Kliničko-Toksikološke Analize

KLINIČKO-TOKSIKOLOŠKE ANALIZE
2018/2019.
ODGOVORI NA PITANJA ZA USMENI ISPIT
Sandra Bogdanović
Kliničko-toksikološke analize 2018/2019.
1. Toksikovigilanca
Toksikovigilanca je aktivan proces koji obuhvata identifikaciju i analizu rizika od izloženosti hemikalijama,
kao i razmatranje mera koje se preduzimaju u cilju smanjenja rizika.
Uloga i značaj:
 identifikacija i praćenje neželjenih događaja povezanih sa izloženošću ljudi otrovima u
domaćinstvu, na radnom mestu i u životnoj sredini;
 identifikacija uslova pod kojim je došlo do trovanja, praćenje promene incidence trovanja,
sezonskih varijacija incidence trovanja, populacionih razlika…
 statistički i medicinski pristup - izveštaji sadrže medicinsku istoriju, uslove izloženosti i posledice
štetnih efekata;
 omogućava selektivno praćenje podgrupa populacije (deca, kulturološke razlike, način života)
 ima glavnu ulogu za smanjenje smrtnosti usled trovanja;
 unapređuje dijagnozu, prevenciju i upravljanje trovanjem;
 obezbeđuje detekciju novih mera bezbednosti usled trovanja;
 pomaže u identifikaciji faktora rizika i obima rizika;
 praćenje proizvoda na tržištu (akcidenti, smrtni slučajevi...);
 posebna analiza novih neočekivanih rizika (nepredviđeni akcidenti, efekti na zdravlje ljudi);
 hronični efekti - uspostavlja vezu između izloženosti i efekata na zdravlje ljudi usled dugotrajne
izloženosti.
Globalni značaj:
• osnivanje Centara za kontrolu trovanja;
• statistika trovanja - od značaja da se definišu uzroci, učestalost i težina trovanja ...
• kada se identifikuje problem - sprovođenje odgovarajućih mera (kroz zakonsku regulativu,
povlačenje sa tržišta...).
2. Centri za kontrolu trovanja

Istorijat:
 1953. god. prvi Centar za kontrolu trovanja u Čikagu
 1963. god. National Poison Information Service (UK)
 1964. god. European Association for Poison Control Centers (Francuska)
 1968. god. AAPCC (American Association of Poison Control Centers)
 1997. god. Nacionalni centar za kontrolu trovanja - sa zadatkom “da organizuje i sprovodi
preventivne mere zaštite od trovanja, da vrši informisanje o dejstvu otrova, pruža medicinsku
pomoć u slučaju trovanja i otklanja posledice trovanja”.
Prethode mu:
 VMA 1964. godine - Odeljenje za toksikologiju u okviru Klinike za unutrašnje bolesti VMA;
 1984. godine - Klinika za toksikologiju.
Nacionalni centar za kontrolu trovanja je referentna ustanova koja pruža medicinske usluge prevencije i
terapije trovanja hemijskim materijama, kao i usluge detekcije hemijskih materija u biološkom materijalu,
vodi, zemljištu i vazduhu; omogućava edukaciju iz oblasti toksikološke hemije I toksikologije, kao I naučno-
istraživački rad iz oblasti toksikologije i farmakologije.
Centar za kontrolu trovanja čine:
 klinika za urgentnu i kliničku toksikologiju, u čijem su sastavu Odeljenje za reanimaciju i trijažu,
Odeljenje za intenzivno lečenje i Toksikološko-informacioni odsek;
 institut za toksikologiju i farmakologiju, u čijem su sastavu Odeljenje za toksikološku hemiju i
Odeljenje za eksperimentalnu toksikologiju i farmakologiju;
 mobilna toksikološko-hemijska ekipa.
Broj dežurnog toksikologa: 011 3608 440
1
3. Akutna trovanja odraslih

Najčešći uzročnici trovanja podeljeni su u tri velike grupe: farmaceutski proizvodi, pesticidi i industrijske
hemikalije (kozmetički proizvodi, sredstva za čišćenje domaćinstva...).
Najčešći uzročnici trovanja ljudi (prema izveštaju American Association of Poison Control Centers) su:
 analgetici,
 sredstva za ličnu higijenu,
 sredstva za održavanje higijene u domaćinstvu,
 sedativi, hipnotici, antipsihotici,
 strana tela, igračke, ostalo.
Prema najnovijem dostupnom godišnjaku Centra za kontrolu trovanja (2016.), najčešći razlog dovoženja u
toksikološku ambulantu je bila sumnja na zloupotrebu PAS (alkohola i opojnih droga) i samotrovanje
lekovima, korozivnim sredstvima i pesticidima (preko 90% svih slučajeva). Ređi razlog dovoženja bile su
zadesne ekspozicije i trovanja.
Najčešći agensi zbog kojih su se pacijenti javljali u Odeljenje za reanimaciju i trijažu su alkoholi (metanol,
etanol, etilen glikol), lekovi, sredstva zloupotrebe, gasovi, gljive i biljke, korozivi i pesticidi. Od ukupnog
broja ambulantno pregledanih, većinu su činili muškarci. Najveći broj osoba bile su starosne dobi između
19 i 40 godina.
Po etiološkim grupama, najveći procenat indikacija za hospitalizaciju u odnosu na broj pregleda
registrovan je kod korozivnih jedinjenja, potom lekova, pesticida, gljiva. To istovremeno ukazuje da su
navedene grupe toksičnih agenasa najčešće uzrokovale kliničku sliku koja je zahtevala bolnički tretman
pacijenata. Najčešći razlog za hospitalizaciju bilo je samotrovanje, i to lekovima, korozivnim sredstvima i
pesticidima. Od ukupnog broja hospitalizovanih, većinu su činile žene, a prema starosnoj strukturi osobe
između 19 i 65 godina.
Trovanja se po težini rangiraju prema PSS (Poisoning Severity Score) na PSS 0 – bez klinički značajnih
znakova trovanja, PSS 1 – trovanje lakog stepena, PSS 2 – srednje teško trovanje, PSS 3 – trovanje teškog
stepena i PSS 4 – smrtni ishod. Najveći broj pacijenata, i kod ambulantno zbrinutih i kod hospitalizovanih,
pripadao je grupi PSS 1.
Alkohol je bio najčešći uročnik trovanja; slede lekovi iz grupe benzodiazepina (bromazepam),
antiepileptika (karbamazepin i klonazepam) i neuroleptika (klozapin, olanzapin, risperidon), antidepresiva
(SSRI); zatim sredstva zloupotrebe (heroin, marihuana, kokain, amfetamini); gasovi iz požara, isparenja
hlora iz preparata za domaćinstvo i CO.
4. Akutna trovanja dece

Najčešći uzročnici trovanja dece (prema podacima AAPCC 60% trovanja kod mlađih od 6 godina):
 sredstva za ličnu higijenu,
 analgetici,
 sredstva za održavanje higijene u domaćinstvu,
 strana tela, igračke, ostalo,
 topikalni preparati.
Razlozi velikog broja trovanja dece: radoznalost, oralna faza, privlačan izgled farmaceutskih i drugih
preparata i sredstava u domaćinstvu.
Prema najnovijem dostupnom godišnjaku Centra za kontrolu trovanja, broj ambulantno zbrinutih, kao i
hospitalizovanih pacijenata dečijeg uzrasta, bio je značajno manji od trovanja ostalih starosnih grupa.
Akutnim trovanjima dece bavi se Institut za zdravstvenu zaštitu majke i deteta „Dr Vukan Čupić“. Prema
podacima ove ustanove, među najznačajnijim uzročnicima trovanja izdvajaju se lekovi (NSAIL i
psihoaktivni), zatim industrijski proizvodi (deterdženti, dezinfekciona sredstva), korozivi (hlorovodonična
kiselina, sirćetna kiselina, NaOH) – čuvati van domašaja dece – najveća stopa letaliteta; slede alkohol i
pesticidi, i u malom procentu sredstva zloupotrebe, gljive i biljke, gasovi.
2
5. Organizacija kliničko/sudsko-toksikološke laboratorije

Organizacija laboratorije zasniva se na principima Dobre laboratorijske prakse, koja predstavlja koncept
organizacije procesa rada u laboratoriji i uslove pod kojima se vrši planiranje, izvođenje, zapisivanje i
prikazivanje rezultata. Ona treba da zadovoljava standard ISO 17025 I ISO 15189.
Standard ISO 17025 uopšteno se odnosi na sve ispitne laboratorije i reguliše problematiku samo jednog
dela rada, i to analitičke faze rada laboratorije.
Standard ISO 15189 odnosi se na medicinska laboratorijska ispitivanja, pa samim tim opisuje sve što
medicinska laboratorija specifično mora da ispuni u pogledu: osoblja, smeštaja i uslova okoline,
laboratorijske opreme, preanalitičkog procesa rada, analitičke faze, osiguranja kvalititeta rada
laboratorije, postanalitičke faze, izdavanja rezultata itd.
Laboratoriju koja funkcioniše u saglasnosti sa DLP standardima čine rukovodilac, služba obezbeđenja
kvaliteta, standardne operativne procedure (SOP), saradnici, oprema i kontrolni i test uzorci.
Prednosti:
Proces rada se bolje kontroliše i rezultati su kvalitetniji, služba interne kontrole kvaliteta obezbeđuje da se
sve obavlja prema SOP-ovima, smanjena je potreba za ponavljanjem...
Nedostaci:
Uvođenje je skupo, značajno se povećava obim pisane dokumentacije, aktivnosti u laboratoriji postaju
rutinske i stereotipne…
Nivoi organizacije:
 1. nivo – oblasni centar: za populaciju 20 000-100 000 stanovnika u radijusu 10-50 km;
 2. nivo – regionalna laboratorija: za populaciju 1 000 000-2 000 000 stanovnika;
 3. nivo – nacionalna laboratorija: za populaciju od oko 2 000 000 stanovnika (1-4 000 000)
Organizacija kliničko-toksikološke službe u Srbiji:

 stanice za hitnu pomoć i domovi zdravlja;
 opšte bolnice i zdravstveni centri;
 kliničko-bolnički centri;
 nacionalni centar za kontrolu trovanja.
6. Program rada kliničko/sudsko-toksikološke laboratorije

Formiranje liste otrova:
 farmaceutski proizvodi;
 pesticidi;
 industrijske hemikalije.
Lista sadrži:
 naziv leka ili otrova;
 tip analize (kvalitativna/kvantitativna), donja granica osetljivosti;
 tip potrebnog uzorka (krv, urin, serum, lavat…);
 količinu uzorka;
 vreme obrade.
Nivo Obim poslova Druge aktivnosti

1. Oblasni centar Identifikacija otrova in vitro (tablete, rastvarači),
HbCO, MetHb, kvalitativna procena narkotika
2. Regionalna 1. nivo + narkotici, drugi lekovi, alkohol u krvi, Preporuke za 1. nivo;
laboratorija rastvarači istraživanje
3. Nacionalna Svi toksikološki testovi Preporuke za 1. i 2.
laboratorija nivo; istraživanje,
edukacija
3
Ljudi i oprema:
Nivo Osoblje Oprema Kapacitet (slučajevi/godišnje)

Analitičari Tehničari Otrovi Alkohol u krvi
1. Oblasni - 1 Fotometar (UV/VIS), 50 -
centar TLC
2. Regionalna 2-3 6 1. nivo + 200 2000
laboratorija spektrofotometar
(UV/VIS), GC, HPLC
3. Nacionalna 3-6 10-15 1. i 2. nivo + 1000 5000
laboratorija spektrofotometar
(UV/VIS/IR), AAS,
NMR, MS,
imunoesej, ICP…
7. Dokumentacija u kliničko/sudsko-toksikološkoj laboratoriji

 Toksikološki zahtev - formular (uputnica).
 Informacije o pacijentu: ime, starost, pol, stanje svesti, istorija bolesti i dijagnoza, aktuelna
terapija, znaci i simptomi, sumnja na lek ili otov, datum dobijanja uzoraka.
 Informacije o lekaru: ime lekara, telefon ili lokal.
 Zahtev za laboratoriju: traženi testovi.
 Laboratorijski rezultati: šta je rađeno, u kom uzorku, rezultati, ime analitičara, datum.
8. Uzorci za kliničko-toksikološku analizu

Pravilan izbor uzorka, pravilno obeležavanje uzorka i pravilno čuvanje i transport uzorka su preduslovi za
dobijanje maksimalne količine informacija. Odabir uzorka se vrši prema prirodi supstance koju treba
analizirati i prema kliničkom pitanju na koje treba dati odgovor.
Serum
Plazma (heparin ili EDTA): ne koristiti heparinizirane sudove za hipnotike i trankilizere; uzorke
psihoaktivnih lekova (imipramin) zamrznuti.
Puna krv (NaF/oksalat ili EDTA): Pb, CO, alkil nitrit, cijanidi, lako isparljivi otrovi.
Važno je poznavati raspodelu supstanci eritrociti:plazma (serum)!

CE= [CB – CP (1-H)]/H
CE - koncentracija analita u eritrocitima
CB - koncentracija analita u punoj krvi
CP - koncentracija analita u plazmi
H - hematokrit
Primeri:
 hlortalidon (diuretik) - conc. (eritrociti) 40 x > conc. (plazma): 1 % hemoliza  25 % povećanje
conc. u plazmi;
 plastifikator (tris-(2)-butoksi-etil-fosfat) - redistribucija supstanci u eritrocite;
 fenitoin - bolje vezivanje za proteine plazme na nižoj temperaturi.
4
Urin: lekovi i metaboliti, lako isparljivi otrovi.

Želudačni sadržaj: peroralno uneti lekovi.
Saliva: kanabinoidi, lako isparljivi otrovi, alkohol, benzodiazepini...
 mehanizmi transporta supstanci iz krvi u salivu: pasivna transcelularna difuzija, paracelularni
transport (ultrafiltracija) i aktivni transport.
 brzina difuzije leka iz krvi u salivu zavisi od: osobina leka, osobina salive, cirkulišućih nivoa leka u
slobodnom obliku, doze i klirensa leka.
 uticaj oralne kontaminacije: prisustvo samog leka u usnoj duplji nakon oralne ili intranazalne
primene utiče na saliva/plazma odnos.
 komercijalne test trake - DOA MultiGnost S6 je imunohromatografski test koji se zasniva na
principu kompetitivnog vezivanja; droge prisutne u uzorku salive kompetiraju sa specifičnim
konjugatom za vezna mesta na antitelu prisutnom u testu.
Cerebrospinalna tečnost: lako isparljivi otrovi, lekovi...
Kosa
 kosu (skupina dlaka debljine olovke, oko 100-200 dlaka) treba vezati pri korenu pamučnim
navojem, zatim odseći oko 2 mm od temena zadnjeg dela glave; osigurati da su makaze u nivou
kože glave, a ne pod uglom; vezivanje navojem pomaže u očuvanju poravnanja potrebnog za
segmentnu analizu; uzorak treba ravno postaviti u aluminijsku foliju proksimalno i jasno
identifikovati.
Uzorci za kliničko-toksikološku analizu:
Uzorak Količina
Povraćeni sadržaj 200 g ili 200 ml
Sadržaj 1. ispiranja želuca
Urin
Dijalizat 20 ml
Krv za ispitivanje lekova, drugih organskih, 20 ml
neisparljivih i neorganskih otrova (metali)
HbCO 5 ml
MetHb 1 ml + 4 ml vode
Etanol 5 ml
Lako isparljivi otrovi 8 ml
Kosa - As min 1 g
Nokti - As min 0,2 g
9. Uzorci za sudsko-toksikološku analizu

Pravilan izbor uzorka, pravilno obeležavanje uzorka i pravilno čuvanje i transport uzorka su preduslovi za
dobijanje maksimalne količine informacija. Odabir uzorka se vrši prema prirodi supstance koju treba
analizirati i prema kliničkom pitanju na koje treba dati odgovor. Važan je odabir posude za sakupljanje
uzoraka (citrat može da razgradi gamahidroksibuternu kiselinu); alkohol u krvi u epruveti sa fluoridima u
koncentraciji 1,5%-2% u finalnom uzorku; za lako isparljive supstance staklene posude sa specijalnim
čepovima koji dobro zaptivaju.
Predmet (posuda) treba da se ispita na otiske → pre toksikološke analize.
DNK analiza, biolog prvi uzima uzorak → pre toksikološke analize.
Lekovi i drugi sumnjivi materijali nađeni pored tela:

 bočice lekova - odlična početna tačka, ali i gubitak vremena ako su namerno ostavljeni da skrenu
pažnju;
 pakovanja sredstava za čišćenje, zaštitu bilja (obično je dovoljan podatak sa pakovanja);
 špricevi - analiza zaostalog sadržaja;
 hrana i piće nađeni na mestu događaja.
5
Urin
 jedan od najviše upotrebljavanih uzoraka,
 mnoge pozitivne karakteristike, nema ometajućih endogenih jedinjenja, proteina,
 ne mora uvek ekstrakcija,
 mnogo dostupnih kolor testova,
 koncentracija alkohola - GC.
Želudačni sadržaj
 zapažaju se boja ili miris koji mogu biti indikativni, prisustvo tableta;
 lako izvođenje kolor testova i priprema za TLC.
Krv
 glavni uzorak za toksikološku analizu - prema nekim regulativama to je glavni uzorak za skrining
analizu, ali i kvantitativnu analizu etanola i ugljen-monoksida,
 vizuelno - trovanje ugljen-monoksidom (trešnja crveno) i methemoglobinemija (braon boja krvi),
 kolor testovi - teško izvođenje iz krvi; imunoesej - brz i efikasan način skrining analize iz male
količine uzorka - jedna kap krvi,
 preporuka - uvek skrining analiza bez obzira što sve ukazuje na jedan otrov (CO ili CN-) i da je
posredi slučajno ili samoubilačko trovanje.
o na sudu - da li je osoba napijena ili drogirana pre nego što je uzela otrov ili joj je dat
otrov?
 Sve češće je toksikološka analiza pratilac slučajeva kao što su saobraćajne nesreće, ubistvo bez
predumišljaja, silovanje, neredi, različite nesreće i slično u kojima se ne razmatra trovanje već je
bitnije utvrditi prisustvo npr. psihoaktivne supstance.
Tkivo
 u prošlosti su tkiva bila glavni zahtev, uzorak, za toksikološku analizu;
 jetra bi trebalo da bude i dalje rutinski uzorak u svim post mortem analizama;
 kada bi analiza otrova u jetri trebalo obavezno da se uradi: kada su telesne tečnosti nedostupne,
kada kompletna analiza telesnih tečnosti nije pružila zadovoljavajuće rezultate (primer: tioridazin,
u krvi koncentracije malo više od terapijskih, a u jetri 10x više), kada postoji sumnja na trovanje
lekovima za koje je poznato da podležu post mortem redistribuciji (prelaz iz organa i duplji u
krvne sudove);
 analiza više tkiva - ekshumirana tela, tela u stanju raspadanja (mišići i kosa), ili ako je osoba bila
živa nekoliko dana nakon trovanja i tada krv, urin i želudačni sadržaj ne sadrže otrov.
 mogu se koristiti i bubreg, mozak, pluća, mišić, sadržaj tankog creva i kolona...
10. Stabilnost uzoraka za kliničko/sudsko-toksikološku analizu

Faktori koji u najvećoj meri utiču na stabilnost uzorka su svetlost, temperatura, oksidacija, hidorliza,
biološko razlaganje, kontaminanti.
Svetlost
 fotolabilne supstance - LSD, fenotiazini.
Temperatura
• klonazepam, nitrazepam, morfin, kokain, izoniazid, metadon, paracetamol, triazolam,
metilfenidat, prokainamid - degradacija u uzorcima jetre/krvi na 40C;
• nitrazepam (krv) - brzina razgradnje 6% na dan na 200C;
• cijanid - niže conc. posle čuvanja na -160C;
• hlorpromazin (plazma) - stabilan na -200C, u krvi 2x veća conc. posle odmrzavanja (-200C) -
redukcija sulfoksida i N-oksidnih metabolita u hlorpromazin; povećanje conc. posle 18 dana na
40C.
6
Oksidacija
 antioksidansi: askorbinska kiselina, Na-metabisulfit (1 % w/v) - redukcija N-oksidnih metabolita u
amino oblik - fenotiazini, TCA, neki antihistaminici.
Primeri:
 fenolna funkcionalna grupa oksidabilna i na 4 0C - paracetamol, morfin;
 tio grupe oksidabilne in vitro u alkalnim rastvorima - tiopenton do tiobarbitona;
Hidroliza
 kokain, diacetilmorfin, aspirin - inhibicija esteraza 1% NaF.
Biološko razlaganje
 truljenje - produkcija alkohola, H2S, HCN;
 mikroorganizmi.
Konzervansi: Na-fluorid (1% w/v), Na-azid (0,1% w/v).
Kontaminanti
 kontaminanti nastali truljenjem: feniletilamin, tiramin, triptamin;
 kontaminanti iz posuđa: ftalatni plastifikatori, fosfatni estri;
 kontaminanti prisutni u lekovima.
Faktori koji utiču na kvalitet uzorka:

 nadekvatno transportovan;
 nedostatak zahteva za analizu;
 neobeležen/pogrešno obeležen;
 kontaminacija posude za uzorak;
 pogrešna ambalaža;
 neadekvatna zapremina;
 hemoliza;
 zgrušan uzorak sa antikoagulansom.
11. Priprema uzoraka za kliničko/sudsko-toksikološku analizu

Priprema uzorka je ključni segment za dobijanje pouzdanih rezultata toksikološke analize i njihovo
tumačenje.
Ciljevi pripreme biološkog materijala:

 dobijanje otrova u rastvoru, u što čistijem obliku;
 koncentrisanje otrova;
 uklanjanje potencijalnih interferencija koje mogu ometati analizu otrova;
 uklanjanje interferencija koje mogu uticati na rad samog instrumenta za kvalitativnu i
kvantitativnu analizu (lipidi, proteini, nerastvorne čestice).
Metode pripreme biološkog materijala treba da obezbede da tokom njihovog izvođenja ne dođe do
kontaminacije uzorka. Izbor metoda pripreme biološkog materijala zavisi od fizičko-hemijskih osobina
supstance, prirode materijala u kome se istražuje, kao i metode kvalitativne i kvantitativne analize. Nema
standardne procedure za pripremu materijala, laboratorije poseduju vodiče u kojima su date smernice;
izbor postupka zavisi od slučaja do slučaja.
7
Uticaj karakteristika otrova na izbor metode pripreme:

 lako-isparljivi otrovi - bez pripreme;
 isparljive organske i neorganske supstance - destilacija;
 organske i neorganske supstance, posebno anjoni - dijaliza;
 gasoviti otrovi - mikrodifuzija;
 metali - mineralizacija;
 neisparljive organske supstance - ekstrakcija - najčešći slučaj u toksikološkoj analizi.
“Minimalni set” analitičkih podataka - baza podataka o otrovima/lekovima:

• mogućnost ekstrakcije iz vodene faze;
• mogućnost deproteinizacije;
• tačka mržnjenja;
• retencioni faktor (standardni sistemi);
• retencioni indeks (standardni sistemi);
• reakcije sa standardnim detekcionim reagensima;
• UV maksimum (0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, metanol, etanol);
• IR spektar...
Bez pripreme
Lako isparljivi otrovi - materijal za analizu: krv; u najvećoj meri eliminišu se iz organizma u
nepromenjenom obliku putem izdahnutog vazduha.
Primer: određivanje etanola u krvi - gasnom hromatografijom sa head space-om - uzorak krvi se stavlja u
head space bočicu gasnog hromatografa; sledi odabir uslova za pripremu uzorka (pH uzorka, jonska jačina,
temperatura zagrevanja) i uslova hromatografskog određivanje (GC – T, kolona…).
Destilacija, dijaliza i mikrodifuzija

 destilacija/frakciona destilacija (t.k. do 90 °C – metanol, etanol, dietil etar, etilestar sirćetne kis.,
benzen, alifatični ugljovodonici (do heksana), hlorovani ugljovodonici, alifatični amini, HCN...)
 destilacija vodenom parom (t.k. iznad 90 °C)
 dijaliza - separacija supstanci male molekulske mase od koloidno rastvorenih supstanci i
makromolekula procesom difuzije kroz membranu nepermeabilnu za velike molekule (anjoni za
jonoizmenjivačku hromatografiju)
 mikrodifuzija (CO, HCN - Conway ćelija; etanol - Widmark tikvica)
Mineralizacija
Suvi i vlažni postupci (izbor postupka zavisi od vrste materijala, analiziranog metala, analitičke metode).
Suva mineralizacija na T do 500 °C, dovodi do neznatnog gubitka Pb, Zn, Co, Fe (III), Sr, Cr, Cu, Sb; gubitak
veći od 10 %: Cd, Ag; kompletni gubitak: Hg, As.
Suva mineralizacija na T do 800 °C: veliki gubitak: Hg, B, Pb, Zn, Cd, Ga, In, Tl, As, Sb, Fe, Cr, Cu.
Vlažna mineralizacija: različite kombinacije oksidacionih sredstava uz zagrevanje (generalno razaraju sve
biološke uzorke - HNO3, HNO3+H2O2, HClO4, H2SO4+HClO4 - moguća eksplozija!, H2SO4+HNO3+HClO4,
HCl+KClO3 - neprikladna za metale u tragovima; kombinacija HNO3 i HClO4 koja ne razara lipide).
Mikrotalasna digestija - zatvoren sistem, smanjena kontaminacija, manja količina upotrebljenih kiselina,
nema gibitaka isparljivih metala, brza, jednostavna i ekonomična priprema, bezbedna
upotreba.
Ekstrakcija
Najčešće korišćena metoda pripreme uzoraka za toksikološku analizu - koristi se za detekciju, identifikaciju
i određivanje neisparljivih organskih supstanci. Postoji više metoda ekstrakcije, najčešće korišćene su
tečno-tečna i tečno-čvrsta ekstrakcija.
Dodatak internog standarda: jedinjenje slične strukture ekstrahuje se i određuje istovremeno sa
ispitivanim jedinjenjem - služi za kontrolu analitičkog postupka, bolja preciznost; dodaje se u koncentraciji
između terapijske i toksične.
Vrlo često je potrebno izvesti i pretpripremnu fazu.
8
Pretpripremna faza obuhvata:

 razblaženje uzorka (fosfatni pufer),
 segmentaciju (uzorak kose),
 spoljašnju dekontaminaciju (pranje uzorka kose organskim rastvaračem npr. izopropanolom i dva
puta vodom),
 usitnjavanje/pulverizaciju,
 filtriranje/centrifugiranje uzorka nakon seckanja/homogenizacije uzorka (post mortem uzorci) ili
držanja uzorka u ultrasoničnom kupatilu,
 hidrolitičku razgradnju, najčešće radi praćenja konjugata II faze metabolizma:
o dodavanje jakih baza, kiselina ili enzima pre ekstrakcije - oprez da ne bi došlo do
razgradnje analita i nastanka sporednih produkata koji bi dalje ometali analizu;
o 37% HCl tokom 15 minuta na 100 °C – za hitne analize i brzo dobijanje rezultata;
o β-glukuronidaza iz E. Coli i arilsulfataze - iz urina + interni standard (16 h na 37 °C, ili
najmanje 90 minuta na 50 °C),
 precipitaciju proteina:
o veći sadržaj proteina utiče na stvaranje emulzije kod tečno-tečne ekstrakcije;
o sredstva za deproteinizaciju - etanol:aceton (glikozidi), aceton (β-blokatori), vinska
kiselina:aceton (barbiturati), aceton:n-heptan (organohlorni insekticidi), HCl, HClO4,
trihlorsirćetna kiselina, volframova kiselina, Na-volframat, amonijum-sulfat, Cu(II)-sulfat,
uranil-nitrat, AlCl3, acetonitril;
o toplota;
o enzimska deproteinizacija - pepsin, tripsin, enterokinaze, lipaze.
Vrste ekstrakcija:
 tečno-tečna ekstrakcija (ekstrakcija organskim rastvaračem koji se ne meša sa vodom);
 tečno-čvrsta ekstrakcija (ekstrakcija organskim rastvaračem na čvrstom nosaču);
 mikro ekstrakcija na čvrstoj fazi;
 mikrotalasna ekstrakcija.
Tečno-tečna ekstrakcija (LLE)

 brza, jeftina i efikasna metoda pripreme materijala, posebno biološkog materijala sa niskim
sadržajem proteina;
 izvodi se u širokom opsegu pH vrednost (pH 2-3 i pH 8-9);
 strogo kontrolisana pH vrednost: kisela sredina - Na-dihidrogen fosfat, slabo-bazna sredina - Na-
hidrogen karbonat; za morfin ne sme da pređe pH 9;
 zasićenje neutralnim solima (NaCl);
 određen odnos faza organska/vodena 1:2 onemogućava koekstrakciju širokog opsega
interferencija.
Tipovi tečno-tečne ekstrakcije:

 direktna ekstrakcija/jednostepena: velika brzina, velika efikasnost regeneracije analita, mala
specifičnost usled koekstrakcije, osetljiva analitička metoda, selektivan način merenja;
 višestepena ekstrakcija: neselektivan način merenja.
Faze:
 mešanje sa organskim rastvaračem,
 odvajanje organske faze,
 koncentrisanje (uparavanje) ekstrakta,
 rekonstituisanje suvog ostatka.
9
Optimizacija postupka ekstrakcije:

 izbor organskog rastvarača,
 odnos vodena-organska faza (1:10; 1:5; 1:3),
 preporučene smeše rastvarača: dietil-etar/etilacetat (1:1, v/v),
dihlormetan/izopropanol/etilacetat (1:1:3; v/v/v),
 način i trajanje mućkanja (5-60 min; optimalno 15-30 min).
Nedostaci LLE:
 vremenski zahtevna:
o mućkanje i vreme za razdvajanje,
o vreme potrebno za uparavanje ekstrakata,
 zahtevna u smislu rada i materijala:
o faktor vreme,
o veliki utrošak rastvarača, cene rastvarača, toksičnost,
 uticaj na rezultat:
o stvaranje emulzije,
o loše razdvajanje faza,
o slabo reproduktivna ekstrakcija,
o niske recovery vrednosti,
 neophodno uparavanje ekstrakata.
Tečno-čvrsta ekstrakcija (SPE)

Princip - razdvajanje ili uklanjanje jednog ili više analita iz smeše komponenata selektivnim razdvajanjem
komponenata između čvrste (adsorbens) i tečne faze (rastvarač). Analit se rastvara u rastvaraču koji ima
malu eluacionu moć i zadržava se na čvrstom nosaču; eluiranje se vrši malom zapreminom rastvarača
velike eluacione moći.
Čvrsta faza može biti: nemodifikovan silika gel, hemijski modifikovan silika gel (normalne faze, reverzne
faze i jonoizmenjivači), stiren-divinil benzenske smole modifikovane jonoizmenjivačkim grupama, Al2O3...
SPE ekstrakcija - faze izvođenja: Uobičajena SPE procedura:

 kondicioniranje (aktiviranje pakovanja)  reverzno-fazna - izolovanje nepolarnih
 propuštanje uzorka jedinjenja iz polarnog matriksa:
 zadržava se analit i pojedine nečistoće o kondicioniranje (metanol +
 ispiranje nečistoća dejonizovana voda/pufer),
 eluiranje toksične supstance o propuštanje uzorka (1-5 mL/min),
o ispiranje (polarni rastvarač, ako
se analit zadržava),
o eluiranje (nepolarni rastvarač)
 normalno-fazna i jonoizmenjivači.
Prednosti SPE:
 jednostavnost i brzina izvođenja; ekonomičnost (mala zapremina i uzorka i organskog rastvarača,
ne zahteva primenu višekomponentnih pufera, skupih rastvarača i reagenasa),
 efikasnost (nema stvaranja emulzije, visoka selektivnost, čistiji ekstrakti, veliki prinos ekstrakcije –
recovery >95%),
 omogućava koncentrisanje uzorka - eluiranje malom zapreminom rastvarača, nije neophodno
uparavanje - značajno za termolabilne supstance, olakšana analiza (povećana osetljivost),
 veći prinos (min. transfer uzorka) i čistoća analita,
 osetljivost, specifičnost, selektivnost,
 ne zahteva posebnu pretpripremu uzorka,
 nema problema emulzije,
 smanjen kontakt sa štetnim materijama (min. isparavanja),
 lakše se uklanja otpad, mogućnost uključivanja u proces automatizacije.
10
Poređenje LLE i SPE

LLE SPE
 200 mL do 500 mL rastvarača,  20 mL do 30 mL rastvarača,
 mućkanje je dugotrajan proces,  proces filtracije,
 nastaje emulzija,  ne formira se emulzija,
 niska selektivnost,  visoka selektivnost,
 potrebno oko 2 h/uzorku.  potrebno 20 min/uzorku.
QuEChERS metoda pripreme uzoraka

 Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe.
Veća specifičnost u odnosu na klasične metode ekstrakcije; proširuje opseg izolovanih supstanci; ubrzava
se vreme pripreme uzorka. Prvobitno je postavljena za analizu rezidua pesticida u hrani; u novije vreme
počela sa korišćenjem za pripremu uzoraka krvi, urina i post mortem materijala za kliničko/sudsko-
toksikološku analizu. QuEChERS paket podrazumeva set kiveta i reagenasa, kao i
aplikacija za ekstrakciju i prečišćavanje jer predstavlja kombinaciju različitih metoda pripreme i
prečišćavanja uzoraka. Osnovna forma obuhvata tečnu mikro ekstrakciju i solid-phase
prečišćavanje; pripremljen uzorak se analizira LC-MS/MS ili GC-MS tehnikom.
Derivatizacija
Za GC analizu; vrši se pre/tokom/nakon ekstrakcije:
 trimetilsililacija - silirajući agensi deluju sa širokim spektrom funkcionalnih grupa - hidroksil-,
karboksil-, amino grupe),
 acetilacija - anhidrid sirećetne kiseline za bazne i neutralne komponente,
 metilacija - diazometan za kisele komponente.
Prednosti automatizacije pripreme uzoraka:

 visoka preciznost i reproduktivnost,
 nema uticaja na integritet uzorka,
 80% smanjenja greške i vremena koji potiču od ljudskog faktora,
 izbegava se kontaminacija.
12. Ekstrakcija u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

Eto je iznad. Evo i bonus.
Stas i modifikakcije:
Prvobitna Stasova metoda - istraživanje alkaloida:

 Principi:
o alkaloidi, kao supstance baznog karaktera, jedine se sa kiselinama, stvarajući soli koje se
obično dobro rastvaraju u vodi i alkoholu,
o rastvorene soli alkaloida lako se razlažu dejstvom NaOH, NH3, Na2CO3, NaHCO3,
oslobađajući iz soli alkaloid.
o alkaloid, ovako izvučen iz svoje soli, uglavnom se slabo rastvara u vodi; ako se tečnost, u
kojoj se sada nalazi alkaloid, pomeša sa etrom i mućka, alkaloid se obično više ili manje
rastvara u etru; kad etar ispari, ostaje čist alkaloid.
11
Praktično izdvajanje vršilo se na sledeći način: u isitnjen i vinskom kiselinom zakišeljen materijal dodaje se
dva puta onoliko alkohola koliko je zapremina materijala; posuda se ostavi određeno vreme na vodenom
kupatilu na 600C i filtrira; alkoholni filtrat se ispari u vakuumu na niskoj temperaturi kako bi se isterao
najveći deo alkohola; opet se filtrira radi uklanjanja nečistoća (mast i proteini); dobijeni filtrat se opet
isparava dok se ne dobije sirupasta masa; ova masa, koja sadrži alkaloide u obliku tartarata, rastvara se u
malo vode i u rastvor se dodaje NaHCO3 koji će iz tartarata istisnuti čist alkaloid; tečnost se mućka sa
nekoliko puta većom zapreminom etra u koji prelaze alkaloidi; etar isparava i alkaloidi se identifikuju.
Nedostaci:
 ne obuhvata druga organska jedinjenja, osim alkaloida,
 krajnji ekstrakti su nedovoljno čisti.
Modifikacija Stas-Otto-Ogier-Kohn-Abrest
Prvu izmenu uveo je Otto: kiseli rastvor, dobijen po isparavanju alkohola i rastvaranju sirupaste mase
ekstrahuje se etrom pre dodatka baze, što je korisno iz dva razloga: etar će iz kiselog rastvora izvući masti
- olakšano kasnije prečišćavanje; i etar će rastvoriti otrove iz grupe heterozida i mnoge sintetičke otrove
od alkaloida.
I ovako izmenjena metoda nije davala dovoljno čiste ekstrakte - problem su bile masti koje su ometale
identifikovanje alkaloida, te su usledile izmene Ogier-a i Kohn-Abrest-a.
One se sastoje iz višestrukog prečišćavanja dobijene sirupaste mase - dok rastvor ne bude potpuno bistar;
pored toga, ekstrakt se ekstrahuje prvo petroletrom, a onda etrom.
Dobijeni ekstrakt naziva se kiselo-etarni ekstrakt - u njemu se mogu naći kiseli otrovi, kao što su oksalna
kiselina, salicilna kiselina, barbiturati; neutralni otrovi kao što su sulfonal i kantaridin, kao i cela grupa
heterozida (digoksin), a od alkaloida izuzetno kolhicin.
Alkalno-etarni ekstrakt: vodeni rastvor iz koga je izdvojen kiselo-etarni ekstrakt, služi za istraživanje
alkaloida. Ovaj rastvor treba zaalkalisati, kako bi se iz soli oslobodili alkaloidi. Rastvor se može prvo
zaalkalisati, pa ekstrahovati etrom (Stas-Otto), međutim na ovaj način može se desiti da morfin ne pređe u
etar, jer samo sveže staložen - amorfan, to radi (stajanjem prelazi u kristalan oblik koji je nerastvoran u
etru). Da bi se ovo izbeglo, u kiseli ekstrakt prvo se doda etar, a onda zaalkališe bikarbonatom. Ekstrahuje
se tri puta, filtrira, etar ispari i istražuju se alkaloidi.
Napomena: sve pripreme uzoraka su preuzete iz Clarke's analysis of drugs and poisons, 4th edition.
13. Priprema uzorka krvi

Priprema uzorka krvi za gasno-tečnu hromatografiju - generalno
Izdvojiti plazmu. U uzorak dodati interni standard (promazin-hidrohlorid), natrijum hidroksid i smešu
heksana i izoamilalkohola. Vorteksirati ili mućkati 5 minuta; centrifugirati 10 min. Smestiti epruvetu u
ledeno kupatilo dok vodena faza ne smrzne ili izdvojiti vodenu i interfazu Pasterovom pipetom. Prebaciti
organsku fazu u čistu epruvetu i upariti je na struji vazduha ili azota, a onda rekonstituisati u 0,1 ml
metanola. Injicirati u kolonu za GC.
Priprema uzorka krvi (seruma/plazme) za HPLC - generalno

U uzorke (2) dodati acetonitril i dihlormetan i vorteksirati. U jedan od uzoraka dodati hlorovodoničnu
kiselinu, a u drugi natrijum hidroksid. Mućkati dva minuta i centrifugirati. Ukloniti vodeni sloj i proteine, a
organski sloj prebaciti u čistu epruvetu i upariti na 400C u struji azota, a onda rekonstituisati u mobilnoj
fazi. Injicirati tačno 40 µL uzorka u kolonu.
12
14. Priprema uzorka urina

Priprema uzorka urina za tankoslojnu hromatografiju - generalno
Uzorak se pipetira u dve epruvete, pri čemu se u jednu dodaje sumporna kiselina, a u drugu natrijum
hidroksid. U obe epruvete dodaje se dihlormetan, mućka 5 minuta i centrifugira 5-10 minuta. Vodeni sloj
iz obe epruvete se odbacuje. Ukloniti zaostalu vodu filtriranjem kroz filter papir i u bazni ekstrakt dodati
malo vinske kiseline, kako bi se izbegao gubitak isparljivih supstanci. Upariti ekstrakte u struji vazduha ili
azota, a onda ih rastvoriti u 0,1 ml metanola.
Priprema za TLC benzodiazepina:
 uzorak - 20 ml urina, pH 9 uz boratni pufer;
 ekstrakcija: 20 ml metilen hlorid:izopropanol (75:25);
 ekstrakt rekonstituisan u 200 µl metanola;
 100 µl se nanese na svaku od dve TLC ploče (silikagel G).
15. Priprema uzorka želudačnog sadržaja

Priprema uzorka želudačnog sadržaja za tankoslojnu hromatografiju - generalno
Uzorak se pipetira u dve epruvete, pri čemu se u jednu dodaje sumporna kiselina, a u drugu natrijum
hidroksid. U obe epruvete dodaje se dihlormetan, mućka 5 minuta i centrifugira 5-10 minuta. Vodeni sloj
iz obe epruvete se odbacuje. Ukloniti zaostalu vodu filtriranjem kroz filter papir i u bazni ekstrakt dodati
malo vinske kiseline, kako bi se izbegao gubitak isparljivih supstanci. Upariti ekstrakte u struji vazduha ili
azota, a onda ih rastvoriti u 0,1 ml metanola.
16. Priprema uzoraka salive i kose

Saliva: kanabinoidi, lako isparljivi otrovi, alkohol, benzodiazepini...
Prednosti: odražava slobodnu frakciju leka u krvi, jednostavno, neinvazivno prikupljanje.
Mane: lekovi kratkog biološkog poluvremena se ne uhvate na vreme, gusta, infektivna.
Odnos S/P dat je Henderson-Haselbahovom jednačinom. Kako je saliva kiselija od krvi, u njoj se u većoj
meri nalaze bazni lekovi.
Uzorkovanje – žvakanje zubarske rolnice, sa ili bez stimulacije kiselinom 30-45 sekundi; rolnica se prebaci
u centrifužnu epruvetu i centrifugiranjem se saliva slije na dno epruvete, dok se na samom dnu nalaze
ćelijske komponente. Postoje i brisevi, papiri i druge metode.
Bar 1 sat pre uzorkovanja ne sme se piti, jesti niti pušiti.
Za imunoeseje ne treba pripremati uzorak, ili se samo razblažuje.
Uzorci za određivanje nestabilnih supstanci – kokain, benzodiazepini – se zamrzava ili se priprema LLE ili
SPE, koja smanjuje potrebu za zamrzavanjem, jer se eliminišu enzimi, mucini i drugo…
Kosa
 kosu (skupina dlaka debljine olovke, oko 100-200 dlaka) treba vezati pri korenu pamučnim
navojem, zatim odseći oko 2 mm od temena zadnjeg dela glave. Osigurati da su makaze u nivou
kože glave, a ne pod uglom. Vezivanje navojem pomaže u očuvanju poravnanja potrebnog za
segmentnu analizu. Uzorak treba ravno postaviti u aluminijsku foliju proksimalno i jasno
identifikovati. Uzorak kose treba oprati, jednom ili dva puta – hirurškim sredstvom za pranje,
organskim rastvaračem, vodom; po potrebi usitnjavanje, pulverizacija;
 priprema za imunohemijske testove – vodeni pufer, ekstrakcija; za GC – tečno-tečna ili tečno-
čvrsta ekstrakcija iz kiselog ili baznog rastvora; najjednostavnija je inkubacija sa organskim
rastvaračem par sati na 45 stepeni, a onda GC-MS.
13
17. Priprema uzorka lešnog materijala

Prvi korak u analitičkom postupku podrazumeva izdvajanje supstance od interesa iz biološkog matriksa.
Urin i druge neviskozne tečnosti uglavnom ne zahtevaju tretman pre ekstrakcije. Tečno-tečna i tečno-
čvrsta ekstrakcija su pogodne procedure za ekstrakciju iz krvi i urina. Zgrušana krv može se
homogenizovati u vodi ili puferu. Ekstrakcija supstanci iz čvrstih tkiva zahteva da se ono razori, kako bi se
otrov oslobodio. Ovo se može postići homogenizacijom, kiselom ili baznom hidrolizom, ili enzimskom
digestijom. Upotreba reagenasa za precipitaciju proteina, kao što su barijum-hlorid i cink-sulfat se ne
preporučuje, jer mogu dovesti do koprecipitacije analita od interesa.
18. Skrining analiza

Brzi i jednostavni postupci izolovanja i identifikacije otrova u slučajevima kada je nepoznat uzročnik
trovanja.
 kvalitativni nivo - direktni testovi, postupci izolovanja i identifikacije; nekada je to zadovoljavajući

odgovor: kod hitnosti zbrinjavanja trovanog, u prvom koraku KTA; kao smernica za dalji tok KTA u
smislu kvanitifikacije uzročnika trovanja; nepouzdanost (oprez) - s obzirom da su dokazne reakcije
(razne skrining tehnike) manje ili više (ne)specifične;
 kvantitativni nivo.
14
Pristupi sveobuhvatnom skriningu:

Grupa A Grupa B Grupa C Grupa D
Sastav grupe Alkoholi i CO Supstance koje se Supstance za koje
isparljive materije analiziraju TLC su potrebne
- acetaldehid, tehnikom - specifične metode
etanol, metanol, amfetamin, - acetaminofen,
aceton... barbitol, kofein, benzodiazepini,
kodein, efedrin, kokain,
morfin, nikotin, fenotiazini,
varfarin... cijanid...
Primarni GC CO-oksimetar TLC Conway difuzija,
postupak EMIT,
skrininga kolorimetrijski i
spot testovi...
Sekundarni GC, HPLC, GC-MS GC, HPLC, GC-MS
testovi ili testovi
za konfirmaciju
19. Primarni skrining

Primarni postupak skrininga varira od grupe do grupe:
 grupa A - alkoholi i isparljive materije - acetaldehid, etanol, metanol, aceton... - skrining metoda
je GC;
 grupa B - CO - skrining metoda je CO-oksimetar - hemoliza uzorka, a onda merenje na različitim
talasnim dužinama, odgovarajućim za spektar oksi-, deoksi- i karboksihemoglobina;
 grupa C - supstance koje se analiziraju TLC tehnikom - amfetamin, barbitol, kofein, kodein,
efedrin, morfin, nikotin, varfarin... - skrining metoda je TLC;
 grupa D - supstance za koje su potrebne specifične metode - acetaminofen, benzodiazepini,
kokain, fenotiazini, cijanid... - skrining metode su različite: Conway difuzija, EMIT, kolorimetrijski i
spot testovi...
20. Direktni testovi u skrining analizi

Urin
 test glukoze, ketona, pH;
 salicilati - Trinderov test - ljubičasto obojenje;
 isparljive redukcione supstance – test bihromata - narandžasto u zeleno;
 fenotiazini - FPN reagens: HNO3, HClO4, FeCl3 - ljubičasto, crveno, roze, plavo, zeleno ili
narandžasto obojenje;
 triciklični antidepresivi - Forestov reagens: H2SO4, HNO3, K2Cr2O7, HClO4 - žuto u zeleno ili plavo;
 trihloro jedinjenja - Fujiwara test (piridin, onečišćen trihlorsirćetnom kiselinom često, slepa
proba!) - crveno obojenje;
 paracetamol - krezol-amonijačni test - plavo obojenje;
 ethlorvinol - difenilamin test - crveno obojenje;
 parakvat i dikvat - ditionit test - plavo i zeleno obojenje;
15
Želudačni sadržaj
 miris, boja i pH;
 salicilati - Trinderov test;
 oksidacioni reagensi - difenilamin test;
 fero i feri joni - test fericijanida i ferocijanida - plavo obojenje;
 fenotiazini - FPN reagens;
 triciklični antidepresivi - Forestov test;
 trihloro jedinjenja - Fujiwara test;
 ethlorvinol - difenilamin test;
 parakvat i dikvat - ditionit test;
 OFJ - inhibicija serumske holinesteraze.
Krv
 glukoza;
 urea;
 CO - karboksihemoglobinski test - ružičasto obojenje;
 salicilati - Trinderov test;
 isparljive redukcione supstance - bihromat test;
 OFJ – inhibicija holinesteraze.
21. Značaj hromatografskih metoda u skrining analizi

U skrining analizama od značaja je, pre svega, tankoslojna hromatografija - TLC. Njena korist ogleda se u
relativno jednostavnoj pripremi uzoraka za analizu, mogućnosti identifikovanja većeg broja različitih
otrova, u zavisnosti od uslova pretretmana (ekstrakcije), kao i u mogućnosti identifikacije otrova u većem
broju uzoraka istovremeno, mogućnost poređenja rezultata sa standardom i relativno kratko vreme
izvođenja.
Iz kiselog ekstrakta na ovaj način mogu se identifikovati amilobarbiton, fenobarbiton, fenitoin, glutetimid,
meprobamat...
Iz baznog ekstrakta izdvajaju se kodein, amitriptilin, nortriptilin, hlorpromazin...
Glavni nedostatak ove tehnike jeste njena nespecifičnost, odnosno nemogućnost razdvajanja otrova iz iste
grupe (lekova npr. - benzodiazepini).
Druga značajna tehnika jeste gasna hromatografija, koja ima ulogu u identifikaciji trovanja ugljen
monoksidom. Ova tehnika omogućava i određivanje sadržaja CO u krvi, nakon oslobađanja iz veze sa Hb,
unošenjem para uzorka odgovarajućim špricem, uz detektor termalne provodljivosti. Kao standard koristi
se krv zasićena ugljen monoksidom (gas nastao mešanjem mravlje i sumporne kiseline sprovodi se do
standarda krvi i zasićuje je). Kvalitativni parametar je retenciono vreme, a kvantitativni su PIK i visina pika.
Glavni nedostatak ove tehnike jeste dugo vreme izvođenja (viala stoji 24 h pre unošenja u hromatograf).
22. Analitičke metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj praksi

Postavljanje eksperimentalnog protokola u K/S-TA:
Cilj:
 validan rezultat - specifičnost, preciznost, pouzdanost;
 ispravno tumačenje dobijenog rezultata.
16
Preduslovi:
 pravilan odabir ciljnog jednjenja/biomarkera koje će se kvantifikovati;
o ciljno jedinjenje: polazno jedinjenje ili metabolit,
o biomarker:
• najčešće su to enzimi koji direktno učestvuju u metabolisanju polaznog
jedinjenja ili nekog drugog endogenog jedinjenja,
• ili se određuje međuprodukt nekog otrovom ugroženog metaboličkog puta
(sinteza Hb pod dejtsvom Pb);
 pravilan odabir uzorka za analizu datog jedinjenja (poznavanje ADME);
 pravilan odabir analitčke metode i adekvatni eksperimentalni postupak pripreme uzorka za
analizu.
Adekvatan analitički postupak KTA treba da:
 razreši sumnju trovanja, tj. da proizvede pouzdan rezultat;
 opseg merljivih koncentracija mora da pokriva polje terapijskih vrednosti u biološkim uzorcima
(što ujedno znači da je i opseg toksičnih vrednosti obuhvaćen) (validacija bioanalitičke metode);
 odgovori zahtevu kliničkog toksikologa (hitnost, kvalitativni/kvantitativni postupak);
 da je moguć u datim laboratorijskim uslovima.
Ako imamo mogućnost izbora analitičkog postupka onda se opredeljujemo prema sledećim kriterijumima:
 brzina (ako je neophodna hitnost, onda je to prioritet);
 jednostavnost (kratki analitički postupci ujedno sužavaju polje mogućih kontaminacija tokom
manipulacije; brzina i ekonomičnost);
 racionalnost (cost/benefit).
Analitički pristup:
Kvalitativni Kvantitativni
 nekada je to zadovoljavajući odgovor:  kompletan rezultat - ujedno je i kvalitativan;
o kod hitnosti zbrinjavanja, u prvom  pouzdanost - specifični su;
koraku TA,  validan pristup za postavljenje dozne terapije
o smernica za dalji tok KTA, u smislu tokom tretmana trovanja, i praćenje ishoda
kvantifikacije uzročnika trovanja; terapije;
 nepouzdanost (oprez):  skupe tehnike - hromatografija, imunoeseji...
o s obzirom da su dokazne reakcije -
razne skrining tehnike (ne)specifične.
Izbor analita: toksikodinamski i toksikokinetički profil toksičnog jedinjenja diktira odabir adekvatnog
analita koji se određuje u adekvatnom uzorku (krv, urin, serum, saliva, znoj, kosa, nokti...).
Analit može biti:
 polazno jedinjnenje;
 metabolit;
 ključni metabolišući enzim (prati se utrošak endogenih supstrata ili količina nastalih proizvoda);
o utrošak supstrata: npr. NOS i arginaza troše arginin - inhibirati ostale enzime koji troše
isti supstrat, proveriti selektivnost inhibicije (ispitivanog i drugih enzima koj dele isti
supstrat), razmotriti koja je količina inhibitora potrebna (10 Km količina);
o stvaranje produkata: npr. arginaza katalizuje konverziju arginina u ornitin - inhibirati
enzime koji nastali produkt imaju imaju za sopstevni supstrat i proveriti da li je dodati
inhibitor ujedno i/ili u kom stepenu inhibitor i ispitivanog enzima;
 izmenjena aktivnost enzima pod dejstvom toksičnog agensa koji direktno ne učestvuju u
metabolizmu unetog otrova (npr. povećana ekspresija CYP 450 pod dejstvom barbiturata, ALT,
GGT ili odnos aktivnosti enzima ALT/GGT kod alkoholizma,...);
 međuprodukti fizioloških biohemijskih procesa koji su kompromitovani dejstvom toksičnog

agensa:
o specifični - koproporfirin kod saturnizma: ometanje sinteze Hb,
o nespecifični (dodatne dopunske analize) - sadržaj endogenih antioksidanata GSH/GSSG.
17
ADME - izbor uzorka:

 Administracija:
o per os (biljni i sintetski otrovi, POPs, metalni otrovi) – želudačni sadržaj, krv, feces
(hepatobilijarni put), urin (kosa, nokti - kod hronične izloženosti);
o inhalacija (gasoviti otrovi, lako isparljivi otrovi, čestice metalnih otrova) – krv, urin,
ekspirijum, (kosa, nokti - kod hronične izloženosti);
o dermalna (gasoviti otrovi, lako isparljiva jedinjenja) – krv, ekspirijum, urin, znoj;
o nazalno (psihoaktivne supstance) – krv, saliva, urin.
 Distribucija:
o prema afinitetu raspodele/deponovanja u određena tkiva;
• kod deponovanja - bitnije je za hroničnu ekspoziciju - kosa, nokti - metalni
otrovi.
 Metabolizam:
o biotransformacija do aktivnih/nekativnih metabolita (dobro poznavanje distribucije
novonastalih jedinjenja);
o aktivnost metaboličkih enzima je jedan od ključnih biomarkera ekspozicije
ksenobioticima (meri se nastanak produkta ili utrošak supstrata).
 Ekskrecija:
o urin, feces, saliva, znoj – međuodnos analita (raspodela između ovih ekskreta -
koeficijenti su definisani za neke agense od toksikološkog značaja); ovi koeficijenti su
direktno determinisani vremenskim periodom od unosa otrova do uzorkovanja (različiti
su koeficijenti kod akutnih i hroničnih trovanja);
o alternativni uzorci (manje invazivno uzorkovanje).
Priprema uzorka
Hromatografija Atomska apsorpciona spektrometrija
 kisela/bazna ekstrakcija analita iz uzorka  mineralizacija uzoroka: mikrotalasna pećnica;
etrom ili CHCl2; temperatura; hemijska - jake kiseline...; od
 uparavanje do suva, pod strujom vazduha ili količine biomaterijala koji treba da se
N2 (kod nestabilnih, lako-oksidirajućih mineralizuje i termičke stabilnosti pojedinih
jedinjenja); metala zavisi koji postupak mineralizacije će se
 rekonstituisanje ostatka mobilnom fazom ili primeniti;
metanolom;  rastvaranje suvog ostatka u 1M HNO3 i
 iniciranje. merenje.
23. Kolor testovi u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

Delom preuzeto iz Clarke's analysis of drugs and poisons, 4th edition i VV Pillay - Modern medical
toxicology, 4th edition.
Kolor testovi se sprovode kao skrining testovi - brzi i jednostavni postupci izolovanja i identifikacije otrova
u slučajevima kada je nepoznat uzročnik trovanja. Kvalitativnog su nivoa - direktni testovi, postupci
izolovanja i identifikacije; nekada je to zadovoljavajući odgovor: kod hitnosti zbrinjavanja trovanog, u
prvom koraku KTA; kao smernica za dalji tok KTA u smislu kvanitifikacije uzročnika trovanja; nepouzdanost
(oprez) - s obzirom da su dokazne reakcije (razne skrining tehnike) manje ili više (ne)specifične. Izvode se u
urinu (i želudačnom sadržaju). Prihvaćeni sistem prepoznaje deset osnovnih boja - boje spektra: crvenu,
naranžastu, žutu, zelenu, plavu i ljubičastu, kao i ružičastu, braon, sivu i crnu. Testovi se izvode u staklenim
epruvetama ili belim pločicama, koje omogućavaju uniformnu pozadinu za viđenje boja.
18
Dve važne preporuke su:

 u isto vreme kada i uzorak, treba testirati i uzorak za koji se zna da ne sadrži supstancu od
interesa; ovo omogućava poređenje dobijene boje sa 'blank' uzorkom (on treba da ima isti
matriks kao i uzorak; ako to nije izvodljivo, koristi se voda);
 pre konačne odluke o rezultatu testa, boju uzorka treba uporediti sa bojom koju proizvodi
supstanca od interesa, pod istim uslovima izvođenja.
Primeri kolor testova:
 Trinder test - za identifikaciju salicilata - salicilne kiseline, salicilamida i metilsalicilne kiseline;
ljubičasto obojenje;
 ferihlorid test - za fenole, fenotiazine, fenilbutazon, oksifenobutazon ili salicilate; ljubičasto
obojenje;
 FPN test - za detekciju fenotiazina (tricikli mogu dati plavu ili zelenu boju); ljubičasto,
narandžasto, crveno, roze ili plavo obojenje;
 o-krezol test (krezol-amonijačni) - za detekciju paracetamola i fenacetina; plavo obojenje;
 dihromat test - za detekciju etanola; zeleno obojenje;
 Marquis test - za detekciju opijuma i derivata; ljubičasta prelazi u plavu boju;
 Lee-Jones test - za detekciju cijanida (zeleno-plava boja) i salicilata (ljubičasta boja);
 Reinsch test - za detekciju žive (srebrno), arsena ili bizmuta (crno), ili antimona (ljubičasto-
crno);
 desferoksamin test - detekcija toksičnih koncentracija gvožđa - narandžasto ili crveno
obojenje;
 Fujiwara test - detekcija trihloro jedinjenja; crveno obojenje.
24. Spektrofotometrijske metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

Preuzeto iz VV Pillay - Modern medical toxicology, 4th edition i Clarke's analysis of drugs and poisons, 4th
edition.
Spektrofotometrijske metode u UV i VIS delu spektra široko se koriste u farmaceutskoj i biohemijskoj
analizi u svrhe kvantifikacije i, sa određenim ograničenjima, karakterizacije lekova, nečistoća, metabolita i
srodnih supstanci. UV/VIS spektrofotometrija pronalazi upotrebu primarno u kvantitativnoj analizi. Obim
apsorpcije može se značajno povećati korišćenjem bojenih reakcija, koje često povećavaju osetljivost i
specifičnost. Takođe, one često omogućavaju pomeranje spektra supstance u VIS region (400-800 nm), pri
čemu analit osobađaju interferencija prisutnih u UV oblasti (200-400 nm), u kojoj najveći broj lekova i
otrova apsorbuje. Metode se zasnivaju na Lamber-Berovom zakonu (zavisnost intenziteta apsorbancije od
koncentracije).
Uzorci su najčešće tečnosti - rastvori, ali mogu se analizirati i gasovi i čvrste supstance. Pri analizi tečnosti
koriste se kivete (kvarcne, jer imaju sposobnost apsorpscije u UV delu spektra).
Prema principima Dobre laboratorijske prakse, sve hemikalije, reagensi i rastvori treba da su obeleženi
nazivom i koncentracijom, kao i da sadrže informacije o proizvođaču, datumu proizvodnje i stabilnosti.
Najčešći način kvantifikacije analita od interesa je metoda kalibracione krive, koja podrazumeva pripremu
višestrukih razblaženja standarda poznate koncentracije, merenje njihove apsorbancije i konstruisanje
kalibracione krive (jednačina mora imati r>0,99), nakon čega se meri apsorbancija uzorka, i sa krive
očitava, ili iz jednačine izračunava (češće) koncentracija analita od interesa. Drugi načini su metoda
standarda i izračunavanje preko molarnog apsorpcionog koeficijenta.
Glavni nedostatak ove vrste detekcije jesu interferencije prisutne u trovanjima većim brojem supstanci.
25. Imunohemijske metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

edition.
U toksikologiji se rutinski koriste mnogi heterogeni eseji. Ove tehnike uključuju ELISA, RIA, CIA
(hemiluminiscentni imunoesej), FIA (fluorescentni imunoesej)...
19
RIA - Radio immunoassay

Ovo je spora i skupa metoda detekcije otrova u krvi, ali je izuzetno tačna. Uključuje mešanje poznate
količine specifičnog antitela sa poznatom količinom radioaktivno obeleženog otrova i dodavanje uzorka.
Usled kompeticije, javlja se smanjenje radioaktivnosti proporcionalno količini ispitivane supstance
(obrnuta korelacija). Ovaj test je odličan za supstance koje se u krvi nalaze u jako niskim koncentracijama -
kanabinoidi, digoksin, LSD, parakvat...
ELISA Generalni princip heterogenih imunoeseja
EMIT - Enzyme mediated immunoassay technique

Ovo je brza i skupa metoda, sa dobrom tačnošću, zasnovana na principu da je količina prisutnog otrova
srazmerna nivou inhibicije reakcije supstrat-enzim. Poznata količina otrova obeležena je enzimom i
dodata u medijum koji sadrži supstrat. Specifična antitela se dodaju i inhibiraju enzimsku reakciju.
Slobodan otrov iz uzorka takmiči se sa enzimski-obeleženim za antitela, smanjujući na taj način inhibiciju.
Enzimska aktivnost korelira sa koncentracijom otrova u uzorku i meri se kao apsorbancija proizvoda
nastalog reakcijom enzima i supstrata. EMIT je metoda izbora u odnosu na RIA u hitnim situacijama zbog
brzine i jednostavnosti izvođenja (1 uzorak/min).
EMIT
20
26. Hromatografske metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

Hromatografske tehnike u toksikologiji se koriste i kao skrining (TLC, GC) i kao metode za postavljanje
dijagnoze (analiza na osnovu koje se tačno utvrđuje uzročnik trovanja među nekoliko alternativnih
dijagnoza - HPTLC, HPLC-UV, GC-FID, GC-ECD, GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS, LC-MS/MS).
Zasnivaju se na različitom afinitetu analita od interesa za stacionarnu i mobilnu fazu, što je određeno
njegovim fizičko-hemijskim karakteristikama.
Na osnovu agregatnog stanja mobilne faze, podela je na gasnu i tečnu hromatografiju, a na osnovu
polarnosti faza na normalno-faznu - kada je stacionarna faza polarna, a mobilna nepolarna, i reverzno-
faznu - kada je obrnuto.
Radi postizanja odgovarajućih performansi, biraju se adekvatni uzorci, uslovi razdvajanja, detektori...
Osetljivost analitčke metode:
 priprema uzorka: što idealnija ekstrakcija (izbor rastvarača/stacionarne faze): smešom rastvarača
(kod tečno/tečne) i još stacionarne faze (kod sistema za jednokratnu primenu: tečno/čvrsta ili kod
preparativne hromatografije);
 izbor hromatografske tehnike: TLC, HPTLC (jedno i dvodimenzionalne: denzitometrija za
kvantifikaciju ili fluorescencija); HPLC, LC;
 izbor analitičke kolone (finoća punjenja, specifičnost punjenja (hem grupe, C8-C18), dužina
kolone,...);
 izbor detektora (UV-VIS, Diode-array, MS).
Veoma bitno za GC/MS: mogu se analizirati samo jedinejnja čiji je napon pare veći od 10-10 mbar, maseni
spektri izomernih komponenata se ne razlikuju (ali ovaj nedostatak se često prevazilazi hromatografskim
razdvajanjem izomera).
Izbor detektora u hromatografiji u cilju postizanja osetljivosti
 UV/VIS (jedna talasna dužina), Diode array (opseg talasnih dužina):
o manje osetljivi;
o jednostavnija priprema uzorka;
o izbor talasne dužine za merenje.
 fluorescentni detektor:
o osetljiv (moguće je meriti izuzetno niske koncentracije analita);
o zametnija priprema uzorka, skuplja;
o izbor fluorogena.
 masena spektrometrija:
 analiziraju se molekuli na temelju odnosa njihove mase fragmenata i naboja jona (m/z - the
mass-to-charge ratio).
27. Gasna hromatografija u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

edition.
Ovo je sofisticirani sistem za kvantitativnu analizu i našao je značajnu primenu u toksikologiji zbog
mogućnosti simultanog razdvajanja, identifikacije i merenja količine lekova i drugih organskih otrova.
Gasna hromatografija, posebno gasno-tečna hromatografija, uključuje uparavanje uzorka i injiciranje u
kolonu. Uzorak se kroz kolonu transportuje inertnom gasnom mobilnom fazom. Sama kolona sadrži tečnu
stacionarnu fazu koja je adsorbovana na čvrsto telo.
Princip: tečni ili čvrsti uzorak rastvara se i injicira u hromatograf. Uzorak se uparava na toploti, u talasu
gasa nosača (uglavnom azot). Izbor gasa nosača često zavisi od tipa detektora koji se koristi. Za optimalnu
efikasnost kolone, količina uzorka ne treba da bude prevelika i treba da se injicira brzo - sporo injiciranje
velike količine uzorka dovodi do širenja pikova i smanjuje rezoluciju. Za pakovane kolone, količina uzorka
je oko 20 µl. Kapilarne kolone koriste znatno manju količinu uzorka i imaju mikrošpriceve koji mogu biti
split (sa mogućnošću razblaženja) ili splitless (bez te mogućnosti). Detektor prepoznaje prisustvo
hemikalije i detektuje ga u funkciji vremena. Retenciono vreme i površina ispod pika koriste se za
kvalitativnu i kvantitativnu analizu. Postoji veći broj detektora u upotrebi, različite selektivnosti.
21
Neselektivni detektor odgovara na prisustvo svih supstanci izuzev gasa nosača, selektivni odgovara na
prisustvo većeg broja supstanci sličnih fizičkih ili hemijskih svojstava, dok specifični detektor odgovara na
prisustvo jedne konkretne supstance. Detektori se takođe mogu podeliti na koncentraciono zavisne i
detektore masenog protoka. Prvi je vezan za koncentraciju analita i obično ne razara uzorak, ali
razblaženje gasom nosačem dovodi do nižeg signala. Drugi uglavnom razara uzorak i signal je
proporcionalan molekulima analita koji dospeju u detektor.
Najčešće korišćeni način detekcije je plamena jonizacija (FID). Gas nosač po napuštanju kolone dospeva u
plamen vodonika koji sagoreva i jonizuje prisutni analit, koji se kreće ka elektrodi i dovodi do nastanka
električnog signala koji je proporcionalan količini uzorka. FID se uglavnom koristi za detekciju organskih
jedinjenja zbog visoke osetljivosti i širokog linearnog opsega. Robustan je i jednostavan za upotrebu, a
glavni nedostatak mu je destrukcija uzorka.
Među drugim detektorima, značajni su detektor na bazi zahvata elektrona i maseni spektrometar.
Gasna hromatografija se najčešće koristi za određivanje isparljivih tečnosti kao što je etanol, etilen glikol,
metanol.
Gasni hromatograf
28. Tečna hromatografija u kliničko/sudsko-toksikološkim analizama

edition.
Ova metoda slična je gasnoj hromatografiji, s tim što nije ograničena na isparljive supstance - svi tipovi
analita (polarni, nepolarni, male ili velike molekulse mase) mogu se razdvojiti korišćenjem adekvatne
stacionarne faze (normalna, reverzno-fazna, jonoizmenjivačka hromatografija). Pumpe pod visokim
pritiskom (do 400 bara) pumpaju uzorak kroz kolone pakovane odgovarajućim adsorbensom (npr. silika,
aluminijum oksid). Efluent dospeva do detektora, najčešće UV spektrofotometra i prisutni otrov u uzorku
manifestuje se kao pik na hromatogramu (zavisnost jačine signala od vremena, kao i u GC). Površina ispod
pika proporcionalna je koncentraciji otrova u uzorku.
Sistem je često spregnut sa masenim detektorom, a kao jonizaciona tehnika najčešće se koristi APCI
(hemijska jonizacija pod atmosferskim pritiskom).
HPLC se može koristiti za razdvajanje komponenata kompleksnih smeša.
Postoji veći broj primena HPLC, ona može biti preparativna (u cilju dobijanja veće količine supstance od
interesa) i analitička (uključuje prečišćavanje, identifikaciju i kvantifikaciju analita od interesa). UHPLC
koristi sitnije čestice stacionarne faze i veće pritiske i posebno je pogodna za detekciju analita u smeši.
22
29. Tumačenje rezultata u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

edition.
Koraci u dobijanju i interpretaciji rezultata podrazumevaju:
 inicijalno dobijene informacije - informacije sa mesta zločina/nesreće su vitalne i njih
toksikolog najčešće dobija od policije ili medicinskih radnika koji su bili prisutni; takođe, on
treba da bude informisan o svim okolnostima događaja, kako bi laboratorija imala
preliminarne informacije o potrebnim testovima; ukoliko se sumnja na neke supstance, to
treba iskazati, kao i doneti eventualno pronađene lekove (posebno ako te supstance nisu
obuhvaćene rutinskim skriningom - mogu promaći); informacije od značaja su i ime, datum
rođenja, tip uzorka, a kod post mortem uzoraka i način skladištenja;
 toksikološke analize - često ih bira klijent (policija, forenzičar...) i neretko su određene
budžetom; preporučuje se skrining na sve dostupne supstance; ukoliko ovo nije moguće,
preporučuje se skrining na alkohol, amfetamine, kokain, opijate, kanabinoide i
benzodiazepine, kao i na OTC lekove - antidepresive i antipsihotike;
 finalni izveštaj treba da:
o sadrži objašnjenje načina na koji su testovi izvedeni,
o ukaže na supstance koje se racionalno mogu isključiti kao uzročnici trovanja,
o pokaže koje su supstance detektovane u uzorku,
o ukoliko su izvršene, sadrži rezultate ispitivanja tableta, praha i sl.
Krajnji korisnik treba da razume koji su testovi izvedeni kao i limitacije metoda (ako su
relevantne). I u kliničkim i sudskim okolnostima, veliki broj faktora utiče na koncentraciju
supstance u uzorku. To, zauzvrat utiče na krajnju interpretaciju rezultata.
Najznačajniji faktori i pitanja koja utiču na interpretaciju su:
 Može li supstanca ispoljiti značajne štetne ili toksične efekte i kojim mehanizmom?
o nisu sve supstance pronađene tokom analize toksične, ili njihovo prisustvo nije
relevantno za slučaj;
 Koji je najverovatniji put ekspozicije?
o prisustvo supstance u GIT-u ukazuje na oralnu administraciju, ubodi igle na i.v,
visoke koncentracije u mišićnom tkivu na i.m...
 Jesu li rezultati dobijeni post mortem analizom?
o problematična interpretacija rezultata alkoholemije (bakterije produkuju
alkohol), benzodiazepini, kao i supstance sa sumporom (tioridazin) ili estarskom
grupom (diamorfin, kokain) u molekulu su nestabilne u post mortem uzorcima...
 Da li se smrt dogodila kratko po ekspoziciji ili nakon određenog vremenskog perioda?
o koncentracije nekih supstanci drastično se smanjuju tokom vremena;
 Da li je supstanca uneta jednokratno, ili je u pitanju ponovljena izloženost?
o mnoge supstance se akumuliraju pri ponovljenom unosu, do postizanja steady
state-a; koncentracije pri ponovljenom doziranju su samim tim više, i mogu
navesti na razmišljanje da je uzeta jedna velika doza supstance;
 Koliko osoba ima godina i ima li značajne bolesti srca, bubrega ili jetre?
o godine su značajne zbog metabolizma i volumena distribucije, a hronične bolesti
za eliminaciju, pre svega;
 Ima li osoba značajne povrede?
o ako je upucana, to će biti uzrok smrti, iako možda ima i koncentracije supstance
koje bi dovele do smrti;
 Postoji li mogućnost genetskog poremećaja metabolizma supstance?
o polimorfizam enzima, posebno CYP450 familije je značajan za metabolizam;
 Postoji li mogućnost da se razvila tolerancija?
o fenomen adaptacije na efekte supstance - viša doza potrebna za postizanje istog
efekta - predoziranje;
 Ukoliko su druge supstance prisutne, kakva je interakcija i ima li je uopšte?
o sinergistički efekat (npr. alkohol i sedativi).
23
30. Najznačajniji otrovi sa aspekta kliničke toksikologije

Specifična disciplina u toksikologiji koja se bavi izučavanjem toksičnih efekata agenasa koji se koriste u
terapiji ali i hemijskih agenasa koji nemaju takvu primenu:
 agensi u životnoj sredini,
 alkohol i PAS,
 hemijski agensi u industrijskoj upotrebi (gasovi, ugljovodonici itd),
 esencijalne komponente urbane, poljoprivredne ili druge tehnologije (pesticidi, sredstva u
domaćinstvu itd.),
Klinički toksikolozi se bave identifikacijom, prevencijom, dijagnozom i lečenjem stanja, patologije ili
oboljenja koja su posledica zadesne, namerne ekspozicije ili ekspozicije u životnoj sredini.
Toksindrom: skup simptoma i znakova koji se javljaju u vezi sa izlaganjem određenom leku ili
toksičnom agensu.
Najčešći:
 antiholinergički - antiholinergici (atropin), antihistaminici (benadryl), antipsihotici/neuroleptici
(haldol), antidepresivi (TCA, amitriptilin), neke biljke (Datura stramonium, Hyosciamus niger,
gyromitre);
 holinergički - OFI, karbamati, neke gljive, nervni otrovi;
 opijatni - opijati, barbiturati, benzodiazepini, etanol;
 sedativno/hipnotički - antikonvulzivi, barbiturati, benzodiazepini, etanol;
 simpatomimetski - kokain, MDMA, amfetamini, fenciklidin, teofilin, kofein;
 serotoninski - antidepresivi (SSRI, MAOI), meperidin, dekstromorfan, ekstazi;
 halucinogeni - LSD, neke gljive, kokain, fenciklidin.
31. Najznačajniji otrovi sa aspekta sudske toksikologije

Najuži krug poznatih, uobičajenih, najčešće zastupljenih otrova:
 gasovi,
 lako isparljiva jedinjenja,
 lekovi i droge,
 metali,
 pesticidi,
 anjoni,
 mešano.
Najprikladnija podela u sudskoj toksikologiji, zasnovana na analitičkim potrebama, je
prema metodi izolovanja, izdvajanja, otrova iz materijala:
 gasovi:
o ugljen-monoksid: često uzročnik trovanja sa letalnim ishodom; dokazivanje u krvi u svim
slučajevima trovanja u požarima, kolima, prikolicama itd; u određena doba godine (npr.
na jesen začepljeni dimnjaci nakon perioda kada nije bilo grejanja);
o cijanidi: požari ili unos kalijum ili natrijum-cijanida; i pored karakterističnog mirisa neke
osobe ga ne zapažaju - zato kolor testovi; Conway posudice - mikrodifuzija;
 lako isparljivi otrovi:
o grupna analiza – GC sa head space-om; najčešće metanol, etanol, ugljovodonici, toluen…;
 organske, neisparljive supstance koje se izoluju ekstrakcijom sa organskim rastvaračima (lekovi i
droge),
o najviše ispitivana grupa jedinjenja u sudskoj toksikologiji (sa izuzetkom alkohola);
prisustvo u mnogim slučajevima, a da nema značaja za događaj; skrining analiza - veoma
rasprostranjena; izolovanje otrova iz materijala - ekstrakcija - jedan od najvažnijih
momenata u analizi; analiza tkiva: izolovanje otrova - metode tipa Stass-Otto… ili
enzimska digestija;
24
 metalni otrovi se izoluju mineralizacijom (suvim ili vlažnim postupkom) ili enzimskom
degradacijom tkiva tj. organskog materijala,
o u prošlosti veoma često, danas ređe, razlike među regionima; postoje grupni reagensi, ali
ne obuhvataju sve metale; nisu osetljivi, ali ni metali ne spadaju u jake otrove te su kod
trovanja prisutni u visokim koncentracijama; danas ima dobrih analitičkih mogućnosti, ali
su ti aparati retko u osnovnoj postavi sudsko-toksikološke laboratorije;
 pesticidi - analitičke metode odlično razvijene zbog stavljanja pesticida na tržište i kontrole
rezidua u hrani i vodi; metode za pesticide u biološkom materijalu nisu tako dobro razvijene;
zločinačka trovanja ograničena su neprijatnim mirisom i ukusom, a koriste se jedinjenja
 arsena i talijuma, fosfora, strihnin (rodenticidi), nikotin (insekticidi), jedinjenja žive (fungicidi);
samoubilačka trovanja su češća;
 toksični anjoni koji se izoluju dijalizom,
o ne postoji grupna analiza već se analiziraju pojedini anjoni; najčešće ne spadaju u jake
otrove (osim hlorata i fluorida), ali se sreću u „zlonamernim trovanjima“ - analiza hrane,
pića, želudačnog sadržaja, urin; različiti otrovi koji iziskuju specijalne tehnike ekstrakcije.
32. Najznačajniji uzročnici hemijskih udesa

Hemijski udes ili hemijski akcident je iznenadni i nekontrolisani događaj koji nastaje oslobađanjem,
izlivanjem ili rasipanjem opasnih materija, obavljanjem aktivnosti pri proizvodnji, upotrebi, preradi,
skladištenju, odlaganju ili dugotrajnom neadekvatnom čuvanju – Zakon o zaštiti životne sredine.
Najčešći uzročnici hemijskih udesa su: CO i CN (požari), hlor, amonijak, hlorovodonična kiselina, sumporna
kiselina, benzen, dioksini.
Amonijak
1986. - Šabac, 2013. Novi Beograd, 2014. Novi Sad, 2017. - Pančevo...
Tečnost - vodeni rastvor gasa amonijaka (10-33%). Široko se upotrebljava u proizvodnji veštačkog đubriva,
kao rastvarač, za odmašćivanje... Ima karakterističan jak miris - otkriva se prisustvo u vazduhu u niskim
koncentracijama. Najčešći akcidenti – izlivanje u fabričkim postrojenjima ili prilikom transporta
(saobraćajna nezgoda). Inhalacioni unos - nadražajni i korozivni efekat - koža, oči, respiratorni trakt.
Snižava pH zemljišta i vode - štetan uticaj na organizme u životnoj sredini. Opasnost je posledica
zapaljivosti, korozivnog efekta, akutne toksičnosti i dejstva na životnu sredinu.
Ugljen monoksid i cijanidi - uzročnici trovanja ljudi u požaru

Nekontrolisano širenje vatre u prostoru koje izaziva velike materijalne štete, zagađenje životne sredine i
veliki broj ljudskih žrtava.
Uzroci: visoke temperature, neispravne instalacije, kvarovi, ljudski faktor,...
Pet klasa požara: A, B, C, D i E.
Mere protiv požara (detektori dima i povišenih koncentracija toksičnih gasova; obeležavanje zapaljivih
materija; adekvatna protivpožarna oprema; edukacija).
Dugotrajne posledice požara (hronična ekspozicija) podrazumevaju oslobađanje brojnih supstanci u
životnu sredinu koje imaju toksične efekte po čoveka i živi svet (npr. usporivači gorenja “flame retardant”
- polobromovani difeniletri).
Lista osam faktora koji mogu izazvati smrt u požaru:
• direktno gorenje u vatri,
• veoma visoke T (opekotine),
• smanjenjena koncentracija O2,
• prisustvo CO,
• prisustvo drugih toksičnih gasova,
• prisustvo dima,
• šok i panika,
• sekundarni efekat usled mehaničkih posledica (trauma, frakture,...).
25
Vrste trovanja u požaru su slučajna, profesionalna, i samoubilačka i zločinačka.

Glavni uzročnici trovanja u požaru su:
• gorenje materijala:
o prirodni - drvo, celuloza, pamuk, svila, vuna;
o veštački (sintetski polimeri) - guma, plastika (topi se), poliuretan, najlon.
• gasovi i lako isparljive supstance u dimu - CO, CO2, SOx, NOx, HCN (poliuretani i druge organske
komponente sa N u molekuli), benzen, formaldehid, dioksini...
CO i HCN ispoljavaju kumulativno dejstvo u požarima, njihovi nivoi koreliraju.
Toksikokinetika
CO: HCN
• unos: pluća; • unos: pluća (brza) i koža (spora
• resorpcija: parcijalni pritisak CO, sadržaj resorpcija);
CO i O2 u vazduhu, volumen plućne • metabolizam: mitohondrije -
ventilacije, trajanja ekspozicije, transsulfuraze (rodanaze);
prethodno stanje individue... • eliminacija: u obliku tiocijanata - relativno
• metabolizam: manje od 1% se oksidiše u netoksični, t1/2 - 2,5 dana.
CO2;
• eliminacija: pluća - eksponencijalni odnos;
povećava se sa sadržajem O2; procesom
difuzije u alveolarnim kapilarima; biološko
poluvreme kod zdravih 4-5h.
Mehanizam toksičnog dejstva CO - potiskivanje kiseonika iz Hb; građenje stabilnijeg HbCO; vezivanje za
mioglobin i citohrom oksidazu.
Simptomi trovanja - glavobolja, mučnina, povraćanje, vrtoglavica, nedostatak vazduha, kolaps, nesvestica,
koma, smrt.
Toksični efekti: KVS - smanjenje funkcije miokarda (hipotenzija sa tahikardijom, bol u grudima, disritmija,
ishemija miokarda, ventrikularna fibrilacija - uzrok smrti); metaboličke promene - respiratorna alkaloza,
metabolička acidoza, respiratorni sistem - edem pluća.
Analitika - CO oksimetar (za oksi-, karboksi- i deoksihemoglobin); GC.
Mehanizam toksičnog dejstva HCN - inhibicija enzima citohrom oksidaze; inhibicija oksidativne
fosforilacije i produkcije ATP; inhibicija ćelijskog disanja - ćelijski otrov.
Simptomi trovanja - metabolička acidoza, bradikardija, poremećaji disanja (dispneja, tahipneja, apneja),
oštećenje CNS (glavobolja, vrtoglavica, koma), smrt.
Toksični efekti: srce - direktna stimulacija hemioreceptora karotide, kratki period hiperpneje, poremećaj
rada srca; CNS - centralni respiratorni arest - uzrok smrti.
Analitika: nedostatak specifičnog biomarkera; koncentracija CN - GC/FID - sporo; mikrodifuzija po Conway-
u; laktat u krvi preko 10 mmol/L ukazuje na trovanje. Za dokazivanje cijanida u krvi - prethodna proba -
pikrinska kiselina.
Methemoglobinemija pri požarima

Hb (Fe2+) može biti preveden u MetHb (Fe3+) kod žrtava požara inhaliranjem znatne količine NOx. MetHb
vezuje cijanide u netoksičan cijanomethemoglobin, stoga nivoi cijanida u krvi mogu biti i znatno viši u
odnosu na letalnu koncentraciju (3 mg/L).
Rizične grupe su deca, stare osobe, trudnice, kardiovaskularni bolesnici, pacijenti sa smanjenim
kapacitetom za transport kiseonika (anemije), pacijenti sa hroničnom respiratornom insuficijencijom.
Terapija trovanja:
CO - do 15% svež vazduh, do 40% čist kiseonik, preko 40% hiperbarična komora.
HCN - Na-nitrit, amil-nitrit(?) - izazivanje methemoglobinemije; i.v. Na2S2O3 (nastaje SCN); vitamin B12;
terapija kiseonikom i transfuzija krvi.
26
U cilju smanjenja broja trovanja gasovima u požaru:

• edukacija,
• detekcija toksičnih gasova,
• korišćenje nezapaljivih materijala, adekvatno obeležavanje i skladištenje zapaljivih materijala;
• obeležavanje protiv požarnih puteva, obeležavanje mesta gde je zabranjeno koristiti otvoreni plamen,
• prisustvo obučenih vatrogasaca na mestima gde postoji trenutna opasnost od požara...
33. Ugljen monoksid, koeficijent intoksikacije

Eto ga CO iznad, ovde samo koeficijent.
Koeficijent intoksikacije ugljen monoksidom predstavlja odnos određene količine CO u ispitivanom uzorku
i maksimalne količine tog gasa koju ispitivani uzorak može da apsorbuje. Imajući u vidu individualnu
varijabilnost u sadržaju Hb, kao i kod obdukcionih nalaza, u slučajevima kad je krv pomešana sa ostalim
seroznim tečnostima (siromašnim u sadržaju oksihemoglobina), ovaj način prikaza rezultata trovanja CO
smatra se pouzdanim.
Određivanje koeficijenta intoksikacije CO: metodom po Conway-u odrediti sadržaj CO u ispitivanom
uzorku i istom uzorku maksimalno zasićenom CO (CO se dobija dejstvom sumporne kiseline na mravlju).
KI=koncentracija CO u ispitivanom uzorku/koncentracija CO u istom uzorku, zasićenom CO
34. Alkoholemija
Etanol
 uzročnik saobraćajnih nezgoda (povređivanje vozača, putnika i pešaka)
 uzročnik svađa, rasprava i smrtonosnih povreda u krugu porodice
 uzročnik povreda na radnom mestu
Značajan sa aspekta kliničke i sudske toksikologije; često je predmet veštačenja i sudskim sporovima,
vožnja pod dejstvom alkohola, ubistvo, samoubistvo, utapanje... u alkoholisanom stanju.
Epidemiologija
Najviše korišćena psihoaktivna supstanca - legalan status. Najčešći uzročnik akutnih trovanja.
Zastupljenost polova: više muškarci.
Uglavnom laka do srednje teška trovanja koja ne zahtevaju hospitalizaciju osim ako se ne radi o
istovremenom trovanju i lekovima.
Zahtev za analizu alkohola
 kliničko-toksikološka analiza - Odeljenje za toksikološku hemiju, Nacionalni centar za kontrolu
trovanja,
 sudsko-toksikološka analiza - Institut za sudsku medicinu, Medicinski fakultet - Univerzitet u
Beogradu.
Jedna od najčešćih analiza u toksikologiji.
Ko može da zahteva toksikološku analizu alkohola?
• sud - tužilac;
• lekar;
• radna organizacija;
• privatni zahtev.
Kada?
Iznenadne nerazjašnjene okolnosti smrti, saobraćajne nezgode, ubistva, samoubistva, utapanja; prilikom
zapošljavanja ili na sistematskim pregledima.
27
Zašto?
Klinička toksikologija Sudska toksikologija
• određivanje koncentracije • određivanje koncentracije alkohola u
alkohola u krvi - dokaz u saobraćajnim deliktima, postmortalnoj krvi i drugim uzorcima - dokaz
konfliktima i sličnim situacijama; u saobraćajnim i sudskim
• procena alkoholisanosti - tumačenje nivoa deliktima;
alkohola u krvi u trenutku nezgode, • procena alkoholisanosti - tumačenje nivoa
kriminalnog dela. alkohola u krvi u trenutku nezgode,
kriminalnog dela;
• koncentracija alkohola u krvi – alkoholemija • tumačenje da li je izmerena koncentracija
alkohola u postmortalnoj krvi alkohol
unet pre smrti ili je nastao nakon smrti.
Procena alkoholisanosti, dokaz u
saobraćajnim i sudskim deliktima. Veoma zahtevna interpretacija
dobijenih rezultata.
Vrste materijala za procenu alkoholisanosti

• izdahnuti vazduh - saobraćajna policija u trijaži - odnos sadržaja etanola u alveolarnom vazduhu i krvi
je definisan - alko test;
• klinička praksa - krv (venska), urin (svež), želudačni sadržaj;
• sudska praksa - krv femoralne vene, urin mokraćne bešike, želudačni sadržaj, tkiva i organi, tečnost
staklastog tela...
Metode
Gasna hromatografija (head space) - metoda izbora, i hemijske metode - oksido-redukcione (npr. K2Cr2O7).
Alkoholemija - koncentracija etanola u krvi.

Osobine molekula - mala molekulska masa, rastvara se u vodi i nepolarnim rastvaračima.
Količina resorbovanog alkohola determiniše nivo alkohola u krvi, a time i količinu etanola koja dospeva u
mozak i stepen postignute intoksikacije.
Kriva alkoholemije - grafički prikaz koncentracije alkohola u krvi u zavisnosti od vremena.
Napomena: brzina eliminacije etanola je 0,15 – 0,20‰/h (prosečna vrednost 0,18‰/h).
Kriva alkoholemije
Primena u praksi
Izračunavanje koncentracije alkohola u trenutku nesreće.
Brzina eliminacije etanola je konstantna i ne zavisi od sadržaja etanola u krvi – iznosi 0,15 do 0,2 ‰ na sat
(srednja vrednost 0,18‰) - faktor β (Widmarkov faktor). Samo pri veoma niskim dozama etanol se
eliminiše kinetikom prvog reda.
Faktor β može biti znatno viši u prvim satima pri jako visokim alkoholemijama, kao i kod alkoholičara
(0,3‰/h - 0,4‰/h).
28
Interpretacija post mortem rezultata

Pri izračunavanju alkoholemije u postmortalnoj krvi uzima se u obzir:
 stanje tela pri autopsiji,
 vreme između smrti i autopsije,
 uslovi okruženja (temperatura i vlaga),
 vrsta uzorka.
Faktori koji utiču na koncentraciju alkohola u post mortem materijalu

Endogeni etanol - dijabetičari 10 puta veća vrednost; Japan Candida albicans – „auto-brewery syndrome”
– sindrom sopstvene pivare; sinteza postmortalnog etanola - mikroorganizmi Candida albicans;
postmortalna degradacija ALDH enzima; primena manitola; čuvanje leša na niskoj temperaturi - odsustvo
postmortalne sinteze alkohola.
Dobijanje lažno većih koncentracija etanola u krvi
Post mortem sinteza alkohola zbog mikrobiološke aktivnosti i fermentacije glukoze (leš u stanju
raspadanja); postmortalna difuzija alkohola iz želuca (osoba umrla odmah nakon teškog opijanja);
kontaminacija bioloških uzoraka etanolom ili drugim alkoholom u toku spasavanja života...
Iz ovih razloga radi se analiza alternativnih uzoraka - tečnost staklastog tela.
Veštačenje alkoholisanosti
Od sudskog veštaka se zahteva da pruži odgovor kolika je bila alkoholemija u momentu kritičnog
događaja, čak iako nije blagovremeno uzet ili nije uopšte uzet uzorak krvi.
Procena alkoholemije posle konzumiranja određene količine alkoholnog pića:
A=(V x Q x J)/100
A - masa unetog čistog alkohola,
V - zapremina popijenog alkoholnog pića (mL),
Q - specifična težina etanola 0,789~0,8 (1 mL etanola ima masu 0,8 g)
J - jačina alkoholnog pića izražena u zapreminskim procentima (vol%).
C=A/p x r
C - alkoholemija u promilima,
A - količina resorbovanog alkohola u gramima,
p - telesna težina,
r - redukcioni faktor (♂-0,7, ♀-0,6)
Csn=Ct+β x t
Csn - alkoholemija u vreme kritičnog događaja u promilima,
Ct - alkoholemija u vreme uzimanja uzorka za analizu u promilima,
β - Widmarkov faktor
t - vreme proteklo od momenta događaja do uzimanja uzorka (u satima).
1. april - Svetski dan borbe protiv alkoholizma.
35. Toksikološki značaj i analiza barbiturata

Prvi barbiturat je sintetisan 1903. god. od barbiturne kiseline. Uvedeni su kao hipnotici i zamenili su
opijate, bromide, hloral hidrat, alkohol... Od uvođenja benzodiazepina (krajem '70-ih) retko se koriste kao
sedativi.
Toksikološki značaj
Vrste trovanja:
• samoubilačka (polimedikamentozna trovanja),
• medicinska trovanja (ponovno posezanje za lekom, doziranje),
• slučajna.
Upotreba: sedacija, hipnoza, anestezija; antikonvulzivi, akutni konvulzivni napadi; glavobolje.
Tržište Srbije: fenobarbiton (tablete 100 mg, ampule 220 mg).
29
Zloupotreba: courage pills; downers; F-40s; goof balls (sa amfetaminima); gorilla pills; mexican yellows;
pink ladies; lutkice...
Podela barbiturata
• ultrakratkodelujući – do 1 h (tiobarbiturati),
• kratkodelujući – do 6 h (pentobarbiton, sekobarbiton),
• srednjedelujući – do 10 h (amobarbiton, butabarbiton, butalbital),
• dugodelujući – do 24 h (barbiton i fenobarbiton).
Toksikološke karakteristike barbiturata
• dugodelujući - manje toksični: manje lipofilni, sporije se distribuiraju, manje se vezuju za proteine
(fenobarbiton 20%) i brže se ekskretuju preko bubrega (u nepromenjenom obliku: fenobarbiton
20-30%, barbiton i do 100%); t1/2>40 h.
• kratkodelujući - toksičniji: više lipofilni, više se vezuju za proteine (sekobarbiton 40%), imaju veći
pKa i efekat se ispoljava brzo i kratko traje. t1/2 <40 h.
Metabolizam barbiturata
Metabolišu se uglavnom u jetri do neaktivnih metabolita, koji se u obliku glukuronida ekskretuju putem
urina. Indukuju hepatičnu citohrom P-450, multifunkcionalnu oksidazu mikrozomalnog enzimskog
oksidirajućeg sistema.
Eliminacija barbiturata
Spontana eliminacija - barbiturati i metaboliti su slabe kiseline - smanjena jonizacija i pojačana tubularna
reapsorpcija - smanjena renalna eliminacija.
Forsirana eliminacija primenom bikarbonata - pojačana jonizacija, smanjena tubularna
reapsorpcija - pojačana renalna eliminacija.
Mehanizam dejstva (i toksičnosti)
Vezuju se za specifična mesta na jonskim kanalima GABAA, drže ih otvorenim, čime omogućavaju ulazak Cl-
i posledičnu hiperpolarizaciju membrane postsinaptičkih neurona. Blokiraju glutamatne
receptore u CNS (ekscitatorni neurotransmiter) i inhibiraju glutamat-indukovanu depolarizaciju
(potenciraju i produžuju delovanje GABA).
Toksični efekti: progresivna depresija CNS (posledica depresije polisinaptičkih sinapsi), efekat na pluća,
efekat na kardiovaskularni sistem.
Odnos doze i efekta - u niskim dozama deluju sedativno, u nešto višim hipnotički, a nakon toga anestetički
ili izazivaju smrt; toksična doza iznosi 3-5 terapijskih, a letalna varira u zavisnosti od dužine delovanja - za
kratkodelujuće je 2-3 g, a za dugodelujuće 6-10 g.
Klinička slika trovanja
Prvo se javljaju neurološki simptomi: ataksija, poremećaj govora (dizartrija), nistagmus i konfuznost, a
zatim poremećaj svesti (od somnolencije do duboke kome). Zenice su u početku sužene, a sa
produbljivanjem kome one se šire. Depresija centra za disanje se manifestuje sporim i površnim disanjem
koje se završava apnejom. Posledice centralne depresije na kardiovaskularni sistem su slab i ubrzan puls,
hipotenzija, cijanoza i na kraju šok. Prisutne su hipotermija, acidoza, rabdomioliza; na koži se javljaju bule i
posledica su epidermolize. Javlja se oligurija do anurije; depresija disanja je najteža posledica → uzrok
brze smrti.
Pneumonija, cirkulatorni kolaps, zastoj bubrežne funkcije, edem mozga i pluća → uzroci odloženog
letalnog ishoda.
Tretman trovanja
Nema specifičnog antidota; terapija je suportivna - gastrična lavaža, aktivni ugalj, velike količine tečnosti,
vazopresorni agensi - noradrenalin i dopamin, antibiotici, forsirana alkalna diureza - za dugodelujuće,
hemodijaliza.
Analitika
Određivanje barbiturata u krvi:
• praćenje efikasnosti hronične terapije (antikonvulzivi, antiepileptici),
• potvrda trovanja barbituratima,
• odluka o forsiranoj diurezi,
• kontrola efikasnosti terapije trovanja.
Nivo barbiturata u krvi nije pouzdan za procenu težine i ishoda trovanja (razvijena tolerancija).
30
Materijal: krv, želudačni sadržaj, urin, organi.
Kvalitativna analiza:
• komercijalne test trake (urin),
• kolor testovi - Dille-Koppanyi test - plavo ljubičasta boja; Hg(NO3)2 test - siva boja,
• TLC - dietiletar, 10 % vinska kiselina (pH 4); reagens za identifikaciju: 1% Hg-nitrat,
• EMIT (osetljivost 0,5 mg/L).
Kvantitativna analiza:
 GC-FID, GC-MS,
 HPLC-UV, LC-MS.
36. Toksikološki značaj i analiza benzodiazepina

1960. u Velikoj Britaniji registrovan prvi benzodiazepin - hlordiazepoksid, a 1963.
diazepam. Krajem 70-ih benzodiazepini su najčešće propisivani lekovi. 1998. uvođenje tzv. Z lekova
(zolpidem, zalepion).
Vrste trovanja: samoubilačka (polimedikamentozna trovanja); medicinska trovanja (doziranje); slučajna.
Upotreba:
 anksiolitici (trankilizeri),
 hipnotici (nebarbituratnog tipa) - poseduju veliku terapijsku širinu, smanjuju REM fazu -
sporotalasno spavanje, a produžavaju ne-REM fazu,
 antikonvulzivi (relaksanti skeletne muskulature),
 anestetici (ne mogu dovesti do potpune anestezije).
Zloupotreba: kombinacije sa etanolom i drugim sredstvima zloupotrebe (heroin), upotreba više
benzodiazepina.
Podela benzodiazepina
 derivati 3H-1,4-benzodiazepin-2-ona - bromazepam, klonazepam, diazepam, lorazepam,
oksazepam, temazepam, prazepam...
 derivati 3H-1,4-benzodiazepina - hlordiazepoksid, kvazepam,
 triciklični derivati - alprazolam, midazolam,
 lekovi srodne strukture - zolpidem, zalepion.
Metabolizam benzodiazepina
N-demetilovanje, hidroksilacija - aktivni metabolit oksazepam.
Ekskrecija putem urina u najvećoj meri.
Mehanizam dejstva (i toksičnosti)
 povećavaju inhibitornu aktivnost CNS vezivanjem za GABAA receptore - hiperpolarizacija
postsinaptičke membrane uz influks Cl- (povećana frekvencija i dužina otvaranja jonskih kanala,
čime se smanjuje ćelijska ekscitabilnost),
 antiholinergički efekat - midrijaza, suvoća usta, tahikardija.
Toksični efekti
 opšta depresija CNS-a - razvoj kome,
 respiratorni arest - znatno češći sa novijim krakodelujućim benzodiazepinima: triazolam,
alprazolam, midazolam, i zolpidem,
 hipotenzija - nakon i.v. unosa.
Izrazita kardiovaskularna depresija i depresija disanja, kombinovana sa dubljom komom ukazuje na
kombinovano trovanje (drugi depresor CNS).
31
Terapija trovanja
 aktivni ugalj,
 lavaža želuca (samo ako nije primenjen aktivni ugalj),
 suportivna terapija (tretirati komu, hipotenziju i hipotermiju).
Antidot - flumazenil (specifični antagonist); kratak poluživot, daje se i.v.
Analitika benzodiazepina
 kvalitativna analiza (često pozitivna):
o bojene reakcije:
 Mandelin test - zeleno-plava boja,
 Zimerman test - crveno-ljubičasta boja,
 Liebermann test - braon-narandžasta boja.
o test trake (imunoesej tehnike),
o TLC - Dragendorff reagens,
o EMIT.
 kvantitativna analiza:
o GC (MS, FID),
o HPLC (UV, DR, MS).
37. Toksikološki značaj i analiza antiepileptika

Karbamazepin
Prva indikacija: trigeminusna neuralgija.
Upotreba: antiepileptik, parcijalni napadi, pojedini primarno GTK napadi, trigeminusna neuralgija,
bipolarna psihoza, herpesne neuralgije, fantomski bolovi.
Toksikokinetika
Spora apsorpcija nakon per os unosa, 75 - 80% se vezuje za albumin; u cerebrospinalnoj tečnosti se nalazi
¼ doze prisutne u plazmi.
Aktivni metabolit karbamazepin-10,11-epoksid nastaje posredstvom citohrom P450 sistema. Podleže
enterohepatičnoj cirkulaciji.
Mehanizam dejstva
 blokira Na+ kanale tako što produžava fazu inaktivacije Na+ kanala i smanjuje ulazak Na+ u ćeliju,
 antiepileptički efekat - smanjuje oslobađanje glutamata i stabiliše neuronske membrane
(smanjuje sinaptičko širenje ekscitacijskih impulsa),
 antimanični efekat - smanjuje delovanje dopamina i noradrenalina.
Mehanizam toksičnosti i toksični efekti
 depresija CNS,
 antiholinergički efekti,
 poremećaj ravnoteže na nivou vestibularnog aparata i malog mozga,
 sličnost sa TCA (imipraminom),
 konvulzije,
 promene u srčanoj provodljivosti.
Simptomi akutnog trovanja

Početak kliničkih znakova trovanja može biti blag.
 CNS: midrijaza, divergentni strabizam, nistagmus, (retko ekscitiranost), laki poremećaji svesti
(somnolencija, vrtoglavica), ozbiljna respiratorna depresija i koma,
 KVS: bradikardija, hipotenzija, aritmija i AV blokovi,
 RS: poremećaj disanja, apnea.
Toksične doze: oko 20 g - moguć letalni ishod.
32
Terapija trovanja
 korekcija depresije disanja (retko): respiratorna reanimacija,
 ispiranje želuca (i posle 12h ima smisla zbog spore apsorpcije) uz primenu aktivnog uglja i
laksativa,
 korekcija hipotenzije: nadoknada tečnosti i vazopresorni amini (dopamin),
 korekcija antiholinergičkog efekta: fizostigmin (?),
 hemoperfuzija - kod najtežih slučajeva.
Analitika
 kvalitativna analiza: bojena reakcija sa Na-hipobromitom (plavo-ljubičasta boja) - slaba osetljivost;
 kvantitativna analiza: HPLC, GC-MS...
38. Toksikološki značaj i analiza fenotiazina

1950. sintetisan hlorpromazin; 1954. primenjen kod psihijatrijskih bolesnika.
Upotreba
• antipsihotici, neuroleptici.
• samoubilačka, medicinska, slučajna,
• pratioci svih vrsta suicida,
• veza sa iznenadnom smrću,
• deca!
Hemijska struktura i podela
• sa alifatičnim aminom u bočnom nizu (hlorpromazin, levomepromazin)
• sa piperazinom u bočnom nizu (flufenazin, trifluperazin)
• sa piperidinom u bočnom nizu (tioridazin)
Farmakokinetika
• maksimalna koncentracija u plazmi nakon 2-3 h, Vd 20 L/kg, vezivanje za proteine >90 %,
akumulacija - masno tkivo, mozak (10x veće koncentracije).
Mehanizam dejstva
• blokada svih dopaminskih receptora u mozgu.
• periferne aktivnosti:
o blokada alfa-adrenergičkih receptora,
o antiholinergički i antihistaminski efekti.
Efekat na CNS: centralna sedacija i antiholinergički efekti → depresija CNS.
Alfa-adrenergička blokada - mioza (prevladava nad antiholinergičkim efektom); ekstrapiramidalni sindrom
već pri terapeutskim koncentracijama, izazvan centralnom blokadom dopaminskih receptora. Snižavanje
praga za konvulzije je nepoznatog porekla.
Efekat na KVS: antiholinergički efekti - tahikardija; alfa-adrenegrička blokada - ortostatska hipotenzija;
visoke doze fenotiazina - hinidinu sličan efekat na miokard.
Metabolizam: N-oksidacija, aromatična hidroksilacija, N-demetilovanje, sulfoksidacija; konjugacija.
Terapija trovanja
 lavaža želuca, aktivni ugalj,
 korekcija acidobaznog statusa i elektrolita,
 korekcija hipotenzije: noradrenalin - deluje samo na alfa-adrenergičke receptore (dopamin - ne,
jer deluje i na alfa- i na beta-adrenergičke receptore),
 korekcija aritmije: lidokain ili fenitoin,
 tretman antiholinergičkog efekta – fizostigmin,
 privremeni pejsmejker.
Analitika
 kvalitativna analiza:
o bojene reakcije - FPN,
o test trake (imunoesej tehnike),
o TLC - reagensi - PdCl2; sumporna kiselina:voda:etanol – ružičasta u ljubičastu;
33
o ekstrakcija - hloroform:n-heksan (pH 11, fosfatni, karbonatni pufer),
o GC (MS, FID),
o HPLC (UV, MS).
39. Toksikološki značaj i analiza tricikličnih antidepresiva

Podela antidepresiva
 TCA: amitriptilin, imipramin, doksepin, klomipramin, dosulepin;
 Neselektivni antidepresivi: maprotilin, mianserin, amoksapin, viloksazin, trazodon, mirtazapin,
nefazodon, venlafaksin;
 SSRI - selektivni inhibitori preuzimanja serotonina: fluoksetin, fluvoksamin, paroksetin,
citalopram, sertralin;
 inhibitori MAO: moklobemid, fenelzin, izokarboksazid.
Farmakokinetika
 brza resorpcija iz GIT-a,
 vezivanje za proteine plazme i preko 95%
 enterohepatična cirkulacija osnovnog jedinjenja i metabolita.
Metabolizam
 tri najznačajnija puta: N-oksidacija, hidroksilacija alicikličnog i aromatičnog prstena (C2 i C10), N-
dealkilacija dialkilamino grupe - najznačajniji metaboliti (N-demetilovani metaboliti su
farmakološki aktivni)
Eliminacija: konjugovani hidroksi metaboliti dominiraju u urinu.
Mehanizam dejstva:
 inhibira preuzimanje serotonina i noradrenalina,
 antiholinergičko (neželjeno dejstvo) i hinidinu slično dejstvo.
Mehanizmi toksičnosti:
 centralni i periferni antiholinergički efekat;
 razlike među predstavnicima u mehanizmu i intenzitetu (amitriptilin - najjači efekat; imipramin
dodatno povećava nivo dopamina… ).
Toksični efekti
 neurotoksični efekat:
o CNS: konfuznost, agitiranost i halucinacije, konvulzije, poremećaj svesti, koma;
o periferni antiholinergički efekat: crvenilo lica, suvoća usta, midrijaza, tahikardija…
 kardiotoksični efekat (deca)
o antiholinergički efekat - sinusna tahikardija,
o simpatomimetički efekat - tahikardija, hipertenzija,
o hinidinu sličan efekat - smanjenje kontraktilnosti, frekvencije, koronarnog protoka, v.
ekstrasistole, v. tahikardija i fibrilacija.
Tahiaritmija - najčešća manifestacija → do prestanka rada srca.
Teška akutna trovanja - koncentracije veće od 1 mg/L, čest letalan ishod (izrazit efekat na KVS).
Posebna pažnja kod dece, srčanih bolesnika i osoba na dugogodišnjoj terapiji antipsihoticima.
Terapija trovanja:
 lavaža, laksativi;
 aktivni ugalj (više puta) - zbog enterohepatične cirkulacije TCA i aktivnih metabolita;
 korekcija acidobaznog statusa (bikarbonat) i elektrolita (značajno zbog srčanih aritmija);
 fizostigmin, diazepam, antiaritmici;
 hemoperfuzija.
Analitika
o TLC - Dragendorff-ov reagens ili jodoplatinat; Mandelin – ljubičasto u crveno;
34
o GC (FID, MS),
o HPLC (UV).
Određivanje i aktivnih metabolita!
Postmortem redistribucija visokoliposolubilnih supstanci (krv iz femoralne vene).
40. Toksikološki značaj i analiza β-blokatora i kardiotoničnih glikozida

Kardiotonični glikozidi
Izvor: Digitalis lanata.
Sastav: tri šećera i aglikonski digoksigenin.
Terapijske indikacije:
 kongestivna srčana insuficijencija (ima pozitivn inotropni i negativni hronotropni efekat),
 supraventrikularna aritmija (u lečenju hronične atrijalne fibrilacije).
Mehanizam dejstva
 inhibira Na+-K+ ATP-aznu membransku pumpu - povećanje intracelularnog Na; zauzvrat, Na+-Ca2+ -
izmenjivač pokušava da izbaci Na iz ćelije, na račun upumpavanja Ca; povećan intracelularni Ca
aktivira kontraktilne proteine (aktin, miozin),
 deluje na električnu aktivnost srca (povećava nagib 4. faze depolarizacije, skraćuje trajanje
akcionog potencijala) i smanjuje maksimalni dijastolni potencijal.
Farmakokinetika digoksina
 apsorpcija: GIT (60-100 % zavisno od formulacije); t1/2 - 3,5-5 dana (digoksin), a za digitoksin je
veće (zbog čega toksični efekat traje duže);
 depozicija: 25% se vezuje za proteine;
 metabolizam - nedovoljno proučen: digoksin - I faza: 3-b-digoksigenin, 3-keto-digoksigenin
(hidroksilacija, oksidacija, nezavisno od CYP450); II faza: glukuronid i sulfat.
 ekskrecija: urin - digoksin 50-70%, nepromenjen, digitoksin 10-50%, nepromenjen.
Klinička slika akutnog trovanja - srce, nervni sistem, GIT

 disbalans elektrolita, hiperkalijemija;
 poremećaji srčanog ritma - v. ekstrasistole, bigeminija, v. tahikardija i fibrilacija, atrijalna
tahikardija sa blokom;
 glavobolja, konfuzija, dezorjentacija, amnezija, poremećaji svesti (koma);
 neuralgični bolovi u ekstremitetima, grčevi ekstremiteta;
 oftalmološka simptomatologija - smetnje vida, diplopija, fotofobija, neraspoznavanje boja;
 mučnina, povraćanje, bol u trbuhu, dijareja.
Terapija trovanja
 stabilizacija vitalnih f-ja,
 povraćanje/lavaža, aktivni ugalj, simptomatska terapija,
 specifična Fab-antitela.
Analitika
 Identifikacija:
o antimon pentahlorid; ekstrakcija - metilen hlorid – plavo u ljubičasto;
o TLC: m.f. benzen:etanol; reagens: dil. HClO4 (fluorescencija pod UV lampom);
 Kvantitativna analiza:
o HPLC (fluorescentni detektor, UV),
o RIA,
o fluoroimunoesej.
35
β-blokatori
Predstavnici - acebutolol, alprenolol, atenolol, betaksolol, metipranolol, metoprolol, nadolol, oksprenolol,
pindolol, propranolol, timolol, nebivolol.
Receptori
 β1 receptori mahom se nalaze u srcu i deluju posredstovm aktivacije adenilat ciklaze uz delovanje G
proteina; za njega se podjednakim afinitetom vezuju noradrenalin i adrenalin,
 β2 receptori najzastupljeniji su na nivou pluća i vezuju adrenalin 30 puta više od noradrenalina.
Propranolol
Terapija:
• akutnog infarkta miokarda, aritmije, angine pektoris, hipertenzije;
• kod urgentnih hipertenzivnih stanja, hipertiroidizam, migrene, feohromocitoma, kod menopauze i
anksioznosti.
Mehanizam aktivnosti:
• nekompetativni antagonista β1 adrenergičkih receptora, bez intrinzične simpatomimetičke
aktivnosti.
Propranolol je racemsko jedinjenje: L-izomer je aktivan.
Farmakodinamski efekat: smanjenje srčane frekvencije, sistolnog i dijastolnog krvnog pritiska i refleksa
kod ortostatske hipotenzije.
Farmakokinetika
 potpuna resorpcija u GIT-u; Vd je 4L; u visokom procentu se vezuje za proteine plazme;
 metaboliše se u jetri - hidroksilacija, N-demetilacija, oksidativna deaminacija u prvoj fazi i
konjugacija sa glukuronskom kiselinom u drugoj;
 eliminiše se urinom (atenolol fecesom).
Toksični efekti
 bradikardija, poremećaj srčanog rada, hipotenzija,
 bronhospazam.
Životno ugrožavajući simptomi: AV blok, srčani udar (toksične doze 10-100 puta veće od onih koje su
potrebne za blokadu β-receptora).
Terapija trovanja
 lavaža želuca,
 aktivni ugalj,
 atropin,
 adrenalin, dopamin,
 glukagon - specifični antidot.
Analitika β-blokatora
 Kvalitativna analiza:
o bazna ekstrakcija, TLC; reagens: acidifikovan jodoplatinat, Marquis;
 Kvantitativna analiza:
o GC-ECD,
o HPLC-UV ili fluorescentni detektor.
41. Toksikološki značaj i analiza paracetamola

Analgetik i antipiretik, nema antiinflamatorno dejstvo.
Mehanizam dejstva:
 slab inhibitor sinteze prostaglandina;
 za razliku od selektivnih inhibitora COX-2, ne suzbija upalu reumatoidnog artritisa;
 smatra se da je analgetički efekat centralnog porekla (aktivacija nishodnih serotonergičnih
puteva), ali je primarno inhibicija sinteze PG;
 na molekularnom nivou, pretpostavlja se da njegovoj toksičnosti posreduju reaktivni metaboliti
(peroksidazna aktivnost COX-2 troši glutation - kofaktor enzima za sintezu PGs).
36
Farmakokintetika
 apsorpcija iz GIT-a;
 distribucija - vezivanje za plazma proteine: 25-50%, Vd 0,75-1L/kg;
 metabolizam - 4% oksidacija do N-acetil-p-benzo-hinonimina; konjugacija sa sulfatima i
glukuronskom kiselinom;
 ekskrecija - urin: 5% doze u nepromenjenom obliku.
 inicijalni stadijum, do 24 h: mučnina, povraćanje, anoreksija;
 srednji stadijum, 24-48 h: osećaj opšteg poboljšanja, subkliničko povećanje aktivnosti enzima
jetre;
 stadijum nekroze jetre, 3-4 dana: encefalopatija, mučnina, povraćanje, žutica, hemoragija,
konfuznost, letargija, koma, DIK, poremećaji srčanog ritma, insuficijencija bubrega;
 stadijum oporavka.
Letalna doza: 15-25 g.

Terapija trovanja
 povraćanje, lavaža, aktivni ugalj;
 specifični antidot - N-acetil-L-cistein.
Analitika paracetamola:
 identifikacija - krezol-amonijačni test,
 kvantifikacija - HPLC-UV, GC-FID.
42. Toksikološki značaj i analiza salicilata

Salicilati su nesteroidni antiinflamatorni lekovi, široko upotrebljavani u svetu.
 trovanja: akutna; slučajna, samoubilačka, medicinska.
Farmakokinetika
 acetilsalicilna kiselina se dobro apsorbuje iz želuca i tankog creva; Vd je 0,1-0,3 L/kg; može biti
povećan usled acidoze koja favorizuje ulazak leka u ćelije;
 eliminacija: terapijske doze - hepatički put; toksične doze - renalna ekskrecija; eliminacija zavisi od
pH urina.
Mehanizam toksičnosti
 centralna stimulacija respiratornog centra, što dovodi do hiperventilacije i potom respiratorne
alkaloze; sekundarna posledica hiperventilacije uključuje dehidraciju i kompenzatornu
metaboličku acidozu;
 metabolički (intracelularni) efekti uključuju izostanak oksidativne fosforilacije i prekid
metabolizma glukoze i masnih kiselina, što dovodi do metaboličke acidoze;
 mehanizam nastanka cerebralnog i pulmonarnog edema nije razjašnjen; možda je povezan sa
promenama integriteta kapilara;
 salicilati menjaju funkciju trombocita i mogu da produže protrombinsko vreme.
Klinička slika
 akutno trovanje (slučajno ili samoubilačko):
o povraćanje praćeno hiperpneom, tinitusom i letargijom;
o respiratorna alkaloza i metabolička acidoza;
Teža trovanja: napadi slični epileptičkim, hipoglikemija, hipertermija, edem pluća, koma. Smrt nastaje
usled CNS poremećaja i kardiovaskularnog kolapsa.
 subakutno trovanje:
o slika je nespecifična - dijagnoza može biti pogrešna: konfuzija, dehidratacija, metabolička
acidoza, često i sepsa, pneumonija ili gastroenteritis; edem pluća i mozga - češće nego pri
akutnom trovanju (smrtnost veća).
37
Rejov sindrom
Kliničke karakteristike su obimne i široke - kod dece do 15 godina koja imaju virusnu infekciju i koja su
uzela aspirin (ali dešava se i bez upotrebe aspirina). Ovaj sindrom prouzrokuje hepatičku steatozu sa
veoma slabom upalom i teškom encefalopatijom. Jetra je neznatno povećana i tvrda, a dešavaju su i
određene promene u izgledu bubrega.
Faze:
 prva faza - stalno i preterano povraćanje, letargija, konfuzije i noćne more;
 druga faza - stupor uzrokovan manjom upalom mozga, hiperventilacija, "masna jetra",
hiperrefleksija;
 treća faza - progresija navedenih simptoma, moguća koma i cerebralni edem;
 četvrta faza - dublja koma, midrijaza (na svetlost), disfunkcija bubrega;
 peta faza - brzo pogoršavanje simptoma četvrte faze, duboka koma, otkazivanje brojnih organa,
mlitava paraliza, ekstremna koncentracija amonijaka u krvi (preko 300 mg/dL krvi), smrt.
Terapija trovanja
 nema specifičnog antidota;
 aktivni ugalj;
 tretirati komu, napade slične epileptičkim, plućni edem, hipoglikemiju i hipertermiju;
 tretiranje metaboličke acidoze i.v. NaHCO3;
 forsirana diureza;
 hemodijaliza i hemoperfuzija.
Analitika salicilata
 spektrofotometrija:
o uzorci: urin, krv, serum, plazma (metanolni ekstrakt); meri se salicilat, glavni metabolit
acetilsalicilne kiseline.
Salicilna kiselina u formi dianjona, reaguje sa Fe(NO3)3(aq) (Trinder-ov reagens) i gradi ljubičasti kompleks -
prethodna proba iz urina.
43. Toksikološki značaj i analiza psihoaktivnih kontrolisanih supstanci

Psihoaktivne kontrolisane supstance su:
 opojne droge, odnosno narkotici;
 psihotropne supstance;
 proizvodi biološkog porekla koji imaju psihoaktivno dejstvo;
 druge psihoaktivne kontrolisane supstance.
Opojna droga je svaka supstanca biološkog, odnosno sintetičkog porekla koja deluje primarno na
centralni nervni sistem smanjujući osećaj bola, izazivajući pospanost ili budnost, halucinacije, smetnje u
motornim funkcijama, kao i druge patološke ili funkcionalne promene centralnog nervnog sistema. Npr.
narkotični analgetici: morfin, metadon, petidin, fentanil, pentazocin, tramadol…
Psihotropna supstanca je svaka supstanca biološkog, odnosno sintetičkog porekla koja deluje primarno na
centralni nervni sistem i menja moždane funkcije, zbog čega se menja percepcija, raspoloženje, svest i
ponašanje.
Postoje različite podele ovih supstanci. Na primer, podela na osnovu farmakološkog dejstva
tj. medicinske upotrebe, prema potencijalu izazivanja fizičke i psihičke zavisnosti, prema kazni
zatvora za posedovanje i snabdevanje, itd. Podela koju daje Svetska zdravstvena organizacija zasniva se na
potencijalu izazivanja fizičke, odnosno psihičke zavisnosti podrazumeva podelu ovih supstanci u 8 grupa:
 alkoholno-barbituratni tip,
 opijatsko-morfinski tip,
 kokainski tip,
 kanabinoidni tip,
 khat tip (izaziva euforiju slično kokainu),
38
 halucinogeni tip (LSD),

 amfetaminski tip,
 rastvarači.
Na listi psihoaktivnih kontrolisanih supstanci se nalaze i duvan i alkohol.
Ministarstvo unutrašnjih poslova za terenske analize koristi tzv. "komplet za analizu
praškastih supstanci" i eventualno rastvora. Radi se o kompletu reagenasa koji su specifični
za određenu grupu supstanci. To su jednostavni kolor testovi. Ovakvi kompleti se ne koriste za
biološki materijal, već isključivo za praškaste supstance i rastvore. Služe za preliminarnu detekciju,
tj. identifikaciju supstanci. Konfirmatorna tehnika koja se koristi za analizu praškastih supstanci je
infracrvena spektroskopija.
Kada govorimo o biološkom materijalu, razlikujemo dve vrste metoda. Prva grupa su skrining
metode, a druga grupa su konfirmatorne metode. Kao konfirmatorne metode se u najvećem broju
slučajeva koristi HPLC i gasna hromatografija sa masenim spektrometrom (GC-MS), kao
najpouzdanijom potvrdom identiteta neke supstance.
Kada govorimo o skrining tehnikama, onda su u upotrebi test trake za detekciju psihoaktivnih
kontrolisanih supstanci. Postoje test trake koje su namenjene profesionalnoj upotrebi od strane
zdravstvenih profesionalaca, a takođe postoje i test trake koje mogu da se nabave u slobodnoj prodaji u
apoteci i koje su našle upotrebu kada roditelji žele da prekontrolišu svoju decu. U zavisnosti toga koliko
supstanci pokriva jednom analizom, odnosno može da detektuje jednom analizom, razlikuju se
višekomponentne i jednokomponentne test trake.
Test trake rade na principu imunohromatografskog eseja, odnosno kombinuje se imunska reakcija i
hromatografija. Biološki materijal koji se koristi za analizu obuhvata urin (zlatni standard), saliva,
kosa (specifična za kokain).
Princip
Na uranjajućem delu test trake naneta su antitela specifična za drogu. Kada se test traka uroni u
uzorak doći će do vezivanja supstance za antitelo, ukoliko je u uzorku prisutna ta supstanca.
Antitela okupirana tom supstancom bivaju nošena kapilarnim silama na suprotan deo test trake i
stižu do tzv. T-regiona (test region) u kojem se dešava reakcija i očitava rezultat. Na T-regionu su
nanete čestice supstance imobilisane u obliku jedne linije. U slučaju pozitivnog rezultata pristigla
antitela su okupirana drogom i ne reaguju sa česticama droge u test regionu (izostaje promena
boje, odnosno pojava linije u test regionu). U slučaju negativnog rezultata pristigla antitela nisu
okupirana drogom i reaguju sa česticama droge u test regionu (dolazi do promene boje i pojave
linije u test regionu). U sledećem kontrolnom regionu do kojeg stižu antitela nošena kapilarnim
silama naneta su i antitela i droga, i dovoljno je da taj deo bude samo nakvašen uzorkom i omogući
kontakt antigen-antitelo da bi došlo do reakcije (promena boje, odnosno pojava linije u kontrolnom
regionu). U kontrolnom regionu uvek mora da se pojavi linija, jer je to znak da traka dobro radi.
Ako se u kontrolnom regionu ne pojavi linija, rezultat nije validan.
Svaka test traka ima cut off vrednosti koncentracija, ispod kojih ne može više da detektuje supstancu.
Slične supstance, lekovi i hrana mogu biti uzrok lažno pozitivnih rezultata (heroin, kodein, morfin - štrudle
sa makom). Lažno negativni rezultati su najčešće posledica manipulacija uzorcima (zamena, razblaživanje
opterećenjem vodom ili pojačanjem diureze, dodatak maskirajućih supstanci). U Drajzerovoj postoji
Centar za prevenciju i terapiju bolesti zavisnosti, koji pruža pomoć i u savetodavnom smislu i u
terapijskom smislu.
44. Toksikološki značaj i analiza opioida

Morfin
Aktivni metabolit heroina (diacetilmorfin) i kodeina.
Metabolizam
 N-demetilacija, O-metilacija, N-oksidacija;
 morfin → morfin-3-glukuronid i morfin-6-glukuronid (eliminacija); t1/2 plazma: 2-3 h;
Ekskrecija
 urin (90%) i žuč.
39
Toksični efekti
 depresija CNS-a, depresija disanja (edem pluća), bradikardija i hipotenzija, mioza, hipotermija.
Terapija trovanja narkotičnim analgeticima
 lavaža, aktivni ugalj;
 nalokson (ne kod tramadola, ne deluje primarno na µ receptore); ako ne deluje - sumnja na druge
depresore.
Heroin - diamorfin, diacetilmorfin
Heroin 40-60% + šećer, paracetamol, kofein (hinin, mleko u prahu, skrob). Uzrok smrti - čist heroin.
Depresija disanja, izrazito sužene zenice, koma → trovanje opijatima.
Specifični antidot - nalokson.
Heroin ima kratak poluživot u plazmi i metaboliše se deacetilacijom do morfina i 6-monoacetilmorfina -
dokaz zloupotrebe heroina.
Analitika narkotičnih analgetika
Materijal: krv, urin, organi, kosa, koža, nepoznata supstanca...
o bojene reakcije - Dragendorff - narandžasto obojenje,
o test trake,
o TLC - acidifikovani jodoplatinat.
o GC (MS),
o HPLC (UV, MS).
Tramadol
 (+/-)-tramadol - sintetski analog kodeina;
 centralni analgetik (6000 puta slabiji od morfina), smanjen razvoj zavisnosti;
 noradrenalinski i serotoninski efekat: (-) enantiomer inhibira preuzimanje noradrenalina, a (+)
inhibira preuzimanje serotonina;
 selektivno deluje na µ opiodne receptore; analgetski efekat se parcijalno inhibira naloksonom (što
ukazuje na druge mehanizme delovanja).
Metabolizam
 N- i O- demetilacija; metaboliti se eliminišu u obliku glukuronida i sulfata;
 O-dezmetil metabolit je aktivniji od samog tramadola, za N-dezmetil nije poznato.
Toksični efekti
 prvenstveno potiču od inhibicije preuzimanja serotonina i noradrenalina, a znatno manje od
efekta na opioidnim receptorima;
 znatno slabiji od opioda, respiratorna depresija, disforija i konstipacija;
 konvulzije - najozbiljniji problem - pacijenti sa sklonošću ka konvulzijama;
 kombinacije sa antidepresivima - opasne po život.
45. Toksikološki značaj i analiza kanabinoida

Marihuana, najčešće korišćena ilegalna droga, produkt konoplje, Cannabis sativa. THC deluje umereno
depresorno i halucinogeno.
Metabolizam
 Δ-8-THC - mala aktivnost,
 Δ-9-tetrahidrokanabinolna kiselina (neaktivna),
 Δ-9-tetrahidrokanabinol (delta-9-THC) (aktivni princip).
THC → 11-hidroksi-delta-9-THC (aktivni metabolit) → 11-nor-delta-9-THC-delta-9-karbonska kis. →
glukuronid.
Kinetika - Δ-9-THC
 t1/2 (plazma) - 26 do 36h, Vd - 10 L/kg,
 vezivanje za proteine plazme: 94 do 99%,
 ekskrecija: feces (65% doze), 11-hidroksi-Δ-9-THC karbonska kiselina (konjugat).
40
Efekti akutnog unosa

 problemi sa memorijom i učenjem, razmišljanjem i rešavanjem problema, motornom
koordinacijom,
 ubrzan rad srca, muka, halucinacije, anksioznost, napadi panike i paranoja,
 relaksirano i letargično raspoloženje sa izmenjenom percepcijom (zvuk, vreme, dodir, pogled),
druželjubivost,
 povećan apetit,
 suvoća usta i grla.
Efekti hroničnog unosa
Dim kanabisa sadrži visok nivo karcinogena.
Toksični efekti
 stimulacija simpatikusa i parasimpatikusa,
 tahikardija, ventrikularne ekstrasistole, anksioznost, paranoidno ponašanje, akutna psihoza,
halucinacije, poremećaj govora, pamćenja.
Terapija je simptomatska.
Analitika
o test trake,
o TLC - Fast Blue B;
o GC (FID, MS),
o HPLC (UV, RIA, MS).
Prisustvo metabolita - 4 (7) dana od konzumiranja.
46. Toksikološki značaj i analiza LSD

Dietilamid lizergne kiseline, nađen u ergotu, gljivi koja raste na raži ili drugim žitaricama. 1938. sintetisan -
pokušaj u lečenju psihoza. Halucinogen - iluzioni i halucinogeni efekti koji podsećaju na akutnu psihozu.
Metabolizam: ekstenzivan (hidroksilacija), neaktivni metaboliti, izlučivanje urinom (1% nepromenjen
oblik).
Efekti akutnog unosa
 nepredvidiv efekat (8-12h): mistična, euforična, kompletno zastrašujuča halucinacija ili sve
zajedno;
 fizički efekti: midrijaza, povećana telesna temperatura, brzina rada srca i krvni pritisak, znojenje,
gubitak apetita, nedostatak sna, suvoća usta, i tremor;
 senzacije i emocije se menjaju dramatičanije od fizičkih simptoma - izmena emocija jedne
drugima "cross over," (čuju se boje i vide se zvuci), ove promene izazvaju strah i paniku.
Efekti hroničnog unosa
 “flashback” se dešava nenadano i bez upotrebe droge i bez upozorenja (u nekoliko dana ili čak
više od godinu dana od poslednjeg uzimanja droge);
 Mnogi zavisnici prestaju dobrovoljno sa uzimanjem LSD.
Simptomi trovanja
Velike varijacije doza koje će dovesti do promena u fiziološkim funkcijama.
 hipertenzija, tahikardija, midrijaza, crvenilo kože, hipersalivacija, lakrimacija, hiperrefleksija,
ataksija, hipertermija, konvulzije, hiperglikemija, koma;
 mentalni status: psihoze, flešbekovi, panika…
Terapija je simptomatska.
Analitika
Kvalitativna analiza - bojene reakcije: Mandelin test - zeleno-braon boja; Marquis test - braon boja.
Kvantitativna analiza - HPLC-UV.
41
47. Toksikološki značaj i analiza kokaina

Kokain je ekstrahovan iz lista koke. Snažan je stimulans CNS. U reakciji sa NH3 kokain–HCl se prevodi u
kokain-bazu, tj. krek, u obliku strugotine, komada, kamenčića. Obično se puši.
Metabolizam - hidroliza: benzoilekgonin (inaktivan).
Eliminacija urinom 30-60% doze (benzoilekgonin).
Toksični efekti
Dejstvo: simpatomimetik - inhibira preuzimanje dopamina i noradrenalina u sinapsama (trovanje -
centralno delovanje):
 mučnina, povraćanje, ubrzano disanje, midrijaza, halucinacije, konvulzije;
 ubrzan srčani rad, povišen krvni pritisak, poremećaji srčanog ritma - kardiotoksičnost;
 visoke doze - centralna depresija disanja - uzrok smrti;
 nema specifičnog antidota - simptomatska terapija.
Analitika kokaina
Benzoilekgonin - krv i urin.
o bojene reakcije - kobalt-tiocijanat - plavo; p-dimetilaminobenzaldehid - crveno;
o TLC - acidifikovani jodoplatinat, Dragendorff;
o GC (FID, MS),
o HPLC (UV).
48. Toksikološki značaj i analiza amfetamina, metamfetamina i MDMA

Amfetamini
Ubrajaju se amfetamin (spid) - snažan stimulans CNS, metamfetamin - snažan stimulans pojedinih regija
CNS, MDMA (ekstazi) - snažan stimulans CNS i halucinogen, fenfluramin, fentermin... Unose se gutanjem,
ušmrkavanjem, injekciono ili pušenjem.
Mehanizam dejstva
 centralni i periferni, alfa, beta-adrenergički efekti → povećanje koncentracije dopamina i
noradrenalina (indukcija oslobađanja iz depoa, inhibicija preuzimanja) → stimulacija CNS i
kardiovaskularnog sistema.
Metabolizam
 manji udeo: aromatična i N-hidroksilacija, konjugacija sa sulfatima i glukuronskon kiselinom
 t1/2 plazma: 4 do 8 h - kiseo urin, ≈ 12 h - nekontrolisan pH;
 laka:
o mučnina, povraćanje;
o rumenilo kože (lica), suvoća sluznica, midrijaza;
o uznemirenost, pojačani refleksi, tremor, nesanica;
 srednje teška:
o hipertenzija, tahikardija, ventrikularne ekstrasistole;
o hiperaktivnost, konfuzija, halucinacije (neprijatne);
 teška:
o izrazita hipertenzija, tahikardija, poremećaj ritma (bigeminija, v. fibrilacije), cirkulatorni
kolaps;
o hiperpireksija, konvulzije, koma.
Simptomatska terapija (antipsihotici - psihoza, delirijum, anksioznost; benzodiazepini - konvulzije…).
Analitika
o test trake (lažno pozitivne reakcije),
o bojene reakcije - Liebermann - crveno-narandžasto, Marquis - narandžasto u braon,
ninhidrin - roze-narandžasto;
o TLC;
42
o GC (ECD, MS),
o HPLC (UV).
49. Toksikološki značaj i analiza novih psihoaktivnih supstanci

Delom preuzeto sa sajta United Nations Office on Drugs and Crime - Sistema ranog upozoravanja.
Nove psihoaktivne supstance su supstance zloupotrebe u čistom obliku ili preparati, koje nisu obuhvaćene
Konvencijom o narkoticima (1961.) ili Konvencijom o psihotropnim supstancama (1971.), a koje mogu
predstavljati pretnju po javno zdravlje. Termin 'nove' ne odnosi se na to da su novosintetisane (neke od
njih su sintetisane i pre 40 godina), već da su nove na tržištu. Mnoge od njih imaju efekte slične kanabisu,
kokainu, heroinu, MDMA ili metamfetaminu. Posmatrajući efekte, većina njih su stimulansi, sintetički
agonisti kanabinoidnih receptrora i klasični halucinogeni.
Prodaju se u „head shop-ovima”, internet - kao osveživači vazduha, soli za kupanje, vitamini...
Inicirale su Sistem ranog upozoravanja - kad se neka supstanca identifikuje kao nova psihoaktivna,
informacija postaje dostupna u sistemu koji to prijavljuje kancelarijama zemalja članica.
Podela novih psihoaktivnih supstanci
• feniletilamini - veliki broj jedinjenja,
• triptamini - veći broj supstanci, prvenstveno halucinogeni,
• piperazini - najznačajniji predstavnici m-hlorfenilpiperazin (mCPP) i benzopiperazin (BZP),
• sintetski katinoni - stimulansi,
• sintetski kanabinoidi.
Feniletilamini
• analozi amfetamina, sintetski amfetamini, prve „dizajnerske droge“;
• veliki broj jedinjenja;
• stimulansi (osećaj empatije, entaktogeni efekat, halucinogeni efekat);
• mehanizam dejstva - posledica izrazite sličnosti feniletilamina i amfetamina (alfa-metil-
feniletilamin) sa dopaminom, noradrenalinom i serotoninom.
Sintetski katinoni
• po strukturi slični katinonu, aktivnom sastojku biljke Catha edulis,
• najznačajniji polusintetski predstavnik je metkatinon, a sintetski mefedron, metilon i
metilendioksipirovaleron (MDPV), alfa-PDP;
• soli za kupanje, sredstva za prihranjivanje biljaka;
• najčešće se unose ušmrkavanjem ili pušenjem, ređe oralno i i.v.
• stimulansi - pojačavaju oslobađanje serotonina, dopamina i noradrenalina i dodatno blokiraju
preuzimanje noradrenalina.
43
Sintetski kanabinoidi
• najčešće se koriste kao biljne smeše, pušenjem,
• sličnog dejstva kao Δ9-tetrahidrokanabinol (THC);
• različite hemijske strukture koje ne moraju biti slične THC;
• efekat na GIT (mučnina, povraćanje), CNS (agitacija, halucinacije, somnolencija, konvulzije,
konfuznost i akutna psihoza), KVS (tahikardija, dispnea, bol u grudima);
• simptomi se brzo povlače, sem akutne psihoze (može trajati nekoliko dana).
Flunitrazepam (Rohipnol®)
• terapija nesanice i uvod u anesteziju;
• tablete su bez ukusa i mirisa, jeftine, brzo se rastvaraju u alkoholu (laka intranazalna i peroralna
primena);
• “date-rape drug” - euforija, halucinacije, gubitak inhibicija, amnezija;
• pojačava heroinsku i kokainsku euforiju;
• dejstvo se javlja za 20 do 30 min i traje do 12 h;
• efekat na GABA receptore i do 10 puta jači od diazepama;
• pospanost, dezorjentisanost, vrtoglavica (drowsiness, disorientation, dizziness-“DDD”),
nepovezan govor, nauzeja, psihomotorni poremećaji, depresija disanja, koma;
• flumazenil u slučaju depresije disanja (samo ako nisu korišćeni stimulansi).
50. Toksikološki značaj i analiza pesticida

Vrste trovanja
Suicidalna trovanja - peroralno, intramuskularno, intravenski; akcidentalna inhalaciona trovanja radnika u
polju, akcidentalna ingestija.
Epidemiologija
Najveća učestalost trovanja je u starosnom dobu 31-40 i >60 godina, i to među ženama. Najčešće
korišćena doza atropina je između 100 i 500 mg. Aktivnost eritrocitne acetilholinesteraze najčešće je u
opsegu 20-50%, a butirilholinesteraze ispod 10%. Za identifikaciju otrova najčešče se kao uzorak koriste
krv, lavat i urin. Trovanja organofosfatnim pesticidima najčešće spadaju u grupe PSS 1 (i trovanja
karbamatima) i PSS 3.
Akutni toksindromi
44
Mehanizam dejstva
 organofosfatna jedinjenja: ireverzibilna inhibicija AChE;
o kliničku sliku čine akutna holinergička kriza, intermedijarni sindrom, odložena periferna
neuropatija i druge specifične lezije organa;
 karbamati: reverzibilna inhibicija AChE; klinička slika posledica nakupljanja endogenog
acetilholina - nikotinski, muskarinski i centralni efekti;
 organohlorni insekticidi: deluju na nivou ćel. membrane - smanjivanje transporta K+ kroz
membrane nervnih ćelija; sprečavnje zatvaranja Na+ kanala; inhibicija Na+-K+ ATP-aze i
Ca2+-Mg2+ATP-aze; smanjenje sposobnosti kalmodulina da veže i prenosi Ca2+;
 bispiridinijum jedinjenja: lokalno deluju kao korozivi; parakvat - peroksidacija lipida i kiseonični
radikali; organ-specifično dejstvo: parakvat - pluća, dikvat - bubrezi;
 antikoagulantni rodenticidi: antagonisti vitamina K (učestvuje u sintezi faktora II, VII, IX i X
koagulacije).
Analitika
 organofosfatna jedinjenja - paration:
o kvalitativna analiza: bojene reakcije: PdCl2 - braon, fosfor - žuto; Elmanov reagens -
smanjenje intenziteta žute boje;
o kvantitativna analiza - GC/MS, HPLC/UV;
 karbamati - aldikarb:
o kvalitativna analiza: TLC,
o kvantitativna analiza: GC/MS, HPLC/UV;
 organohlorni insekticidi - aldrin:
o kvalitativna analiza: bojene reakcije: Erdman reagens - ružičasto;
 bispiridinijum jedinjenja - parakvat:
o kvalitativna analiza: bojene reakcije - Na-ditionit - plavo (dikvat - zeleno);
 antikoagulantni rodenticidi - varfarin:
o kvalitativna analiza: bojene reakcije: Libermann - crveno-narandžasta boja, TLC;
o kvantitativna analiza: GC/MS, HPLC/UV.
45
51. Specifičnosti trovanja sa više hemijskih agenasa

Preuzeto iz Clarke's analysis of drugs and poisons, 4th edition.
Trovanje većim brojem supstanci je pravilo u toksikologiji odraslih. Najčešće se u pitanju kombinacije
alkohola i lekova, ili većeg broja lekova istovremeno. Kada se ovo dogodi, nije neobično da se jave
drastičnije promene u ponašanju ili veći rizik od letalnog ishoda, nego kada je u pitanju trovanje jednom
supstancom. U najvećem broju slučajeva, neto efekat upotrebe većeg broja supstanci jednak je zbiru
njihovih pojedinačnih efekata (kada govorimo o psihoaktivnom delovanju), što uglavnom rezultira
depresijom centralnog nervnog sistema.
 sinergistički efekat alkohola i heroina snižava fatalnu dozu heroina, upotreba alkohola i kanabisa
pojačavamsedativne efekte na CNS, dok interakcije alkohola i kokaina nisu primećene.
Nekada kombinacije supstanci dovode do većeg od očekivanog efekta, za šta uzrok može biti inhibicija
enzima koji metaboliše jednu od supstanci (što rezultira nagomilavanjem u tkivu) ili neka druga
farmakokinetička ili farmakodinamička interakcija.
 dobro je poznato da upotreba inhibitora MAO (npr. moklobemid) sa supstancom koja inhibira
preuzimanje serotonina, može dovesti do potencijalno fatalnog serotoninskog sindroma;
 inhibitori CYP 450 usporavaju metabolizam većine supstanci, što je slučaj sa npr. SSRI i
antigljivičnim (ketokonazol) ili antiretrovirusnim lekovima (aciklovir);
 u slučaju kombinacije fenobarbitona i kokaina, indukcija enzima dovodi do povećanja toksičnosti,
tako što fenobarbiton pojačava aktivnost enzima CYP 450 familije, zaduženih za metabolizam
kokaina N-oksidativnom bioaktivacijom i N-demetilacijom, što dovodi do nastanka
hepatotoksičnih metabolita.
46

Kliničko-Toksikološke Analize - Skripta

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Kliničko-Toksikološke Analize - Skripta

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

2. Centri za kontrolu trovanja

3. Akutna trovanja odraslih

4. Akutna trovanja dece

5. Organizacija kliničko/sudsko-toksikološke laboratorije

Organizacija kliničko-toksikološke službe u Srbiji:

6. Program rada kliničko/sudsko-toksikološke laboratorije

Nivo Obim poslova Druge aktivnosti

Nivo Osoblje Oprema Kapacitet (slučajevi/godišnje)

7. Dokumentacija u kliničko/sudsko-toksikološkoj laboratoriji

8. Uzorci za kliničko-toksikološku analizu

Važno je poznavati raspodelu supstanci eritrociti:plazma (serum)!

Urin: lekovi i metaboliti, lako isparljivi otrovi.

Uzorci za kliničko-toksikološku analizu:

9. Uzorci za sudsko-toksikološku analizu

Lekovi i drugi sumnjivi materijali nađeni pored tela:

10. Stabilnost uzoraka za kliničko/sudsko-toksikološku analizu

Faktori koji utiču na kvalitet uzorka:

11. Priprema uzoraka za kliničko/sudsko-toksikološku analizu

Ciljevi pripreme biološkog materijala:

Uticaj karakteristika otrova na izbor metode pripreme:

“Minimalni set” analitičkih podataka - baza podataka o otrovima/lekovima:

Destilacija, dijaliza i mikrodifuzija

Pretpripremna faza obuhvata:

Tečno-tečna ekstrakcija (LLE)

Tipovi tečno-tečne ekstrakcije:

Optimizacija postupka ekstrakcije:

Tečno-čvrsta ekstrakcija (SPE)

SPE ekstrakcija - faze izvođenja: Uobičajena SPE procedura:

Poređenje LLE i SPE

QuEChERS metoda pripreme uzoraka

Prednosti automatizacije pripreme uzoraka:

12. Ekstrakcija u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

Prvobitna Stasova metoda - istraživanje alkaloida:

13. Priprema uzorka krvi

Priprema uzorka krvi (seruma/plazme) za HPLC - generalno

14. Priprema uzorka urina

15. Priprema uzorka želudačnog sadržaja

16. Priprema uzoraka salive i kose

17. Priprema uzorka lešnog materijala

18. Skrining analiza

 kvalitativni nivo - direktni testovi, postupci izolovanja i identifikacije; nekada je to zadovoljavajući

Pristupi sveobuhvatnom skriningu:

19. Primarni skrining

20. Direktni testovi u skrining analizi

21. Značaj hromatografskih metoda u skrining analizi

22. Analitičke metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj praksi

 međuprodukti fizioloških biohemijskih procesa koji su kompromitovani dejstvom toksičnog

ADME - izbor uzorka:

23. Kolor testovi u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

Dve važne preporuke su:

24. Spektrofotometrijske metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

25. Imunohemijske metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

RIA - Radio immunoassay

ELISA Generalni princip heterogenih imunoeseja

EMIT - Enzyme mediated immunoassay technique

26. Hromatografske metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

27. Gasna hromatografija u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

28. Tečna hromatografija u kliničko/sudsko-toksikološkim analizama

29. Tumačenje rezultata u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi

30. Najznačajniji otrovi sa aspekta kliničke toksikologije

31. Najznačajniji otrovi sa aspekta sudske toksikologije

32. Najznačajniji uzročnici hemijskih udesa