‫‪Dept.

of Chemical Engineering‬‬ ‫המחלקה להנדסת כימיה‬

‫‪and Biotechnology‬‬ ‫וביוטכנולוגיה‬

‫דוח מעבדה בביוכימיה‬

‫מעבדה מספר ‪ – 15‬ניקוי החלבונים על עמודת כרומטוגרפיה‬

‫מגישים‪:‬‬
‫ראונק קבהא‪ -‬ת"ז‪206774044 :‬‬
‫בושרא עבאהרה‪ -‬ת"ז‪208300517 :‬‬

‫תאריך ביצוע הניסוי‪11.01.23 :‬‬

‫תאריך הגשת הדו''ח‪22.01.23 :‬‬

‫מדריכים‪ :‬גב' וענקין לאה‬

‫גב' חניא אסתר‬
 ‫מטרת הניסוי‪:‬‬
‫ניקוי והפרדה לחלבונים דרך שיטת הכרומטוגרפית עמודה‪.‬‬

‫רקע תיאורטי‪:‬‬
‫בכרומטוגרפית עמודה הפזה הנייחת נדחסת לתוך קולונה החומרים המקובלים בשימוש לפזה‬
‫הנייחת הם אלומינה‪ ,‬סיליקה ג'ל‪ ,‬מגנזיה‪ ,‬עמילן‪ ,‬סוכר ועוד‪ .‬כדי לקבל יעילות גבוהה בהפרדה‬
‫משתמשים בחלקיקים בעלי גודל אחיד ככל האפשר ושטח פנים גדול ככל האפשר‪.‬‬
‫באופן עקרוני ניסוי בכרומטוגרפית קולונה מתבצע באופן הבא‪:‬‬
‫בשלב ראשון שוטפים את העמודה בבופר הקולונה לאחר מכן מטעינים בראש העמודה את‬
‫התערובת החלבונים להפרדה‪ ,‬לאחר מכן מוסיפים במנות את הפאזה הניידת תוך הקפדה על‬
‫מינימום ערבוב‪ .‬הפאזה הניידת עוברת דרך העמודה מלמעלה למטה בכוח הגרביטציה‪.‬‬
‫אם החומרים המופרדים הם בעלי צבע אז בדומה לכרומטוגרפית נייר ניתן מיד לזהותם‪ .‬אם הם‬
‫חסרי צבע ניתן לזהותם על ידי‪:‬‬
‫א‪ .‬איסוף מקטעים של נוזל ביציאה מהעמודה‪.‬‬
‫ב‪ .‬שימוש בחומריי זיהוי או שיטות זיהוי אחרות (כגון שיטות ספקטרליות) על כל מקטע‪ .‬לעיתים‬
‫רחוקות אף נהוג לפרק את העמודה לאחר הניסוי ולמצות מתוך הפזה הנייחת את החומרים‬
‫שהופרדו‪.‬‬
‫כאשר רוצים להפריד על ידי קולונת אופייניות נלקחים מספר דברים בחשבון‪:‬‬
‫מולקולת המטרה (לרוב חלבון) תהייה בעלת תכונה ידועה ומוגדרת‪ ,‬אותה ניתן לנצל‬ ‫‪‬‬
‫לטובת ההפרדה ‪.‬‬
‫הקישור של מולקולת המטרה לליגנד היא ספציפית מאד ורוב המולקולות לא יקשרו‬ ‫‪‬‬
‫אליו‪.‬‬
‫שימושים‪:‬‬
‫בידוד מולקולות מתערובת מבלי לפגוע בתפקודם הביולוגי‪/‬כימי‪.‬‬ ‫‪‬‬
‫דילול בריכוז חומר מסוים מתוך תערובת‪.‬‬ ‫‪‬‬
‫גילוי איזה מולקולה ביולוגית נקשרת לחומר מסוים ‪.‬‬ ‫‪‬‬

‫הפאזה הנייחת טעונה חיובית והחלבונים טעונים שלילים כך הזרימה תהייה מלמעלה‬ ‫‪-‬‬
‫למטה‬

‫מחליף אניונים‪:‬‬
 ‫מהלך הניסוי‪:‬‬
‫לקחנו מבחנה ראשונה שמנו בתוכה ‪ 3ml‬מים ‪,‬סימנו את הגובה של המים‪ ,‬וסימנו ‪36‬‬ ‫‪-1‬‬
‫מבחנות לפי הגובה של המבחנה הראשונה ‪.‬‬
‫פתחנו הברז שנמצא בתחתית של העמודה והורדנו את כמות המים שהייתה על פני השטח‬ ‫‪-2‬‬
‫של הגרגרים (מעל הפאזה הנייחת)‪.‬‬
‫שמנו את החלבון שלנו בכמות של ‪ 1ml‬וחיכינו עד שיתערבב עם הפאזה הנייחת‪.‬‬ ‫‪-3‬‬
‫בהתחלה טפטפנו בופר של ‪ 0%‬ב ‪ 12‬מבחנות עד הקו שסמנו ‪.‬‬ ‫‪-4‬‬
‫אחרי זה טפטפנו בופר בריכוז ‪ NaCl‬של ‪ 0.1‬בתוך ‪ 12‬המבחנות עד הקו שסימנו‪.‬‬ ‫‪-5‬‬
‫ובסוף טפטפנו בופר בריכוז ‪ NaCl‬של ‪ 0.2‬בתוך ‪ 12‬המבחנות עד הקו שסימנו ‪.‬‬ ‫‪-6‬‬
‫איפסנו את הספקטרופוטומטר באמצעות בלאנק (בופר)‪.‬‬ ‫‪-7‬‬
‫ובסוף עשינו קריאת ‪ OD‬באורך גל ‪ 280nm‬ורשמנו את התוצאות ‪.‬‬ ‫‪-8‬‬

‫תוצאות‪:‬‬
‫טבלה ‪ :1‬תוצאות ערך ‪.OD‬‬

‫‪12‬‬ ‫‪11‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪1‬‬ ‫מספר‬
‫מבחנ‬
‫ה‬
‫‪0.07‬‬ ‫‪0.04‬‬ ‫‪0.08‬‬ ‫‪0.0‬‬ ‫‪0.05‬‬ ‫‪0.05‬‬ ‫‪0.11‬‬ ‫‪0.12‬‬ ‫‪0.13‬‬ ‫‪0.25‬‬ ‫‪0.07‬‬ ‫‪0.00‬‬ ‫‪OD‬‬
‫‪4‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪280n‬‬
‫‪m‬‬

‫טבלה ‪ :2‬תוצאות ערך ‪.OD‬‬

‫‪24‬‬ ‫‪23‬‬ ‫‪22‬‬ ‫‪21‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪19‬‬ ‫‪18‬‬ ‫‪17‬‬ ‫‪16‬‬ ‫‪15‬‬ ‫‪14‬‬ ‫‪1‬‬ ‫מספר‬
‫‪3‬‬ ‫מבחנה‬
‫‪0.37‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.34‬‬ ‫‪0.01‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪OD‬‬
‫‪8‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪280n‬‬
‫‪m‬‬

‫טבלה ‪ :3‬תוצאות ערך ‪.OD‬‬

‫‪36‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪34‬‬ ‫‪33‬‬ ‫‪32‬‬ ‫‪31‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪29‬‬ ‫‪28‬‬ ‫‪27‬‬ ‫‪26‬‬ ‫‪25‬‬ ‫מספר‬
 ‫מבחנ‬
‫ה‬
‫‪0.33‬‬ ‫‪0.32‬‬ ‫‪0.32‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.37‬‬ ‫‪0.35‬‬ ‫‪0.34‬‬ ‫‪0.33‬‬ ‫‪0.33‬‬ ‫‪0.33‬‬ ‫‪0.32‬‬ ‫‪0.33‬‬ ‫‪OD‬‬
‫‪6‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪280n‬‬
‫‪m‬‬

‫גרפים‪:‬‬

‫‪0.4‬‬ ‫‪0.4‬‬

‫‪0.35‬‬ ‫‪0.35‬‬

‫‪0.3‬‬ ‫‪0.3‬‬

‫‪0.25‬‬ ‫‪0.25‬‬
‫]‪OD[280nm‬‬

‫‪Unit\ml‬‬
‫‪0.2‬‬ ‫‪0.2‬‬

‫‪0.15‬‬ ‫‪0.15‬‬

‫‪0.1‬‬ ‫‪0.1‬‬

‫‪0.05‬‬ ‫‪0.05‬‬

‫‪0‬‬ ‫‪0‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪11‬‬ ‫‪13‬‬ ‫‪15‬‬ ‫‪17‬‬ ‫‪19‬‬ ‫‪21‬‬ ‫‪23‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪27‬‬ ‫‪29‬‬ ‫‪31‬‬ ‫‪33‬‬ ‫‪35‬‬
‫מספר פרקציות‬

‫‪Unit\ml‬‬ ‫‪O.D‬‬

‫איור ‪ :1‬פעילויות האנזימים כתלות במספר המבחנה‬

‫מסקנות‪:‬‬
‫לפי מה שמתואר בגרף יכולים לראות שממספר פרקציה שלוש עד ‪ 4‬יש חלבון אחד מבין‬ ‫‪-‬‬
‫שלושת החלבונים וזה אומר שיש הפרדה בצורה טובה בטווח הזה‪.‬‬
‫וכנל ממספר פרקציה ‪ 11‬עד ‪.13‬‬ ‫‪-‬‬
‫ממספר פרקציה ‪ 8‬עד ‪ 10‬נראה שיש שני חלבונים פה וזה אומר שלא היה הפרדה טובה‪.‬‬ ‫‪-‬‬
‫במספר פרקציות ‪ 14‬ומעלה נראה שיש טעות במדידת ערך ה‪ ,OD‬ויש כמה סיבות‬ ‫‪-‬‬
‫לזה‪-‬הסבר בדיון‪.‬‬

‫דיון במסקנות‪:‬‬
‫הבנו מהניסוי שה‪ NaCl‬עוזר בהפרדה כך שהוא נקשר בפאזה הנייחת ויוצה החוצה יחד עם‬
‫החלבון‪ ,‬ובדקנו את ‪ OD‬בספקטרופוטומטר באורך גל של ‪ ,280nm‬כי באורך גל זה מאפשר לנו‬
‫לראות חומצות אמינו ארומטיות שהן‪:‬‬

‫פנילאלנין‪.‬‬ ‫‪.1‬‬
‫טריפסין‪.‬‬ ‫‪.2‬‬
‫טירוזין‪.‬‬ ‫‪.3‬‬

‫גורמי שגיאה‪:‬‬

‫הפרדה לא מדוייקת‪.‬‬ ‫‪.1‬‬

‫נגיעה בקיוטה בצורה לא נכונה וכתוצאה מכך השפיע על תוצאות ערך ‪.OD‬‬ ‫‪.2‬‬
‫כמות לא מדוייקת של האנזים שלנו יותר או פחות משלוש מ"ל‪.‬‬ ‫‪.3‬‬

‫ביבליוגרפיה‪:‬‬
‫‪.Thermo Fisher Scientific‬‬ ‫‪.1‬‬
‫המכלול‪.‬‬ ‫‪.2‬‬
‫חוברת מעבדה‪.‬‬ ‫‪.3‬‬
‫דוח מכין ותוצאות‪:‬‬