CZĘŚĆ I - EKSTRAKCJA BIAŁEK Z MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO

Wstęp teoretyczny

Białka to naturalnie występujące nierozgałęzione polimery o masie cząsteczkowej od 10 000 do

ponad 1 000 000 Da, zbudowane z aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Stanowią
one ogromną grupę związków o różnym źródle pochodzenia, budowie, funkcjach i właściwościach. Z
tego powodu w zależności od potrzeb stosuje się różne kryteria ich podziału:
- ze względu na skład chemiczny:
* proste (proteiny, homoproteiny) składające się z aminokwasów
* złożone (proteidy, heteroproteidy) zawierają dodatkowo cząsteczki o charakterze
niebiałkowym

- ze względu na homologię kształtu i właściwości fizykochemicznych:

*albuminy – białka dobrze rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli;
występują powszechnie w organizmach zwierzęcych i roślinnych
*globuliny – dość często kompleksują jony metali; pełnią w organizmie różnorakie
funkcje, np. katalityczną (enzymy), czy obronną (immunoglobuliny)
*histony – białka zasadowe; występują w jądrze komórkowym
*gluteliny – białka roślinne, nierozpuszczalne w wodzie; charakteryzują się wysoką
zawartością proliny, kwasu glutaminowego i glutaminy.
*prolaminy – białka roślinne, rozpuszczalne w 70% etanolu; np. białka glutenu z
pszenicy

- białka złożone, ze względu na charakter cząsteczki niebiałkowej dzielimy na:

* glikoproteiny – zawierają cząsteczkę cukru, np. przeciwciała
* lipoproteiny – z cząsteczką lipidową, np. HDL, LDL
* nukleoproteiny – zawierają cząsteczkę kwasu nukleinowego, np. nukleohistony
* fosfoproteiny – z resztą kwasu fosforowego, np. kazeiny
* metaloproteiny – zawierają jony metali, np. hemoglobina
* chromoproteiny – barwne białka, np. rodopsyna

Białka posiadają budowę przestrzenną, w której możemy wyróżnić kilka poziomów organizacji:
- struktura I-rzędowa to najniższy i zarazem podstawowy poziom organizacji białek (sekwencja
aminokwasowa) opisujący kolejność aminokwasów. Sekwencja aminokwasowa jest kodowana
genetycznie i determinuje struktury wyższego rzędu;
- struktura II-rzędowa określa sposób sfałdowania łańcucha polipeptydowego, czyli wzajemne
ułożenie sąsiednich reszt aminokwasowych w łańcuchu polipeptydowym. Wyróżniamy kilka typów
struktur II-rzędowych: helikalne - najczęściej spotykaną jest α-helisa– prawoskrętna struktura
cylindryczna, w której na jeden skręt przypada 3,6 reszt aminokwasowych, a ilość atomów (włączając
wodór) zamkniętych w pierścień dzięki utworzeniu wiązania wodorowego wynosi 13. Inne typy helis
występujących w białkach to helisy typu 2,27, 310 i 4,416 (helisa π). Struktury β (harmonijki β, β-
kartki) charakteryzują się tym, że tworzą je znajdujące się w jednej płaszczyźnie łańcuchy
polipeptydowe, połączone siatką wiązań wodorowych pomiędzy grupami –CO i –NH sąsiednich
łańcuchów, które mogą być ułożone w jednym kierunku (równoległa β-struktura) lub w kierunkach
przeciwnych (antyrównoległa β-struktura).

1
- struktura III-rzędowa określa wzajemne przestrzenne położenie struktur drugorzędowych oraz
lokalizację mostków disiarczkowych.
- struktura IV-rzędowa dotyczy organizacji budowy białek podjednostkowych, składających się z
więcej niż jednego łańcucha peptydowego, określając ich wzajemne położenie i rodzaj oddziaływań.

Białka są zbudowane z aminokwasów o różnych właściwościach hydrofilowych, wynikających

przede wszystkim z obecności łańcuchów bocznych zdolnych (bądź nie) do jonizacji. Większość
białek rozpuszcza się w wodzie, rozcieńczonych kwasach i zasadach, a niektóre w rozpuszczalnikach
organicznych. Na rozpuszczalność białka wpływa także stężenie soli nieorganicznych. Obecność w
cząsteczce białka ładunków dodatnich oraz ujemnych powoduje, że są one amfolitami i mogą
reagować jak kwasy lub zasady. Podobnie jak w przypadku aminokwasów, możemy mówić o
punkcie izoelektrycznym białka (pI), czyli takim pH, w którym ilość ładunków dodatnich jest
równa ilości ładunków ujemnych i wypadkowy ładunek cząsteczki wynosi 0. Zdolność białka do
posiadania różnego ładunku w zależności od pH znalazła szerokie zastosowanie w różnych
technikach preparacji (wytrącanie białek z roztworu) lub analizy tej grupy związków - przede
wszystkim w technikach elektroforetycznych i w chromatografii jonowymiennej.

Białka nie posiadają charakterystycznej dla siebie temperatury topnienia. Na ogół są rozpuszczalne w
wodzie. Niektóre z nich mogą rozpuszczać się w rozcieńczonych kwasach lub zasadach, a inne w
rozpuszczalnikach organicznych. Posiadają zdolność wiązania cząsteczek wody - efekt ten nazywany
jest hydratacją. Na rozpuszczalność polipeptydów ma wpływ stężenie soli nieorganicznych. Ich
małe stężenie wpływa dodatnio na rozpuszczalność, jednak przy pewnym stężeniu następuje
uszkodzenie otoczki solwatacyjnej, co powoduje wypadanie białek. Proces ten nie narusza struktury
białka, jest odwracalny i nosi nazwę wysalania białek. Usunięcie soli przez dializę lub obniżenie jej
stężenia przez dodanie wody powoduje ponowne rozpuszczenie wysolonego białka z zachowaniem
pełnej aktywności biologicznej. Poszczególne sole różnią się zdolnością wysalania białek. Do
wysalania białek stosuje się najczęściej: siarczan (VI) amonu, siarczan (VI) sodu lub magnezu i
chlorek sodu. Bardziej skuteczne w wysalaniu białek są sole wielowartościowe, czyli np. siarczan
(VI) amonu, niż sole jednowartościowe, np. NaCl. Niektóre czynniki tj. wysoka temperatura, niektóre
kwasy organiczne, sole metali ciężkich i niektóre roztwory organiczne mogą także powodować
wypadanie białek z roztworu, ale z ich równoczesną denaturacją. W przypadku niektórych z tych
czynników duże znaczenie w wytracaniu białka mają ładunek i utrata otoczki hydratacyjnej.

Przebieg ćwiczenia

Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie studentów z metodami ekstrakcji białek z materiału zwierzęcego
oraz roślinnego.

Analizowane produkty spożywcze: Odczynniki: Sprzęt i akcesoria:

- mleko krowie bez laktozy - 2 M kwas octowy - Statyw:
- mleko krowie - 2% wodny roztwór NaOH - Pipety Paustera
- jajko kurze - Kolby stożkowe 100 ml
- otręby pszenne - Cylindry miarowe 50 ml
- nasiona grochu - Lejek szklany
- soczewica czerwona - Sączki bibułowe
- ciecierzyca - Łaźnia wodna
- Papierki uniwersalne
- Bagietki szklane

2
Wykonanie ćwiczenia
Ø EKSTARKCJA ALBUMIN Z MLEKA KROWIEGO / MLEKA BEZ LAKTOZY
Do kolby stożkowej 100 ml wlać 25 ml mleka, dodać 25 ml wody dejonizowanej, a następnie
porcjami łagodnie mieszając 1 ml 2 M kwasu octowego. Całość wstawić na 20 minut do łaźni
wodnej (temp. 37 ̊C), po czym zdekantować ciecz znad osadu przez lejek z sączkiem bibułowym
gładkim do dwóch probówek wirówkowych. Wirować przez 15 min przy 3500 RPM w temp. 5 ̊C.
Supernatant przenieść do dwóch oznaczonych eppendorfek (poj. 1,5 ml) – ważne! objętość musi
być taka sama!, a następnie odwirować zwartość [t=10 min; rpm=12000; temp = 8 ̊C (gab. B 39)].
Supernatant przenieść ostrożnie do dwóch opisanych eppendorfek.
Ø EKSTRAKCJA ALBUMIN Z JAJKA KURZEGO

Białko oddzielić od żółtka, umieścić w kolbie stożkowej 100 ml, usunąć wszelkie błonki. Dodać 50
ml wody dejonizowanej (zalecenia prowadzącego), a następnie mieszać bagietką ok. 15 min (do
wytrącenia znacznej ilości białych, nitkowatych „kłaczków” globuliny). Przenieść zawartość do
dwóch probówek wirówkowych, wirować przez 15 min przy 3500 RPM w temp. 5 ̊C. Supernatant
przenieść do dwóch oznaczonych eppendorfek (poj. 1,5 ml)* – ważne! objętość musi być taka
sama!, a następnie odwirować zwartość [t=10 min; rpm=12000; temp = 8 ̊C (gab. B 39)].
Supernatant przenieść ostrożnie do dwóch opisanych eppendorfek.
* konieczne może być dodatkowe przesączenie supernatantu.

Ø EKSTRAKCJA GLUTELIN Z OTRĘBÓW PSZENNYCH

Do kolby stożkowej 100 ml wsypać 5 g materiału roślinnego, dodać 50 ml wody dejonizowanej, a

następnie porcjami 2% wodorotlenek sodu do pH 11. Całość wstawić na 60 min do łaźni wodnej
(temp. 50-55 ̊C), po czym zdekantować ciecz znad materiału roślinnego do probówek
wirówkowych, wirować przez 10 min przy 3500 RPM w temp. 5 ̊C. Supernatant przenieść do
dwóch oznaczonych eppendorfek (poj. 1,5 ml) – ważne! objętość musi być taka sama!, a następnie
odwirować zwartość [t=10 min; rpm=12000; temp = 8 ̊C (gab. B 39)]. Supernatant przenieść
ostrożnie do dwóch opisanych eppendorfek.

Ø EKSTRAKCJA GLUTEIN Z NASION GROCHU / SOCZEWICY CZERWONEJ /

CIECIERZYCY
Do kolby stożkowej 100 ml wsypać 10 g materiału roślinnego, dodać 50 ml wody dejonizowanej, a
następnie porcjami 2% wodorotlenek sodu do pH 11. Całość wstawić na 60 min do łaźni wodnej
(temp. 50-55 ̊C), po czym zdekantować ciecz znad materiału roślinnego do probówek
wirówkowych, wirować przez 10 min przy 3500 RPM w temp. 5 ̊C. Supernatant przenieść do
dwóch oznaczonych eppendorfek (poj. 1,5 ml) – ważne! objętość musi być taka sama!, a następnie
odwirować zwartość [t=10 min; rpm=12000; temp = 8 ̊C (gab. B 39)]. Supernatant przenieść
ostrożnie do dwóch opisanych eppendorfek.

3
 CZĘŚĆ II – ANALIZA EKSTRAKTÓW BIOLOGICZNYCH ZA POMOCĄ
ELEKTROFOREZY ŻELOWEJ TYPU SDS-PAGE

Wstęp teoretyczny

Ø Wyznaczanie stężenia białek za pomocą metod spektrofotometrycznych i kolorymetrycznych

Białka ze względu na obecność wiązań amidowych (peptydowych) oraz reszt aminokwasowych

zawierających grupy aromatyczne w łańcuchach bocznych (Trp, Tyr, Phe i His) absorbują światło w
zakresie ultrafioletowym tj. 210-280 nm. Wiązanie peptydowe absorbuje w zakresie 210-230 nm,
natomiast reszty aromatyczne oraz mostki disiarczkowe 260-280 nm. Obecność wyraźnego
maksimum przy 280 nm jest przypisywane przede wszystkim resztom aromatycznym takim jak: Trp,
Tyr i w mniejszym stopniu Phe. Niektóre biała mogą posiadać w swej strukturze również grupy
chromoforowe tj. hem czy chlorofil typy A i B (np. hemoglobina, cytochrom) i tym samym
absorbować również w zakresie światła widzialnego. Właściwości absorpcyjne białek w zakresie
światła ultrafioletowego (szczególnie przy 280 nm) wykorzystuje się w pomiarach ilościowych.
Wartość absorbcji białek w świetle ultrafioletowym zależy od wielu czynników takich jak: skład
aminokwasowy, struktura przestrzenna (fałdowanie), pH i siła jonowa układu buforującego. Dlatego
każde białko posiada indywidualne widmo, którego wygląd zależy od siły jonowej układu
buforującego oraz jego pH.

Do oznaczenia stężenia białek wykorzystuje się wiele metod spektofotometrycznych

i kolorymetrycznych. Metody te możemy podzielić ogólnie na te umożliwiające bezpośrednie
wyznaczenie stężenia danego białka (pomiar absorbcji w zakresie ultrafioletowym i lub/UV-VIS)
oraz te wymagające uprzedniego znakowania barwnikiem (metody pośrednie). Wszystkie te metody
opiera się na prawie Lamberta-Beera, zgodnie z którym absorbancja światła monochromatycznego
przechodzącego przez roztwór danego związku jest wprost proporcjonalna do jego stężenia i grubości
warstwy roztworu:

A=k·c·l

gdzie: A – absorbancja, k – współczynnik absorpcji, c – stężenie, l – grubość warstwy

Przykładem metody bezpośredniego wyznaczania stężenia białek jest ta opisana przez

Whitakera i Granuma. Polega ona na pomiarze absorbancji próbki przy dwóch długościach fali
λ=235nm i λ=280nm, a stężenie białka wylicza się z poniższego równania:

A235nm - A280nm
Cbiałka=
2,51
gdzie: 2,51 – jest różnicą pomiędzy średnimi wartościami absorbancji przy λ=235nm (3,89±0,59)
i λ=280nm (1,38±0,62) dla 0,1% roztworów różnych białek.
Głównymi zaletami tej metody są: możliwość stosowania bez użycia wzorca, kwasy nukleinowe nie
przeszkadzają przy pomiarach, na jednej próbce można wykonać pomiar przy obu długościach fali,
próba może zostać odzyskana i wykorzystana w dalszych eksperymentach. Natomiast głównym
wadami tej, jak i innych metod bezpośrednich, są: niska czułość, problem fałszowania stężenia białek
spowodowany obecnością adduktów w układach buforujących (niektóre sole, niejonowe związki
powierzchniowo czynne, glicerol itd.).

4
 W praktyce laboratoryjnej, pomiar bezpośredniego stężenia białek stosuje się przede wszystkich
do oznaczeń czystych frakcji białek tj. po oczyszczaniu, znając dokładny skład ich roztworów
i pamiętając o konieczności użycia stężenia białka o stężeniu co najmniej 0,1-0,5 mg/ml.
Bardziej użytecznymi metodami wyznaczania stężenia białek wydają się te wymagającego
uprzedniego znakowania zawartych w roztworze białek (metody pośrednie). Jedną
z najpopularniejszych technik tego typu jest metoda Bradforda.
Metoda Melanii M. Bradford wykorzystuje fakt wiązania białka przez barwnik Coomassie
Brillant Blue (CBB) G-250. Kompleks białko-barwnik powoduje przesunięcie długości fali
odpowiadającej maksimum absorpcji barwnik z 465 do 595 nm. Wiązanie barwnika z białkami
odbywa się z udziałem wiązań jonowych i hydrofobowych, reagując głównie z resztami Arg oraz w
mniejszym stopniu z resztami His, Lys, Tyr, Trp i Phe. Barwnik ten w środowisku kwasowym ma
zabarwienie brunatne, natomiast jego kompleks z białkiem – niebieskie. Natężenie barwy kompleksu
jest proporcjonalne do stężenia białka, a sam pomiar wykonujemy przy λ=595 nm wyznaczając
stężenie względem krzywej kalibracyjne. Jako wzorzec stosuje się najczęściej albuminę bydlęcą
(BSA). Metodę stosuje się do detekcji białka w zakresie 10-1200µg białka/ml.

Struktura barwnika Coomassie Brillant Blue G-250

Ø Elektroforeza żelowa białek typu SDS-PAGE

Elektroforeza żelowa białek jest bardzo często wykorzystywaną techniką w każdym

laboratorium biochemiczny. Stosuję się ją do analizy jakościowej i ilościowej preparatów białkowych
przy określeniu ich czystości, zawartości czy wyznaczaniu profilu białkowego. Elektroforeza jest
zjawiskiem migracji molekuł obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym. O szybkości migracji
molekuł w polu elektrycznym decyduje natężenie pola elektrycznego, wypadkowy ładunek molekuły,
jej wielkość, kształt oraz lepkość środowiska.
Elektroforezę żelową białek wykonuje się najczęściej w spolimeryzowanym żelu
poliakrylamidowym - PAGE (od ang. polyacrylamide gel electrophoresis). Żel ten powstaje w
wyniku polimeryzacji akrylamidu i N,N′–metylenobisakrylamidu (bisakrylamidu), tworzących sieć
łańcuchów polimerowych, w którym migrują makromolekuły w polu elektrycznym. Proces
polimeryzacji katalizuje najczęściej nadsiarczan amonu (APS) oraz N,N,N′,N′-
tetrametyloetylenodiamina (TEMED) lub β-dimetyloaminopropionitryl (DMAP). Otrzymany w ten
sposób polimer pełni rolę sita molekularnego, w którym molekuły białek migrują w obecności pola
elektrycznego z różną szybkością - duże molekuły, posiadając mniejszą swobodę poruszania się w
strukturach żelu, migrują wolniej niż te mniejsze.
Białka analizuje się za pomocą elektroforezy żelowej w różnych wariantach tej techniki z
czego najczęściej wyróżnia się elektroforezę: natywną, w warunkach denaturujących i elektroforezę
2D. W elektroforezie natywnej analizowane są białka w ich natywnej, niezdenaturowanej
formie/kształcie. Popularniejszą jednak techniką jest ta prowadzona w warunkach denaturujących,
kiedy to ruchliwość białek w żelu jest niezależna od ich kształtu/konformacji. Najmniej popularną
odmianą elektroforezy typu PAGE jest technika separacji 2D. Jest ona najczęściej wykorzystywana
do separacji skomplikowanej mieszaniny białek (nawet i do 1000 różnych białek) i polega na
dwuetapowej separacji tj. względem masy cząsteczkowej analitów, a następnie względem ich punktu
izoelektrycznego. 5
 Tak jak opisano powyżej, najpopularniejszą techniką elektroforetyczną jest SDS-PAGE (ang.
SDS poliacrylamide gel electrophoresis). Rozdział białek następuje w warunkach denaturujących
z wykorzystaniem detergentu SDS (dodecylosiarczanu sodu). SDS-PAGE pozwala w pełni
uniezależnić proces rozdzielania białek od ich kształtu i ładunku elektrycznego, przez co uzyskany
wynik jest prosty do interpretacji bazując na zależności drogi, jaką przebyło białko w żelu, od jego
masy cząsteczkowej.

Próbkę białka/białek należy przed naniesieniem na żel poliakrylamidowy zdenaturować. W tym

celu stosuje się dodatek buforu zawierającego w swym SDS i substancję redukującą, a następnie taką
próbkę ogrzewa się przez kilka minut w temp 75-100°C. SDS jest detergentem jonowym, który
niszczy oddziaływania niekowalencyjne oraz nadaje wszystkim molekułom ładunek ujemny. Mostki
dwusiarczkowe są niszczone (redukowane) za pomocą czynników redukujących np. DTT
(ditiotreitol), β-merkaptoetanolu, co pozwala na pełną denaturację białek.

Tak przygotowane próbki nanosi się na pionową płytkę żelu poliakrylamidowego, do zagłębień
zwanych studzienkami - sporządzony wcześniej żel umieszczony jest w specjalnej aparaturze
w środowisku buforu o odpowiedniej sile jonowej oraz pH. Próbki białek zawierają w swym składzie
również glicerol, który ze względu na swą gęstość zapewnia ich opadanie na dno studzienek. Po
przyłożeniu napięcia, rozpoczyna się migracja molekuł w strukturach żelu. Całość procesu rozwijania
elektroforegramu odbywa się w komorze do elektroforezy. Żel umieszcza się aparaturze i napełnia
układem buforującym. Budowa komory zapewnia odseparowanie górnej i dolnej części żelu od
siebie, co zapewnia jednokierunkowy przepływ napięcia. Po zakończeniu procesu rozwijania
elektroforegramu, żel przenosi się do roztworów barwiących, mających na celu wizualizację białek
znajdujących się w próbce. Powszechnie stosuje się barwniki typu Coomassie lub barwienie metodą
srebrową.

Najczęściej stosuje się żele PEGE w systemie nieciągły, co oznacza, że żel przygotowywany jest
w ten sposób, że białko najpierw wędruje w jego górnej części o mniejszym stopniu usieciowania
(np. 4%), a następnie migruje do żelu właściwego o wyższym stopniu usieciowania (np. 12%).
Warstwa górna żelu ma za zadanie zagęszczenie próbki (żel zagęszczający), natomiast rozdział
właściwy następuje w żelu dolnym tzw. zagęszczającym. W laboratoriach stosuję się również żele
gradientowe np. 4-12%, które nie posiadają wyraźnej granicy między żelem górnym i dolnym,
a stopień ucieciowania żelu wzrasta gradientowo (od góry do dołu). Tego typu żele są dość trudne do
samodzielnego otrzymania w laboratorium, dlatego stosuje się te dostępne komercyjnie.

Schemat budowy komory do prowadzenia elektroforezy żelowej białek.

6
Przebieg ćwiczenia – część II a

Cel ćwiczenia
Celem tej części ćwiczenia jest wyznaczenie stężenia białek w izolatach odzwierzęcych i roślinnych
(otrzymanych w części I) za pomocą metody Bradforda, a następnie wizualizacja ich składu za
pomocą elektroforezy typu SDS-PAGE.

Wykonanie ćwiczenia „ II a”

1) W celu wyznaczenia stężenia białek w otrzymanych izolatach, przenieś po 300 µl każdego z nich do
osobnych probówek wirówkowych o objętości 1,5 ml. Następnie dodaj do nich po 15 ul odczynnika
Bradforada, wymieszaj pipetą kilkukrotnie i odczekaj 5 minut w celu pełnego utworzenia kompleksu.

2) Przenieś 250 µl próbki kompleksu do kuwety kwarcowej. Do drugiej kuwety (tło) dodaj buforu lub
wody. Wykonaj pomiar absorbacji w spektrofotometrze przy λ=595 nm, pamiętając by za każdym
razem wprowadzić do urządzenia kuwetę wzorcową (z buforem/wodą). Zapisz wartość absorbacji.

3) By odczytać stężenie białka/białek w analizowanej próbce, należy przyrównać wartość otrzymanej

absorbacji do krzywej wzorcowej dla BSA (uprzednio przygotowanej przez prowadzącego) . Krzywa ta
jest liniowa w zakresie absorbancji 0,045-1,4, czyli w zakresie stężeń 0,025-0,8 mg/ml.

4) Jeżeli wartość absorbancji próbki nie mieści się we wskazanym przedziale to należy ją kilkukrotnie
rozcieńczyć i powtórzyć pomiar zaczynając od kroku „1”.

5) Wyznacz stężenie próbki względem poniższej krzywej kalibracyjnej.

7
Wyniki pomiarów stężenia izolatów:

• W poniższej tabeli przestawiono wyniki absorbancji poszczególnych izolatów, wraz z podanymi

rozcieńczeniami próbek w celu otrzymania absorbancji w zakresie liniowym tj. 0,045-1,4.

Tabela 1: pomiar stężenia białek zawartych w izolatach

Lp. Izolat Absorbancja Rozcieńczenie próbki* Stężenie białek w

[Au] izolacie [mg/ml]
1 Jajko kurze 0,858 x 10
2 Nasiona grochu 0,877 x 10
3 Otręby pszenne 1,312 x2
4 Ciecierzyca 0,472 -
5 Soczewica czerwona 0,894 x4
6 Mleko bez laktozy 0,490 -
7 Mleko 0,563 -
*Niewielką próbkę izolatu rozcieńczono np. x 2 (dwa razy) w celu uzyskania absorbacji w zakresie liniowej

Sprawozdanie (punkt 1 i 2):

- Na podstawie wartości absorbancji i krzywej kalibracyjnej (metoda Bradforda) poszczególnych
izolatów wyznacz stężenie białek w (uzupełnij tabelkę). Proszę pamiętać, że absorbrancja jest
podana dla próbek rozcieńczonych tylko dla celów wyznaczenia stężenia białek.
- Policz całkowitą zawartość białek w poszczególnych izolatach w przeliczeniu na mg/100 g
produktu oraz jako zawartość procentową białek.

Wykonanie ćwiczenia „b” – elektroforeza żelowa SDS-PAGE izolatów roślinnych i odzwierzęcych

1) Przygotuj rozcieńczenia próbek (stężonych izolatów) w probówkach o objętości 0,5 ml, wg.tabeli
(następna strona), tak by objętość końcowa każdej z próbki wynosiła 17 µl. Jako bufor rozcieńczający
użyj x 1 PBS (bufor fosforanowy).

2) Do każdej z rozcieńczonej próbki dodaj 5,7 µl buforu obciążającego (4x SDS/glicerol/β-

merkaptoetanol). Następnie próbkę ogrzewaj przez 10 min. w temp, 75° C.

3) Przygotuj 400 ml buforu elektrodowego x1 poprzez zmieszanie 20 ml stężonego buforu MES SDS
Running Buffer (x 20) (firmy novex) z 380 ml wody dejonizowanej (prowadzący wskaże jakiej
czystości wodę użyć).

4) W komorze aparatu do prowadzenia rozdziału umieść kasetkę komercyjnie dostępnego żelu Bolt 4-
12% Bis-Tris Plus (firmy novex). Pamiętaj by odkleić uprzednio taśmę zabezpieczającą (dół). Komorę
zalej buforem elektrodowym (x1)

5) Delikatnie usuń grzebień i przemyj każda ze studzienek. Nanieś po 20 µl każdej z próbek oraz w
pierwszej linii roztwór wzorca.

6) Zamknij komorę i prowadź rozdział przy 200 V przez 35 minut. Po tym czasie wyjmij kasetę żelu z
aparatu. Kasetę należy otworzyć i przenieść do pojemnika z barwnikiem (Instant Blue). Następnego
dnia, żel przemyj 2-krotnie woda i zrób skan.
8
Tabela 2: przygotowanie próbek izolatów do elektroforezy żelowej

Lp. Izolat Objętość próbki Objętość buforu [µl] Objętość 1M

[µl] NaOH[µl]
1 Jajko kurze 2 15 -
2 Nasiona grochu 3,4 13,6 -
3 Otręby pszenne 6,7 10,3 -
4 Ciecierzyca 17 - -
5 Soczewica czerwona 5 10 -
6 Mleko bez laktozy 15 - 2
7 Mleko 15 - 2

Schemat wykonania elektroforezy żelowej typy SDS-PAGE:

1) Przygotowanie rozcieńczeń próbki

i ich denaturacja w 75° C

2) Umieszczeniu kasety żelu w

komorze i dodanie 400 ml buforu 3) Naniesienie próbek 3) Podłączenie źródła
komorowego do studzienek zasilania

3) Rozwijanie elektroforegramu przy

napięciu = 200 V

4) Wizualizacja

9
Wyniki analizy izolatów za pomocą elektroforezy SDS-PAGE:

1 2 3 4 5 6 7 8

Linie:
1) Marker 5) Ciecierzyca
2) Jajko kurze 6) Soczewica czerwona
3) Nasiona grochu 7) Mleko bez laktozy
4) Otręby pszenne 8) Mleko

Skład i masy cząsteczkowy

białek wzorcowych (linia
„Marker”). W doświadczeniu
użyto układu typu „Tris-
Glicyna”:

10
 Sprawozdanie (punkt 3):
- Na podstawie uzyskanego elektroforegramu wypisz 3-5 mas cząsteczkowych białek
wchodzących w skład każdego z izolatów. Masy oszacuj na podstawie wzorca w linii „1)
Marker”) w odniesieniu do załączonego zdjęcia wzorca o znanych masach w układzie Tris-
Glicyna.
- Sformułuj krótkie wnioski odnoście czystości, składu izolatów odzwierzęcych i roślinnych

CZĘŚĆ II b – Degradacja BSA oraz wybranego izolatu przez enzymy: trypsyna, chymotrypsyna
i papaina, oraz wizualizacja produktów degradacji za pomocą elektroforezy typu SDS-PAGE

Wstęp teoretyczny

Enzymy są to wielkocząsteczkowe i w zdecydowanej większości, białkowe katalizatory

przyspieszające specyficzne reakcje chemiczne poprzez obniżenie ich energii aktywacji. Enzymy są
wysoce specyficzne wobec substratów, więc dany enzym jest w stanie katalizować zaledwie kilka
reakcji spośród wielu możliwych dla danych substratów. Budowa enzymów jest niezwykle
zróżnicowana i są tworzone struktury zawierające od kilkudziesięciu do ponad 2500 reszt
aminokwasowych. Aktywność enzymów jest determinowana przez ich strukturą czwartorzędową oraz
budowę kieszeni substratowej. Dodatkowo, niektóre enzymy mogą zawierać również miejsca
wiązania kofaktorów – niezbędnych do aktywności enzymatycznej lub jej regulacji.
Podział enzymów jest niezwykle złożony ze względu na budowę, funkcje, specyficzność
i występowanie. W celu uregulowania i ujednoznacznienia nazewnictwa enzymów, Komitet
Nazewnictwa (ang. Nomenclature Committee) Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii
Molekularnej (ang. International Union of Biochemistry and Molecular Biology) w latach 1956–1972
opracował dla nich nomenklaturę naukową – numer EC. Według niej, każdy enzym jest opisany przez
ciąg czterech segmentów cyfr, oddzielonych od siebie kropką, poprzedzonych literami „EC” (Enzyme
Commission lub Enzyme Catalogue): EC x.xx.xx.xx.

Pierwsza cyfra dzieli enzymy, według mechanizmu reakcji przez nie katalizowanych, na siedem
głównych klas[100][101][102]:

• EC 1 oksydoreduktazy: katalizują reakcje utleniania i redukcji,

• EC 2 transferazy: przenoszą grupy funkcyjne,
• EC 3 hydrolazy: katalizują hydrolizę różnych wiązań,
• EC 4 liazy: rozcinają różne wiązania na drodze innej niż hydroliza czy utlenianie,
• EC 5 izomerazy: katalizują zmiany izomeracyjne cząsteczek,
• EC 6 ligazy: łączą cząsteczki wiązaniami kowalencyjnymi,
• EC 7 translokazy: katalizują ruch jonów i cząsteczek przez błony lub ich rozdział wewnątrz błon.

11
 Aktywność enzymów jest zależna od parametrów fizykochemicznych środowiska tj.:
temperatury, pH, siły jonowej i innych. Maksimum aktywności enzymu leży w pewnym optymalnym
zakresie danego parametru.

Trypsyna (EC 3.4.21.4) – enzym trawienny wytwarzany przez część zewnątrzwydzielniczą trzustki.
Jest wydzielany w postaci proenzymu – trypsynogenu, który wchodzi w skład soku trzustkowego.
Trypsyna należy do endopeptydaz (hydroliza środkowych części łańcuchów białkowych). Katalizuje
hydrolizę wiązań peptydowych w miejscach, w których grupy karbonylowe należą do argininy albo
lizyny. W centrum aktywnym trypsyny znajduje się seryna jako główny aminokwas kontaktowy, przez
co trypsynę zalicza się do podklasy endopeptydaz serynowych. Optymalne warunki działania trypsyny
to pH 7–9 i temperatura 37 °C.

Chymotrypsyna (EC 3.4.21.1) – enzym trawienny, produkowany przez trzustkę i wchodzący w skład
soku trzustkowego. Zostaje uczynniony przez trypsynę. Wykazuje maksimum aktywności przy pH 8-9
i temperaturze 37 °C. Chymotrypsyna hydrolizuje wiązania peptydowe po karboksylowej stronie
aminokwasów zawierających aromatyczny łańcuch boczny, oraz rozgałęziony alifatyczny łańcuch
boczny: Met, Trp, Phe, Tyr, Leu.

Papaina (EC 3.4.22.2) – enzym z podklasy proteaz, a dokładniej proteaz cysteinowych o niskiej
specyficzności substratowej (proteoliza zachodzi niezależnie od tego jakie aminokwasy sąsiadują
z wiązaniem peptydowym). Papaina jest otrzymywana z mleczka zielonych owoców i liści
melonowca właściwego. Optimum działania tego enzymu przypada na pH w zakresie 4.6 - 8.6, co
ciekawe optimum temp. Wynosi około 65 °C.

Cel ćwiczenia „II b”

Celem tej części ćwiczenia jest przeprowadzenie degradacji enzymatycznej BSA oraz izolatu jajka
kurzego za pomocą trzech enzymów: trypsyny, chymotrypsyny i papainy. Dodatkowo, celem będzie
porównanie efektywności degradacji BSA i izolatu jajka kurzego przez enzymy, po uprzednim
traktowaniu odczynnikiem redukującym (DTT)

Wykonanie ćwiczenia „ II a”

Przygotowanie BSA:
BSA rozpuść do stężenia równego 20 mg/ml w wodzie (około 1 ml roztworu w probówce 1,5 ml).
Następnie przygotuj próbkę do uprzedniej, częściowej denaturacji: 315 µl roztworu BSA + 35 µl 0,5M
DTT + 315 µl wody. Próbkę z DTT denaturuj przez 30 min w temp. 75 °C.

Przygotowanie izolatu jajka kurzego:

Izolat jajka kurzego rozcieńcz woda do steezenia 5 mg/ml. Nastepnie przygotuj próbkę do uprzedniej,
częściowej denaturacji: 120 µl izolatu + 6,3 µl 0,5 M DTT. Próbkę z DTT denaturuj przez 30 min w
temp. 75 °C.

Aktywacja papainy:
Papaina przed wykonaniem trawienia musi zostać aktywowana poprzez 2 x rozcieńczenie próbki o steż.
10mg/ml (w 10 mM octanie sodu, pH=4,5) z układem: 954,6 µl 0,1M buf. MES, pH=6,2 + 22 µl 0,5M
Cys x HCl + 22 µl 0,1 M EDTA + 1,34 µl 0,1M β-merkaptoetanolu w wodzie.

1) Próbki przygotuj wg. Tabeli 3 w probówkach o pojemności 0,5 ml.

12
Przygotowanie BSA:
BSA rozpuść do stężenia równego 10 mg/ml w wodzie (około 1 ml roztworu w probówce 1,5 ml).
Następnie przygotuj próbkę do uprzedniej, częściowej denaturacji: 315 µl roztworu BSA + 35 µl 0,5M
DTT + 315 µl wody. Próbkę z DTT denaturuj przez 30 min w temp. 75 °C.

Przygotowanie izolatu jajka kurzego:

Izolat jajka kurzego rozcieńcz woda do stężenia 5 mg/ml. Nastepnie przygotuj próbkę do uprzedniej,
częściowej denaturacji: 120 µl izolatu + 6,3 µl 0,5 M DTT. Próbkę z DTT denaturuj przez 30 min w
temp. 75 °C.

Aktywacja papainy:
Papaina przed wykonaniem trawienia musi zostać aktywowana poprzez 2 x rozcieńczenie próbki o stęż.
10mg/ml (w 10 mM octanie sodu, pH=4,5) z układem: 954,6 µl 0,1M buf. MES, pH=6,2 + 22 µl 0,5M
Cys x HCl + 22 µl 0,1 M EDTA + 1,34 µl 0,1M β-merkaptoetanolu w wodzie.

1) Próbki przygotuj wg. Tabel 3 i 4 w probówkach o pojemności 0,5 ml. By uniknąć pomyłki prosimy o
odpisywanie probówek zgodnie z oznaczeniami w tabeli.

Tabela 3: przygotowanie próbek izolatu jajka do degradacji enzymatycznej

Próbka Enzym Bufor [µl] 0,2M CaCl2 Jajko o steż. Objętość
[µl] 5 mg/ml enzymu [µl]
j1T Trypsyna 149 1 40 10
(0,1M HEPES,
pH=8)
j2Ch Chymotrypsyn 149 1 40 10
Jajko

a (0,1M Tris, pH=7,8)

j3P Papaina 150 - 40 10

(0,1M MES, pH=6,2)

j4T Trypsyna 149 1 40 10

(0,1M HEPES,
Jajko + DTT

pH=8)
j5Ch Chymotrypsyn 149 1 40 10
a (0,1M Tris, pH=7,8)

j6P Papaina 150 - 40 10

(0,1M MES, pH=6,2)

Tabela 4: przygotowanie próbek BSA do elektroforezy żelowej

Próbka Enzym Bufor [µl] 0,2M CaCl2 BSA o steż. Objętość

[µl] 5 mg/ml enzymu [µl]
b1T Trypsyna 149 1 40 10
(0,1M HEPES,
pH=8)
b2Ch Chymotrypsyn 149 1 40 10
BSA

a (0,1M Tris, pH=7,8)

b3P Papaina 150 - 40 10

(0,1M MES, pH=6,2)

b4T Trypsyna 149 1 40 10

(0,1M HEPES,
BSA + DTT

pH=8)
b5Ch Chymotrypsyn 149 1 40 10
a (0,1M Tris, pH=7,8)

b6P Papaina 150 - 40 10

(0,1M MES, pH=6,2)

13
 2) Przygotowane próbki trzymaj w lodzie. Następnie przenieś każdą z nich na płytkę 96-dołkową i
inkubuj w wytrząsarce przez 35 minut, w temp. 37 °C.

3) W probówkach o objętości 0,5 ml przygotuj roztwory: 8 µl wody + 6 µl x4 buforu obciążającego

SDS. Liczba probówek powinna być taka sam jak liczna inkubowanych próbek.

4) Po zakończeniu inkubacji próbek z enzymami, pobierz z każdej z nich po 10 µl i dodaj do

probówek przygotowanych w pkt. 3. Następnie próbki ogrzewaj w temp. 75 °C przez 10 minut.

5) Nanieś po 20 µl każdej z próbek na żale, przygotowany w taki sam sposób jak w „części II a”.
Sposób wizualizacji żeli jest analogiczny.

Wyniki analizy degradacji izolatu jajka kurzego i BSA pomocą elektroforezy SDS-PAGE:

Wyniki dla izolatu jajka kurzego

Tryp. Tryp. Chym. Chym. Pap. Pap.

Marker Jajko +DTT +DTT
+DTT

Skróty: Tryp. – próbka z dodatkiem trypsyny; Chym. – próbka z dodatkiem chymotrypsyny,

Pap. – próbka z dodatkiem papainy. Dodatkowe oznaczenie w postaci „+DTT” oznacza
próbki białka/izolatu uprzednio denaturowane.

14
Wyniki dla BSA
Tryp. Tryp. Chym. Chym. Pap. Pap.
Marker BSA +DTT
+DTT +DTT

Skróty: Tryp. – próbka z dodatkiem trypsyny; Chym. – próbka z dodatkiem chymotrypsyny,

Pap. – próbka z dodatkiem papainy. Dodatkowe oznaczenie w postaci „+DTT” oznacza
próbki białka/izolatu uprzednio denaturowane.

Sprawozdanie (punkt 4):

- Na podstawie analizy uzyskanych elektroforegramów napisz jaki jest wpływ poszczególnych
enzymów na profil degradacji BSA ora izolatu jajka kurzego (wielkość powstałych produktów,
ich liczba).
- Napisz wnioski płynące dla porównania próbek, które zostały poddane degradacji bez i z
uprzednią, częściową denaturacją za pomocą DTT. Dlaczego w większości próbek widoczne są
różnice?

15
 CZĘŚĆ III – ELEKTROFOREZA KAPILARNA

Wstęp teoretyczny

Elektroforeza jest to proces elektrokinetyczny, w którym cząsteczki obdarzone ładunkiem

elektrycznym przemieszczają się, w wyniku przyłożonego pola elektrycznego, w kierunku elektrody
o przeciwnym znaku. Poszczególne cząsteczki poruszają się z różną prędkością, zależnie od ich
kształtu, rozmiaru, ładunku oraz oporów ruchu środowiska. Na podstawie tych właściwości można
dokonać szybkiego rozdzielenia różnych cząsteczek.
Elektroforeza wykorzystywana jest w takich dziedzinach jak: biologia molekularna, biochemia
kwasów nukleinowych i białek, weterynaria, medycyna sądowa, diagnostyka medyczna, kontrola
jakości żywności.

Elektroforetyczna separacja cząsteczek zachodzi na podstawie różnic w prędkości poszczególnych,

naładowanych indywiduów znajdujących się w buforze. Kierunek i prędkość rozdziału jest określona
przez sumę dwóch
2.2.1 wektorów:
Ruchliwość ruchliwości elektroforetycznej i przepływu elektroosmotycznego EOF.
elektroforetyczna
2.2.1 Ruchliwość elektroforetyczna
Podstawą rozdziałuPodstawą elektroforezie
rozdziału w elektroforezie kapilarnej są różnice w ruchliwościach
Podstawą wrozdziału kapilarnej
w elektroforezie są różnice
kapilarnej w ruchliwościach
są różnice elektroforetycznych
w ruchliwościach
poszczególnych składników
elektroforetycznych próbki. Każda
poszczególnych cząsteczka
składników związku
próbki. chemicznego,
Każda która
cząsteczka związku
elektroforetycznych poszczególnych składników próbki. Każda cząsteczka związku
posiada ładunek
elektryczny, migruje która
chemicznego, wzdłuż kapilary
posiada ładunekz elektryczny
prędkością elektroforetyczną.
migruje wzdłuż kapilary zPrędkość
prędkościąelektroforetyczna
chemicznego, która posiada ładunek elektryczny migruje wzdłuż kapilary z prędkością
definiowana jest jako iloczyn ruchliwości elektroforetycznej ! i natężenia pola elektrycznego E.
elektroforetyczną. Prędkość elektroforetyczna definiowana jest jako iloczyn ruchliwości
elektroforetyczną. Prędkość elektroforetyczna definiowana jest jako iloczyn ruchliwości
elektroforetycznej µ i natężenia pola elektrycznego E.
elektroforetycznej µ i natężenia pola elektrycznego E.

Równ. 1. 1:
Równanie Prędkość elektroforetyczna
Prędkość danej
elektroforetyczna cząsteczki [3]
cząsteczki
Równ. 1. Prędkość elektroforetyczna danej cząsteczki [3]

Natężenie pola elektrycznego zależy od zastosowanej różnicy napięć U i

Natężenie pola elektrycznego zależy od zastosowanej różnicy napięć U i
Natężenie polapomiędzy
odległości elektrycznego
katodą azależy
anodą, od stosowanej
w tym przypadkuróżnicy napięć
mierzone U i odległości
całkowitą długością pomiędzy
odległości
katodą pomiędzy katodą a anodą, w tym przypadku mierzone całkowitą
a anodą w tym przypadku mierzone całkowitą długością kapilary L. długością
kapilary L.
kapilary L.

Równ. 2. Natężenie pola elektrycznego [3]

Równ. 2. Natężenie pola elektrycznego [3]
Równanie 2: Natężenie pola elektrycznego
Ruchliwość elektroforetyczna jest wielkością charakterystyczną dla danego jonu. Jej
Ruchliwość elektroforetyczna jest wielkością charakterystyczną dla danego jonu. Jej
wartość zależy od ładunku i promienia jonu oraz od lepkości buforu.
wartość zależy od ładunku i promienia jonu oraz od lepkości buforu.

Równ. 3. Ruchliwość elektroforetyczna danego jonu [3]

Równ. 3. Ruchliwość elektroforetyczna danego jonu [3]
gdzie: q- ładunek jonu 16
gdzie: q- ładunek jonu
r- promień jonu
r- promień jonu
η- lepkość buforu
 Równ. 2. Natężenie pola elektrycznego [3]

Ruchliwość elektroforetyczna jest wielkością charakterystyczną dla danego jonu. Jej

Ruchliwość
wartość zależyelektroforetyczna jest jonu
od ładunku i promienia wielkością charakterystyczną
oraz od lepkości buforu. dla danego jonu. Jej wartość
zależy od ładunku i promienia jonu oraz od lepkości buforu.

Równ. 3. Ruchliwość elektroforetyczna danego jonu [3]

Równanie 3 Ruchliwość elektroforetyczna danego jonu
gdzie: q- ładunek jonu
r- promień jonu
gdzie: q- ładunek jonu
η- lepkość buforu r-promień jonu
Ƞ-lepkość buforu

Z powyższego równania wynika, że małe jony o dużym ładunku wykazują większą

Z powyższego
ruchliwość równania W
elektroforetyczną. wynika,
związkużez małe jony o szybciej
tym, migrują dużym ładunku wykazują
w stosunku do większą
ruchliwość elektroforetyczną i dlatego migrują szybciej niż duże cząsteczki o małym
dużych cząsteczek
ładunku. Ważnyo wpływ
małym na ładunku. Ważnyma
ruchliwość wpływ
takżenaskład
ruchliwość
buforu-maimtakże składstężenie i siła
wyższe
jonowa
buforu. buforu,stężenie
Im wyższe tym mniejsza ruchliwość
i siła jonowa buforu,jonów.
tym mniejsza ruchliwość jonów [3].

2.2.2 Przepływ elektroosmotyczny 13

2.2.2 Przepływ elektroosmotyczny
Ważnym zjawiskiem,
Ważnym jakie zachodzi
zjawiskiem w elektroforezie
zachodzącym kapilarnej jest
w elektroforezie przepływ jest przepływ
kapilarnej
Ważnym zjawiskiem, jakie zachodzi w elektroforezie kapilarnej jest przepływ
elektroosmotyczny.
elektroosmotyczny. Polega on na Polega
ruchuon cieczy
na ruchu cieczy wypełniającej
wypełniającej kapilarę, kapilarę w kierunku jednej z
w kierunku
elektrod. W zetknięciu
elektroosmotyczny. Polegaz onroztworem
na ruchu buforu, w pH > 3, następuje
cieczy wypełniającej kapilarę, wjonizacja
kierunkugrup
ednej z elektrod. W zetknięciu z roztworem buforu przy pH > 3, następuje jonizacja
silanolowych
jednej kapilary
z elektrod. i jej wewnętrzna
W zetknięciu ścianabuforu
z roztworem ładuje przy
się ujemnie
pH > 3, następuje jonizacja
grup silanolowych kapilary i jej wewnętrzna ściana ładuje się ujemnie:
grup silanolowych kapilary i jej wewnętrzna ściana ładuje się ujemnie:

Naładowana ujemnie wewnętrzna ściana kapilary przyciąga dodatnio

Naładowana ujemnie wewnętrzna ściana kapilary przyciąga dodatnio
naładowane Naładowana ujemnie
jony z roztworu wewnętrzna
buforu. ścianafaz
Na granicy kapilary
tworzyprzyciąga dodatnio
się podwójna naładowane
warstwa jony z
roztworu buforu.
naładowane jony Na granicy faz
z roztworu tworzyNa
buforu. się granicy
podwójna fazwarstwa
tworzyelektryczna o potencjale
się podwójna warstwa
elektryczna oelektrokinetycznym,
potencjale elektrokinetycznym,
nazywanym nazywanym
potencjałem potencjałem
zeta (#). zeta (ξ).
elektryczna o potencjale elektrokinetycznym, nazywanym potencjałem zeta (ξ).

Równanie
Równ. 4. Potencjał
4. Potencjał zetazeta
[5]
Równ. 4. Potencjał zeta [5]
gdzie: !- grubość warstwy podwójnej
gdzie: δ- grubość warstwy podwójnej e-wartość ładunku na powierzchnię
gdzie: δ- grubość warstwy"-stała
podwójnej
przenikliwości elektrycznej buforu
e- wartość ładunku na powierzchnię
e- wartość ładunku na powierzchnię
ε- stała przenikalności elektrycznej buforu
ε- stała przenikalności elektrycznej buforu
Wartość potencjału
Wartość potencjału zeta zależy
zeta (ξ) zależy między
od kilku innymi Najważniejsze
czynników. od pH, siły jonowej
z nichi to
stężenia stosowanego
pH, siła
roztworu buforu.
Wartość potencjału zeta (ξ) zależy od kilku czynników. Najważniejsze z nich to pH, siła 17
onowa i stężenie stosowanego roztworu buforu.
jonowa i stężenie stosowanego roztworu buforu.
 gdzie: δ- grubość warstwy podwójnej
Model Sterna składa się z dwóch warstw: bezpośrednio przylegającej do ściany kapilary i
e- wartość ładunku na powierzchnię
dyfuzyjnej, która rozciąga się w głąb roztworu. Przyłożenie pola elektrycznego powoduje
poruszanie
ε- się kationów
stała z warstwyelektrycznej
przenikalności dyfuzyjnej wbuforu
kierunku katody. Ruch hydratowanych kationów
części dyfuzyjnej powoduje przepływ cieczy w kapilarze, który to nazywany jest przepływem
Wartość potencjału(ang.
elektroosmotycznym zetaElectroosmotic
(ξ) zależy od kilku
Flow, czynników.
EOF). Najważniejsze z nich to pH, siła
jonowa i stężenie stosowanego roztworu buforu.

Model Sterna składa się dwóch warstw: bezpośrednio przylegającej do ściany

kapilary i dyfuzyjnej, która rozciąga się w głąb roztworu. Po przyłożeniu pola
elektrycznego, kationy z warstwy dyfuzyjnej poruszają się w kierunku katody. Ruch
Rys. 4. Schemat
Rys. podwójnej
1. Schemat warstwy
podwójnej elektrycznej
warstwy powstającej
elektrycznej przyścianie
powstającejprzy kapilary [7]
ścianie kapilary
hydratowanych kationów części dyfuzyjnej powoduje przepływ cieczy w kapilarze,
nazywanego przepływem elektroosmotycznym (ang. Electroosmotic Flow, EOF) [7]. 14

Prędkośćprzepływu
Prędkość przepływu elektroosmotycznego
elektroosmotycznego (EOF)opisuje
opisuje wzór:
wzór:

Równ. 5. Prędkość
Równanie przepływu
5. Prędkość elektroosmotycznego
przepływu [3]
elektroosmotycznego
gdzie: ε- stała dielektryczna
gdzie: !- stała dielektryczna
ξ- potencjał elektrokinetyczny
"-potencjał elektrokinetyczny
η- lepkość buforu #-lepkość buforu
E-natężenie pola elektrycznego
E- natężenie pola elektrycznego

Przepływ elektroosmotyczny generowany jest przy ściankach kapilary na całej

jej długości. Charakteryzuje się stałą szybkością przepływu w całym jej przekroju.
Ważną zaletą EOF jest jego płaski profil, dzięki czemu elektroforeza kapilarna osiąga
wysokie sprawności mierzone liczbą półek teoretycznych. Dla porównania w HPLC
18
przepływ napędzany jest ciśnieniem, gdzie siły tarcia na ścianach kapilary powodują
powstawanie laminarnego profilu. Metoda CE osiąga wyższe sprawności niż HPLC,
 Przepływ elektroosmotyczny generowany jest przy ściankach kapilary na całej
jej charakterystyczną
Cechą długości. Charakteryzuje się elektroosmotycznego
przepływu stałą szybkością przepływu
jest jegow płaski
całymprofil,
jej przekroju.
który powstaje
dzięki temu, że generowany jest przy ścianach kapilary, na całej jej długości.
Ważną zaletą EOF jest jego płaski profil, dzięki czemu elektroforeza kapilarna osiąga Płaski profil
przepływu elektroosmotycznego jest zdecydowanie bardziej korzystny od przepływu
wysokie sprawności
laminarnego, mierzone
spotykanego liczbą półek
najczęściej teoretycznych.
w technikach Dla porównania wWHPLC
chromatograficznych. przypadku
przepływu
przepływ napędzany jest ciśnieniem, gdzie siły tarcia na ścianach kapilary powodują strony
laminarnego, który spowodowany jest przyłożeniem ciśnienia tylko z jednej
kolumny, roztwór znajdujący się w jej środku porusza się z większą szybkością niż roztwór
powstawanie
będący laminarnego
bliżej ściany kolumny.profilu.
ObecnośćMetoda CE osiąga
takiego wyższe
przepływu sprawności
skutkuje niż HPLC,
poszerzeniem próbki w
kolumnie i co płaski
ponieważ za tymprofil
idzie EOF
poszerzeniem
pozytywnie sygnałów
wpływawnadetektorze.
brak rozmycia pasm rozdzielanych
substancji [7].

Rys.5.
Rys. Profil
2. Profil przepływu
przepływu elektroosmotycznego
laminarnego i laminarnego [7]
i elektroosmotycznego

Szybkość przepływu elektroosmotycznego jest zazwyczaj większa od szybkości 15

elektroforetycznej poszczególnych jonów. Efektem tego jest ruch wszystkich rodzajów
cząsteczek: kationów, anionów i cząstek obojętnych w kierunku katody (-). Przepływ
W obecności przepływu elektroosmotycznego, prędkość z jaką dana cząsteczka
elektroosmotyczny powoduje, że faktyczna szybkość migracji cząstek przedstawia się
następującym
porusza katody νobs (prędkość obserwowana) jest wyrażona wzorem:
wzorem:
się w kierunku

!
Równ. 6. Prędkość obserwowana danej cząsteczki [3]
Równanie 6. Prędkość obserwowana danej cząsteczki

Przepływ elektroosmotyczny umożliwia jednoczesne oznaczanie analitów

W rezultacie kolejność w jakiej rozdzielane cząstki docierają do katodowego końca kapilary
dodatnio i ujemnie naładowanych.
jest następująca: jako pierwsze Zwykle
docierająszybkość EOF od anody
małe cząsteczki do katody
obdarzone dużymjestładunkiem
dodatnim,
większa, następnie większe
w porównaniu kationy oelektroforetycznych
do prędkości mniejszym ładunku,poszczególnych
kolejno nierozdzielone
anionówcząsteczki
obojętne, a na sam koniec małe jony obdarzone dużym ładunkiem ujemnym.
znajdujących się w próbce. Z tego powodu kationy, aniony i indywidua obojętne będą
się poruszały w kierunku ujemnie naładowanej katody. Innymi słowy, kationy migrują
najszybciej, następnie indywidua obojętne, które poruszają się z prędkością EOF. Na
samym końcu do okna detektora docierają aniony, które są w pewnym stopniu
przyciągane przez anodę, w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu
elektroosmotycznego [6].
19
Przepływ elektroosmotyczny można kontrolować za pomocą kilku parametrów:

a) Dodatek kationowych substancji powierzchniowo-czynnych do buforu. Oddziaływanie

takich substancji ze ścianami kapilary powoduje zmniejszenie, a nawet odwrócenie
kierunku przepływu EOF
b) Zmiana lepkości buforu. Dodatek organicznego rozpuszczalnika do buforu zmienia jego
c) Natężenie pola elektrycznego.
lepkość i zmniejsza Zbyt małe napięcie powoduje pogorszenie sprawności.
szybkość przepływu
Korzystniejsze jest stosowanie wysokich napięć, bo sprzyja to lepszemu rozdziałowi
c) Natężenie pola elektrycznego. Zbyt małe napięcie powoduje pogorszenie sprawności.
badanych cząstek. Jednak przykładanie zbyt wysokiego napięcia wpływa na wzrost
Korzystniejsze jest stosowanie wysokich napięć, bo sprzyja lepszemu rozdziałowi
niekorzystnego efektu generowania ciepła Joule’a.
badanych związków. Jednak zbyt wysokie napięcie wpływa na wzrost niekorzystnego

d) efektu generowania
Chemiczna ciepławewnętrznej
modyfikacja Joule’a. ściany kapilary prowadzi do zmniejszenia lub
d)eliminacji
Chemiczna
EOF.modyfikacja wewnętrznej ściany kapilary prowadzi do zmniejszenia lub
eliminacji EOF.
e)e) Zmiana
ZmianapH pHbuforu.
buforu. Wzrost
Wzrost pH buforu
pH buforu prowadzi
prowadzi do jonizacji
do lepszej lepszej jonizacji grup
grup silanolowych,
silanolowych, powodując
powodując wzrost wzrost
ładunku ładunkunaujemnego
ujemnego ścianachna ścianach
kapilary kapilary
i wzrost EOFi wzrost EOF.

f) Zmiana stężenia lub siły jonowej buforu. Wzrost tych czynników generuje spadek
f) Zmiana stężenia lub siły jonowej buforu. Wzrost tych czynników generuje spadek
potencjału elektrokinetycznego i zmniejszenie EOF.
potencjału elektrokinetycznego i zmniejszenie EOF [3].

2.3 Sprawność
Sprawność elektroforezy
rozdziału kapilarnej
eletroforezy kapilarnej wyrażona jest liczbą półek teoretycznych (N).
Sprawność
Im wyższa rozdzielania
jest sprawność, jest sąwyrażona
tym piki węższe, aliczbą półek próbek
indywidua teoretycznych
są lepiej (N). Im
rozdzielane.
wyższa jest
Rozmycie sprawność,
strefy próbki, tym piki są węższe,
wpływające a indywidua
negatywnie próbekrozdzielania
na sprawność są lepiej rozdzielane.
może wynikać
Rozmycie strefy próbki, wpływające negatywnie na sprawność rozdzielania może
ze zbyt dużej objętości wprowadzonej próbki czy gradientu temperatury.
wynikać ze zbyt dużej objętości wprowadzonej próbki czy gradientu temperatury [5].

Równanie
Równ.7.7.Liczba
Liczbapółek
półekteoretycznych.
teoretycznych [5]

gdzie: !-ruchliwość elektroforetyczna

V-wielkość przyłożonego napięcia elektrycznego
gdzie: µ- ruchliwość elektroforetyczna
D-współczynnik dyfuzji
V- wielkość przyłożonego napięcia prądu elektrycznego
D- współczynnik dyfuzji

2.4 Aparatura 20

Zestaw do elektroforezy kapilarnej składa się z następujących elementów:

Aparatura do elektroforezy kapilarnej składa się z:

1. Kapilary – najczęściej stosowanymi kapilarami są te wykonane ze stopionej krzemionki

(SiO2), pokryte poliimidową warstwą, chroniącą kapilarę przed uszkodzeniami. Warstwa
ta nadaje elastyczność kapilarze. Średnica wewnętrzna kapilar wynosi 10 - 100 µm, a ich
długość 20 - 100 cm. Końce kapilary umieszczone są w specjalnych buforach. Kapilara
termostatowana jest za pomocą płynu chłodzącego.
2. Zasilacza wysokiego napięcia – napięcie 10-30 kV przykładane jest przy pomocy
dwóch platynowych elektrod umieszczonych w pojemnikach z buforami.
3. Systemu do wprowadzania próbek
4. Detektora; Stosowane metody detekcji:
- spektrofotometryczna (absorpcyjna i fluorescencyjna)
- elektrochemiczna (konduktometryczna i amperometryczna)
- spektrometria mas.
5. Systemu sterowania układem i zbierania danych.

Schemat podstawowego zestawu został przedstawiony na rysunku poniżej.

Rys. 3. Schemat aparatury do elektroforezy kapilarnej

21
Rodzaje elektroforezy kapilarnej:

a) Strefowa elektroforeza kapilarna (ang. Capillary Zone Electrophoresis; CZE)

Rozdział przebiega w kapilarze, która w całej swej objętości wypełniona jest buforem
separacyjnym. Indywidua badanej próbki, które obdarzone są ładunkiem, w wyniku
przyłożonego napięcia, poruszają się z różną prędkością.

b) Izotachoforeza kapilarna (ang. Capillary Isotachophoresis; CITP)

Badana próbka umieszczana jest w kapilarze, pomiędzy dwa bufory: „wiodący” i

„kończący”. Bufor „wiodący” charakteryzuje się tym, że zawiera jony o ruchlowości
większej niż jony próbki. Natomiast składnikami buforu „kończącego” są jony o
ruchliwości mniejszej niż jony próbki. Po przyłożeniu pola stałoprądowego, składniki
próbki migrują między buforami i jednocześnie rozdzielają się. Rozdział możliwy jest ze
względu na ich różnorodną ruchliwość. Wynikiem tego typu elektroforezy jest
izotachoforegram w postaci schodkowej.

c) Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna (ang. Micellar Electrokinetic

Chromatography; MEKC)

W tej technice do buforu dodaje się związek powierzchniowo czynny, który powyżej
charakterystycznego stężenia tworzy micele. Rozdział składników neutralnych próbki oraz
tych obdarzonych ładunkiem zachodzi w wyniku ich oddziaływań z fazą micelarną.
Prowadzi to do lepszego rozdziału indywiduów jonowych oraz umożliwia rozdzielenie
komponentów neutralnych.

d) Żelowa elektroforeza kapilarna (ang. Capillary Gel Electrophoresis; CGE)

Rozdział składników próbki zależy od masy cząsteczkowej zawartych w niej związków. W

tej technice kapilarę wypełnia się żelem poliakrylamidowym lub agarowym. Żel zawiera
pory o odpowiedniej średnicy i działa jak sito molekularne. Składniki badanej próbki
wędrują wzdłuż kapilary, zależnie od swych rozmiarów. Najszybciej te o małych
rozmiarach, a najwolniej związki o dużej masie cząsteczkowej.

e) Kapilarne ogniskowanie izoelektryczne (ang. Capillary Isoelectric Focusing; CIEF)

Składniki mieszanin (związki o charakterze amfiprotycznym) rozdzielane są na podstawie

różnic ich punktów izoelektrycznych (pI). W kapilarze umieszcza się amfolity
przenoszące, które tworzą gradient pH. U wlotu kapilary umieszcza się anolit-kwas
fosforowy (V), a u wylotu katolit-wodorotlenek sodu. Z tego względu wartość pH jest
wysoka przy katodzie, a niska przy anodzie. Badaną mieszaninę wprowadza się do
kapilary, przykłada napięcie i składniki próbki migrują do momentu osiągnięcia strefy pH,
równego ich pI.

22
 Żelowa elektroforeza kapilarna (CGE)-wykonanie

Aparatura: PA 800 plus Pharmaceutical Analysis System firmy Beckman Coulter

Kapilara: średnica wewnętrzna 50 !m i długości 20 cm do okna detekcji (całkowita długość 30.2cm);
Termostatowana za pomocą płynu chłodzącego (tzw. chłodziwa)
Detekcja: długośc fali-220 nm
Reagenty:
• SDS-MW bufor żelu, pH 8, 0.2% SDS
• SDS-MW bufor próbki, 100 mM Tris-HCl, pH 9, 1% SDS
• SDS-MW standardy wielkości (10-225 kDa, 16mg/mL)
• Standard wewnętrzny, białko 10 kDa, 5mg/mL
• Kwasowy roztwór przemywający (0,1 N HCl)
• Zasadowy roztwór przemywający (0,1 N NaOH)
W stosowanej
Table 2. Average RMTmetodzie CGE
and Molecular używa
Weight się dodecylosiarczanu
(determined (VI)
by CE) of BSA. The average sodu
slope, (SDS),
intercept, który denaturuje
and R-squared from plotting białka
1/RMT vs. log
oraz wiąże
(Molecular sięofzthenimi
Weight w stałym
molecular stosunku,
weight standards) are powodując
shown. The RSDsrównomierny rozkład
for each organisation for theładunku
RMT and na jednostkę
Molecular Weight (MW) are
shown
masy. Do analizowanych próbek dodaje się również 2-merkaptoetanol, aby zredukować występujące
w białkach mostki disulfidowe. Relative Migration
Time (RMT)
Slope Intercept R-squared Molecular Weight
of BSA (kD)
Stężenie BSA 1 mg/mL
Company A Average 1.57 )2.71 6.59 0.995 72.9
Company B Average 1.50 )2.88 6.76 0.995 70.2
Company C Average 1.56 )2.70 6.59 0.996 72.1
Company D Average 1.56 )2.73 6.60 0.995 71.0
Company E Average 1.56 )2.71 6.59 0.996 71.2
Company F Average 1.56 )2.71 6.60 0.995 72.5
Company G Average 1.57 )2.71 6.59 0.995 72.8
Company H Average 1.56 )2.73 6.62 0.995 72.4
Average 1.55 )2.74 6.62 0.995 71.9
RSD 1.32 2.10 0.85 0.02 2.26

RMT RSD MW RSD

Company A Average 0.32 1.28

Company B Average 0.37 2.30
Company C Average 0.07 0.55
Company D Average 0.16 4.02
Company E Average 0.10 0.42
Company F Average 0.45 1.92
Company G Average 0.58 2.38
Company H Average 0.09 0.28

0.04 0.04

Rys. 4.PDA - 220nm

Elektroforegram
MWSS-Rep4 standardów
25
wielkości
.2 2
Name 12 .89
n 17 192
0.03 Migration Time mi 0.03
bu A .
ta l BS n 16 2
ac i .34
a-L um 21
alb e B
Ov las
0.02 ory 0.02
ph .50
os
AU

Ph 23
e
as
sid 0
cto .7 0
0.01 Gala 25 0.01
25 3 b - in
. 6 3 o s
17 14
.2 My
e
ras
hyd
0.00 n 0.00
i cA
rb on
Ca

0 5 10 15 20 25 30
Minutes
Time (min)

Fig. 1. Representative electropherograms of the molecular weight standards

turing process controls employed. The biologics. The major drawbacks of con- and replaceable after each CE analysis.
characterisation also assists in assessing ventional SDS-PAGE have been its Replacement results in enhanced overall
the effect that process changes may have inconvenience and the irreproducibility precision and robustness [19] compared
23
Rys. 5. Elektroforegram
0.04
PDAstrength,
BSA
- 220nm quality and
i standardu wewnętrznego. 0.04
upon the identity, associated with the staining/destaining to fixed gels. There are, however, dis-
BSA-Rep2
purity of a Name
drug; as these factors may steps used in analyte detection, the use of advantages in the use of CE such as
impact0.03 Migration Time
the safety and efficacy [2] of a toxic reagents and high0.03
intra- and inter- poor mass sensitivity with UV detection
 Tabela 1. Względne czasy migracji wyznaczone w programie Karat 32 dla poszczególnych
standardów wielkości

Względny czas migracji standardów

10kD 20kD 35kD 50kD 100kD 150kD 225kD

Próba A 1 1.17 1.33 1.46 1.75 1.92 2.10

Próba B 1 1.15 1.30 1.34 1.67 1.82 1.97

Próba C 1 1.16 1.32 1.46 1.74 1.92 2.10

Próba D 1 1.17 1.33 1.47 1.75 1.92 2.09

Próba E 1 1.16 1.32 1.46 1.74 1.92 2.09

Próba F 1 1.16 1.32 1.46 1.74 1.91 2.09

Próba G 1 1.17 1.33 1.47 1.75 1.92 2.10

Próba H 1 1.16 1.32 1.46 1.74 1.90 2.07

Tabela 2. Względne czasy migracji BSA wyznaczone w programie Karat 32

Względny czas migracji BSA

Próba A 1.57

Próba B 1.50

Próba C 1.56

Próba D 1.56

Próba E 1.56

Próba F 1.56
Próba G 1.57

Próba H 1.56

Rys. 5. Elektroforegram standardów wielkości

Sprawozdanie (punkt 5):

- korzystając z powyższych wyników wyznacz masę cząsteczkową BSA w programie Excel.
- porównaj masę cząsteczką BSA oszacowaną za pomocą elektroforezy żelowej typu SDS-PAGE
oraz obliczonej na podstawie elektroforegramów z elektroforezy kapilarnej. Która z technik daje
lepsze przybliżenia masy cząsteczkowej?
24

Instrukcję opracowali: mgr Katarzyna Olkiewicz, dr Przemysław Karpowicz, dr Aleksandra Walewska