Inżynieria komórki zwierzęcej

Ćwiczenie 4
Zapłodnienie in vitro (przygotowanie
plemników, kapacytacja, ustalenie
koncentracji, inseminacja oocytów)
2009/2010

Niski poziom cholesterolu i

glikozaminoglikanów w obecności wapnia
wspomaga reakcję akrosomalną

Dodanie plazmy
nasienia umożliwia
dekapacytację

Usuwanie cząstek
cholesterolu i innych
Ejakulowane plemniki składników plazmy
pokryte są
cząsteczkami
nasienia
Usunięcie plazmy
cholesterolu i innymi nasienia i martwych Wydzielina macicy w
składnikami plzamy
nasienia
plemników obecności estrogenów
wspomaga proces
usuwania cząstek z
plemników

Proces kapacytacji plemników w drogach rodnych

samicy

Wydzielenie ruchliwej frakcji plemników

1. Wirowanie w
gradiencie
Percoll`u
2. Metoda
podpływania
plemników - swim
up

1
 Wirowanie w gradiencie Percoll`u
(plemniki knura)

plemniki
wirowanie
90% 35 min, x300g

90% i 40% 40% 40%

plemniki martwe i
roztwory słabe
Percoll`u
90% 90%
40% (kolumna stężeń)
Plemniki żywe

Metoda podpływania (swim-up,

nasienie buhaja)

1h, 39ºC Wirowanie

Ruchliwe
plemniki supernatantu w
podpływają z celu zagęszczenia
osadu do plemników
pożywki

Podwarstwienie
zawiesiny
nasienia

Końcowa koncentracja plemników w

kropli inseminacyjnej (bydło)

1 x 106 plemników / ml medium w kropli

(Percoll gradient, swim up)

1,5 x 106 plemników /ml medium w kropli

(sperm washing)

2
 Ocena koncentracji plemników

- wykonać rozcieńczenie plemników w wodzie (zabicie komórek) 1:10

000;
- nanieść po 7 µl zawiesiny plemników na każde z 2 pól stolika
- policzyć wszystkie plemniki na 9 dużych polach (zgodnie z zasadami)
- wyliczyć wartość średnia dla 1 pola
- wstawić wartość średnia do wzoru
(wartość średnia x 107)/(37,5 x 106)

- określenie koncentracji końcowej plemników:

wartość = 1 (dodać 20 µl nasienia do 500 µl kropli co daje 1,5 x 106
plemników/ml
wartość = 2 (do zawiesiny nasienia dodać taką sama objętość pożywki
do inseminacji)

Wykorzystując niniejszy system w każdym doświadczeniu dodaje się

taką sama objętość zawiesiny nasienia w celu uzyskania końcowej
koncentracji plemników

Kapacytacja plemników in vitro

Kapacytacja – przygotowanie plemnika

do penetracji oocytu, proces ten
obejmuje zmiany stabilności i
funkcjonalności błony komórkowej bez
zmian morfologii

Właściwości kapacytowanych
plemników – hiperruchliwość, lepkośc
błony (sklejanie się główek)

Wywoływanie kapacytacji in vitro:

Inkubacja z heparyna lub kofeiną
Podwyższenie pH pożywki

3
 Reakcja akrosomalna

Reakcja akrosomowa – liczne

fuzje błony plazmatycznej
plemnika z zewnętrzną błoną
akrosomu, co prowadzi do
uwolnienia enzymów
(hialuronidaza, akrozyna,
neuraminidaza itp.)
Funkcją uwolnionych enzymów
jest osłabienie połączeń
międzykomórkowych wieńca
promienistego i penetracja
osłonki przejrzystej oocytu

Warunki wspólnej inkubacji gamet bydła

• objętość kropli hodowlanej – 475µ

µl
• objętość dodawanego nasienia – 20ul
• dodatek PHE (penicylina, hypotauryna, epinefryna) –
4ul
• temperatura - 39°C
• warunki atmosferyczne – 5% CO2 w
•powietrzu
• podwyższona wilgotność
• czas – 18-20 godzin

Reakcja korowa (reakcja zony)

Uwolnienie
zawartości ziaren
korowych do
przestrzeni blok
okołożółtkowej, co ziarna polispermii
powoduje twardnienie korowe
osłonki przejrzystej i
niszczy receptory
plemników. Proces
ten zapobiega
polispermii.

4
 Penetracja oocytu i powstawanie
przedjądrzy

Zygota bydła Zygota człowieka

(barwienie (przedjądrze
Hoechst) męskie i żeńskie)

Zaburzenia procesu zapłodnienia

bydło
- polispermia (A,B)
- asynchroniczny rozwój
przedjądrzy
A
- brak cytokinezy
- brak fuzji przedjądrzy
-degeneracja przedjądrza

żubr