Tr­êng §¹i häc D­îc Hµ Néi

Tæ m«n Vi nÊm - Kh¸ng sinh



KiÓm nghiÖm thuèc

b»ng ph­¬ng ph¸p vi sinh vËt
(Tµi liÖu thùc tËp cho sinh viªn D­îc)

Hµ néi - 2000
1
2
 Bµi 1
Thö v« trïng thuèc tiªm vitamin B1

1. Môc tiªu
- Nªu ®­îc nguyªn t¾c thö v« trïng cña Vitamin B1 tiªm b»ng ph­¬ng
ph¸p nu«i cÊy trùc tiÕp.
- BiÕt ph­¬ng ph¸p lµm m«i tr­êng nu«i cÊy láng.
- Lµm ®­îc thÝ nghiÖm thö v« trïng Vitamin B1, víi c¸c thao t¸c ®¶m b¶o
v« trïng.

2. Quy tr×nh thùc hµnh

2.1. Dông cô thÝ nghiÖm:
Pipet 1 ml; èng nghiÖm; kÑp s¾t, ®Ìn cån, ...
Dông cô röa s¹ch vµ tiÖt trïng kh« ë 160 oC trong 2 giê tr­íc khi sö dông.

2.2. M«i tr­êng

 M«i tr­êng canh thang (MT 1).
Pepton 10 g
Cao thÞt 5g
NaCl 5g
N­íc cÊt 1000 ml
PH = 7,4  0,2
Hoµ tan c¸c chÊt vµo n­íc nguéi, ®un nãng cho tan hoµn toµn, ®iÒu chØnh
pH b»ng dung dÞch NaOH 1N hoÆc HCl 1N. §iÒu chØnh cho ®ñ thÓ tÝch. Ph©n
m«i tr­êng vµo èng nghiÖm, mçi èng 10 ml. TiÖt trïng b»ng hÊp ­ít ë 1 atm
trong 15 - 20 phót.
 M«i tr­êng Sabouraud láng (MT2)
Pepton 10 g
Glucose 40 g
N­íc cÊt 1000 ml
pH = 5,8  0,2
Hoµ tan c¸c chÊt vµo n­íc nguéi, ®un nãng cho tan hoµn toµn, ®iÒu chØnh
pH, b»ng dung dÞch NaOH 1N hoÆc HCl 1N. §iÒu chØnh cho ®ñ thÓ tÝch. Ph©n
m«i tr­êng vµo èng nghiÖm, mçi èng 10 ml. TiÖt trïng b»ng hÊp ­ít ë 1 atm
trong 15 - 20 phót.

3
2.3. Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh.
S¸t trïng èng tiªm b»ng cån 70o. BÎ ®Çu èng tiªm b»ng kÑp s¾t v« trïng.
Hót toµn bé thuèc trong 1 èng cho vµo 10 ml m«i tr­êng MT 1 vµ mét èng thuèc
kh¸c ®­îc cÊy vµo m«i tr­êng MT2 (mçi m«i tr­êng lµm 2 èng).
èng ph¸t hiÖn vi khuÈn nu«i cÊy ë 30-35oC trong 4 ngµy,
vµ 25  2 oC trong 7 ngµy ®èi víi vi nÊm.

2.4. §äc kÕt qu¶

Sau thêi gian nu«i cÊy, nhËn ®Þnh kÕt qu¶ vµ kÕt luËn vÒ tiªu chuÈn v«
trïng cña mÉu thö..

4
 Bµi 2
X¸c ®Þnh sè l­îng vi khuÈn hiÕu khÝ, vi nÊm
trong 1 ml bæ phÕ chØ kh¸i lé

I. Môc tiªu.
- Nªu ®­îc nguyªn t¾c x¸c ®Þnh sè l­îng vi sinh vËt trong 1 ml (hoÆc 1g)
chÕ phÈm thö; b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy trùc tiÕp.
- BiÕt ph­¬ng ph¸p lµm m«i tr­êng nu«i cÊy ®Æc.
- X¸c ®Þnh ®­îc sè l­îng vi khuÈn, vi nÊm trong 1 ml bæ phÕ chØ kh¸i lé.

2. Quy tr×nh thùc hµnh

2.1. Dông cô
Hép petri, pipet 1 ml, pipÐt 10 ml, èng nghiÖm; b×nh nãn 250 ml, ®Ìn cån.
Dông cô ®­îc tiÖt trïng kh« 160oC/2h tr­íc khi dïng.

2.2. M«i tr­êng

 M«i tr­êng th¹ch th­êng (MT 1)
Pepton 10 g
Cao thÞt 5g
NaCl 5g
Th¹ch 15 g
N­íc cÊt 1000 ml
PH = 7,4  0,2.
§un tan th¹ch, sau ®ã thªm c¸c thµnh phÇn kh¸c ®· ®­îc hoµ vµo n­íc,
thªm n­íc cho ®ñ thÓ tÝch. §un s«i, vít bät, ®iÒu chØnh PH. §iÒu chØnh cho ®ñ
thÓ tÝch råi ph©n vµo èng nghiÖm (mçi èng 15 ml).
TiÖt trïng hÊp ­ít 1 atm/ 15 - 20 phót.
 M«i tr­êng Sabouraud - kh¸ng sinh (MT 2).
Pepton 10 g
Glucose 40 g
Cloramphenicol 50 mg
Th¹ch 15 g
N­íc cÊt 1000 ml
PH = 5,8  0,2

5
 §un tan th¹ch, sau ®ã cho c¸c thµnh phÇn kh¸c ®· ®­îc hoµ tan trong
n­íc. §un s«i, vít bät, ®iÒu chØnh pH. §iÒu chØnh cho ®ñ thÓ tÝch råi ph©n vµo
èng nghiÖm (mçi èng 15 ml). TiÖt trïng 1 atm/ 15 - 20 phót.

2.3. Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh.

Dïng cån 70o s¸t trïng bªn ngoµi lä. H¬ miÖng lä trªn ngän löa ®Ìn cån
tr­íc khi lÊy thuèc. LÊy 10 ml chÕ phÈm pha vµo 90 ml n­íc muèi 0,9% ®Ó ®­îc
-1
nång ®é pha lo·ng 10 . Pha lo·ng tiÕp ®Õn nång ®é 10-2.
Cho vµo mçi hép petri 1 ml dung dÞch chÊt thö cña mét nång ®é. Thªm 15
ml m«i tr­êng MT1 ®· ®un ch¶y, ®Ó nguéi d­íi 45oC cho c¸c ®Üa x¸c ®Þnh vi
khuÈn vµ m«i tr­êng MT2 ®Ó x¸c ®Þnh vi nÊm.
(Mçi nång ®é lµm 2 ®Üa thö song song)
Nu«i cÊy ë 30 - 35oC trong 2 - 3 ngµy (®èi víi vi khuÈn).
vµ 25  2oC trong 3 - 5 ngµy (®èi víi vi nÊm)

2.4. §äc kÕt qu¶

- Sau thêi gian nu«i cÊy, ®Õm sè khuÈn l¹c vi khuÈn, vi nÊm mäc trªn c¸c
®Üa thö. TÝnh sè khuÈn l¹c vi sinh vËt trong 1 ml chÕ phÈm.
- KÕt luËn vÒ tiªu chuÈn giíi h¹n vi sinh vËt cña mÉu thö.

6
 Bµi 3
§Þnh l­îng bét Streptomycin sulfat
b»ng thö nghiÖm vi sinh vËt
(Ph­¬ng ph¸p khuyÕch t¸n)

1. Môc tiªu:
- Nªu ®­îc nguyªn t¾c ®Þnh l­îng b»ng ph­¬ng ph¸p khuyÕch t¸n.
- X¸c ®Þnh ®­îc ho¹t lùc cña bét Streptomycin sulfat víi sai sè e  10%.

2. Qui tr×nh thùc hµnh

2.1. Dông cô thÝ nghiÖm
- Khoanh tÈm giÊy kh¸ng sinh - èng nghiÖm
- B×nh ®Þnh møc 25 ml - Pipet 1 ml, 10 ml
- Hép petri - B×nh nãn 250 ml
- §òa thuû tinh - Hép c©n thuû tinh
- §Ìn cån.
C¸c dông cô ®­îc tiÖt trïng 160oC/ 2h tr­íc khi dïng.
2.2. M«i tr­êng
- N­íc cÊt v« trïng.
- M«i tr­êng th¹ch nÒn:
Th¹ch 15 g
N­íc cÊt 1000 ml
- M«i tr­êng th¹ch dinh d­ìng:
Pepton 10 g
Cao men 3g
Cao thÞt 1,5 g
Glucose 1g
Th¹ch 15 g
N­íc cÊt 1000 ml
pH = 7,8 - 8,0
§un ch¶y th¹ch, sau ®ã thªm c¸c ho¸ chÊt kh¸c vµ cho n­íc võa ®ñ thÓ
tÝch. §un s«i kü, vít bät, ®iÒu chØnh pH. §iÒu chØnh cho ®ñ thÓ tÝch, ph©n vµo
b×nh nãn mçi b×nh 100 ml m«i tr­êng.
Khö trïng hÊp ­ít 1 atm/ 15 - 20 phót.
2.3. Chñng vi khuÈn chØ thÞ
- Bacillus subtilis ATCC 6633.
7
 - Nhò dÞch nha bµo cã nång ®é 107 - 108 nha bµo/1 ml.
2.4. Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh
 Pha dung dÞch chuÈn.
C©n chÝnh x¸c mét l­îng thuèc chuÈn pha dung dÞch gèc cã nång ®é
kho¶ng 1000 ®v/1 ml.
- Tõ dung dÞch gèc, pha 3 nång ®é ®Ó ®Þnh l­îng:
S1 = 5 U/ ml
S2 = 10 U/ ml
S3 = 20 U/ ml.
- Pha dung dÞch thö:
C©n mét l­îng chÊt thö nh­ chÊt chuÈn, víi gi¶ ®Þnh chÊt thö cã ho¹t lùc
t­¬ng ®­¬ng víi chÊt chuÈn. Pha c¸c dung dÞch thö ®Ó ®Þnh l­îng nh­ pha dung
dÞch chuÈn.
T1 = 5 ®v/1 ml
T2 = 10 ®v/1 ml
T3 = 20 ®v/1 ml.
 TÈm kh¸ng sinh vµo c¸c khoanh giÊy
Dïng 6 hép c©n thuû tinh v« trïng, cho vµo mçi hép 10 khoanh giÊy s¾c
ký cã ®­êng kÝnh  = 7 mm, sau ®ã cho 3 ml dung dÞch kh¸ng sinh cña tõng
nång ®é vµo mçi hép, ®Ó c¸c khoanh giÊy ®· ®­îc tÈm dung dÞch kh¸ng sinh ®Õn
b·o hoµ lªn c¸c cÆp ®òa thuû tinh cho kh« tù nhiªn.
 §æ m«i tr­êng
Chän 10 hép petri ph¼ng ®¸y, ®­êng kÝnh b»ng nhau. Hót 10 ml th¹ch nÒn
cho vµo hép. Khi th¹ch nguéi, thªm 7 ml th¹ch dinh d­ìng ®· cã vi khuÈn chØ thÞ
víi tû lÖ 1% (v/v).
§Æt c¸c khoanh giÊy tÈm kh¸ng
sinh lªn mÆt ®Üa th¹ch theo s¬ ®å: T1
§Ó c¸c ®Üa thö ë nhiÖt ®é phßng
kho¶ng 2 giê ®Ó kh¸ng sinh khuyÕch
t¸n vµo m«i tr­êng.
Nu«i cÊy 35oC - 37oC / 16 - 18
giê.

2.5. TÝnh kÕt qu¶.

- §o ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn, b»ng th­íc ®o cã ®é chÝnh x¸c ®Õn
0,1 mm.
- TÝnh kÕt qu¶ ®Þnh l­îng theo ph­¬ng ph¸p to¸n thèng kª.
8
9