기본적인 크로마토그래피 과정

1. 수직의 칼럼에 정지상을 채운다.

2. 칼럼에 분리해야 하는 시료 혼합물을 넣는다.
3. 칼럼에 이동상을 지속적으로 첨가해 시료 혼합물이 칼럼을 통해 운반(용출)되게 된다.
(구성 성분의 이동 속도가 다르면 성분들은 분리될 수 있고 이동상과 혼합하여 회수 가능)

크로마토그래피 분석
-정량분석에 사용
-온도, 이동상, 물리적 매개변수를 이용해 분리
-칼럼의 길이, 지름, 선택, 정지상의 조성, 분리를 위한 매개변수는 서로 상호작용
(분리능 시간(resolution time)과 용출시간(elution time)은 가장 중요한 매개변수)
--->분리능이 좋다면 짧은 칼럼을 이용해 분석 시간을 줄여야 함(최적화)

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이동상(물/아세토나이트릴)( )
--->물이 아세토나이트릴보다 극성이 높음

이동상의 극성이 크면 수소결합에 의해 물질을 더 잘 붙잡아 칼럼에 더 오래 머물음

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☆용매(solvent)
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☆크로마토그래피의 분류

-액체상 크로마토그래피(Liquid Chromatography(LC))

이동상이 액체인 크로마토그래피

-액체/고체 크로마토그래피(Liquid Solid Chromatography(LSC))

이동상은 액체, 고정상은 고체인 크로마토그래피

-액체/액체 크로마토그래피(Liquid Liquid Chromatography(LLC))

이동상은 액체, 고정상은 액체인 크로마토그래피

-----------------------------------------------------------------------------
Gas chromatography(GC)

*고정상으로 폴리실록세인
*질량 분석기를 검출기로 사용하는 기체 크로마토그래피

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-----------------------------------------------------------------------------

☆정지상

-이동상과 샘플의 종류에 따라 샘플을 잘 분리하기 위해서는 고정상과 칼럼을 잘 선택해야함

*폴리실록세인 –극성을 띠는 정지상

-실리콘 원자 1개당 2개의 탄화수소로 구성된 반복 구조

*스쿠알렌 –비극성을 띠는 정지상

- 의 구조를 갖음

*사이클로 덱스트린 –라세미 혼합물을 분리할 때 사용됨

-광학 이성질체 화합물(분리된 거울상 이성질체) 연구를 위해서 사용
-유기화합물이 비대칭 탄소로 구성되어 있을 때 R과 S 거울상 이성질체
에 해당하는 크기가 같은 2개의 봉우리가 나옴

*라세미 혼합물이란: -카이랄 센터를 중심으로 4개의 결합을 가짐

-4개의 치환기는 모두 달라야 함
-4개의 치환기 중 하나는 H가 있어야 하고 H는 하나여야 함
-도는 방향에 따라서 R form, S form으로 나눔
-사이클로 덱스트린이 포함된 정지상을 사용한다면 한 개의 peak이 두
개로 갈라짐

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*그림 2.10)

-2와 4는 라세미 혼합물이고 사이클로 덱스트린이 포함된 카이랄 칼럼을 이용하여 명확히 분
리할 수 있음
-시료 혼합물의 성분을 정렬할 때 분자량 외에 극성, 비극성을 고려해야할 때 정지상을 극성
으로 해주면 극성 정지상이 수소결합으로 극성 시료를 붙잡아 극성인 시료는 더 늦게 나오고
비극성 시료는 먼저 나옴
-2, 4는 극성 시료이기 때문에 늦게 나오고 칼럼에 오래 머물음
-

-----------------------------------------------------------------------------
그림 2.12)
-6과 7을 비교할 때 iso 구조가 끓는점이 더 약하기 때문에 먼저 나옴
-1과 3은 특수한 칼럼을 이용해 detect할 수 있음
-나머지는 분자량 순으로 나옴

-열 전도도 검출기(Thermal Conductivity Detector(TCD))

☆중요한 기체 크로마토그래피 검출기(그림 2.17)

-광 이온화 검출기(Photoionization Detector(PID))

이중결합이 포함되어 있는 화합물 검출
-전자 포획 검출기(Electron Capture Detector(ECD))
할로젠 원소가 포함되어 잇는 화합물 검출
-불꽃 이온화 검출기(Flame Ionization Detector(FID))
연소되어 이온화할 수 있는 화합물 검출
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-고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Chromatography(HPLC))

*그림 3.14)

*1~7까지 순서를 나열할 수 있어야 함

-정지상과 시료 모두 극성
-분자량이 작은 순으로 먼저 나옴
-정지상이 극성이기 때문에 분자량이 크면 나오기 힘듬
-정지상이 극성이면 분리를 원활히 하기 위해서 eluting solvent는 비극성을 사용함
(eluting solvent로 (hexane/ethanol)을 사용)(hexane은 비극성, ethanol은 극성)
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*정지상, 화합물, 이동상 관계
-정지상이 극성—이동상은 비극성—비극성 화합물이 먼저 나옴
-정지상이 비극성—이동상은 극성—극성 화합물이 먼저 나옴
-극성인 이동상: 물. 메탄올, 아세토나이트릴 등
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-그림 3.12) 이동상으로 사용되는 용매의 용리 세기와 점도
*정상
-정지상이 극성이면 정상 크로마토그래피
-정지상이 극성, solvent는 비극성, 화합물은 비극성이 먼저 나옴
-물과 용매를 혼합하는데 물의 비중이 클수록 극성이 크다
-solvent로 처음에는 비극성을 써 비극성을 먼저 빼내고, 점점 극성을 올려서(물의 비중을
올려서) 극성을 빼냄

*역상
-정지상이 비극성이면 역상 크로마토그래피
-정지상이 비극성, solvent는 극성, 화합물은 극성이 먼저 나옴
-물과 개질용매를 혼합하는데 개질용매는 물보다 작은 극성을 갖음
-solvent로 처음에는 극성을 써 극성을 먼저 빼내고, 점점 극성을 내려서(물의 비중을
내려서) 비극성을 빼냄

*용매 분자와 분석물질 사이의 4가지 상호작용

-쌍극자 상호작용
-분산 상호작용
-유전체 상호작용
-수소결합
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-이온쌍 크로마토그래피(Ion-pair Chromatography(PIC))
비극성 정지상에 머물지 않는 극성이 아주 큰 화합물을 분리하기 위해 RP-HPLC를 개선한 것

-정지상은 비극성, 이동상은 극성, 분리하고자 하는 것은 극성

-화합물이 칼럼에 오래 머물게 하려면 용질의 극성을 줄여야 함
-이동상의 PH를 변화시켜 이온의 전화를 변화시킴
-이것으로 불충분할 때는 이온쌍 시약이라는 강한 이온 시약을 이동상에 첨가

*이온쌍 시약은 분석물질과 반대 전하를 갖는 탄소사슬 화합물

-이온쌍 시약은 비극성 정지상에 달라붙지만 결국 이온 교환 메커니즘에 따라 용리됨

-역상 정지상에서 무기 양이온 또는 음이온의 분리가 가능하다

-소수성 상호작용 크로마토그래피

작용기 사이의 소수성 상호작용에 기초한 크로마토그래피
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*그림 3.15) 역상 정지상에서 이온쌍 형성이 이온의 분리에 미치는 영향

a) 일반적인 이온쌍 크로마토그래피

b) 산성인 이동상의 극성도를 줄여준 것

-OH가 늘어날수록(P의 수가 늘어날수록) 극성이 증가(AMP는 비극성, ATP는 극성)

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*몇가지 화합물의 극성

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-이온 크로마토그래피(Ion Chromatography(IC))
HPLC와 비슷한 분리 기법으로 IC는 이온과 극성 화합물을 분리하는데 이용됨

그림 4.2) 용액으로 구성된 이동상과 평형을 이루는 를 포함하는 음이온 칼럼.

(정지상의 모든 양이온은 이동상의 음이온과 짝을 이룸)

-음이온 교환 칼럼은 음이온 화학종을 분리할 때 사용됨

-고정상 수지의 말단에는 가 있음
- 의 짝으로 가 있음(그런데 보다는 또는 가 더 선호됨)
-이동상으로는 이온성 화합물을 사용함
-이동상 또는 시료의 음이온은 고정상의 음이온과 교환함
(고정상의 음이온이 이동상으로, 이동상의 음이온이 고정상으로 교환)
1)초기에 정지상에 고정된 상대 이온( )은 이동상의 음이온 와 교환
2) 가 정지상을 재생하여 역으로 일어나는 용출이 있음
3)정지상에 있는 의 치환이 일어남
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*반대로 양이온 화학종을 분리하려면 양이온 교환 칼럼을 사용해야 함
(정지상으로는 설폰산기( )를 포함하는 수지를 쓸 수 있음)
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*음이온 교환 수지

*양이온 교환 수지

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*그림 4.3)양이온 칼럼으로 1가 및 2가인 여러 양이온들의 분리

-이동상에 녹아있는 1~6은 모두 이온성을 띤다

-이온화가 더 잘 되는 것부터 분리가 된다
-1~6 순서로 분리가 잘 됨
-1가가 이온화가 더 잘되고, 반응성이 더 좋음
-반응성이 더 좋으면 먼저 분리가 된다
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이온 크로마토그래피(IC)에서의 정지상
-양이온 교환 수지에서는 설폰산기를 포함하는 중합체
-음이온 교환 수지에서는 암모늄기를 포함하는 중합체
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-얇은 막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography(TLC))
*2차원 TLC
-2개의 다른 이동상으로 연속적인 용출
-높은 정도의 분리가 가능
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-그림5.3

-a,b,c는 반응물(a+b+c)
-혼합물 분리를 목적으로 spot을 찍음
-X는 unknown 물질

-미지의 x와 3개의 표준물

-2차원이기 때문에 가로, 세로 두 번 찍음

*첫 번째 용출
-chamber에 solvent(헥산:아세테이트=25:1)를
넣음
-첫 번째 방향에서 이동
-x는 a와 비슷함
-첫 번째 용매 이동으로는 한계가 있음

-꺼내서 말린 뒤 판을 90 회전

-용매2는 용매 1처럼 (헥산:아세테이트=25:1)로

사용해도 되지만 비율을 바꿔주는 것이 좋음
-첫 번째 용매에서는 a 하나에 가능성을 뒀지
만 두 번째 용매에서는 unknown compound
로 보임(적어도 b는 아님)
(x는 최소한 두 화합물의 혼합물인데 하나는 a
고, 다른 화합물은 적어도 b가 아님)

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*그림5.5) 2가지 용매 시스템을 사용해 6가지 정지상에서 다른 극성도를 가진 3개의
스테로이드 분리(TLC)

-2가지 용매 시스템(hexane/acetone) 또는 (acetone/water)

-6가지 정지상(Si-60, , CN, RP-2, RP-8, RP-18)
(극성은 , Si-60, CN, RP-2, RP-8, RP-18 순)
-3가지 스테로이드(alcohol/diol/triol)(OH가 많을수록 극성이 큼)

*normal phase(정상)일 때 정지상은 극성, 이동상은 비극성, sample은 극성일수록 오래

머물음

-정지상 가 가장 극성이 크고, sample도 가장 극성이 큰 것을 잡고 있음

-정지상 는 ■, ●에 비해서는 극성도가 크지만, ▲에 비해서는 극성도가 작음
-정지상 CN은 ■, ●, ▲에 비해서 극성도가 떨어짐
-비극성 용매 시스템은 극성이 비교적 큰 것을 분리하기에 좋음

*reversed phase(역상)일 때 정지상은 비극성, 이동상은 극성, sample은 비극성일수록 오래

머물음

-solvent는 ((acetone/water):(60/40)) 사용 (water는 극성이 매우 큼)(극성이 큰 용매)

-극성 용매는 극성이 다소 작은 것들을 분리하기에 좋음
-----------------------------------------------------------------------------
그림 5.6) 이동거리를 x축으로 했을 때 역상 TLC에 의한 3가지 스테로이드의 분리

-고정상: RP-18(비극성)
-eluting solvent: ((acetone/water):(50/50)) (극성 용매)
-시료: 1과 가까울수록 비극성, 3에 가까울수록 극성

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*그림 5.7) TLC와 HPLC의 비교

-3번에 가까울수록 극성, 1번에 가까울수록 비극성

-시간을 x축으로 할 때 3번이 가장 먼저 나옴
-3번에 가까울수록 극성, 1번에 가까울수록 비극성
-거리를 기준으로 하기 때문에 3, 2, 1 차례대로 나옴
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-초임계 유체 크로마토그래피(Supercritical Fluid Chromatography(SFC))
초임계 상태의 용액을 이동상으로 사용(기체 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피의 혼성)
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-크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography(SEC))
용액 내에서의 분자 크기에 따라 (간접적으로는 분자량에 따라) 분리하는 방법

*크기 배제 크로마토그래피의 종류

-GFC(Gel Filtration Chromatography)

정지상이 친수성인 경우(이동상이 수용액)

-GPC(Gel Permeation Chromatography)

-정지상이 소수성인 경우(이동상이 비수용액(지용성))
-유기용매를 이동상으로 사용
-고분자를 다룰 때 사용
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그림 7.2) GPC

-충전제로 styrene-divinyl benzene의 공중합체를 사용

-유기용매인 THF(tetrahydrofuran), DMF(dimethylformamide)를 이동상으로 사용
-합성 고분자가 녹지 않을 때 고온의 트라이클로로벤젠, 트라이클로로메테인을 사용

-위의 두 그래프 모두 1에 가까울수록 분자량이 크고 5에 가까울수록 분자량이 작음

-SEC는 분자량이 큰 것의 peak이 먼저 나옴

-GFC에서의 젤 거르기는 일반적인 거르기와는 다르게 분자량이 큰 것이 먼저 나오고 작은

것이 나중에 나온다