DNA bộ gen được tinh chế từ khuếch đại A.

baumannii và PCR với các đoạn mồi cụ thể

cho gen NLPA khuếch đại một đoạn DNA 867 bp

Đoạn gen NLPA 867 bp được nhân bản với kỹ thuật T/A tạp dòng trong một vector T
(PTZ57R/T) và sau khi chuyển đổi hóa học của các tế bào có thẩm quyền E. coli,
plasmid tái tổ hợp PTZ57R/T-NLPA đã được tạo ra.

Tinh chế plasmid và kpni/sacii hạn chế tiêu hóa endonuclease của plasmid tái tổ hợp
PTZ57R/T-NLPA, đã xác nhận việc điều chỉnh nhân bản gen NLPA. Vì vậy, gen
PTZ57R/T và gen NLPA tương ứng có chiều dài 2886 và 867 bp, được phát hiện bằng
điện di gel agarose

Đoạn NLPA được cắt ra khỏi PTZ57R/T-NLPA và được chèn vào các vị trí hạn chế
KPNI/SACII của vectơ PEGFP-C2.Tạo plasmid tái tổ hợp PEGFP-C2-NLPA

Sau khi tiêu hóa, các đoạn 4735 bp và 867 bp của gen PEGFP-C2 plasmid và NLPA
đã được quan sát thấy trên gel agarose. Kết quả của việc giải trình tự cho thấy NLPA
được nhân bản vào vectơ PEGFP-C2 không có bất kỳ đột biến nào

Trong các tế bào HDF của nucleotide của nó được chuyển đổi với các plasmid có chứa
gen cho kháng Neomycin (PTZ57R/T-NLPA hoặc PTZ57 Được trồng trong môi trường
RPMI bao gồm 10% FBS và 50 μg/ml Neomycin.

Trong khi đó, một kết quả khác cho các tế bào HDF chưa được điều chỉnh (kiểm soát
âm tính) cho thấy các tế bào này không phát triển với sự hiện diện của neo-mycin. Kết
quả RT-PCR cho thấy đoạn DNA 867 bp từ NLPA đã được khuếch đại và gen A.
baumannii NLPA đã được biểu hiện thành công trong các tế bào HDF nhân chuẩn

- Cấu trúc tái tổ hợp PEGFP - C2 - NLPA biểu hiện protein NLPA một cách hiệu quả
trong các tế bào HDF

Để tiết lộ nếu cấu trúc PEGFP-C2-NLPA có thể biểu hiện protein NLPA, các tế bào
HDF đã được thay thế bằng vectơ phân tích trong 48 giờ. Chiết xuất tế bào sau đó
được phân tích bằng SDS-PAGE để tìm protein NLPA. Như minh họa hình 2
Hình 1 KPNI/SACII Hạn chế tiêu hóa trên plasmid PEGFP-C2-NLPA. Làn 1 và 2 cho
thấy các đoạn NLPA và PEGFP-C2 867 và 4735, tương ứng, làn 3 là thang DNA 1 kb
(Thermo Fisher Cat số 10816-015)

Hình 2 Phân tích SDS-PAGE của A. Baumannii NLPA. SDS-PAGE đã được sử dụng
để phân tích biểu thức của RNLPA. Các vectơ tái tổ hợp PEGFP-C2-NLPA và PEGFP-
C2 đã được chuyển thành HDF. Tất cả các mẫu được phân tích bằng SDS-PAGE và
protein được nhuộm bằng màu xanh Coomassie trong gel. Điểm đánh dấu khối phân tử
làn M ở 10 kDa, làn 1 tế bào toàn bộ Lysate của HDF với PEGFP-C2, làn 2 HDF bao
gồm PEGFP-C2-NLPA, 6 giờ sau khi truyền, làn 3 Tái tổ hợp PEGFP-C2-NLPA, sau 48
giờ, điều khiển trống làn 5.

Một dải 31 kDa đã được quan sát trên trang tương tự như trọng lượng phân tử dự đoán
của NLPA (Hình 2)

Để mô tả tác dụng của việc tiêm chủng với cấu trúc PEGFP-C2-NLPA đối với nồng độ
kháng thể và cytokine, mẫu vật được thu thập từ chuột được tiêm chủng và kiểm soát.
Theo quan sát trong Bảng 1, tiêm chủng với PEGFP-C2-NLPA đã kích thích mức độ
cao của IgG và IgM đặc hiệu kháng nguyên ở động vật được tiêm phòng sau mỗi lần
tiêm.

Mức IgG và IgM trong nhóm đối chứng cũng được tăng lên và sự thay đổi của chúng ít
đáng kể so với nhóm thử nghiệm.Sự thay đổi của các dấu hiệu kháng thể như sau:
Mức IgG và IgM tăng. Mức độ của INFγ, IL-2, IL-4 và IL-12 cao hơn có thể phát hiện
được trong nhóm được tiêm phòng so với nhóm đối chứng (Bảng 2).

Sự thay đổi của các dấu hiệu cytokine như sau: Mức độ INF, mức IL-2 tăng. Những dữ
liệu này chứng minh rằng có các phản ứng miễn dịch tế bào và tế bào bằng vắc-xin
DNA này.

Hiệu suất được kiểm tra bằng cách lây nhiễm cho động vật được tiêm vắc-xin và kiểm
soát với liều A. baumannii gây chết người (5 × 108 CFU) và sau đó được phát hiện sự
sống sót. => 50% chuột được tiêm chủng với PEGFP-C2-NLPA (n = 10) đã được bảo
vệ khỏi nhiễm trùng liều gây chết người. Trong khi đó, tất cả những con chuột đối
chứng nhận được vectơ PBS hoặc PEGFP-C2 (không có gen mục tiêu) đã chết trong
thời gian nhiễm trùng sau 48 giờ (p <0,05)