Subscribe to DeepL Pro to translate larger documents.

Visit www.DeepL.com/pro for more information.

Асептична техніка та протокол культивування клітин (2017)

Цей протокол описує основні процедури асептичної техніки для культури клітин у біотехнології. Цей
протокол слід використовувати разом зі сторінками 65-66 вашого підручника. Однією з основних умов
успішної асептичної техніки є особиста гігієна. Шкіра людини містить природну і активну популяцію
бактерій і грибків, які виділяються в мікроскопічних кількостях і поширюються повсюдно. На
превеликий жаль, для роботи з культурами клітин середовище та умови інкубації забезпечують ідеальне
середовище для росту цих потенційних мікробних забруднювачів. Ця процедура описує кроки для
запобігання занесенню мікрофлори шкіри людини під час асептичних маніпуляцій з культурами. Кожен
предмет, який контактує з культурою, повинен бути стерильним. Це стосується як прямого контакту
(наприклад, піпетка для перенесення клітин), так і непрямого (наприклад, колби або контейнери, що
використовуються для тимчасового зберігання стерильного реагенту перед аліквотуванням розчину в
стерильне середовище). У біотехнологічному шляху ми будемо переважно використовувати обладнання,
яке потрібно буде стерилізувати, використовуючи методи цього протоколу.

Матеріали: Антибактеріальне мило, 70% ізопропанол, 91% ізопропанол, чисті лабораторні халати або
халати, нелатексні хірургічні рукавички, чиста і тиха робоча зона, пальники Бунзена

Вживайте особистих заходів обережності:

1. Безпосередньо перед асептичними маніпуляціями довге волосся зав'яжіть ззаду на голові. Інтенсивно
скрабуйте руки та кисті антибактеріальним милом щонайменше 2 хвилини. Поверхневе намилювання
більше схильне до розпушування, ніж до видалення відшарованої шкіри та мікробних забруднень.
Шкірна флора, що нещільно прилягає до шкіри, легко зміщується і може потрапити в стерильні
контейнери.
2. Одягайте відповідний одяг. Для безпечних операцій зі стерильним заповненням використовуйте
чисті лабораторні халати та латексні рукавички. При маніпуляціях з біологічними агентами слід
носити захисні окуляри.
3. Часто дезінфікуйте руки в рукавичках 70% ізопропанолом під час виконання асептичних робіт. Хоча
рукавички, можливо, спочатку були стерильними, коли їх одягли, вони, безсумнівно, контактували з
багатьма нестерильними предметами під час використання. Вимийте руки після зняття рукавичок.

Підготуйте та підтримуйте робочу зону:

4. Виконуйте всі асептичні роботи в чистому робочому просторі, без забруднюючих повітряних потоків
і протягів. Для оптимального контролю навколишнього середовища використовуйте пальник Бунзена
для підтримки постійного висхідного повітряного потоку (рис. 1). Ніколи не залишайте пальник без
нагляду під час використання цієї техніки. Один студент завжди повинен бути присутнім, якщо його
немає, вимкніть пальник.
5. Звільніть робочий простір від усіх предметів, що не стосуються виконуваної асептичної операції.
6. Протирайте робочу поверхню до і після використання 70% ізопропанолом або іншим відповідним
дезінфікуючим засобом.
7. Де це можливо, протирайте предмети дезінфікуючим засобом, коли вони вносяться в чистий робочий
простір. Розташовуйте необхідні предмети в робочому просторі в логічній послідовності від чистого до
брудного, щоб уникнути переміщення забрудненого матеріалу (наприклад, піпетки для перенесення
культур) над чистими предметами (наприклад, колбами зі стерильними поживними середовищами).
8. Після завершення асептичних робіт негайно приберіть з робочого місця будь-які великі забруднені
предмети або інші матеріали, призначені для утилізації (наприклад, старий культуральний матеріал,
відпрацьовані поживні середовища, контейнери для відходів), і помістіть їх у спеціальні пакети або
каструлі для автоклавування. Дезінфікуйте робочий простір, як на кроці 6.

Полум'ям стерилізують отвір посудини:

9. Якщо ви правша, візьміть посудину в ліву руку під кутом ∼45° (або якомога більше, щоб не розлити
вміст; рис. 2) і обережно зніміть кришку. Не допускайте, щоб будь-яка частина кришки, яка
безпосередньо контактує з вмістом посудини, торкалася будь-яких забруднюючих предметів
(наприклад, рук або робочого столу). В ідеалі, на практиці, потрібно вміти тримати кришку в згині
мізинця правої руки, маючи при цьому можливість маніпулювати петлею для посіву або піпеткою
іншими пальцями руки. Утримання посудини у вертикальному положенні під час відкривання запобігає
потраплянню в контейнер частинок, що містяться в повітрі.
10. Повільно пронесіть отвір посудини над полум'ям пальника Бунзена (а не крізь нього), щоб спалити
всі забруднюючі речовини. Будьте обережні при спалюванні контейнерів з інфекційними матеріалами.
Будь-яка рідина, що застрягла в різьбі контейнера з гвинтовою кришкою, буде розбризкуватися при
нагріванні. Утворені таким чином аерозолі можуть поширювати захоплені біологічні агенти до того,
як тепло полум'я стане достатньо гарячим, щоб їх інактивувати.
11. Тримаючи посудину під нахилом, використовуйте стерильну піпетку та піпетку для повільного
додавання або видалення аліквот, щоб уникнути утворення аерозолю.
12. Знову простерилізуйте полум'ям, як на кроці 10, дайте контейнеру трохи охолонути і обережно
закрийте його.

Полум'ям стерилізують дрібні ручні інструменти:

13. Занурте критичні ділянки інструменту (тобто ті, що контактують з матеріалом) в 91% ізопропанол.
Переконайтеся, що спирт знаходиться в контейнері, достатньо важкому, щоб підтримувати інструмент
без перекидання. УВАГА: 91% ізопропанол легкозаймистий; тримайте контейнер на безпечній відстані
від відкритого вогню.
14. Вийміть інструмент зі спирту, намагаючись не торкатися дезінфікованих частин інструменту.
Дозвольте надлишку етанолу стекти в контейнер.
15. Пропустіть оброблену спиртом частину інструменту через полум'я пальника Бунзена і дайте
згоріти залишкам спирту.
16. Не допускайте контакту стерилізованої частини інструмента з будь-яким нестерильним матеріалом
перед використанням. Перед використанням дайте нагрітій частині інструменту охолонути протягом
∼10 секунд.

Простерилізуйте полум'ям ін'єкційні петлі та голки:

17. Тримаючи прищеплювальний дріт за ручку, почніть з центру дроту повільно нагрівати його
полум'ям бунзенівського пальника. Продовжуйте рухатися вперед і назад по всій довжині дроту, доки
він не стане помаранчевим.
18. Не відпускаючи ручку, дайте інокуляційному дроту охолонути до кімнатної температури (∼10
секунд), перш ніж переносити матеріал. Якщо переносити матеріал, поки дріт для посіву гарячий,
клітини будуть вбиті гарячим дротом, а аерозолі, що утворюються при розбризкуванні матеріалу,
можуть рознести забруднюючі речовини по всьому робочому простору.
19. Після перенесення повторно прогрійте інокуляційний дріт, як у кроці 17, щоб знищити
залишки біологічного матеріалу. Дайте охолонути до кімнатної температури перед тим, як
відкласти для наступного використання.

Рисунок 1Рисунок 2
ПРОДОВЖИТИ НА НАСТУПНІЙ СТОРІНЦІ 🡪
Зображення 1: Посів на агарову
пластину проводиться в 3-4 секціях.
Мета полягає в тому, щоб секції "D" і "E"
дали ізольовані, індивідуальні колонії.
Між кожною секцією зробіть петлю
полум'я.
Малюнок 3: Завжди позначайте
дно чашки Петрі перед тим, як
заливати середовище.

Малюнок 2: Смугастість і
щеплення нахилу.

Малюнок 4: Техніка посіву на три

секції з використанням посівної петлі.