được sử dụng để thẩm vấn trình tự GrainGenes

lúa mì chất lượng cao

được đánh dấubộtrong
gen chuỗi Bobwhite Sal1
(https://wheat.pw.usda.gov/blast; truy 5D có sẵn
cậpđược
ngày
hiển
11 tháng tại
thị trong
4 nămHình
2022).
S2. Vùng này

DNA bộ gen được chiết xuất từ lá lúa mì Bobwhite bằng cách sử dụng giao thức bộ gen Pure đã

được sửa đổi (Qiagen, Redwood City, CA USA). Trình tự bộ gen của Mùa xuân Trung Quốc được sử dụng

trong Primer3 (https://primer3.ut.ee/; truy cập ngày 5 tháng 10 năm 2021; Bảng S1) để thiết kế các

đoạn mồi đặc trưng cho alen cho Sal1 bao gồm ba vị trí đích CRISPR / Cas9 [47]. Các hạt sản phẩm PCR

được khuếch đại với DNA polymerase hiệu đính Q5 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) và amplicon có
kích thước mong đợi đã được tinh lọc bằng gel Zy moclean Gel DNA Recovery kit (Zymo Research Inc.,

Irvine, CA, Hoa Kỳ), được liên kết qua đêm với T4 ligase thành vectơ plasmid pUC-Blunt được tiêu hóa

bởi StuI (New England Biolabs, Hoa Kỳ), biến đổi thành các tế bào E. coli NEB10β có thẩm quyền về mặt

hóa học (New England Biolabs, Hoa Kỳ) và được mạ lên môi trường LB rắn với 100 mg / L carbenicillin.
DNA plasmid được phân lập với bộ kit ZR Plasmid Miniprep (Zymo Research Inc., USA) và được giải trình
tự với M13 thuận và ngược M13, và bổ sung các đoạn mồi nội đặc hiệu cho gen khi cần thiết. Một hoặc

nhiều cặp mồi đặc trưng cho alen được sử dụng để điều tra đột biến Sal1

các alen và một homeolog Bobwhite 5A tiềm năng (không được phát hiện). Các lần đọc trình tự Sanger

được căn chỉnh với chuỗi Mùa xuân của Trung Quốc và được chú thích bằng cách sử dụng Snapgene
(www.snapgene.com; truy cập ngày 5 tháng 10 năm 2022).

Đối với sự sắp xếp trình tự protein Sal1 (Hình S3), các protein T. aestivum Bobwhite, B. distach

yon (Bradi4g40860) và A. thaliana (AT5G63980) đã được cắt tỉa thủ công để di chuyển lại các vùng

không được giải trình tự trong các nhà đồng vị Bobwhite Sal1 . Việc căn chỉnh protein được thực hiện

bằng Clustal Omega (CLUSTAL O (1.2.4)) tại https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (truy cập ngày 11
tháng 4 năm 2022) với pa rameters mặc định. Lưu ý rằng trình tự Sal1 5B có khoảng trống bắt đầu từ mức

dư 60, vì chúng tôi không thể khuếch đại và trình tự phần đó của trình tự Bobwhite 5B, có thể do sự

hiện diện của một intron lớn gần đó chứa trình tự mà chúng tôi không thể khuếch đại

băng qua.
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 13 của 17

4.2. Cấu trúc chuyển đổi CRISPR Sal1

Cấu trúc biến nạp CRISPR Sal1 được xây dựng bằng cách sử dụng các kỹ thuật nhân bản enzym
tái giới hạn tiêu chuẩn. Bản đồ và trình tự của plasmid được thể hiện trong Hình S4. Cấu trúc
này mang ba RNA dẫn đường nhắm mục tiêu Sal1 (gRNA 5 ′, gRNA giữa và gRNA 3 ′) được bao bọc bởi
các bộ đệm RNA chuyển (tRNA), được biểu hiện bằng cách sử dụng promoter Ubiquitin 1 của cỏ
switchgrass và trình kết thúc phiên mã nopaline synthase. Gen Cas9 được biểu hiện một cách cấu
thành trong lúa mì bằng cách sử dụng promoter Ubiquitin 1 của ngô và không có trình kết thúc
phiên mã.

4.3. Chuyển đổi sinh học lúa mì Bobwhite

Các thí nghiệm chuyển đổi được thực hiện với hỗn hợp cấu trúc plasmid biến nạp CRISPR và
plasmid pAHC20 mang Ubiquitin 1 ở ngô
promoter và nos terminator kiểm soát sự biểu hiện của gen chọn thanh tạo ra khả năng kháng thuốc
diệt cỏ bialaphos [48]. Chuyển đổi lúa mì mùa xuân Bobwhite được thực hiện bằng cách sử dụng
phương pháp biến đổi lưỡng cực tiêu chuẩn như đã mô tả trước đây [49–51]. Tóm lại, các hạt vàng
1µm được phủ một hỗn hợp 1: 1 của plasmid CRISPR và pAHC20. Các hạt tráng bị bắn phá thành các
phôi lúa mì chưa trưởng thành đã được mổ xẻ bằng cách sử dụng PDS-1000 Helium Gun (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA) với các đĩa vỡ 1100 pound / inch vuông và khoảng cách 13 cm từ đĩa dừng đến
mục tiêu [49 ]. Sau một thời gian phục hồi, các mẫu được nuôi cấy trên môi trường MMS có chứa 2
mg / L 2,4-D và 1 mg / L bialaphos. Sau 2-4 tuần chọn lọc, những con bê còn sống được chuyển
sang môi trường tái sinh có chứa 3 mg / L bialaphos để tạo cây [49–51].

Chín thí nghiệm biến đổi lúa mì độc lập đã được thực hiện tại các lọ khác nhau. Các cây chuyển
gen ứng viên đã được xác minh lại về khả năng kháng bialaphos bằng các xét nghiệm sơn lá [52]
và sàng lọc PCR bộ gen cho 4 vùng trong cấu trúc chuyển gen CRISPR (Bảng S3). Thử nghiệm sơn
lá sử dụng thuốc diệt cỏ Finale® (BASF Cor poration, USA) pha loãng trong nước 1: 128 (nồng độ
cuối cùng của hoạt chất glufosinate amoni là 0,177%). Một chiếc cọ vẽ đã được sử dụng để bôi một
lớp mỏng thuốc diệt cỏ đã pha loãng lên một khu vực dài 2 cm của một lá lúa mì non đã nở hoàn
toàn. Một cây Bobwhite dại cùng tuổi được vẽ cùng lúc với đối chứng. Các cạnh của các phần sơn
được đánh dấu bằng bút đánh dấu vĩnh viễn, và các lá được theo dõi trong 3-5 ngày. Các phần được
sơn của lá kháng thuốc diệt cỏ chuyển gen vẫn xanh, trong khi các lá nhạy cảm với loại wildtype
bị vàng và / hoặc bị hoại tử. Ba mươi hai sự kiện chuyển gen lúa mì mùa xuân Bobwhite độc lập
mang cấu trúc biến đổi CRISPR / Cas được tạo ra từ các thí nghiệm này trong số 2.945 em bryos
chưa trưởng thành bị bắn phá.

4.4. Xác định các sự kiện mang đột biến Sal1

Các cây lúa mì T0 chuyển gen đã được sàng lọc bằng cách sử dụng xét nghiệm Trình tự đa
nhân tạo đã được khuếch đại (CAPS) của vị trí mục tiêu 3 ′ (các đoạn mồi trong Hình 2C). Sản
phẩm PCR được khuếch đại với Taq polymerase (New England Biolabs, USA) và được phân hủy bằng
XcmI ở 37 ° C trong 1 giờ, được tách trên gel agarose 2% và được hiển thị bằng phương pháp nhuộm
ethidium bromide. Việc xác định trình tự các dòng đột biến được thực hiện ở thế hệ T2 và T3 và
những dòng đột biến đó được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình khuếch đại và nhân
bản PCR đã được hình thành để xác định kiểu gen ở những cây này.

4.5. Định lượng phiên mã ngược-PCR

Lúa mì được trồng trong nhà kính với ánh sáng bổ sung trong 16 giờ ngày (mẹ tối đa 85–90 °
F) và 8 giờ đêm (tối thiểu 55 ° F). Cây được trồng trong Sunshine Mix # 1 (Sungro Horticulture)
trong các chậu có kích thước bằng nhau (9,5 x 9,5 inch) và tưới hai lần mỗi ngày bằng nước phân
bón (pha loãng 20-20-20 của Peter theo hướng dẫn) với 2 dây nhỏ giọt trên mỗi chậu. Trong ba
tuần đầu tiên của sự phát triển, cây được phun bằng baking soda
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 14 của 17

dung dịch hai lần mỗi tuần để kiểm soát bệnh phấn trắng (1 muỗng canh baking soda và 1/2 muỗng cà
phê xà phòng lỏng, không chất tẩy rửa / 1 gallon nước).
Đối với các thí nghiệm RNA, 6 hạt của mỗi dòng được trồng vào mỗi chậu, sau đó được tỉa mỏng
thành 5 hạt trên mỗi chậu 7 ngày sau khi trồng. Lá non nhất trên mỗi cây được thu hoạch 21 ngày sau
khi trồng (khoảng Zadoks giai đoạn 21-22) và được đông lạnh trong nitơ lỏng và
được bảo quản ở -80 ° C cho đến khi chế biến. RNA được chiết xuất bằng kit miniprep Zymo Quick-RNA
Plant (Zymo Research Inc., USA) và kit không chứa DNA TURBO được sử dụng để di chuyển lại DNA (Life
Technologies, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Nồng độ RNA mẫu được đo bằng máy quang phổ DeNovix
(Mỹ); 3 ng / µL RNA được sử dụng cho mỗi phản ứng qPCR. Tiếp theo, phản ứng qRT-PCR 10 µL được
thực hiện với Bộ công cụ một bước màu xanh lá cây iTaq Universal SYBR (Bio-Rad, Hoa Kỳ) trong Hệ
thống PCR thời gian thực Quantstudio 3 Ứng dụng với 96 giếng 0,1 mL (Phần số A28566, Thermo Fisher ,
Hoa Kỳ) bằng cách sử dụng các điều kiện tiêu chuẩn được khuyến nghị trong hướng dẫn sử dụng iTaq.
Các phản ứng đối chứng không có men sao chép ngược được thực hiện cho mỗi mẫu bằng cách sử dụng pri
mers CJ705892 để xác nhận rằng không có sự nhiễm bẩn DNA [53]. Biểu hiện gen Sal1 được chuẩn hóa
so với biểu hiện của gen quản lý CJ705892 [53] bằng cách sử dụng phương pháp delta Ct, và sau đó
được chuẩn hóa so với kiểu hoang dã Bobwhite. Tất cả các mồi được thể hiện trong Hình S6C. Các loại
mồi đặc trưng cho Sal1 được thiết kế trong Primer3 [47]. Các mẫu được phân tích từ ba lần lặp lại
sinh học độc lập cho mỗi thí nghiệm từ hai thí nghiệm không xác định.

4.6. Sự tăng trưởng và đặc điểm của cây chuyển gen và cây đột biến Nhiệt được trồng trong nhà
kính như mô tả trong Phần 4.5. Đối với thí nghiệm sinh trưởng, 6 hạt của mỗi dòng được gieo vào mỗi
chậu, sau đó 12-14 ngày sau khi nảy mầm, cây được tỉa thưa thành 4 hoặc 5 cây trên một chậu. Đối
với các thí nghiệm dùng chung chậu, một thẻ nhựa được sử dụng để chia chậu thành hai nửa; ba hạt
từ dòng đột biến sal1 được trồng ở một bên, và ba hạt Bobwhite được trồng ở bên kia, sau đó tỉa
thưa thành hai cây mỗi bên trong 12–14 ngày. Tất cả các chậu trong một thí nghiệm được sắp xếp ngẫu
nhiên (xen kẽ với nhau) theo chiều dài 5ft. × 5ft. khu vực trên một băng ghế nhà kính duy nhất và
được sắp xếp lại hàng tuần để giảm thiểu ảnh hưởng của vị trí băng ghế. Sự phát triển của cây (số
xới, số lá, chiều cao xới sơ cấp và giai đoạn phát dục) được ghi lại hàng tuần. Độ dẫn của khí
khổng được đo bằng Máy đo độ ẩm lá SC-1 (Meter Group Inc.) nhiều lần trong hai đợt hạn hán độc lập.

Thí nghiệm hạn hán giai đoạn cuối được bắt đầu sau 5,5 tuần sau khi trồng. Khi bắt đầu thí
nghiệm hạn hán, tất cả các chậu đều được tưới bằng tay đến bão hòa (độ ẩm tối đa của đất), sau đó
việc tưới sẽ tạm dừng và chúng không được tưới lại trong suốt thời gian thí nghiệm. Mỗi thí nghiệm
được trồng hai chậu trên mỗi dòng, và những chậu được đặt trong quá trình xử lý hạn hán được xác
định bằng cách lật đồng xu. Các cây đối chứng được tưới nước bình thường bằng hệ thống tưới nhỏ
giọt cho đến khi thân chính của chúng bắt đầu se lại, tại thời điểm đó các đường nhỏ giọt được loại
bỏ và cây được để tự nhiên. Các thân sơ cấp được cắt bỏ nguyên vẹn khi thu hoạch; Chiều cao của
chúng được đo bằng thước và các đường kính thủy triều được đo bằng thước cặp kỹ thuật số. Tổng
sinh khối thực vật trên mặt đất sau đó được thu hoạch vào túi giấy. Các cây được xử lý khô hạn được
thu hoạch theo cách tương tự sau khi chúng đã hoàn toàn thu hoạch và khô. Sinh khối được làm khô
trong tủ sấy 4–5 ngày ở 30 C, sau đó được cân. Sau đó, hạt được đập và đếm bằng tay và cân.

Ý nghĩa thống kê được xác định bởi ANOVA. Ba thí nghiệm độc lập được thực hiện cho thí nghiệm dùng
chung chậu và thí nghiệm hạn hán.

Tài liệu bổ sung: Thông tin hỗ trợ sau có thể được tải xuống tại: https://www.mdpi.com/article/
10.3390/plants11172259/s1, Hình S1: Mức độ biểu hiện của Sal1 al leles trong các mô lúa mì khác
nhau dựa trên dữ liệu phiên mã công khai; Hình S2: Trình tự của các vùng được nhắm mục tiêu
trong các gen Bobwhite Sal1 . Hình S3: Sự sắp xếp của một phần trình tự protein Sal1 từ T.
aestivum Bobwhite, B. distachyon (Bradi4g40860) và A. thaliana (AT5G63980); Hình ure S4: Sơ
đồ và trình tự của cấu trúc vector plasmid Sal1 CRISPR / Cas9; Hình S5: Sự sắp xếp lại, chèn
và xóa chính được thấy ở thể đột biến 6KO1 và 6KO2 sal1 ; Hình S6: Mức độ tập lệnh tran Sal1
trong các đột biến 6KO1 và 6KO2. Hình S7: Sự phát triển của cây được tưới nước tốt và được xử lý khô hạn
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 15 của 17

Dòng đột biến Sal1 ở bầu đơn; Hình S8: Sự tăng trưởng và số lượng hạt trung bình của Sal1 được tưới nước tốt

dòng đột biến trong bầu đơn và chung; Hình S9: Khối lượng hạt trung bình của các dòng đột biến Sal1 được tưới nước tốt

trong các chậu đơn và bầu chung; Hình S10: Sinh khối trên mặt đất trên mỗi cây của kiểu dại được xử lý khô hạn và các dòng

đột biến trong các chậu đơn và chung; Bảng S1: Các đoạn mồi được sử dụng để xác định kiểu gen và xác định trình tự các

alen Sal1 . Bảng S2: Trình tự của mục tiêu gRNA Sal1 CRISPR / Cas9; Bảng S3: Các đoạn mồi được sử dụng để xác nhận gen

chuyển trong các dòng lúa mì chuyển gen; Bảng S4: Mô tả chi tiết các dòng cây trồng phụ thuộc được sử dụng trong các thí

nghiệm; Bảng S5: Chú thích chi tiết về các đột biến ở các dòng đột biến Bobwhite.

Đóng góp của tác giả: Khái niệm hóa, NAA, YQG và RT; quản lý dữ liệu, TM, JH, YQG

và RT; phân tích chính thức, TM và JH; mua lại tài trợ, NAA và RT; phương pháp luận, TM, JH và NIE; quản trị dự án, RT;

tài nguyên, RT; giám sát, RT; hình dung, TM; viết — bản nháp gốc, TM và RT; viết — đánh giá & chỉnh sửa, TM, JH, YQG, NIE,

NAA

và RT Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản xuất bản của bản thảo.

Tài trợ: Các kết quả được trình bày dựa trên dữ liệu chủ đề được USAID và NAS tài trợ toàn bộ hoặc một phần thông qua

Subaward [2000009531]. Mọi ý kiến, phát hiện, kết luận hoặc khuyến nghị được trình bày là của riêng các tác giả và không

nhất thiết phản ánh quan điểm của USAID hoặc NAS. Bài báo này dựa trên hoạt động được hỗ trợ bởi nguồn tài trợ Khoa học,

Công nghệ & Đổi mới do Au thority (STDF) tài trợ (US C18 ID 892). Nghiên cứu này cũng được hỗ trợ bởi Dự án Dịch vụ Nghiên

cứu vùng tural của USDA Agricul số 2030-21000-020-00D.

Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu: Dữ liệu nghiên cứu được bao gồm trong các số liệu và thông tin bổ sung liên quan đến

bản thảo. Các vectơ biến nạp, vật liệu thực vật và kiểu gen Sal1 đột biến được sắp xếp theo trình tự có sẵn từ các tác giả

theo yêu cầu.

Lời cảm ơn: Mọi ý kiến, phát hiện, kết luận hoặc khuyến nghị được trình bày trong bản thảo này là của riêng tác giả và

không nhất thiết phản ánh quan điểm của USAID hoặc NAS. Đề cập đến tên thương mại hoặc sản phẩm thương mại chỉ nhằm mục

đích cung cấp thông tin cụ thể và không ngụ ý khuyến nghị hoặc xác nhận của Bộ văn hóa nông nghiệp Hoa Kỳ. USDA là một nhà

cung cấp cơ hội bình đẳng và nhà tuyển dụng.

Xung đột lợi ích: Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích. Các nhà tài trợ không có vai trò gì trong việc thiết kế

nghiên cứu; trong việc thu thập, phân tích hoặc giải thích dữ liệu; trong việc viết kịch bản manu; hoặc trong quyết định

công bố kết quả.

Người giới thiệu

1. Shewry, PR Wheat. J. Exp. Người máy. 2009, 60, 1537–1553. https://doi.org/10.1093/jxb/erp058.

2. Ani Akpinar, B.; Avsar, B.; Lucas, SJ; Budak, H. Tín hiệu Căng thẳng Phi sinh học Thực vật. Tín hiệu thực vật. Behav. 2012, 7, 1450–1455.

https://doi.org/10.4161/psb.21894.

3. Reynolds, MP; Lewis, JM; Ammar, K .; Mạng cơ sở, BR; Crespo-Herrera, L .; Crossa, J.; Dhugga, KS; Dreisigacker, S.; Juliana, P.; Karwat, H.; et al. Khai thác

nghiên cứu tịnh tiến trong lúa mì để chống chịu với khí hậu. J. Exp. Người máy. 2021, 72, 5134–5157. https://doi.org/10.1093/jxb/erab256.

4. Budak, H.; Hussain, B.; Khan, Z .; Ozturk, NZ; Ullah, N. Từ di truyền đến gen chức năng: Cải thiện hạn hán

Tín hiệu và khả năng chịu đựng trong lúa mì. Đổi diện. Khoa học thực vật. 2015, 6, 1012. https://doi.org/10.3389/fpls.2015.01012.

5. Pandey, DM; Hu, Y .; Shavrukov, Y. Gupta, NK Biên tập: Đe doạ hạn hán: Phản ứng và Cơ chế di truyền phân tử của sự thích nghi và khả năng chịu đựng ở lúa mì.

Đổi diện. Khoa học thực vật. 2022, 13, 3389–3391. https://doi.org/10.3390/ijms212.

6. Bapela, T.; Shimelis, H.; Tsilo, TJ; Mathew, I. Cải thiện di truyền của lúa mì để chịu hạn: Tiến bộ, thách thức và

Những cơ hội. Thực vật 2022, 11, 1331. https://doi.org/10.3390/plants11101331.

7. Doudna, JA; Charpentier, E. Biên giới mới của kỹ thuật bộ gen với CRISPR-Cas9. Khoa học 2014, 346, 1258096.

https://doi.org/10.1126/science.1258096.
số 8.
Belhaj, K .; Chaparro-Garcia, A. .; Kamoun, S.; Người bảo trợ, NJ; Nekrasov, V. Chỉnh sửa bộ gen thực vật bằng CRISPR / Cas9. Curr. Opin.

Công nghệ sinh học. 2015, 32, 76–84. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2014.11.007.

9. Hsu, PD; Tàu đổ bộ, ES; Zhang, F. Sự phát triển và các ứng dụng của CRISPR-Cas9 cho Kỹ thuật bộ gen. Ô 2014, 157,

1262–1278. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.05.010.

10. Sander, JD; Joung, JK CRISPR-Cas Hệ thống để Chỉnh sửa, Điều chỉnh và Nhắm mục tiêu Genome. Nat. Công nghệ sinh học. 2014, 32, 347–350.

https://doi.org/10.1038/nbt.2842.

11. Đinh, Y.; Li, H.; Chen, LL; Xie, K. Những tiến bộ gần đây trong việc chỉnh sửa bộ gen bằng CRISPR / Cas9. Đổi diện. Khoa học thực vật. 2016, 7, 703. https://

doi.org/10.3389/fpls.2016.00703.

12. Matres, JM; Hilscher, J.; Datta, A.; Armario-Nájera, V .; Baysal, C.; Anh ấy, W .; Hoàng, X. .; Zhu, C.; Valizadeh-Kamran, R .; Trijatmiko, KR; et al. Chỉnh sửa

bộ gen trong cây trồng ngũ cốc: Tổng quan. Chuyển gen Res. Năm 2021; Tập 30; ISBN 0123456789.
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 16 trên 17

13. Awan, MJA; Pervaiz, K .; Rasheed, A.; Amin, tôi; Saeed, NA; Dhugga, KS; Mansoor, S. Lúa mì chỉnh sửa bộ gen- Những tiến bộ hiện tại cho cuộc Cách mạng

Xanh lần thứ hai. Công nghệ sinh học. Tiến lên 2022, 60, 108006. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2022.108006.

14. Rao, Y.; Yang, X.; Pan, C.; Vương, C.; Wang, K. Sự tiến bộ của Hệ thống lặp lại Palindromic-Cas9 ngắn được phân cụm thường xuyên xen kẽ và ứng dụng của

nó trong cải tiến cây trồng. Đổi diện. Khoa học thực vật. 2022, 13, 839001. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.839001.

15. Li, J.-F.; Norville, JE; Aach, J.; McCormack, M. .; Zhang, D.; Bush, J .; Nhà thờ, GM; Sheen, J. Tái tổ hợp đa dạng và tương đồng – Chỉnh sửa bộ gen qua

trung gian ở Arabidopsis và Nicotiana Benthamiana bằng cách sử dụng RNA dẫn đường và Cas9. Nat.

Công nghệ sinh học. 2013, 31, 688–691. https://doi.org/10.1038/nbt.2650.

16. Nekrasov, V.; Staskawicz, B.; Weigel, D.; Jones, JDG; Kamoun, S. Gây đột biến được nhắm mục tiêu trong thực vật kiểu mẫu Nicotiana Benthamiana bằng cách

sử dụng Endonuclease hướng dẫn RNA của Cas9. Nat. Công nghệ sinh học. 2013, 31, 691–693. https://doi.org/10.1038/nbt.2654.

17. Giang, W .; Chu, H.; Bi, H.; Từm, M.; Yang, B.; Tuần, Trình diễn DP về biến đổi gen mục tiêu qua trung gian CRISPR / Cas9 / SgRNA ở cây Arabidopsis, thuốc

lá, lúa miến và lúa. Axit nucleic Res. 2013, 41, e188 – e188. https://doi.org/10.1093/nar/gkt780.

18. Shan, Q.; Vương, Y. Li, J .; Zhang, Y. Chen, K .; Liang, Z .; Zhang, K.; Liu, J .; Xi, JJ; Gui, J.-L.; et al. Chỉnh sửa bộ gen mục tiêu của cây trồng

bằng hệ thống CRISPR-Cas. Nat. Công nghệ sinh học. 2013, 31, 686–688. https://doi.org/10.1038/nbt.2652.

19. Miao, J.; Guo, D.; Zhang, J .; Hoàng, Q.; Tần, G.; Zhang, X. .; Wan, J .; Gu, H.; Qu, LJ Nhắm mục tiêu gây đột biến trên lúa sử dụng CRISPR

Hệ thống Cas. Độ phân giải tế bào. 2013, 23, 1233–1236. https://doi.org/10.1038/cr.2013.123.

20. Upadhyay, SK; Kumar, J .; Alok, A. .; Tuli, R. Chỉnh sửa bộ gen do RNA hướng dẫn cho đột biến gen mục tiêu ở lúa mì. Gen G3,

Bộ gen, Genet. 2013, 3, 2233–2238. https://doi.org/10.1534/g3.113.008847.

21. Vương, Y.; Cheng, X.; Shan, Q.; Zhang, Y. Liu, J .; Gao, C.; Qiu, JL Việc chỉnh sửa đồng thời ba giống đồng loại trong lục bội Bread Lúa mì tạo ra khả

năng đề kháng thực sự đối với bệnh phấn trắng. Nat. Công nghệ sinh học. 2014, 32, 947–951. https://doi.org/10.1038/nbt.2969.

22. Zhang, Y.; Liang, Z .; Zong, Y. Vương, Y. Liu, J .; Chen, K .; Qiu, JL; Gao, C. Chỉnh sửa bộ gen hiệu quả và không chuyển gen ở lúa mì thông qua sự biểu

hiện thoáng qua của DNA hoặc RNA CRISPR / Cas9. Nat. Commun. 2016, 7, 12617. https://doi.org/10.1038/ncomms12617.

23. Li, J.; Zhang, S.; Zhang, R.; Gao, J .; Qi, Y. Bài hát, G.; Li, W .; Li, Y. Li, G. Chỉnh sửa bộ gen đa kênh hiệu quả bằng CRISPR / Cas9 trong

Lúa mì thông thường. Biotechnol thực vật. J. 2021, 19, 427–429. https://doi.org/10.1111/pbi.13508.

24. Kottakota, C.; Pradhan, B.; Roychowdhury, R.; Dubey, VK Cải thiện lúa mì (Triticum spp.) Thông qua thao tác di truyền. Về cây trồng biến đổi gen: Hiện

trạng, triển vọng và thách thức; Kavi Kishor, PB, Rajam, MV, Pullaiah, T., Eds .; Springer Nature: Singapore, 2021; trang 100-1 33–66, ISBN 9789811558979.

25. Quintero, FJ; Garcideblas, B.; Rodriguez-Navarro, A. Gene SAL1 của Arabidopsis, Mã hóa Enzyme với 3 ′ (2 ′), 5′-

Bisphosphate Nucleotidase và Inositol Polyphosphate 1-Phosphatase Hoạt động, tăng khả năng chịu muối ở nấm men. Tế bào thực vật

1996, 8, 529–537. https://doi.org/10.1105/tpc.8.3.529.

26. Xiong, L.; Lee, H.; Huang, R.; Zhu, JK Một sự thay thế axit amin đơn trong protein Arabidopsis FIERY1 / HOS2 tạo nên tính đặc hiệu của tín hiệu lạnh và

khả năng dung nạp Lithium. Nhà máy J. 2004, 40, 536–545. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2004.02225.x.

27. Wilson, PB; Estavillo, GM; Trường, KJ; Pornsiriwong, W .; Carroll, AJ; Howell, KA; Woo, NS; Hồ, JA; Smith, SM; Harvey Millar, A. .; et al. Nucleotidase /

Phosphatase SAL1 là một chất điều chỉnh tiêu cực khả năng chịu hạn ở cây Arabidopsis. Thực vật J. 2009, 58, 299–317. https://doi.org/10.1111/

j.1365-313X.2008.03780.x.

28. Estavillo, GM; Sắc nét, PA; Pornsiriwong, W .; Wirtz, M.; Collinge, D.; Carrie, C.; Giraud, E.; Whelan, J .; David, P.; Javot, H.; et al. Bằng chứng cho

một con đường ngược dòng lục lạp SAL1-PAP có chức năng phát tín hiệu trong hạn hán và ánh sáng cao ở cây Arabidopsis. Tế bào thực vật 2011, 23, 3992–

4012. https://doi.org/10.1105/tpc.111.091033.

29. Chân, KX; Mabbitt, PD; Phua, SY; Mueller, JW; Nisar, N.; Gigolashvili, T.; Stroeher, E.; Grassl, J .; Arlt, W .; Estavillo, GM; et al. Cảm nhận và phát

tín hiệu về stress oxy hóa trong lục lạp bằng cách bất hoạt SAL1 Phosphoadenosine Phosphatase.

Proc. Natl. Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 2016, 113, E4567 – E4576. https://doi.org/10.1073/pnas.1604936113.

30. Shirzadian-Khorramabad, R .; Moazzenzadeh, T.; Sajedi, RH; Jing, HC; Hille, J .; Dijkwel, PP Một đột biến ở cây Arabidopsis SAL1 Làm thay đổi Hoạt động

trong ống nghiệm của nó chống lại IP3 và trì hoãn Sự phát triển của lá khi có mức ROS thấp hơn. Mol thực vật. Biol. 2022, 108, 549–563. https://doi.org/

10.1007/s11103-022-01245-0.

31. Manmathan, H.; Shaner, D.; Quay lén, J .; Tisserat, N.; Lapitan, N. J. Exp. Người máy. 2013, 64, 1381–1392. https://doi.org/10.1093/jxb/ert003.

32. Zhao, C.; Vương, Y. Chân, KX; Marchant, DB; Franks, PJ; Randall, D.; Thanh thiếu niên, EE; Chen, G.; Ramesh, S.; Phua, SY; et al.

Sự phát triển của tín hiệu ngược dòng lục lạp tạo điều kiện cho cây xanh thích nghi với đất. Proc. Natl. Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 2019, 116, 5015–5020.

https://doi.org/10.1073/pnas.1812092116.

33. Vương, L.; Zhu, T.; Rodriguez, JC; Thỏa thuận, KR; Dubcovsky, J.; McGuire, Chuyên gia tư vấn; Lux, T.; Spannagl, M.; Mayer, KFX; Baldrich, P.; et al.

Aegilops Tauschii Genome Assembly Aet v5.0 Tính năng Tiếp cận trình tự rộng hơn và Chú thích được cải thiện. Bộ gen của gen G3. Genet. 2021, 11, 12.

https://doi.org/10.1093/g3journal/jkab325.

34. Chu, Y.; Bai, S.; Li, H.; Hát.; Zhang, D.; Ma, F.; Zhao, X.; Không, F .; Li, J .; Chen, L.; et al. Đưa bộ gen Aegilops Tauschii vào lúa mì làm cơ sở cải

tiến ngũ cốc. Nat. Các nhà máy 2021, 7, 774–786. https://doi.org/10.1038/s41477-021-00934-
Trong.
Machine Translated by Google

Cây 2022, 11, 2259 17 trên 17

35. Zhu, T.; Vương, L.; Rodriguez, JC; Thỏa thuận, KR; Avni, R .; Distelfeld, A.; McGuire, Chuyên gia tư vấn; Dvorak, J .; Luo, MC Cải thiện
trình tự bộ gen của Wild Emmer Wheat Zavitan với sự hỗ trợ của Bản đồ quang học. G3 Genes Genomes Genet. 2019, 9, 619–624. https://doi.org/
10.1534/g3.118.200902.
36. Scott, MF; Botigué, LR; Niềng răng.; Stevens, CJ; Mullin, VE; Stevenson, A. .; Thomas, MG; Đầy đủ hơn, DQ; Mott, R. Một bộ gen lúa mì
Emmer Ai Cập 3.000 năm tuổi tiết lộ lịch sử phát tán và thuần hóa. Nat. Thực vật 2019, 5, 1120–1128. https://doi.org/10.1038/
s41477-019-0534-5.
37. Maccaferri, M.; Harris, NS; Twardziok, SO; Pasam, RK; Gundlach, H.; Spannagl, M.; Ormanbekova, D.; Lux, T.; Prade, VM; Milner, SG; et al.
Bộ gen lúa mì Durum nêu bật các dấu hiệu thuần hóa trong quá khứ và các mục tiêu cải thiện trong tương lai. Nat.
Genet. 2019, 51, 885–895. https://doi.org/10.1038/s41588-019-0381-3.
38. Walkowiak, S.; Gao, L.; Monat, C.; Haberer, G .; Kassa, MT; Brinton, J .; Ramirez-Gonzalez, RH; Kolodziej, MC; Delorean, E.; Thambugala, D.;
et al. Nhiều bộ gen lúa mì tiết lộ sự biến đổi toàn cầu trong chăn nuôi hiện đại. Bản chất 2020, 588, 277–283. https://doi.org/10.1038/
s41586-020-2961-x.
39. Zhu, T.; Vương, L.; Rimbert, H.; Rodriguez, JC; Thỏa thuận, KR; De Oliveira, R .; Choulet, F.; Keeble-Gagnère, G.; Tibbits, J.; Rogers,
J. .; et al. Bản đồ quang học Tinh chỉnh Bánh mì Lúa mì Triticum Aestivum Cv. Đại hội bộ gen mùa xuân của Trung Quốc. Plant J. 2021, 107, 303–
314. https://doi.org/10.1111/tpj.15289.
40. Sato, K .; Abe, F .; Mascher, M.; Haberer, G .; Gundlach, H.; Spannagl, M.; Shirasawa, K .; Isobe, S. Tổ hợp bộ gen quy mô nhiễm sắc thể
của thợ săn lúa mì thông thường có khả năng biến đổi. DNA Res. Năm 2021, 28, 1–7. https://doi.org/10.1093/dnares/dsab008.

41. Prykhozhij, SV; Rajan, V .; Gaston, D.; Berman, JN CRISPR Multitargeter: Một công cụ web để tìm các mục tiêu RNA hướng dẫn đơn CRISPR chung
và duy nhất trong một tập hợp các chuỗi tương tự. PLoS ONE 2015, 10, e0119372. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119372.

42. Čermák, T.; Curtin, SJ; Gil-Humanes, J .; Čegan, R .; Kono, TJYY; Konečná, E.; Belanto, JJ; Starker, CG; Mathre, JW; Greenstein, RL; et al.
Bộ công cụ đa năng để kích hoạt kỹ thuật bộ gen nâng cao ở thực vật. Tế bào thực vật 2017, 29, 1196–
1217. https://doi.org/10.1105/tpc.16.00922.
43. Hahn, F.; Bảo tàng Sanjurjo, L.; Tia lửa, CA; Kanyuka, K .; Nekrasov, V. Hiệu quả Crispr / Gây đột biến có mục tiêu qua trung gian trong
Các giống lúa mì mùa xuân và mùa đông. Thực vật 2021, 10, 1481. https://doi.org/10.3390/plants10071481.
44. Andersson, M.; Turesson, H.; Nicolia, A. .; Fält, AS; Samuelsson, M. .; Hofvander, P. Gây đột biến đa gen được nhắm mục tiêu hiệu quả ở
khoai tây tứ bội (Solanum Tuberosum) bởi Biểu hiện CRISPR-Cas9 thoáng qua trong nguyên bào. Đại diện Tế bào Thực vật 2017, 36, 117–
128. https://doi.org/10.1007/s00299-016-2062-3.
45. Banakar, R .; Eggenberger, AL; Tỏi tây.; Được rồi, DA; Murugan, K .; Zarecor, S.; Lawrence-Dill, CJ; Thu ngân, DG; Wang, K.
Chèn DNA ngẫu nhiên tần số cao khi đồng phân phối CRISPR-Cas9 Ribonucleoprotein và Plasmid Marker có thể lựa chọn trong gạo. Khoa học.
Rep. 2019, 9, 19902. https://doi.org/10.1038/s41598-019-55681-y.
46. Lawlor, DW Kỹ thuật di truyền để cải thiện hiệu suất của cây trồng trong điều kiện hạn hán: Đánh giá sinh lý về thành tựu, hạn chế và khả
năng. J. Exp. Người máy. 2013, 64, 83–108. https://doi.org/10.1093/jxb/ers326.
47. Untergasser, A.; Cắt tóc, tôi; Corressar, T.; Anh ấy, J .; Faircloth, BC; Remm, M.; Rozen, SG Primer3-Khả năng mới và
Các giao diện. Axit nucleic Res. 2012, 40, e115. https://doi.org/10.1093/nar/gks596.
48. Christensen, AH; Cút, Vectơ dựa trên chất xúc tiến PH Ubiquitin để biểu hiện mức độ cao của các gen đánh dấu có thể lựa chọn và / hoặc có
thể sàng lọc ở cây một lá mầm. Chuyển gen Res. 1996, 5, 213–218. https://doi.org/10.1007/bf01969712.
49. Tuần, JT; Anderson, OD; Blechl, AE Sản xuất nhanh nhiều dòng lúa mì chuyển gen màu mỡ độc lập (Triticum aestivum). Thực vật Physiol. 1993,
102, 1077–1084. https://doi.org/10.1104/pp.102.4.1077.
50. Okubara, PA; Blechl, AE; McCormick, SP; Alexander, NJ; Dill-Macky, R .; Hohn, TM Engineering Sự trao đổi chất Deoxynivalenol trong lúa mì
thông qua sự biểu hiện của gen Acetyltransferase của nấm Trichothecene. Theor. Appl. Genet. 2002, 106, 74–83. https://doi.org/10.1007/
s00122-002-1066-2.
51. Thilmony, R.; Guttman, TÔI; Lin, JW; Blechl, AE Chất xúc tiến gen lúa mì HMW-Glutenin 1Dy10 kiểm soát sự biểu hiện nội nhũ ở Brachypodium
Distachyon. Cây trồng biến đổi gen. Thực phẩm Biotechnol. Nông nghiệp. Chuỗi thực phẩm 2014, 5, 36–43. https://doi.org/10.4161/gmcr.27371.

52. Rajasekaran, K .; Majumdar, R .; Sickler, C.; Wei, Q.; Cary, J .; Bhatnagar, D. Độ trung thực của Thử nghiệm vẽ lá tự do đơn giản để xác
thực các cây ngô chuyển gen biểu hiện gen đánh dấu có thể lựa chọn, Bar. J. Cải tiến cây trồngv. 2017, 31, 628–636. https://doi.org/
10.1080/15427528.2017.1327913.
53. Dudziak, K .; Sozoniuk, M.; Szczerba, H.; Kuzdraliński, A. .; Kowalczyk, K .; Börner, A.; Nowak, M.Xác định các gen tham chiếu ổn định cho
các nghiên cứu QPCR trên cây giống lúa mì thông thường (Triticum aestivum L.) dưới áp lực hạn hán ngắn hạn. Phương pháp thực vật 2020,
16, 58. https://doi.org/10.1186/s13007-020-00601-9.