IMMUNOLOGIA - LABORATORIUM

METODY IMMUNODYFUZYJNE

CZĘŚĆ TEORETYCZNA
Jakościowe i ilościowe metody oznaczania antygenów oparte na tworzeniu immunoprecypitatów.
Iwona Kątnik-Prastowska. Immunochemia w biologii medycznej: metody laboratoryjne. Wydawnictwo
Naukowe PWN, 2009

Materiały:
 szkiełka podstawowe
 szalki Petriego (5 cm)
 bufor fosforanowy (PBS) pH = 7,4
 alkohol do odtłuszczania szkiełek
 aparat do suszenia żeli
 probówki eppendorf 1,5ml, 0,5 ml i 0,2 ml
(PCR)
 agaroza
 komora wilgotna
 lignina/wata/bibuła do wyłożenia wilgotnej
komory
 Coomassie Brilliant Blue i odbarwiacz
 komora do barwienia i odbarwiania
 sól fizjologiczna (0,9% NaCl) do płukania

Podwójna dyfuzja według Ouchterlony’ego

1. Każda grupa przygotowuje szkiełko podstawowe lub szalkę Petriego, na które wylewa 1% roztwór
agarozy w PBS (buforze fosforanowym) o grubości do około 5 mm.
2. Po zastygnięciu wyciąć po trzy studzienki (otworki) w odległości do 1 cm w następującym układzie.

1 3

3. Do studzienek dodać następujące ilości surowic:

 Zespół I: 1 – 5 ul surowicy króliczej; 2 – 5 ul surowicy mysiej; 3 – 5 ul surowicy koziej
 Zespół II: 1 – 10 ul surowicy króliczej; 2 – 10 ul surowicy mysiej; 3 – 10 ul surowicy koziej
 Zespół III: 1 – 15 ul surowicy króliczej; 2 – 15 ul surowicy mysiej; 3 – 15 ul surowicy koziej
 Zespół IV: 1 – 20 ul surowicy króliczej; 2 – 20 ul surowicy mysiej; 3 – 20 ul surowicy koziej
  Zespół V: 1 – 10 ul surowicy mysiej; 2 – 10 ul surowicy króliczej; 3 – 10 ul surowicy koziej
 Zespół VI: 1 – 10 ul surowicy mysiej; 2 – 10 ul surowicy koziej; 3 – 10 ul surowicy króliczej
 Zespół VII: 1 – 10 ul surowicy króliczej; 2 – 10 ul albuminy; 3 – 10 ul surowicy koziej
4. Szkiełka podstawowe lub szalki umieścić w wilgotnej komorze i pozostawić w temperaturze
pokojowej na 24-72h, sprawdzając czy pojawiły się łuki immunoprecypitacyjne.
5. W przypadku braku widocznych łuków immunoprecypitacyjnych, przepłukać żel solą fizjologiczną,
a następnie wysuszyć.
6. Po wysuszeniu zabarwić żel w 0,5% roztworze Coomassie Brilliant Blue, a następnie odbarwić tło.
7. Określić obecność lub brak łuków immunoprecypitacyjnych. Ocenić typ immunoreakcji. Wyjaśnić,
o czym świadczy powyższy wynik, również w przypadku braku zaobserwowania łuków
precypitacyjnych, wyjaśnić przyczynę ich braku. Jakie jest zastosowanie tej metody ?

Immunodyfuzja radialna – test Mancini

1. Przygotować dwie płytki zawierające agarozę z przeciwciałami. W celu przygotowania jednej płytki
przygotować 5-10 ml (w zależności od wielkości płytek) 1% r-r agarozy w buforze PBS
(fosforanowym, pH = 7,4), schłodzić do temperatury poniżej 56°C i dodać przeciwciał K lub G
(stężenie 1:400) i wylać na płytkę.
2. Po zastygnięciu żelu wyciąć studzienki (otworki) – 4 dla próbek standardowych antygenu (25, 50,
100 i 200 ug/ml) oraz X (_______) – w zależności od liczby zespołów pracujących z danym
antygenem
3. Do wyciętych otworków dodać po 5 ul r-r standardowych (25, 50, 100 i 200 ug/ml) oraz po 5 ul
próbek badanych o nieznanym stężeniu.
4. Całość umieścić w komorze wilgotnej wyłożonej bibułą/ligniną i inkubować 48 godzin.
5. Po zajściu immunodyfuzji zmierzyć średnicę powstałych kręgów precypitacyjnych dla roztworów
standardowych oraz próbek badanych. Na podstawie otrzymanych wyników wykreślić krzywą
standardową i określić stężenie antygenu w badanych próbkach.