Χαλκοπρωτεΐνες: Κέντρα Cu(II)

1
 Αντιπροσωπευτικές Πρωτεΐνες µε Κέντρα Χαλκού Τύπου 2 (Κοινές Χαλκοπρωτεϊνες)

Κατηγορία ΜΒ(kD) Κέντρα Χαλκού Δράση

Μη κυανές οξειδάσες (O2 → H2O2)
•  οξειδάση της γαλακτόζης 68 1 τύπου 2 οξείδωση αλκοολών στους µύκητες
•  οξειδάσες των αµινών >70 1 τύπου 2 αποικοδόµηση αµινών σε
καρβονυλικές ενώσεις, σταυροδεσµοί
του κολλαγόνου
Mονοοξυγονάσες (O2 → H2O + υπόστρωµα-O)
•  β-µονοοξυγονάση 4 x 70 8 τύπου 2 οξείδωση της πλευρικής αλυσίδας της
της ντοπαµίνης ντοπαµίνης σε νορεπιρεφρίνη
στον φλοιό των επινεφριδίων
•  τυροσινάση 42 2 τύπου 3 όρθο- υδροξυλίωση των φαινολών και
οξείδωση τους σε όρθο- κινόνες στο
δέρµα, στην σάρκα των φρούτων κτλ
Διοξυγονάσες (O2 → 2 υπόστρωµα-O)
•  κερκετινάση 110 2 τύπου 2 οξειδωτική διάσπαση της κερκετίνης
στους µύκητες
Τερµατικές οξειδάσες (O2 → 2 H2O)
•  οξειδάση του >100 CuΑ, CuΒ τελικό σηµείο της αναπνευστικής
κυτοχρώµατος c αλυσίδας
Αποικοδόµηση σουπεροξειδίων (2 O2•- → O2 + O22-)
•  Δισµουτάση (Cu, Zn) 2 x 16 2 τύπου 2 αυτοοξειδοαναγωγή O2•-, π.χ. στα
των σουπεροξειδίων ερυθροκύτταρα 2
Κέντρα Χαλκού Τύπου 2: Μη Κυανές χαλκοπρωτεΐνες

Λειτουργία: ενεργοποίηση O2 από τον CuΙ σε

συνεργασία µε οργανικά συνένζυµα

Δοµή: επίπεδη µε ασθενή πρόσθετη ένταξη

(φαινόµενο Jahn-Teller για τον CuΙΙ)

Φασµατοσκοπία: Τυπικές ασθενείς

απορροφήσεις του CuΙΙ , ε < 1000 M-1 cm-1,
µεταπτώσεις πεδίου υποκαταστατών (d → d),
κανονικό EPR φάσµα CuΙΙ

L L
Cu(His)m(L)n
Cu m = 1-4, n = 0-3, m+n = 4-5
L L
3
 Mη κυανές οξειδάσες:
•  οξειδάση της γαλακτόζης Οξειδοαναγωγάσες
•  οξειδάσες αµινών (Oxidoreductases)
(οξειδάσες των µονοαµινών,
οξειδάσες των διαµινών,
οξειδάσες της λυσίνης)

Δράση: οξείδωση υποστρωµάτων µε τη χρήση Ο2 και µετατροπή του σε Η2Ο2

Ηµιαντίδραση αναγωγής: O2 + 2e- + 2H+ H2O2

Ηµιαντίδραση οξείδωσης: 2 Υπόστρωµα – 2e- 2 Οξειδωµένο υπόστρωµα

H O O H Οξειδωτική κατάσταση Ο: -1

Τελική αντίδραση:
Ο2 + υπόστρωµα οξειδωµένο υπόστρωµα + Η2Ο2

4
 Οξειδάση της γαλακτόζης (Galactose Oxidase)
D-galactose: oxygen 6-oxidoreductase
ωψχ
Το ένζυµο καταλύει την αντίδραση:

χχχχ
D-galactose + O2 D-galacto-hexodialdose + H2O2

Γενική αντίδραση οξείδωσης αλκοολών προς αλδεϋδες

RCH2OH + O2 RCHO + H2O2

Επειδή το ένζυµο έχει την ικανότητα να οξειδώνει τη γαλακτόζη ακόµη και σε πολυσακχαρίτες,
χρησιµοποιείται για να προσδιορίζει τα επίπεδα της γαλακτόζης στους ιστούς, καθώς και για την
ανίχνευση και διάκριση των γλυκοπρωτεινών.
Η παραγόµενη οξειδάση από το µήκυτα Dacylium dendroides χρησιµοποιείται ευρέως για τον
ποσοτικό προσδιορισµό της γαλακτόζης στο αίµα και άλλα βιολογικά υγρά
5
 Οξειδάση της γαλακτόζης: Ενεργό κέντρο

Ο(Tyr)

(His)N N(His)

Cu
H 2O O(Tyr)*
|
S(Cys)

Το ένζυµο χρησιµοποιεί για τη δράση του δύο συµπαράγοντες:

α) ένα ιόν Cu(II)
β) µία τροποποιηµένη τυροσίνη (Tyr272) που περιλαµβάνει µία ασυνήθιστη θειοαιθερική
οµοιοπολική σύνδεση µε Cys228, όπου δηµιουργείται η ελεύθερη ρίζα για την έναρξη
του καταλυτικού κύκλου. 6
 Οξειδάση της γαλακτόζης: Προτεινόµενος Μηχανισµός Δράσης

1ο στάδιο: Ενεργοποίηση του ενζύµου µε απόσπαση ενός e από την Tyr272

2ο στάδιο: προσθήκη υποστρώµατος µέσω ένταξης µε το Cu(II) ως RCHOH υπό σύγχρονη αποµάκρυνση
του Η2Ο και της Τyr495 η οποία δέχεται το Η+ της αλκοόλης.
3ο στάδιο: µεταφορά ενός e προς το υπόστρωµα συνδυασµένη µε µεταπήδηση Η+ από το υπόστρωµα στην Tyr272.
4 στάδιο: αποµάκρυνση της αλδεϋδης, RCHO, υπό σύγχρονη αναγωγή του Cu(II) προς Cu(I)
5o στάδιο: προσθήκη Ο2, οξείδωση του Cu(I) προς Cu(II) και ένταξη υπό µορφή Ο2-, [CuO2]-
6ο στάδιο: µεταφορά ενός e προς την Tyr272, υπό σύγχρονη µεταπήδηση Η+ από την Tyr στη µονάδα Ο2-,
και σχηµατισµό ΗΟ2-.
7
7o στάδιο: αποµάκρυνση του Η2Ο2 αφού προστεθεί Η+ από την Tyr495, υπό σύγχρονη προσθήκη Η2Ο και ένταξη
της Τyr495.
 Οξειδάσες Αµινών (Amine Oxidases), AO

Γενικά:
Καταλύουν την οξείδωση µεγάλου εύρους βιογενών αµινών, συµπεριλαµβανοµένων
νευροδιαβιβαστών, της ισταµίνης και ξενοβιοτικών αµινών.
Διακρίνονται σε δύο κατηγορίες:
ένζυµα που περιέχουν φλαβίνη και ένζυµα που περιέχουν χαλκό.

Οι αµινοξειδάσες µε χαλκό καταλύουν την οξείδωση πρωτοταγών αµινών προς αλδεύδες,

υπό σύγχρονη απόδοση αµµωνίας και υπεροξειδίου του υδρογόνου:

RCH2NH2 + H2O + O2 RCHO + NH3 + H2O2

Διακρίνονται σε υποκατηγορίες: Οξειδάσες των Mονοαµινών (Monoamine Oxidases, MAO)

Οξειδάσες των Διαµινών (Diamine Oxidases, DAO)
Οξειδάσες της Λυσίνης (Lysine Oxidases)

8
 Οξειδάσες Αµινών (Amine Oxidases), AO

Φυσιολογικός Ρόλος:
Οι οξειδάσες των αµινών που περιέχουν χαλκό είναι ευρύτατα διαδεδοµένες στη φύση:
βρίσκονται στα βακτήρια,τους µήκυτες, τα φυτά και τα ζώα.

Στους προκαρυωτικούς οργανισµούς, τα ένζυµα µετασχηµατίζουν διάφορα αµινικά υποστρώµατα,

έτσι ώστε να χρησιµοποιούνται ως πηγές άνθρακα και αζώτου.

Στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς έχουν πολύ ευρύτερη κλίµακα δράσεων, όπως η κυτταρική
διαφοροποίηση και ανάπτυξη, η επούλωση των τραυµάτων, η αποτοξίνωση,
η κυτταρική απόκριση, καθώς η συγκόλληση των κυττάρων σε ορισµένους ιστούς θηλαστικών.

Οι αµινοξειδάσες είναι επίσης υπεύθυνες για τη δηµιουργία διασταυρούµενων συνδέσεων

(σταροδεσµών, cross-linking) των πρωτεϊνών του συνδετικού ιστού, της ελαστίνης
και του κολλαγόνου.

Στον άνθρωπο έχουν προσδιορισθεί τρία γονίδια αµινοξειδασών:

ABP1, AOC2 AOC3
9
 Οξειδάσες αµινών (amine oxisases), AO
Δοµή:
Οι οξειδάσες των αµινών συναντώνται
ως οµοδιµερή µέσω δισουλφιδικού δεσµού,
µε σχήµα µανιταριού και µέγεθος 70-95 KDa.
Κάθε µονοµερές περιέχει ένα ιόν Cu(II)
και έναν οµοιοπολικά συνδεδεµένο συµπαράγοντα
(προσθετική οµάδα) που βοηθά στην οξειδοαναγωγή,
την topaquinone
(κινόνη της 2,4,5-τριυδροξυφαιναλανίνης, TPQ).
H TPQ σχηµατίζεται από µετα- µεταγραφική Crystal structure of a copper-
containing benzylamine oxidase
τροποποίηση µιας τυροσίνης. from Hansenula polymorpha.
Ενεργό Κέντρο
Η 2Ο
Το ιόν Cu(II) εντάσσεται µέσω τριών His και δύο
µορίων Η2Ο, σε µία τετραγωνική πυραµιδική
(His)N N(His) διευθέτηση.
Cu Το µεταλλικό ιόν έχει διπλό ρόλο:
H 2O N(His) συµµετέχει στην καταλυτική διαδικασία αλλά και στη
βιογένεση της ΤPQ.

Πρόσφατα, οι αµινοξειδάσες θεωρούνται ως τα πρώτα παραδείγµατα τα οποία µπορούν να αποτελέσουν µια νέα
κατηγορία ενζύµων, αυτά, δηλ. όπου µία τροποποιηµένη πλευρική αλυσίδα αµινοξέος βρίσκεται στο ενεργό
10
κέντρο και παίζει οξειδοαναγωγικό ρόλο στην κατάλυση.
 Οξειδάσες Αµινών (Αmine Οxidases, AO) στον άνθρωπο

ABP1, Οξειδάση των Διαµινών (Diamine Οxidase, DAO)

human amiloride sensitive amine oxidase
(Cu-containing), histaminase, kidney amine oxidase
histamine
Το γονίδιο ABP1 κωδικοποιεί µια µεµβρανική
γλυκοπρωτεΐνη, την Οξειδάση των Διαµινών
(Diamine Οxidase, DAO), η οποια εκφράζεται σε
πολλούς επιθηλιακούς και αιµοποιητικούς
ιστούς. Η πρωτεΐνη καταλύει την οξειδωτική
απαµίνωση ουσιών, όπως η πουτρεσκίνη, η putrescine
ισταµίνη, η σπερµιδίνη και η σπερµίνη. Οι
αµίνες αυτές συµµετέχουν στην αλλεργική και
ανοσολογική απόκριση, στη κυτταρική διαίρεση,
στη διαφοροποίηση των ιστών, στο σχηµατισµό
των όγκων και πιθανώς στην κυτταρική
απόπτωση. Ο ρόλος του ενζύµου είναι spermidine
σηµαντικός στον έλεγχο των επιπέδων των
ουσιών αυτών.
Επί λέον, η DAO του πλακούντα θεωρείται ότι
παίζει ρόλο στη ρυθµιση του γυναικείου
αναπαραγωγικού συστήµατος. spermine
11
 Ο Ρόλος της διαµινοξειδάσης στο µεταβολισµό της ισταµίνης
Η ισταµίνη είναι ένας σηµαντικός ρυθµιστής πολλών βιολογικών διαδικασιών, στις οποίες
περιλαµβάνονται η φλεγµονή, η έκκριση γαστρικού υγρού, ο κατευνασµός των νεύρων και η
ρύθµιση της ανοσολογικής δράσεως.

Η ισταµίνη σχηµατίζεται από

αποκαρβοξυλίωση της L-
ιστιδίνης µέσω µιας
αντίδρασης που καταλύεται
από το ένζυµο αποκαρβο-
ξυλάση της ιστιδίνης. Οι
κύριες οδοί για την
απενεργοποίηση της ισταµίνης
στα θηλαστικά είναι δύο:
α) η µεθυλίωση του
ιµιδαζολικού δακτυλίου, που
καταλύεται από την Ν-
µεθυλτρανσφεράση της
ισταµίνης και
β) η οξειδωτική απαµίνωση
της πρωτοταγούς αµινοµάδας,
που καταλύεται από την
Oξειδάση της Διαµίνης
(Diamine Oxidase, DAO).
12
 Ο Ρόλος της διαµινοξειδάσης στο µεταβολισµό της ισταµίνης (συνέχεια)

Η οξειδάση της διαµίνης χρησιµοποιεί µοριακό οξυγόνο και απαµινώνει

οξειδωτικά την ισταµίνη σε ιµιδαζολοακεταλδεϋδη, αµµωνία και υπεροξείδιο
του υδρογόνου:

Η ισταµίνη εξασκεί τις διάφορες βιολογικές δράσεις της δεσµευόµενη και, συνεπώς,
ενεργοποιώντας 4 διαφορετικούς υποδοχείς που βρίσκονται στην επιφάνεια των αντίστοιχων
κυττάρων. Ο κύριος στόχος για την απενεργοποίηση της ισταµίνης είναι η µετατροπή της σε
µεταβολίτες οι οποίοι δεν θα ενεργοποιούν τους υποδοχείς της. Αυτό επιτυγχάνεται είτε µε
µεθυλίωση είτε µε οξείδωση. Τα αρχικά προϊόντα που προέρχονται από τους δύο διαφορετικούς
τρόπους διαφοροποίησης και απενεργοποίησης της ισταµίνης καταβολίζονται στη συνέχεια προς
άλλα προϊόντα.
13
Προτεινόµενος µηχανισµός για την
απαµίνωση της πουτρεσκίνης από το ενεργό
κέντρο της DAO (ΤΟPA-Cu(II))
Η ελεύθερη καρβονυλική οµάδα
της ΤΟPA κινόνης αντιδρά µε τη
µία αµινοµάδα της
πουτρεσκίνης (17) παρέχοντας
ένα ενδιάµεσο τύπου αµινόλης
(18), από το οποίο απασπάται
Η2Ο οδηγώντας σε ένα
ενδιάµεσο κινόνης-ιµίνης (19).
Στην ένωση 19 δηµιουργείται
ένας διπλός δεσµός µε την
απόσπαση ενός πρωτονίου από
µία γειτονική βάση του ενζύµου,
οπότε παράγεται µία αλειφατική
µορφή ιµινίου (20), η οποία
υδρολύεται µετά από προσβολή
από Η2Ο προς αµινοκινόλη (21)
και 4-αµινοβουτανάλη (22). Η
αλδεϋδη (22) κυκλοποιείται
προς σχηµατισµο D1-
πυρρολίνης, ενώ η αµινοκινόλη
(21) επαναγεννά την TOPA
κινόνη και ΝΗ4+, µέσω του
οξειδοαναγωγικού κύκλου Cu
14
(II)-O2.
 Οξειδάσες Αµινών (Αmine Οxidases, AO) στον άνθρωπο
H Amine Oxidase, Copper Containing 2 (AOC 2) από τους
φακούς των µατιών θεωρείται κρίσιµος ρυθµιστής της
µετάδοσης του σήµατος στον αµφιβληστροειδή,
πιθανώς αποδοµώντας τις βιογενείς αµίνες ντοπαµίνη,
ισταµίνη και πουτρεσκίνη.
Το αντίστοιχο γονίδιο µπορεί να είναι υπεύθυνο για τις
κληρονοµικές οφθαλµικές παθήσεις.

Η Amine Oxidase, Copper Containing 3 (vascular adhesion protein 1, ΑΟC 3) είναι επίσης
γνωστή ως Semicarbazide-Sensitive Amine Oxidase (SSAO) και είναι η κύρια πρωτεΐνη στη
µεµβράνη των λιποκυττάρων. Διαθέτει συγκολλητικές ιδιότητες και έχει σηµαντική δράση ως
µονοαµινική οξειδάση, ικανή να απαµινώσει
πρωτοταγείς αµίνες µικρού µοριακού βάρους. Κύριος
αναστολέας του ενζύµου είναι το ηµικαρβαζίδιο
(semicarbazide). Η SSAO βρίσκεται στα αιµοφόρα αγγεία και σε
διάφορους άλλους ιστούς. Η φυσιολογική της δράση δεν είναι απόλυτα
κατανοητή, ενώ έχει προταθεί η ανάπτυξη των αγγείων, η ρύθµιση
της λιπόλυσης και η αποτοξίνωση. Αύξηση της
δραστικότητας του ενζύµου έχει παρατηρηθεί σε
ασθένειες όπως η αθηροσκλήρυνση, ο διαβήτης
melitus, η παχυσαρκία κλπ. 15
 Οξειδάσες της λυσίνης (Lysine oxisases), LOX
Συνιστούν µία ειδική κατηγορία αµινοοξειδασών που περιέχουν χαλκό
(είναι µονοµερή και χρησιµοποιούν ένα διαφορετικό συµπαράγοντα τύπου κινόνης για τη δράση τους)
Η Οξειδάση της Λυσίνης (Lysyl oxidase, LOX, protein-lysine 6-oxidase) είναι ένα ένζυµο το οποίο
εκφράζεται στον εξωκυττάριο χώρο. Αρχικά θεωρήθηκε ότι πρόκειται για ένα µοναδικό τύπο. Η
αποµόνωση του ενζύµου από διάφορες πηγές οδήγησε στην άποψη ότι υπάρχουν διάφορες µορφές
του ενζύµου, ή διαφορετικά, την παρουσία ισοενζύµων µε παρόµοιες αλλά όχι ακριβώς ίδιες
ιδιότητες.

Σήµερα είναι γνωστοί 4 τύποι ισοενζύµων στον άνθρωπο:

Lysyl oxidase-like 1 (επίσης γνωστή ως LOXL1), Lysyl oxidase homolog 2, Lysyl oxidase homolog 3,
Lysyl oxidase homolog 4, τα οποία εκφράζονται από τα γονίδια LOX1, LOX2, LOX3 και LOX4,
αντίστοιχα.
Τα ισοένζυµα έχουν ίδια εκλεκτικότητα ως προς τα υποστρώµατα, ίδια σύσταση αµινοξέων και
µοριακή µάζα ~ 32 kDa.
Φυσιολογική δράση
Οι Οξειδάσες της Λυσίνης (LOX) είναι υπεύθυνες για τη δηµιουργία διασταυρούµενων δεσµών στις
πρωτεΐνες του συνδετικού ιστού, κολλαγόνο και ελαστίνη. Η έκφραση των LOX είναι εξαιρετικά
υπεύθυνη για πολλές φυσιολογικές καταστάσεις, όπως η ανάπτυξη, η επούλωση των πληγών, η
γήρανση, γενετικές ασθένειες συµπεριλαµβανοµένων των αυξηµένων επιπέδων χαλκού και η
ογκογένεση.
H αναστολή τους οδηγεί σε προβλήµατα που σχετίζονται µε τη σταθερότητα του συνδετικού ιστού,
16
ενώ η υπερλειτουργία τους διευκολύνει τη µετάσταση των καρκινικών όγκων.
 Οξειδάσες της λυσίνης (Lysine oxisases), LOX

Ενζυµική δράση
Κατά το πρότυπο των αµινοξειδασών:

RCH2NH2 + H2O + O2 RCHO + NH3 + H2O2

Με τη χρήση Ο2, µετατροπή της ε-αµινοµάδας της λυσίνης σε αλδεϋδη και

παραγωγή Η2Ο2 και ΝΗ3:

17
 Συµπαράγοντες απαραίτητοι για την καταλυτική δράση
1 ιόν Cu(II) ανά µονοµερές
Δεν υπάρχει κρυσταλλική δοµή διαθέσιµη για την οξειδάση της λυσίνης.
Με διάφορες τεχνικές έχει δειχθεί ότι σε κάθε µονοµερές των 32 kDa είναι ενταγµένο ένα ιόν
Cu(II).
Η αποµάκρυνση του µεταλλικού ιόντος οδηγεί σε ένα καταλυτικά αδρανές αποένζυµο.
Μελέτες Ηλεκτρονικού Συντονισµού του Spin (Electron Spin Rresonance, ESR) έδειξαν ότι το
ιόν Cu(II) βρίσκεται σε ένα οκταεδρικό, τετραγωνικά παραµορφωµένο πεδίο υποκαταστατών.
Η ακολουθία WEWHSCHQHYH έχει προταθεί ότι είναι η περιοχή δέσµευσης του Cu(II) στο
ανθρώπινο ένζυµο. Η περιοχή αυτή περιέχει 4 ιστιδίνες, οι οποίες σχηµατίζουν ένωση
εντάξεως µε το µεταλλικό ιόν.

1 κινόνη ανά µονοµερές (λυσίνη, τυροσυλοκινόνη, lysine tyrosylqhinone, LTQ)

Από πολύ νωρίς, η LOX ήταν γνωστό ότι περιέχει µία οµοιοπολικά συνδεδεµένη καρβονυλική
προσθετική οµάδα, η φύση της οποίας όµως παρέµενε άγνωστη για πολλές δεκαετίες. Τελικά
προσδιορίσθηκε ότι η προσθετική οµάδα η οποία καταλαµβάνει το ενεργό κέντρο του
ενζύµου είναι ένα παράγωγο το οποίο προέρχεται από τη σύζευξη της αµινοµάδας ε µιας
λυσίνης (Lys-314 στη LOX των βοοειδών) µε την τροποποιηµένη αλυσίδα µιας τυροσίνης
(Tyr-349 στη LOX των βοοειδών) και ονοµάσθηκε λυσίνη τυροσυλοκινόνη (lysine
tyrosylquinone, LTQ). Η LTQ σχηµατίζεται στο ενδοπλασµατικό δίκτυο ή κατά τη
κυκλοφορία της πρωτεΐνης µέσω των σωµατιδίων Golgi. Σε αυτήν την πορεία, ο χαλκός
παίζει ρόλο στη σταθεροποίηση της κινόνης. 18
Βιοσύνθεση της LOX
Ο πρόδροµος της LOX εισέρχεται στο
ενδοπλασµατικό δίκτυο,
όπου το αρχικό πεπτίδιο διaσπάται.
Ο πρόδροµος γλυκοσυλιώνεται σε µια Asn
που βρίσκεται στην περιοχή του προπεπτιδίου.
Η προσθήκη του Cu(II) και ο σχηµατισµός
του συµπαράγοντα
(λυσυλτυροσυλκινόνης, LTQ),
πιθανώς πραγµατοποιείται στο ενπλασµατικό
δίκτυο ή κατά τη µεταφορά της πρωτεΐνης
στα σωµατίδια Golgi.
Μετά τη έκκριση της πρόδροµης πρωτεΐνης
στον εξωκυττάριο χώρο,
η περιοχή του προπεπτιδίου διασπάται
από την C-πρωτεινάση του προκολαγόνου
(µεταξύ των Gly-168 και Asn-169), οπότε
προκύπτει το ενεργό ένζυµο των 32 kDa.

19

LOX: Προτεινόµενος Μηχανισµός Δράσης
• 1o στάδιο: σχηµατισµός µιας βάσης Schiff
µε τον συµπαράγοντα λυσίνη
τυροσυλοκινόνη (LTQ) (I →II). Ενώ η LTQ
είναι δεσµευµένη στο υπόστρωµα, υφίσταται
απόσπαση ενός πρωτονίου, γεγονός που
διευκολύνεται από µία γενική βάση (έχει
προταθεί ότι µία ιστιδίνη παίζει αυτό το
ρόλο στη LOX).
• 2ο στάδιο: στερεοεκλεκτική απόσπαση του
πρωτονίου, ενώ τα ηλεκτρόνια τα οποία
µετακινούνται από το καρβανιόν του
υποστρώµατος, ανάγουν τον συµπαράγοντα
LTQ (II → III).
• 3ο στάδιο: Η υδρόλυση της προκύπτουσας
ιµίνης ελευθερώνει το προΐόν, µία αλδεϋδη, η
οποία αντιδρά άµεσα, προκειµένου να
σχηµατίσει σταυροδεσµούς λυσίνης ή
υδροξυλυσίνης (ΙΙΙ → IV).
• 4ο στάδιο: Μετά την απόσπαση της
αλδεϋδης, το ανηγµένο ένζυµο
επανοξειδώνεται από µοριακό οξυγόνο µε τη
βήθεια του Cu(II) παράγοντας Η2Ο2 και ΝΗ3
(IV → V). Με αυτόν τον τρόπο, το
οξειδωµένο ένζυµο επαναγεννάται και ο
20
καταλυτικός κύκλος συµπληρώνεται (V→I).
Η συµµετοχή της LOX στη δηµιουργία του κολλαγόνου και της ελαστίνης (1)

Κολλαγόνο και Ελαστίνη

Το Κολλαγόνο είναι µία οµάδα φυσικών πρωτεινών που συνιστούν το κύριο συστατικό του
συνδετικού ιστού. Υπό τη µορφή επίµηκων ινιδίων (fibrils) βρίσκεται κυρίως στους τένοντες,
τους συνδέσµους και το δέρµα, ενώ αφθονεί στον κερατοειδή, τους χόνδρους, τα οστά, τα
αιµοφόρα αγγεία, τα έντερα και τους µεσοσπονδύλιους δίσκους.

Η αρχική µορφή του κολλαγόνου είναι µία τριπλή έλικα πολυπεπτιδικού τύπου, που ονοµάζεται
Τροποκολλαγόνο.

Tropocollagen triple helix.

Η Ελαστίνη είναι το κύριο πρωτεϊνικό συστατικό των

ιστών που χρειάζονται ελαστικότητα,
όπως οι αρτηρίες, οι πνεύµονες, η κύστη, το δέρµα, οι
ελαστικές συνδέσεις και οι χόνδροι.
Η βασική µορφή της ελαστίνης είναι µία διαλυτή
πρωτεϊνη ~65 kDa, που ονοµάζεται Τροποελαστίνη. 21
 Η συµµετοχή της LOX στη δηµιουργία του κολλαγόνου και της ελαστίνης (2)

Η µετατροπή του Τροποκολαγόνου και της

Τροποελαστίνης στην τελική ινώδη µορφή τους
προέρχεται από τη δηµιουργία
Lysyl Oxidase Lysyl Oxidase
διασταυρούµενων δεσµών οµοιοπολικής
φύσεως µεταξύ των αρχικών µονάδων. Η
δηµιουργία αυτών των cross-links καταλύεται
από την οικογένεια ων Οξειδασών της Λυσίνης.
Συγκεκριµένα, οι LOX απαµινώνουν
οξειδωτικά ορισµένα κατάλοιπα λυσίνης και
υδροξυλυσίνης στο κολλαγόνο και κατάλοιπα
µόνο λυσίνης στην ελαστίνη, σχηµατίζοντας τις
αντίστοιχες α-αµινοαδιπι-δ-ηµιαλδεϋδες, οι Lysyl Oxidase
οποίες αναφέροται συνήθως µε τα ονόµατα
allysine και hydroallysine.
Η απαµίνωση ακολουθείται από αυθόρµητες
αντιδράσεις συµπύκνωσης που οδηγούν σε
διάφορες µορφές δι-, τρι- και τετραδραστικών
σταυροδεσµών.
22
Η συµµετοχή της LOX στη δηµιουργία του κολλαγόνου και της ελαστίνης (3)

Lysyl Oxidase

Σχηµατικά, η µετατροπή του Τροποκολλαγόνου

σε Κολλάγονο και
της Τροποελαστίνης σε Ελαστίνη
23
από την Οξειδάση τηςΛυσίνης
 Mονοοξυγονάσες (O2 → H2O + υπόστρωµα-O)
(Οξειδοαναγωγάσες)
β-Μονοοξυγονάση της ντοπαµίνης,
Dopamine β-monooxygenase, DBM
(dopamine β-hydroxylase)

Λειτουργία:

Οξείδωση της πλευρικής αλυσίδας της

ντοπαµίνης σε νορεπιρεφρίνη
στον φλοιό των επινεφριδίων κατά τη
βιοσύνθεση των κατεχολαµινών.
Η εκλεκτικότητα ως προς το υπόστρωµα της
DBM είναι ευρεία και το ένζυµο είναι ικανό να
καταλύσει διάφορες οξειδώσεις.

24
 β-Μονοοξυγονάση της ντοπαµίνης

Τρόπος Δράσης

Το ένζυµο καταλύει την υδροξυλίωση του β-ατόµου άνθρακα της ντοπαµίνης.

Για την αντίδραση χρησιµοποιούνται
i)  Μοριακό οξυγόνο, Ο2 και
ii)  ένας εξογενής ηλεκτρονιοδότης, τα ασκορβικά in vivo

Η τελική αντίδραση είναι:

3,4-dihydroxyphenethylamine + ascorbate + O2 norepinephrine +

dehydroascorbate + H2O
25
 Catecholamine biosynthesis

Dopamine β-hydroxylase
Tyrosine hydroxylase

26
 Σουπεροξειδικές Δισµουτάσες, Superoxide Dismutases (SOD)
Γενικά
Οι σουπεροξειδικές δισµουτάσες αποτελούν µία κατηγορία ενζύµων που καταλύουν την
αυτοξειδοαναγωγή του σουπεροξειδίου σε µοριακό οξυγόνο και υπεροξείδιο του υδρογόνου:

2 O2- + 2 H+ → O2 + H2O2
Φυσιολογική Δράση

Συνιστούν τη βασική αντιοξειδωτική άµυνα όλων σχεδόν των κυττάρων που εκτίθενται στο
οξυγόνο.

Έχουν προσδιορισθεί 3 οικογένειες SOD, σε σχέση µε το µεταλλικό κέντρο που περιέχουν:

•  η οικογένεια των Cu, Zn-SOD (οι οποίες περιέχουν και τα δύο µεταλλικά ιόντα),
•  η οικογένεια των Fe-SOD και Mn-SOD (οι οποίες δεσµεύουν είτε σίδηρο, είτε µαγγάνιο)
•  η οικογένεια των Ni-SOD (οι οποίες δεσµεύουν ιόντα νικελίου).

Οι Cu,Zn-SOD χρησιµοποιούνται κυρίως από τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς.

27
Το κυτταρόπλασµα όλων σχεδόν των ευκαρυωτικών κυττάρων περιέχει ένα ένζυµο Cu,Zn-SOD.
Σουπεροξειδικές Δισµουτάσες, Superoxide Dismutases (SOD)

ΕΙΔΗ  SOD  στον  άάνθρωπο  και  σε  όόλα  τα  θηλαστικάά:

-­‐‑   SOD1
Cu/Zn-­‐‑SOD
Κυτταρόόπλασµμα
(διµμερέές  έένζυµμο)

-­‐‑  SOD2
Μn-­‐‑SOD
Μιτοχόόνδρια
(τετραµμερέές  έέζυµμο)
-­‐‑  SOD3
Cu/Zn-­‐‑SOD
εξωκυττάάριος  χώώρος
(τετραµμερέές  έένζυµμο) 28
 Cu/Zn-­‐‑SOD

-­‐‑  Mοριακόό  βάάρος:  32000

-­‐‑  Διµμερέές  έένζυµμο

-­‐‑  Εµμφανίίζεται  κυρίίως  στα  

κύύτταρα  του  πνεύύµμονα,  αλλάά  
και  σε  άάλλα  κύύτταρα  (π.χ.  
ερυθράά  αιµμοσφαίίρια)

Κάάθε  Υποµμονάάδα

-­‐‑  8  αντιπαράάλληλες  β-­‐‑δοµμέές

-­‐‑   Διευθέέτηση  µμε  “Greek-­‐‑key”
αναδίίπλωση
-­‐‑ Σύύνδεση  µμε  έένα  ιόόν  Cu(II)  και
έένα  ιόόν  Zn(ΙΙ)
29
 Δισµουτάση του σουπεροξειδίου Cu-Zn,
Superoxide Dismutase, Cu/Zn-SOD
Ενεργό Κέντρο: Ετεροµεταλλικό, Διπυρηνικό Σύµπλοκο
µέσω ιµιδαζολικής γέφυρας ανά υποµονάδα

Ένταξη Cu(II): Ένταξη Zn(II):

3 Ν(His) + Ο(Η2Ο) + N(His-61) N(His-61) + 2 Ν(His) + Ο(Asp)

Παραµορφωµένη
Τετραγωνική Πυραµίδα Τετραεδρική

Απαραίτητος για την κατάλυση Δοµικός Ρόλος 30

 Cu,Zn-SOD: Καταλυτική Δράση
Αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής του ιόντος σουπεροξειδίου, Ο2- :
O2 + 1e O2- (superoxide) (13 e σθένους) ελεύθερη ρίζα

O2- (superoxide) + 1e O22- (peroxide) (14 e σθένους)

2 O2- + 2 H+ → O2 + H2O2
Οξειδωτική
κατάσταση 2 x (-1/2) 1 x (0) 1 x (-1)
οξυγόνου: 1 άτοµο οξείδωση 1 άτοµο αναγωγή

31
Cu, Zn-SOD: Προτεινόµενος Μηχανισµός Δράσης (1)
Μετατροπή ελευθέρων ριζών σουπεροξειδίων (Ο2-) σε Ο2 και Η2Ο2
.

32
 Cu, Zn-SOD: Προτεινόµενος Μηχανισµός Δράσης (2)
Όταν η πρώτη ρίζα του υπεροξειδίου πλησιάσει κοντά στο ένζυµο, ένα ηλεκτρόνιο
µεταπηδά από την υπεροξειδική ρίζα στο ενεργό κέντρο. Η ιµιδαζολική γέφυρα διασπάται
και το ιόν του χαλκού µετακινείται ελαφρώς πιο πέρα, καθώς οι δακτύλιοι της δοµής του
χαλκού περιστρέφονται περίπου 20 µοίρες έναντι του ψευδαργύρου.
Όταν η δεύτερη υπεροξειδική ρίζα πλησιάσει κοντά στο ενεργό κέντρο, ο ανηγµένος
χαλκός οξειδώνεται πάλι, το αρχικό ηλεκτρόνιο µεταπηδά στο δεύτερο υπεροξείδιο µαζί
µε δυο πρωτόνια και έτσι δηµιουργείται ένα µόριο υπεροξειδίου του υδρογόνου.

33
 Μεταβολισµός του Μοριακού Οξυγόνου και Ελεύθερες Ρίζες
Το οξυγόνο είναι ένα απαραίτητο για τη ζωή στοιχείο και ρυθµιστής του ανθρώπινου
µεταβολισµού. Ο βιολογικός προορισµός του οξυγόνου είναι τα µιτοχόνδρια, κύτταρα στα οποία
πραγµατοποιούνται οι βιοχηµικές διαδικασίες που χορηγούν την ενέργεια που χρησιµοποιεί ο
ανθρώπινος οργανισµός και προέρχεται από την πέψη και το µεταβολισµό των υδατανθράκων,
των πρωτεϊνών και των λιπών.
Το 95% του οξυγόνου που φτάνει στα κύτταρα, υφίσταται σταδιακή αναγωγή 4 ηλεκτρονίων
προσλαµβάνοντας τέσσερα ηλεκτρόνια από τον κύκλο του Krebs, µε ταυτόχρονη παραγωγή
ενέργειας µέσω της Οξειδωτικής Φωσφορυλίωσης.

Ο2 + 4e + 2H+ → 2 H2O
Το υπόλοιπο, όµως, 5% υφίσταται αναγωγή
1 ηλεκτρονίου που οδηγεί στο σχηµατισµό
ελευθέρων ριζών οξυγόνου, µορίων που
ελευθερώνονται µέσα στο κύτταρο ή διαπερνούν
την κυτταρική µεµβράνη και µεταφέρονται σε
άλλα σηµεία του σώµατος. Οι ελεύθερες ρίζες
είναι οµάδες ατόµων, οι οποίες περιέχουν ένα
µονήρες e και είναι µόρια πολύ επιβλαβή για τα
κυτταρικά συστατικά, διότι εµφανίζουν υψηλή
χηµική δραστικότητα επηρεάζοντας έτσι τη
φυσιολογική κυτταρική λειτουργία. Οι ελεύθερες
ρίζες που δηµιουργούνται κατά την ατελή
αναγωγή του οξυγόνου είναι ιδιαίτερα 34
καταστρεπτικές για το µιτοχονδριακό DNA.
 Δραστικές Μορφές Οξυγόνου, Reactive Oxygen Species, ROS
Μοριακές ή ιοντικές µορφές που σχηµατίζονται από µερική αναγωγή του µοριακού οξυγόνου.
Σε αυτά τα δραστικά οξυγονούχα εδιάµεσα περιλαβάνονται το singlet οξυγόνο, τα σουπεροξείδια,
οι υδροξο-ρίζες και το υποχλωριώδες οξύ. Συµµετέχουν στη µικροβιοκτόνο δραστικότητα των
φαγοκυττάρων, στη ρύθµιση της µεταφοράς του σήµατος και της γενετικής έφρασης, αλλά και
στην οξειδωτική καταστροφή των νουκλενικών οξέων, των πρωτεϊνών και των λιπιδίων.

ROS που είναι ρίζες

ΟΗ* (ρίζα υδροξυλίου)
ΗΟ2- (ρίζα υπεροξειδίου)
Ο2- (ανιόν σουπεροξειδίου)

ROS που δεν είναι ρίζες

Μόρια
Η2Ο2 (υπεροξείδιο του υρογόνου)
O2 + 1e O2- (superoxide)
Ιόντα
ΟCl- (υπoχλωριώδες ιόν)
O2- (superoxide) + 1e O22- (peroxide)
35
 ROS και Οξειδωτικό Stress των κυττάρων
Αν και οι ROS δηµιουργούνται ως φυσικά παραπροίόντα του µεταβολισµού του οξυγόνου
και παίζουν σηµαντικό ρόλο στη κυτταρική απόκκριση, υπό την επίδραση περιβαλλοντικών
συνθηκών, όπως η έκθεση σε UV ακτινοβολία ή σε θερµότητα, τα επίπεδα των ROS
αυξάνουν δραµατικά. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη σοβαρή καταστροφή των κυτταρικών
δοµών, γνωστή ως Οξειδωτικό Stress.
Οι Δραστικές Μορφές Οξυγόνου µπορούν να δηµιουργηθούν και από εξωγενείς παράγοντες,
όπως η Ιοντίζουσα Ακτινοβολία.

36
 Αντιοξειδωτικοί Παράγοντες στον Ανθρώπινο Οργανισµό
Απέναντι στις παραγόµενες ελεύθερες ρίζες, ο
ανθρώπινος οργανισµός διαθέτει αρκετές γραµµές
άµυνας που είναι γνωστές σαν αντιοξειδωτικοί
παράγοντες. Τέτοιοι είναι κυρίως βιταµίνες αλλά
και άλλα µόρια που προστατεύουν τα κύτταρα από
τις ελεύθερες ρίζες. Οι αντιοξειδωτικοί µηχανισµοί
άµυνας χωρίζονται σε δυο µεγάλες κατηγορίες, τους
ενζυµικούς και τους µη-ενζυµικούς.

Μετατροπή του τοξικού Ο2-

σε Ο2και Η2Ο2

Οι κυριότεροι ενζυµικοί εκκαθαριστές των

ελευθέρων ριζών είναι διάφορα ένζυµα,
όπως η δισµουτάση του σουπεροξειδίου,
η καταλάση, η υπεροξειδάση της
γλουταθειόνης,
που δρουν καταλύοντας τη διάσπαση των
οξειδωτικών και των ελευθέρων ριζών.
Μετατροπή του τοξικού Η2Ο2 σε Ο2και Η2Ο 37
 Η σηµαντική θέση της SOD ως αντιοξειδωτικού παράγοντα
Η σπουδαιότητα της κυτταρικής άµυνας εναντίον των ROS καταδεικνύεται από την παρουσία της
SOD σε όλους τους αερόβιους οργανισµούς. Μεταλλαγµένα στελέχη της Escherichia coli που δεν
περιέχουν το ένζυµο αυτό είναι ιδιαίτερα ευπρόσβλητα σε οξειδωτική βλάβη.

Στον άνθρωπο, οι
µεταλλάξεις στη SOD1
σχετίζονται µε την
Amyotrophic Lateral
Sclerosis (ALS), όπως
επίσης µε τη Νόσο
Αlchheimer µε έναν
µηχανισµό που δεν είναι
προς τον παρόν κατανοητός,
ενώ υπερέκφραση της SOD1
έχει ως αποτέλεσµα το
σύνδροµο Down. Οι άλλοι 2
τύποι SOD δεν έχουν
συνδεθεί µε οποιεσδήποτε
ανθρώπινες ασθένειες.

38