Professional Documents
Culture Documents
化 學 工 程 學 系
碩士學位論文
胜 鏈中脂肪支鏈胺基酸的疏水表現
之探討
Study of the hydrophobic behavior of the aliphatic
指導教授:阮 若 屈 博士
研 究 生:李碧芬
中華民國九十一年六月
摘要
本研究分成兩個部分來探討。首先利用含脂肪支鏈胺基酸的短
鏈胜 鏈,於不同的疏水基材上,用以探討短鏈胜 鏈的吸附機制為
何。第二部分利用疏水性作用層析的方式,來計算胺基酸的親疏水值。
(GLLG) , 於 疏 水 基 材 ( Octyl-Sepharose ) 中 , 實 驗 結 果 發 現
Gly-Ala-Ale-Gly 先 被 沖 提 出 來 , 接 著 是 Gly-Vle-Vle-Gly 和
Gly-Ile-Ile-Gly,最後被沖提出來的是 Gly-Leu-Leu-Gly。我們藉此推
利用兩相分配時,所得的結果不大一致;我們發現在有機及水相分配
此外,流動相的組成和固定相的表面性質,皆會影響疏水性作用
層析時所得的滯留因子。因此我們的研究是,利用改變固定相中疏水
鏈長、疏水密度和在流動相中改變鹽濃度,視其對疏水性作用層析的
影響。我們發現隨疏水基鏈長、疏水基密度和鹽濃度的增加,滯留因
I
利用疏水性作用層析的方式,來計算胺基酸的親疏水值是可行的。
熵和焓值,我們發現隨著胜 鏈疏水區域的增加,吸附的熵和焓值隨
附焓為主要的驅動力。另外,表面去水合也有可能是吸附時的吸附機
制之一;然而我們的結果顯示隨著胜 鏈疏水區域的增加,吸附的熵
值越來越負,吸附的焓值越來越負。因此可以推論在吸附過程中,隨
著胜 鏈疏水區域的增加,胜 鏈與疏水基材之間的直接作用力,扮
演著極重要的角色。
II
Abstract
This thesis comprises two parts. The first part studies the adsorption
mechanism of small peptides which contain hydrophobic amino acids of
aliphatic side chain on various hydrophobic adsorbents . The second part
studies the possibility to use hydrophobic interaction chromatography to
determine the hydrophobicity of amino acids
III
negative as the peptide hydrophobicity increased. These results suggested
that the direct interaction between the peptides and the ligands played a
much more important role during the adsorption as the hydrophobicity of
the peptides increased .
IV
總目錄
㆗文摘要---------------------------------------------------------- Ⅰ
英文摘要---------------------------------------------------------- Ⅲ
總目錄------------------------------------------------------------- Ⅴ
圖目錄------------------------------------------------------------- Ⅷ
表目錄------------------------------------------------------------- Ⅹ
Ⅰ
第㆒章 緒論------------------------------------------------------ 1
1.1 研究動機----------------------------------------------------- 1
1.2 研究目的----------------------------------------------------- 2
第㆓章 基本原理與文獻回------------------------------------ 4
2.1 疏水性作用層析--------------------------------------------- 4
2.2 疏水性吸附機制的探討-------------------------------------- 7
2.2.1 Solvophobic theory --------------------------------- 7
2.2.2 preferential interaction model-------------------- 9
2.2.3 利用△H0 、△S 0 探討吸附機制------------------ 12
2.3 疏水性大小之測量方式------------------------------------- 16
2.3.1 利用㆓水相系統測定親疏水性---------------------- 16
2.3.2 利用疏水性層析測定親疏水性---------------------- 20
2.4 影響疏水性層析測量疏水性大小的因子---------------- 21
2.4.1 pH 值的影響------------------------------------------ 22
2.4.2 溫度的影響-------------------------------------------- 23
2.4.3 鹽濃度的影響----------------------------------------- 25
2.4.4 鏈長的影響-------------------------------------------- 27
V
2.4.5 疏水基密度的影響----------------------------------- 29
第㆔章探討方法-------------------------------------------------- 31
3.1 滯留因子之測量---------------------------------------------- 31
3.2 以改變鹽濃度探討疏水吸附主要作用力------------------ 31
3.3 溫度變化與熱力學參數的關係----------------------------- 33
3.4 以熱力學參數討論吸附機制-------------------------------- 34
3.5 計算 peptide ㆗各胺基酸對疏水性之貢獻----------------- 35
第㆕章 實驗設備、藥品、方法------------------------------- 36
VI
5.3 影響疏水性層析測量疏水性之因素------------------------ 54
5.3.1 鏈長對吸附性質的影響----------------------------- 54
5.3.2 結合密度對吸附性質的影響----------------------- 56
5.3.3 基材㆖羧基( COO- )對吸附性質的影響----------- 57
5.3.4 鹽濃度對吸附性質的影響----------------------------- 58
5.3.4 溫度對吸附性質的影響-------------------------------- 59
第六章 結論與建議--------------------------------------------- 61
附錄---------------------------------------------------------------- 63
參考文獻---------------------------------------------------------- 68
VII
圖目錄
圖 2.1 疏水性作用層析示意圖------------------------------------ 6
圖 2.2 操作條件:不同濃度的硫酸銨㆘,於基材(1,4-butanediol
diglycidyl ether 的 Sepharose)㆖,均㆒的去氧核糖核酸
uracily(poly U)於不同的鹼基個數㆘,與 logk’的關係
圖------------------------------------------------------------------- 9
圖 2.4 在㆔種不同的疏水管柱㆗,Sepharose(●)、SynChropak
propyl(□) 、TSK-GEL butyl-NPR(△)隨著側鏈的
含碳量不同,其∆H0 和∆S0---------------------------------- 14
圖 2.5 Ovalbumin(pI=5.0)在各種疏水基材的滯留時間操作
條件為鹽梯度為硫酸銨 2M 到 0M 時間 30min,流速
為 1mL/min--------------------------------------------------- 22
圖 2.9 操作條件:不同濃度的硫酸銨㆘,於基材(1,4-butanediol
diglycidyl ether 的 Sepharose)㆖,均㆒的去氧核糖核酸
包括 adenine(poly A)
、thymine(poly T)
、uracily(poly
U),與 logk’的關係圖---------------------------------------- 27
VIII
圖 2.10 RNase、Myoglobin 、Transferrin 操作在不同疏水基鏈長
為(butyl-、pentyl、hexyl-、octyl-)所獲得的滯留因子(k’)
與碳鏈長減 3 的關係圖--------------------------------------- 28
圖 5.4 peptide(IGGI、GIIG、LGGL、GLLG)吸附於
Octyl-Sepharose (40μmole/ml)之自由能(25℃)-------- 51
IX
圖 5.7 吸 附 於 不 同 的 基 材 Octyl-CM-Sepharose 、
Octyl-Sepharose,其滯留因子的變化----------------------- 58
X
表目錄
表 2.2 ㆔種蛋白質的疏水表面積之比較-------------------------- 15
表 2.4 胺基酸的疏水性強弱------------------------------------------- 17
表 2.8 利用疏水管柱(Phenyl-5PW、Ether-5PW),測其胺基酸
的滯留情形---------------------------------------------------- 20
表 5.5 Basiuk(1996),胺基酸的疏水性-------------------------------- 54
XI
第一章 緒論
1.1 研究動機
1
1.2 研究目的
本研究探討含脂肪支鏈胺基酸之 peptide,進行疏水性吸附時,
其吸附的主要驅動力為何?此外想了解帶不同脂肪支鏈胺基酸,對於
peptide 的疏水表現為何?同時比較胺基酸在 peptide 中排列位置不同
peptide 的疏水表現又有何差異?並且探討 peptide 中各胺基酸對疏水
性的貢獻。而影響疏水性吸附的因素有很多,我們就疏水官能基的種
類、疏水基的密度、鹽濃度和溫度,來探討在改變部分的實驗條件下,
對於 peptide 疏水性大小的排列順序,會有何影響?因此我們探討的
主題包括:
1. 探討疏水吸附的吸附機制之影響
利用鹽濃度的改變【2-3M 的(NH4)2SO4】和溫度的改變
【10-35o C】,藉由 preferential interaction model 和 solvophobic theory
及 enthalpy、entropy 的變化,來探討 peptide 進行疏水吸附時的主要
吸附機制。
2. peptide 中各胺基酸對疏水性貢獻之量測
2
3. 影響疏水性層析測量疏水性的因素
我們就基材其疏水基鏈長的不同、疏水基結合密度的不同、疏水
基上有無羧基、鹽濃度和溫度來討論,首先利用 CM-Sepharoe 接上
Octyl-,Decyl-來探討鏈長短對吸附的影響,第二在 CM-Sepharose 上
接上不同密度的 Octyl-來探討疏水基密度後對吸附的影響,第三以相
同結合密度的市售基材(Octyl-Sepharose)和自行合成的疏水基材
(Octyl-CM-Sepharose),對其疏水吸附的情形作比較,最後使用相同
的疏水基材(Octyl-CM-Sepharose),並且改變鹽濃度(2-3M 硫酸銨)和
溫度(10-35 o C),對於疏水性吸附的影響。
3
第二章 基本原理與文獻回顧
早期操作親和性層析時,往往會因為基材上的官能基產生疏
水性作用力,而造成非特定的吸附,使得疏水性作用力在親和性
層析的操作中,成為一項棘手的問題。Hoftee 及 Shaltiel( 1972)
觀察出許多生物特定吸附劑,當進行分離程序時,發現許多蛋白
質會吸附在吸附劑上疏水的部位,像是長的延伸臂上。因此而形
成非特定的吸附,使吸附劑的專一性受到影響。然而疏水作用的
存在並非完全有害,在一些親和純化的程序中,有疏水作用的存
在,反而使得其它的蛋白質被純化出來。而 Shaltiel 早已看出疏
水作用層析的潛在價值,於是發展一系列的研究,也因此疏水作
用層析開始被廣泛利用。而疏水性作用層析的原理,乃是利用基
材上的疏水官能基與蛋白質中疏水的區域以疏水作用力吸附,而
以改變沖提液組成而達到脫附的效果。
要了瞭解疏水性官能基與蛋白質間的作用原理,必須先瞭解
蛋白質分子本身親水及疏水的交互作用。雖然蛋白質分子間有非
常大的差異性,但是若在親水性的環境下,它的形態大致上都是
像球狀的大分子,而且它的中心是一個疏水性的區間,使整個系
統的自由能最小化。而蛋白質本身亦具有一些親水性的官能基,
相反地,它們存在於蛋白質的外表面,包圍了疏水性的部份。
4
疏水性作用力的定義是非極性物質與極性環境之間的排斥
作用,若將兩種或更多的疏水物質置入如水的極性環境中,它們
會自然的形成一聚集 (aggregation) ,原因是疏水性交互作用的影
響。一般運用增加鹽離子的強度可使疏水作用力提升,如陽離子
與陰離子強度的增加,例如
各類陰離子對疏水性作用力的大小順序是: (Queiroz,2001)
各類陽離子對疏水性作用力的大小順序是:
我們研究疏水性作用層析主要的目的是運用它來分離具疏水
性之蛋白質。因此蛋白質本身的構造特性與疏水性作用力是息息
相關的。每一種蛋白質都有一定的疏水度,而蛋白質的疏水度與
其一連串的胺基酸序列有關,亦與蛋白質的三級結構或四級結構
有關。
5
蛋白質
圖 2.1 疏水性作用層析示意圖
疏水作用層析之優點如下:
( 1)其流動相為水相,生化分子不易失活。
( 2)疏水作用層析管柱之選擇性多、可變性大。
( 3)分子與固定相間的親和力,可藉由調整流動相之離子強
度而輕易改變。
疏水性層析的操作方式是在高鹽濃度下進行吸附,而在低鹽
濃度下進行脫附。一般操作蛋白質分離應用到疏水性層析上的方
法是以鹽梯度下降的方式來達成。
在疏水性層析的操作中,造成蛋白質與疏水性基材吸附的因
素有很多,包括凡得瓦力、靜電作用力、氫鍵、去除表面水分子
的作用力等,在疏水性吸附時,可能造成的吸附作用力。近年來
6
有許多學者探討疏水性吸附時,可能的吸附機制、吸附行為。也
提出了一些理論,來探討其吸附時主要的驅動力;這裡介紹
2.2 疏水性吸 附機 制 的 探 討
影響疏水性作用層析的因素有很多,包括基材的疏水表面吸附位
置、蛋白質的構形、鹽的種類等,都會影響熱力學中的平衡係數。當
排除其他因素,只就疏水表面吸附位置和鹽類不同探討時,△G0 的
表示如下
K 是指平衡常數, G0 h ϕ是指疏水吸附,促使自由能改變的作用
力,R 是指氣體常數,T 是指溫度,由 Vailaya et al.(1996)推導
k’ = ϕK (2)
k’ 是指滯留因子, ϕ 是指體積比,因疏水吸附造成自由能的改
變的因素,包括有靜電作用力、基材與基材的疏水基之間的作用力、
凡得瓦作用力等作用力,所以△G0 h ϕ的表示如下
△G0 hϕ=△G0 es +△G0 assoc +△G0 vdw +△G0 red + NAV(γSAS-γM AM)+ RTln
7
(RT/P0V) (3)
γ =γ 0 + σSmS (4)
簡化(3)式得
△G0 aq 是指包括所有的作用力造成的自由能的改變,但不包括受鹽濃
度影響的疏水作用力。由(1)
(2)(5)可得
logk’= A+CmS
≈ -(△G0 h ϕ /2.3RT)
8
核酸之間的表面積〈△A’〉和鹽的莫耳表面張力(σS)有關;但是我們
使用的鹽類皆相同,所以與莫耳表面張力(σS)無關。因此 C 只與固定
相及流動相分子的表面積〈△A’〉有關,如圖 2.2。
影響疏水作用力的因素有很多,若只探討蛋白質分佈於溶劑與不
同溶質間作用時的影響,所以 preferential interaction coefficient 表示如
下
∂m
Γ32m ≡ 3
∂m 2 T ⋅ µ1 ⋅ µ 2
9
Γ是指 preferential interaction coefficient, mi 是指莫耳濃度。 m 的下
m3
Γ32m = v 3 − v1
m1
其中 v3 是指每莫耳蛋白質,其蛋白質附近溶質的多寡;v1 每莫耳蛋
白質,其蛋白質附近溶劑的多寡;另外考慮離子的作用,因此又可表
示為
nm3
Γ+m, 2 + Γ−m, 2 = (v + + v − ) − v
m1 1
pP + sS ⇔ cC
m
ln K obs = c ln( mC ) − p ln( mP ) − s ln( m S )
微分後可得
∂ ln( K OBS )
SK OBS ≡ ( ) ( ) (
= c Γ+m,C + Γ−m,C − p Γ+m,P + Γ−m, P − s Γ+m,S + Γ−m, S )
∂ ln( a ± ) T .P . EQ
在這裡 a ± 是指離子強度,其和鹽濃度的關係式如下
( ) 1
a ± = n+n + n −n− γ ± m3
n
10
γ ± 是指離子強度係數、 n + 和 n − 是指每單位鹽陽離子和陰離子的個
數、 n 是指單位所有陰離子和陽離子的總合。假設其不受 protein 存
在的多寡及排除溶質的多寡所影響。上式可得
∂ ln( K OBS )
= (∆v+ + ∆v− ) −
nm3
SK OBS ≡ ∆v1
∂ ln( a ± ) T , P , EQ m1
∆v1 : 產物與反應物的莫耳化學當量數。且在疏水性層析中、可以推知
因此上式又可表示為
∂ ln( k ′)
=
(∆v + + ∆v− ) − n ⋅ ∆v1 m
∂ ln( m3 ) T , P , EQ m1 ⋅ g
3
g
∂ ln m3
在這裡 g = 若 ∆v + 、 ∆v − 及 g 非 m3 的函數時。
∂ ln a ± T , P
此時Vi = bi ⋅ m3
Perkins (1997)等人,利用在疏水性層析中,使用兩種蛋白質分別
為 hen egg white lysozyme 和 ovalbumin,操作在五種疏水管柱中,測
定其滯留因子。
− n∆v1 ∆v + ∆v−
的作圖,取其斜率為 ,截距為 + ,因此斜率與疏水吸附
m1 ⋅ g g
11
時的去除水分子數目多寡有關。截距為吸附的離子有關,但其似乎與
蛋白質的疏水度無關。發現蛋白質的吸附情形主要的趨動力為去除吸
附的水分子。如表 2.1
( Perkins et al1997 )
2.2.3 利 用 △ H 0 、 △ S 0 探 討 吸 附 機 制
12
子或是離子的重新排列也可說是再水合,在這個階段時,其 enthalpy
是下降的,另外 entropy 亦是下降的。
第一和第二階段蛋白質以及吸附劑外
層的去水合
△ H(+)
△ S(+)
第三階段蛋白質與吸附劑間的吸
附
△ H(-)
△ S(-)
最後一個階段是吸附完成後水分子
的再水合
△ H(-)
△ S(-)
13
由吸附時的焓熵值變化,配合以上機制,我們可以推測疏水吸
附的推動力。例如 Haidacher et al(1996)利用不同脂肪支鏈的 dansyl
衍生物胺基酸,在三種不同的疏水性層析(Seherogel 、SynChropak
propyl 、TSK-GEL butyl-NPR),操作溫度在 5-50 ,利用 van’t Hoff
14
F.-Y. Lin et al.(2001),利用 Isothermal titration calorimetry
(ITC) ,直接測量三種不同疏水表面積的蛋白質(ribonucleaseA、chick
lysozyme、horse muscle myoglobin)如表 2.2,在疏水基材(Toyopearl
Butyl Sorbent)的吸附熱( △H)
。其緩衝液為 2.0M ammonium sulfate,
pH 7.0,溫度 25℃,另外再利用恆溫吸附曲線,用以推算出△G、△
S。發現隨著蛋白質的疏水度越大,則△H 越正,△S 越正,推測其
吸附機制主要為去水合。其結果如表 2.3
表 2.2 三種蛋白質的疏水表面積之比較
15
2.3 疏 水 性 大 小 之 測 量 方 式
測量蛋白質表面官能基的親疏水值的方法有很多,如疏水性
作用層析、逆相層析以及二水相系統的操作,而對於逆相層析,
它雖然具有相當的解析值,不過由於流動相要加入有機溶劑會破
壞蛋白質的立體結構,所以測出的疏水性大小並不是很客觀。
N wγ w
∆Ft = − RT ln
N orgγ org
其中 Nw 及 Norg 為胺基酸分別在水相及有機相的莫耳數;為 ãw 及
ãorg 胺基酸分別表水相及有機相中的活性係數
16
表 2.4 胺基酸的疏水性強弱
陳紹彥(1992)採用二水相系統,用以探討胺基酸、dipeptide、
tripeptide 中,對於其疏水性質的影響,而在 dipeptide、tripeptide 中,
以改變胺基酸的序列來探討。此二水相系統為 PEG/Na2SO4/H2O,視
其分布在上層的濃度與下層的濃度比,以分離係數(K)來描述,以
決定其疏水大小。
上相生化物質的濃度 C t
K= =
下相生化物質的濃度 C b
Gly-Gly-Phe>Gly-Gly-Ala>Gly-Gly-Gly;
Phe-Gly-Gly>Ala-Gly-Gly>Gly-Gly-Gly;
Tyr-Tyr-Tyr>Tyr-Tyr-Leu>Tyr-Tyr-Phe
17
都是 tripeptide 中有 Phe 者大於 Ala 大於 Gly,此與 dipeptide 的結果
相同;而有 Tyr 者大於 Leu 大於 Phe,此符合胺基酸的實驗結果。可
見胺基酸在 peptide 中的影響行為有其一致性。且 K 值 Tyr-Tyr-Tyr>
Tyr-Tyr>Tyr,Gly-Gly-Gly>Gly-Gly>Gly,此種順序將是胺基酸中
R 基的性質而定。一般而言疏水性的胺基酸相接將使其更疏水性
18
表 2.6 PEG/Na2 SO4 /H2O 系統中,dipeptide 的 K 值
19
2.3.2 利 用 疏 水 性 層 析 測 定 親 疏 水 性
表 2.8 利用疏水管柱(Phenyl-5PW、Ether-5PW),測其胺基酸的滯留情形
20
2.4 影 響 疏 水 性 層 析 測 量 疏 水 性 大 小 的 因 子
在疏水性層析的操作中,影響物質的滯留性質的因素大致上
可以由兩方面來探討。就流動相(mobile phase)而言,影響的因
素有鹽的種類、疏水基的鏈長、鹽的濃度、pH 值。就固定相
(stationary phase)而言,影響的因素有疏水基的種類、疏水基的
密度以及疏水基的鏈長。
2.4.1 pH 值 的 影 響
Schmuck19 等學者探討在疏水性作用層析中,改變沖提 液的
pH 值對蛋白質 ovalbumin、 lysozyme 在六種不同疏水基的疏水基
材 SynChropak hydroxypropyl、 methyl、propyl、butyl、pentyl 和
benzyl 滯留時間的探討。
在不同 pH 值的操作條件下,可以發現到當沖提液的 pH 值接
近蛋白質的 pI 值時,蛋白質表面會變的較疏水,這個現象也可以
由圖 2.5、 2.6 看出來。如 ovalbumin 的 pI 值為 4.7, lysozyme 的
pI 值為 10.0。圖 2.5 當沖提液 pH 為 5.0 時,ovalbumin 的滯留時
間在大部分的疏水基材會較高。圖 2.6 滯留時間便隨著 pH 值的增
高而增加。
21
hydroxypropyl
methyl
propyl
butyl
pentyl
40
benzyl
retention time(min)
30
20
10
0
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
pH
50
40
30
retention time(min)
20
10
0
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
pH
圖 2.6 Lysozyme(pI=10.0)在各種疏水基材的滯留時間操作條件
為 鹽 梯 度 為 硫 酸 銨 2M 到 0M 時 間 30min , 流 速 為
1mL/min。
22
2.4.2 溫 度 的 影 響
( ◆) Leu;(╳ )ã-Abu;( ♁)
23
管柱 A B C
Bian et al.(1998)實驗發現,蛋白質在不同的溫度區間有不
同的焓熵值,在低溫區時(21∼50℃)其△H 0 偏向正值,而在高
溫區(60∼ 80℃)可能因構形改變所以有些蛋白質偏向正值有些
卻相反。而在△S 0 方面,其值都偏向正值。且發現小分子苯甲醇
和氯化芐的熱行為與蛋白質正好相反。而 Haidacher et al.(1996)
利用 dansyl amino acid 作層析實驗發現△H 0 隨溫度的升高而越偏
向負值。 △S 0 也是有相同的現象,隨溫度的升高而越偏向負值。
24
1.色素細胞 C
2.牛 血 清 蛋 白
3.溶 菌
4.á -澱粉
5.胰 島 素
6.苯 甲醇
7.氯 化芐
2.4.3 鹽 濃 度 的 影 響
在疏水作用層析中,鹽的種類對蛋白質的疏水性質有非常重
要的影響。 Rippel et al. ( 1994)等人利用 Alkyl-Superose為管柱操
作 快 速 蛋 白 質 液 相 層 析 (fast protein liquid chromatography ;
FPLC)。在三種鹽類硫酸銨、醋酸銨及檸檬酸鈉的作用下,比較
五種不同的蛋白質α-chymotrypsinogen A(CHY)、lysozyme(LYS)、
ovalbumin(OVA)、 ribonuclease(RNA)和 cytochrome C(CYT)之滯留
性質。通常來說,當鹽類的濃度愈高疏水性強度愈高,而鹽類種
類不同其疏水強度也不同。
25
表 2.9 在不同的沖提液下蛋白質的滯留因子 (k’)( Rippel et al.,1994)
Gradient tG K’
Former (min) CHY LYS OVA RNA CYT
Ammonium 10 0.891 0.677 0.469 0.384 0.004
sulfate 15 1.108 0.869 0.656 0.448 0.005
(2M∼0M) 20 1.305 1.110 0.768 0.532 0.007
25 1.518 1.240 0.895 0.576 0.009
Sodium 10 0.727 0.647 0.544 0.552 0.207
citrate 15 0.968 0.943 0.834 0.811 0.305
(2M∼0M) 20 1.270 1.233 1.083 1.068 0.389
25 1.554 1.555 1.324 1.304 0.503
Sodium 10 1.038 0.615 0.274 0.109 0.064
acetate 15 1.417 0.847 0.380 0.148 0.073
(5M∼0M) 20 1.699 1.069 0.463 0.195 0.092
25 1.978 1.230 0.542 0.230 0.106
t G為鹽梯度時間
由表 2.9 可以發現當所使用的鹽離子強度越高時,蛋白質的
滯留因子都會隨之增加。不過當操作的鹽種類不同時,它對個別
的蛋白質的滯留性質的影響也不盡相同。如醋酸鈉相較於硫酸胺
而言,對於疏水性較強的蛋白質如α-chymotrypsinogen A 滯留因
子就有很明顯的增加。但是對於較親水的蛋白質如 cytochrome C
滯 留 因 子 增 加 的 幅 度 較 少 。 而 就 檸 檬 酸 鈉 而 言 ,
α-chymotrypsinogen A的滯留因子增加較少,但 cytochrome C 的
滯留因子卻是增加許多。
26
濃度,測其滯留時間。並且利用 solvophobic theory 所推導的 logk’=
A+Cms ,發現在較高鹽濃度時(>1.0M),去氧核糖核酸的 logk’與
鹽濃度呈線性關係,如圖 2.9
2.4.4 鏈 長 的 影 響
楊晏銘(1999)利用自行合成的基材進行疏水性層析,基材的疏水
基為(butyl-、pentyl、hexyl-、octyl-)。探討不同鏈長的疏水基,探討
蛋白質(RNase、Myoglobin 、Transferrin)的滯留情形。發現蛋白質
於不同鏈長下的吸附作用力大小,為隨鏈長的增加基材與蛋白質的疏
水吸附力亦增加。
27
圖 2.10 RNase、Myoglobin 、 Transferrin 操作在不同疏水基鏈長為(butyl- 、
28
圖 2.11 蛋白質 â-lactoglobulin(BLG),於 0.2 g/L 的 copolymer,其緩衝液
為 pH=6.3、離子強度=0.05M 磷酸鈉,進行恆溫吸附。
(■) Methyl,
(●)ethyl(▲)butyl,(◆)hexyl,(▼)octyl,(♁)dodecyl
2.4.5 疏 水 基 密 度 的 影 響
Burton et al.(1997)等學者利用自行合成三種不同的接合密
度的基材 MBA( 4-Mercaptobutyric acid)Perloza,在這些基材上
進行疏水性作用層析的操作,探討蛋白質 chymosin 在這些基材的
滯留性質。由圖 2.12 可以得知當基材的接合密度為 65µmol/mL
能完全滯留。
29
圖 2.12 蛋白質 chymosin在疏水基材 MBA Perloza 的滯留情形。圖 (I) (II) (III)
30
第三章 探討方法
3.1 滯 留 因 子 之 測 量
Vailaya et al.(1996)探討疏水性作用層析的熱力學性質時,提
(t R − t m )
出了下列滯留因子了關係式:k ' = 。滯留因子 k’
(retention factor)
tm
代表溶質在固定相的滯留能力。其中 tR 為溶質通過管柱的滯留時間
(retention time)
,tm 為流動相(不滯留物)通過管柱所需的時間。而
將其化簡,可得下式(3-1)
。ts 為溶質在固定相(stationary phase)的
滯留時間。而 ns 以及 nm 分別代表溶質在固定相以及流動相(mobile
phase)的莫耳數。
(t R − t m ) tS n
k '= = = S (3-1)
tm t m nm
3.2 以改變鹽濃度探討疏水吸附主要作用力
S = △A’ σS/2.3RT
其中,△G0 h ϕ是指疏水吸附時,促使自由能的改變的作用力;包
31
括凡得瓦引力、靜電吸引力等作用力。
所以 S 主要受鹽的莫耳表面張力影響,lnkw 主要受凡得瓦作用力
或靜電作用力等直接作用力的影響。
( ∆b + + ∆b− ) n∆ν1
ln k ' = c + − ⋅m ,
g m1 g 3
其中 g =
∂ ln m3
、a± (
= n +n n −n −
+
)
1/ n
γ ± m 3 、ν ι = bι ⋅ m 3
∂ ln a ± TP
如果隨著胺基酸脂肪支鏈的不同,lnkw 改變不大,主要改變在 S,
則表示與疏水表面排列可去水的數目有關,也與從疏水表面去除水分
子的難易程度有關,反之若 S 改變不大,主要改變在 lnkw,則表示主
要受凡得瓦作用力的影響。
32
3.3 溫 度 變 化 與 熱 力 學 參 數 的 關 係
M+ L → ML ( 3-2)
ML
Keq = ( 3-3)
M ⋅L
nS 1
K eq = ⋅ (3-4)
nm L
nS
由之前式 1:k ' = ,將式( 3-1)與式(3-4)合併可得到(3-5)
nm
33
接下來由 Vailaya et al.(1996)在熱力學性質中推導自由能可以表
示為式(3-6)
∆G 0 = − RT ln Keq (3-6)
其中 R 為氣體平衡常數,T 為管柱溫度(K)
。而自由能亦可以
表示成式(3-7)
∆ G 0 = ∆ H 0 − T∆ S 0 (3-7)
∆H 0 ∆S 0
ln Keq = − + (3-8)
RT R
再將式(3-5)中的 K 代入式(3-8)中
∆H 0 ∆S 0
ln k ' = − + + ln L (3-9)
RT R
藉著操作在疏水性作用層析管柱中,所獲得胺基酸以及 peptides
的滯留因子 k’,再與所操作的溫度作圖,即可求得△H0 以及△S0。
如果我們得知△H 0 和△S0 的值和 Lin(2000)等人所提出的吸
附機制理論,可以推測 peptide 在疏水吸附時的吸附機制為何
34
3.4 以熱力學參數討論吸附機制
35
第四章 實驗設備、藥品、方法
4.1 實 驗 藥 品
4.1.1 吸 附 劑 合 成 方 面
4.1.2 層 析 操 作 方 面
36
10. 鹽酸( HCl): 37% , R.G., R.D.H., Germany
11. 氫氧化鈉( NaOH): R.G., R.D.H., Germany
pH stability 6-12
long term 3-12
cleaning-in-place 2-14
Chemical stability All commonly used aqueous buffers , 1.0M acetic acid , 1.0M NaOH ,
8M urea , 8M guanidine hydrochloride , ethanol , methanol etc.
Physical stability Negligible volume variation due to changes in pH or ionic strength
Autoclavable In 0.1M sodium acetate at 121℃ for 30.min
37
表 4.2 Octyl Sepharose CL-4B 之性質
Ligand density 40µ mole/ml drained
Available capacity* HSA ( MW 68 000) 1 5-20 mg/ml drained gel
4.2 實 驗 設 備
4.2.1 一 般 設 備
38
4. 桌上型微量離心機︰ Labofuge 400, Heraeus, Germany, 台灣默
克代理 ,台灣桃園
4.2.2 高 效 液 相 層 析
39
4. 自動注射器: Spark , Holland,建宏層析股份有限公司代理 ,台灣
台北
4.3 實 驗 方 法
a. 膠 體 的 洗 滌 :
2. 加入同體積的去離子水至離心管中,以試管振盪混合器振盪均
勻,再置入旋轉培養基中旋轉 30分鐘,取出後放入離心機中,
以 4000 rpm離心 3分鐘,取出倒除上層液,再加入去離子水重
覆以上步驟 5次。
3. 再將膠體的體積調整到 30 mL(膠體的體積之計算,以離心積
離心 4000rpm、 3分鐘為基準),利用 THF ( tetrahydrofuran)將
30 mL的膠體充分洗滌重複數次達到成為完全有機相後,洗入
250 mL的錐形瓶。
4. 待膠體於 250 mL的錐形瓶中自然沉降後,將上層液去除。
b. 胺 基 辛 烷 溶 液 的 配 製 :( n-Octylamine )
1. 取 0.1莫耳的胺基辛烷,加至燒杯中。
2. 利用 6 N HCl將胺基辛烷的 pH值調整到 7.2。
40
c. 反 應 液 的 配 製 :
d. 反 應 條 件 :
1. 將含有 CM-Sepharose、胺基辛烷溶液及活化劑的錐形瓶,迅速
地將之放入恆溫振盪器中。
2. 調整至室溫( 25℃)、以 240rpm反應 20小時。
e. 反 應 完膠 體 的 洗 滌 :
4. 將清洗乾淨的膠體存放於冰箱中。
f. 一 次 反 應 、 二 次 反 應 及 三 次 反 應 之 吸 附 劑 之 合 成
41
1. 一次反應為上述步驟 1.1∼1.5,二次反應為一次反應完後在 1.4
步驟完後,膠體只需再有機相洗淨(溶液由棕色洗到無色),
即可在反應再重複步驟 1.1∼1.5一次。
2. 三次反應同二次反應再重複一次。
4.3.2 所 合 成 吸 附 劑 疏 水 基 合 成 量 之 測 定 方 式
1. 分別取 1 mL CM-Sepharose、一次反應吸附基材、二次反應吸
附基材、三次反應吸附基材及 d-water( Blank)放至燒杯中,
加入 4 mlL 之 1M KCl溶液( pH 2),使整個溶液在 pH 2,再以
4.3.3 層 析 實 驗 系 統
a. 高 效 液 相 層 析 ( HPLC) 管 柱 堆 積
42
2. 將上層液去除,且將膠體的體積調整至 5 mL,再利用 30 mL的
蒸餾水懸浮之。
b. 配 製 緩 衝 溶 液
配製完之後,拿到超音波振盪器中,振盪 30分鐘並同時用抽氣的
方式以去除溶液中之空氣。
c. 層 析 操 作 ( t 0 之 測 定 )
1. 不同層析管柱的基材填充完後,利用起始緩衝溶液對管柱預平
衡,注入0.1mg/mL之 G-G-G-G (溶於 20mM Tris buffer pH6+ 2.5M
(NH4 ) 2SO4的緩衝溶液中)
,而 sample loop為 50μ l,UV之吸收值在
d. 層 析 操 作 ( t′ 0 之 測 定 )
43
1. 將管柱整個移除,同樣地利用起始緩衝溶液對系統管路預平
衡,注入 0.1mg/mL之 G-G-G-G(溶於 20mM Tris buffer pH6+
e. peptide 層 析
1. 預平衡
先 利 用 起 始 2.5M(NH4 )2SO 4 的 緩 衝 溶 液 pH 6 , 以 流 速
3. 胺基酸溶液的配製
量取胺基酸少量,將之溶解於流動相起始鹽濃度的緩衝溶液
中,而最後濃度達到 0.1mg / mL。
4. 操作條件
將樣品用 50μ l 的溶液體積打入管柱中,以流速 0.4mL/min 沖
提之,而以不改變鹽濃度的條件( isocratic ),其偵測的波長皆
為 220nm,利用 CHEM-LAB 系統記錄之。
44
第五章 結果與討論
本研究主要分三大部分進行討論,第一部份探討短鏈 peptide 疏水
5.1 疏 水 吸 附 的 吸 附 機 制 之 影 響
分,peptide 疏水部份與疏水基直接接觸的作用力較不受鹽濃度影響,而
週邊水分子的作用則較受鹽濃度的影響,此外利用 enthalpy、entropy 的
變化,亦可來探討其吸附時的主要作用機制為何,因此我們利用改變鹽
濃度及改變溫度對滯留因子的影響,來推測 peptide 疏水吸附的機制。
5.1.1 改 變 鹽 濃 度 的 影 響
本實驗利用疏水性層析的方式,改變鹽的濃度,探討 peptide
(GAAG、GVVG、GIIG、GLLG)的吸附情形,操作條件為:
鹽濃度下的疏水作用力大小。如圖 5.1 所示
45
。由圖 5.1 可以知道隨著鹽濃度的增加,其 lnk’也隨之增加,而且是有
著線性的關係。
Octyl-CM-Sepharose(47.96µmole/ml),25℃
4 GAAG
GVVG
3
GIIG
GLLG
2
0
lnk'
-1
-2
-3
-4
2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
ammoniumsulfate(m)
難易程度有關,鹽濃度越高則去表面水越容易。由表一可以發現隨著胺
46
基酸脂肪支鏈的增加,lnkw 、S 都有增加的趨勢;因此可以推測隨著脂
肪支鏈的增加,影響其吸附作用力包括有疏水吸附直接作用力、吸附後
去水合的數目多寡和疏水表面去除水分子的難易程度有關。
C8(47.96) lnkw S
GAAG -4.96511 0.48163
GVVG -4.09174 0.79332
GIIG -3.23518 1.0509
GLLG -2.72724 1.17393
5.1.2 吸 附 之∆ H0 與∆ S0 值
Lin (2000)等人,認為蛋白質之吸附行為可分為五個步驟。首先
第一階段和第二階段是蛋白質疏水表面以及吸附劑周圍水分子的脫水
或者是去離子的動作,也可以稱為去水合,在這個步驟會使系統的
enthalpy 上昇、且 entropy 也會上昇。第三步驟為蛋白質與吸附劑間因凡
或是重排,因此,第四個步驟一般而言是可以忽略的。
GVVG、GIIG、GLLG)吸附時主要的驅動力。本實驗利用 peptide
47
(GAAG、GVVG、GIIG、GLLG),操作於結合密度為 48μmole/ml 的
疏水基材上【 Octyl-CM-Sepharose】,控制溫度分別為 10、15、20、25、
鏈鏈長的增加,∆H0 有減少的趨勢,表示因胺基酸脂肪支鏈鏈長的增長,
的趨勢,表示隨胺基酸脂肪支鏈鏈長的增長,其凡得瓦力吸附時,疏水
O c t y l - C M - S e p h a r o s e ( 4 7 . 9 6 µm o l e / m l ) 2 . 5 M a m m o n i u m s u l f a t e
4.5
4.0
GAAG
3.5
GVVG
3.0
GIIG
2.5
GLLG
2.0
1.5
1.0
0.5
lnk'
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
-3.5
-4.0
-4.5
0.00320 0.00325 0.00330 0.00335 0.00340 0.00345 0.00350 0.00355
1/T
48
圖 5.2 GAAG、GVVG、GIIG、GLLG 吸附在基材上【Octyl-CM-Sepharose(18.03
μmole/ml)
】,鹽濃度為 2.5M 的(NH4)2 SO4;利用溫度控制在 10、15、20、
25、30、35℃時,1/T 與 lnk’的關係圖。
5.2 peptide 中 各 胺 基 酸 對 疏 水 性 貢 獻 的 量 測
對於疏水性的量測方式有很多種,例如有機和水兩相系統、逆向層
析以及疏水性作用層析。我們利用疏水性層析的方式,來量測 peptide
中各胺基酸對疏水性貢獻的量測。為了討論脂肪支鏈胺基酸在 peptide
中的疏水表現,首先我們就脂肪支鏈胺基酸的不同,在 peptide 中的疏
5.2.1 胺 基 酸 疏 水 吸 附 的 ΔG0
49
6.0,溫度控制在 25℃,求其在疏水性層析中的滯留時間(k’),經由前
面所推導的ΔG0= -RTln(k’/L),可以求得各 peptide 的ΔG0。如圖 5.3、
5.4;我們發現隨脂肪支鏈之增加,其Δ G0 越負,由此可見胺基酸脂肪
支鏈越長,因其疏水區域越大,造成其疏水作用力就越大。由圖 5.4 可
酸有帶電基的關係,導致表面水的排列較不整齊,因 此減低了其疏水作
用力。
-1000
-2000
∆G (J/gmole)
-3000
0
-4000
-5000
-6000
50
IGGI GIIG LGGL GLLG
0
-500
-1000
-1500
-2000
∆G (J/gmole)
-2500
-3000
-3500
0
-4000
-4500
-5000
-5500
-6000
有加成性,及胺基酸在鏈首及鏈尾具有相同的ΔG0 值。為了求得在鏈首
及鏈尾 Glycine 的ΔG0 值;我們亦在上述的相同操作條件下,測量
51
表 5.3 胺基酸在 peptide 中的ΔG0
H3+N-Gly、Gly-COO - 2.831
-Gly- 0
H3+N-Ile、Ile-COO- -1.400
H3+N-Leu-、Leu-COO- -1.730
-Val- -3.114
-Ile- -4720
-Leu- -5788
探討其疏水性,而將資料轉換成莫耳自由能(∆Ft),由下式求得:
N wγ w
∆ Ft = − RT ln
N org γ org
胺基酸分別表水相及有機相中的活性係數。
以 Glycine 為基準,將其他胺基酸的ΔFt 值減去 Glycine 的ΔFt 值,
可得各胺基酸的疏水性,如表 5.4。
52
表 5.4 Bigelow value 胺基酸的疏水性
我們的結果與 Basiuk(1996)等人的相互比較結果,可得知不同的疏水性
基材所得的ΔG0 值會有所差異,但脂肪支鏈胺基酸之疏水性的順序是一
致的,皆為 Leu>Ile>Val> Ala 。由我們的結果與 Bigelow value 比
53
較,可以得知以疏水層析測得之的疏水性與使用兩相分配方式所得的結
果可能略不同。
5.3 影 響 疏 水 性 層 析 測 量 疏 水 性 之 因 素
影響疏水性層析測量疏水性的因素有很多,就流動相(mobile phase)
而言,有鹽的種類、鹽的濃度、操作溫度、溶液的 pH 值等。而就固定
相(stationary phase)而言,可分為基材上疏水官能基的種類以及疏水
官能基的結合密度。
在本實驗中,改變接合的密度以及疏水官能基的種類,以探討碳鏈
長短、結合的密度以及疏水官能基的上羧基的影響,及改變鹽濃度和溫
度,觀察其疏水作用層析的吸附情形。
5.3.1 鏈 長 對 吸 附 性 質 的 影 響
54
48μmole/ml 時,操作鹽濃度為 2.5M 的(NH4)2SO4,,溫度為 25℃,
其結果如圖 Fig7,發現 Decyl-CM-Sepharose 對於四種 peptide 的疏水作
用力皆大於 Octyl-CM-Sepharose;其原因在於 peptide 和 ligand 的疏水區
域都增加,所以其疏水作用力也增加。而 Jeff Y. Gao(1999)曾利用恆溫
最大,而大於 hexyl-的碳鏈長的疏水吸附,會隨鏈長的增加而下降,小
於 hexyl-的碳鏈長的疏水吸附,隨鏈長的增加而增加;作者推測其可能
的原因為 Methyl-、ethyl-、butyl-在水溶液中的構形為 random coil ;而
Octyl-以上則屬於 hypercoil。而我們的實驗結果顯示,基材的疏水官能
基對於四種 peptide 的疏水作用力,會隨鏈長愈長而滯留時間越長;其
55
GIIG C 8
4
GIIG C10
GLLG C 8
GLLG C10
3
k'
0
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
結 合 密 度 ( µm o l e / m l )
5.3.2 結 合 密 度 對 吸 附 性 質 的 影 響
為了探討疏水官能基的結合密度對吸附情形的影響。我們使用了四
種 peptide(GAAG、GVVG、 GIIG、GLLG),操作在三種結合密度分別
為 18、35、48μmole/ml 的疏水基材 Octyl-CM-Sepharose 上,鹽濃度為
基材的結合密度,peptide 的滯留順序,仍是跟之前的一致。
56
2.6
GAAG Octyl-CM-Sepharose
2.4
GVVG
2.2 GIIG
2.0 GLLG
1.8
1.6
1.4
k'
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0.050
結合密度(mole/L)
5.3.3 基 材 上 羧 基( COO- )對 吸 附 性 質 的 影 響
57
作用力增強,因此滯留時間增加。另外改變基材,peptide 的滯留順序,
仍是跟之前的一致。
2.8
1.8
1.6
1.4
k'
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
結 合 密 度 ( µm o l e / m l )
5.3.4 鹽 濃 度 對 吸 附 性 質 的 影 響
度在 25℃之下,進行疏水性層析,測量其滯留時間換算成滯留因子(k’),
以求各 peptide 在不同鹽濃度下的疏水作用力大小。如圖 5.8 所示,發現
隨著鹽濃度的增加,peptide 的滯留情形越顯著。可能的原因為當溶液中
的鹽分子增加,溶液中的水分子會比較容易離開基材與蛋白質的表面,
因此 peptide 與基材更容易吸附在一起。
58
另外改變鹽濃度,peptide 的滯留順序,仍是跟之前的一致。
O c t y l - C M - S e p h a r o s e ( 4 8 µm o l e / m l ) 2 . 5 M a m m o n i u m s u l f a t e
10
GAAG
GVVG
8
GIIG
GLLG
6
k'
2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
ammoniumsulfate(m)
5.3.5 溫 度 對 吸 附 性 質 的 影 響
我們試著操作在結合密度為 48μmole/mL 的疏水基材
(Octyl-CM-Sepharose)上,鹽濃度為 2.5M 的(NH4) 2SO4,控制溫度在
10-35℃之下,來進行疏水性層析,用以測量其滯留時間,再換算成滯留
幾乎不受溫度改變而改變;peptide(GLLG)的滯留情形,隨溫度增加而滯
留時間些許下降的趨勢。
另外改變溫度,peptide 的滯留順序,仍是跟之前的一致。
59
Octyl-CM-Sepharose(47.96µmole/ml)2.5M ammoniumsulfate
4.5
GAAG
4.0
GVVG
3.5 GIIG
GLLG
3.0
2.5
2.0
k'
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
280 285 290 295 300 305 310
T(K)
60
第六章 結論與建議
經驗發現,在不同鹽濃度下,藉由改變鹽濃度,發現隨著胺基酸
脂肪支鏈鏈長的增加,lnkw 、S 亦隨之增加,因此可以推測隨著脂肪
支鏈鏈長的增加,影響其吸附作用之因素包括疏水吸附的直接作用力
(凡得瓦作用力)、吸附後去水合的數目多寡及疏水表面去除水分子
的難易程度;在不同溫度條件下,隨胺基酸脂肪支鏈鏈長之增加而
ÄH0、ÄS0 值有減少的趨勢,推測隨著 peptide 的疏水區域越大,peptide
與基材之間的凡得瓦作用力越強,因此造成ΔH0、ΔS0 有降低的趨
勢。然而由改變鹽濃度、溫度,我們可以推論隨著 peptide 的疏水區
域越大,peptide 與基材之間的主要驅動力為凡得瓦作用力。
經計算結果顯示,peptide 中 Leucine 的疏水性略大於 Isoleucine,
當其位於 peptide 兩端時疏水性就比較相近,而存在於自由胺基酸形
式時兩者幾乎相同。本實驗的結果與 Nozaki 和 Tanford(1971)的結
果比較略有不同,可能是疏水層析測得之的疏水性與有機/水相系統
比較,所得的結果可能略不同。而本實驗與 Basiuk et al.(1996)比
較,發現不同的實驗條件,所得的ΔG0 會有所不同。
因此試著比較不同條件下,peptide 之疏水性的大小順序為何?發
現不管改變基材、鹽濃度、溫度,peptide 的疏水性大小順序都是一
致的。
61
建議
62
附錄
溫度℃
63
Decyl-CM- Sepharose (39.1μmole/ml) 3.0M ammoniumsulfate
溫度℃
64
Octyl- Sepharose (40μmole/ml) 2.75M ammoniumsulfate
溫度℃
65
不同基材下,不同溫度的 k’值 (定量 5.0ml)
66
不同基材下,不同鹽濃度的 k’值 (定量 5.0ml)
Decyl-CM-Sepharose (48μmole/ml),25℃
鹽濃度
Octyl-CM-Sepharose(48μmole/ml),25℃
鹽濃度
67
參考文獻
68
hydrophobicity and specific hydrophobic surface area of
pesticides determined by high-performance liquid
chromatography compared with reversed -phase thin-layer
chromatography , Journal of Chromatography A ,
771,105-109,1997
8. Diogo M.M.,Queiroz J.A.,Prazeres D.M.F.,Hydrophobic
interaction chromatography of homo -oligonucleotides on
derivatized Sepharose CL-6B Application of solvophobic
theory, Journal of Chromatography A , 944,119-128,2002
9. Gao J. Y. , Dubin P. L. ,Binding of Proteins to Copolymers of Varying
Hydrophobicity , Biopolymers, Vol. 49, 185-193,1999
10. Haidacher D. , Vailaya A. , Horvath C. , Temperature effects in
hydrophobic interaction chromatography , Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of
America,93,2290-2295,1996
11. Lin F. Y. , Chen W. Y. , Ruaan R. C. , Huang H. M. ,
Microcalorimetric studies of the interactions between proteins and
69
13. Perkins T. W. , Mak D. S. , Root T. W. ,Lightfoot E. N. , Protein
retention in hydrophobic interaction chromatography : modeling
variation with buffer ionic strength and column hydrophobicity ,
Journal of Chromatography A , 766,1-14,1997
14. Queiroz J. A. , Tomaz C. T. , Cabral J. M. S. , Hydrophobic
interaction chromatography of proteins , Journal of Biotechnology ,
87,143-159,2001
15. Rippel G. Szepesy L. , Hydrophobic interaction chromatography of
proteins on an Alkyl-Superose column , Journal of
Chromatography A , 664,27-32,1994
16. Rippel G. , Bede A. Szepesy L. , Systematic method development in
hydrophobic interaction chromatography I. Characterization of the
phase system and modeling retention , Journal of Chromatography A,
697,17-29,1995
17. Szepesy L. , Horvath C. ,Specific salt effects in hydrophobic
interaction chromatography of proteins , Chromatographia ,
26,13-18,1988
18. Szikszay Z. , Forgacs E. , Study of peptide-protein interaction by
High-performance liquid chromatography. Effect of hydrophobic
and steric parameters. , Biochemistry and Molecular Biology
International , 42,677-684,1997
19. Szepesy L. , Rippel G. , Effect of the characteristics of the phase
system on the retention of proteins in hydrophobic interaction
chromatography , Journal of Chromatography A, 668,337-344,1994
20. Shen Y. , Shao X., O’Neill K., Reversed-phase liquid
chromatography of proteins and peptides using multimodal
70
copolymer-encapsulated silica , Journal of Chromatography A,
866,1-14,2000
21. Yi-Shiun Tasi., Fu-Yung Lin., Wen-Yih Chen., Isothermal titration
microcalorimetric studies of the effect of salt concentration in the
interaction between proteins and hydrophobic adsorbents, Colloids
and surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects,
197,111-118,2002
22. Yosuke Yamasaki., Kanae Uchida., Hiroshi Tomizawa., Separation of
amino acids and peptides by high performance hydrophobic
interaction chromatography, J. Liq. Chrom. & Rel.
Technol. ,22(13),1965-1974,1999
20. 陳柏勳(民國八十七年),”疏水鏈長短與密度對蛋白質在疏
水作用層析的影響”,碩士論文,私立中原大學化學工程研究
所。
,”疏水鏈長短與密度對蛋白質與胺基
21.楊晏銘(民國八十八年)
酸在層析管柱滯留性質的影響”,碩士論文,私立中原大學化學
工程研究所。
,”含陰離子之疏水性吸附劑在疏水性
22.楊國華(民國八十七年)
蛋白質置換層析的應用”,碩士論文,私立中原大學化學工程研
究所。
23 賴敏達(民國八十五年)
,”離子性暨疏水雙功能吸附基材在蛋
白質層析分離之應用” ,碩士論文,私立中原大學化學工程研
71
究所。
24 林柏勳(民國九十年)
,”胜 鏈疏水性質之熱力學探討”,碩士
論文,私立中原大學化學工程研究所。
72