Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej.

Konspekt do zajęć prowadzonych w ramach przedmiotu Fizjologia stosowana dla studentów II roku Wydziału
Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.
Rok akademicki 2008/2009.

Ćwiczenie 1

Mechanizmy prowadzące do powstania czopu hemostatycznego

oraz testowanie ich sprawności za pomocą badań diagnostycznych

Wprowadzenie
Hemostaza to zespół mechanizmów fizjologicznych, które zapewniają sprawne hamowanie
krwawienia po przerwaniu ciągłości ściany naczyń krwionośnych, szczelności łoŜyska
naczyniowego i płynności krąŜącej krwi.
Głównymi elementami hemostazy są: układ krzepnięcia, układ fibrynolizy, płytki krwi (inne
elementy morfotyczne), ściana naczyń krwionośnych, układ fagocytarny (siateczkowo-
śródbłonkowy).
W celu zrozumienia funkcjonowania hemostazy moŜna wprowadzić „roboczy” podział na układ
prokoagulacyjny i antykoagulacyjny. Układ prokoagulacyjny obejmuje wszystkie mechanizmy
biorące udział w tworzeniu czopu hemostatycznego - jego funkcją jest hamowanie
krwawienia.
Układ antykoagulacyjny obejmuje wszystkie mechanizmy ograniczające tworzenie zakrzepów –
jego funkcją jest, więc zachowanie płynności krwi w łoŜysku naczyniowym.

Zakrzep to czop hemostatyczny, który rozwinął się w sposób niedostatecznie kontrolowany lub
w niewłaściwym miejscu.

Zator to zakrzep całkowicie blokujący przepływ krwi przez naczynie krwionośne.

Hemostaza pierwotna – pierwsza faza aktywacji układu hemostazy: płytki krwi rozpoznają
uszkodzenie naczynia i tworzą czop płytkowy (pierwotny czop hemostatyczny) uwalniając
substancje wspomagające układ krzepnięcia.

Hemostaza wtórna – uszkodzona ściana naczynia jest źródłem czynnika tkankowego (TF,
Tissue Factor), który uaktywnia układ krzepnięcia. Następuje wzmocnienie czopu płytkowego i
tworzenie czopu hemostatycznego (wtórny/właściwy czop hemostatyczny).

Przerwanie ciągłości naczynia krwionośnego zapoczątkowuje sekwencję zdarzeń –

uruchamiane są kolejne elementy (mechanizmy) układu hemostazy.

Poszczególne warstwy ściany naczyń krwionośnych odgrywają istotna rolę w regulacji układu
hemostazy:
- śródbłonek – mechaniczna izolacja od warstwy prokoagulacyjnej, uwalnianie do
krwioobiegu czynników regulujących funkcje łoŜyska naczyniowego i układu
hemostazy (t-PA, u-PA, prostacyklina, EDGF, EDRF, PAI, cz. vW, PAF), pełni rolę
organu endokrynnego ( masa około 2 – 3 kg),warstwa podśródbłonkowa –
aktywacja płytek krwi z udziałem białek włókienkowych (kolagenu) oraz ekspresja TF i
aktywacja układu krzepnięcia, mięśniówka – skurcz naczyń.

1
Diagnostyka laboratoryjna
Aktualnie brak jest powszechnie dostępnego badania testującego sprawność hemostatyczną
ściany naczyń krwionośnych. Badaniem o praktycznie historycznym znaczeniu jest test
opaskowy Rumpela-Leedego, stosowany jest równieŜ czas krwawienia, a z badań
specjalistycznych biopsja skóry.
Diagnostyka sprawności śródbłonka obejmuje przede wszystkim czynnościowe i obrazowe
badania hemodynamiczne, wykraczające poza zakres tradycyjnej diagnostyki laboratoryjnej.
Do najwaŜniejszych naleŜą:
1. FMD (Flow Mediated Dilatation) - badanie zdolności rozkurczowej naczyń krwionośnych po
zwolnieniu kontrolowanego ucisku,
2. Pletyzmografia – rejestracja zmian tętna (ciśnienia) w naczyniach; PAT (Peripheral Artery
Tonometry) to uproszczona wersja tej metody wykorzystywana do badań śródbłonka,
3. pomiary IMT (Intima Media Thickness) – pomiary grubości kompleksu błona wewnętrzna-
błona środkowa, wykonywane dla tętnicy szyjnej.
Opisano liczne, biochemiczne markery uszkodzenia sródbłonka. W osoczu oznaczane są
stęŜenia białek adhezywnych, uwalnianych z powierzchni uszkodzonego śródbłonka (ICAM-1,
VICAM-1, endoteliny, selektyny). W czasie uszkodzenia śródbłonka wzrasta we krwi stęŜenie
czynnika von Willebranda i kwasu moczowego. Badania opisanych markerów są kosztowne i
mało swoiste, stąd nie znalazły szerszego zastosowania w diagnostyce laboratoryjnej.

Płytki krwi najmniejsze (o średnicy 2-4 µm) upostaciowione, pozbawione jądra, elementy krwi
jako pierwsze wykrywają uszkodzenie naczynia. Najczęściej podawana Liczba płytek krwi u
ludzi zdrowych (zakresy referencyjne powinie być wyznaczane w kaŜdym laboratorium) wynosi
150-400 x 109/L. W warunkach fizjologicznych płytki krwi przeŜywają w krwioobiegu 8-12 dni.
Aktywacja płytek krwi obejmuje szereg następujących po sobie procesów (zmiana kształtu,
adhezja, degranulacja, agregacja) wywołanych przez kontakt z powierzchnią uszkodzonego
naczynia lub działaniem agonistów (ADP, trombina).

Rola płytek krwi w tworzeniu czopu hemostatycznego: adhezja i agregacja – tworzenie

pierwotnego czopu hemostatycznego, przyśpieszanie tworzenia ostatecznego czopu
hemostatycznego (wpływ na funkcję wszystkich elementów układu hemostazy).
Czop płytkowy jest zbyt słaby aby zahamować wypływ krwi z uszkodzonych naczyń. Dzięki
procesom biochemicznym „kaskady krzepnięcia” następuje wzmocnienie czopu płytkowego i
tworzenie stabilnego czopu hemostatycznego.

Diagnostyka laboratoryjna
Oznaczenie czasu krwawienia jest najprostszą metodą badania sprawności hemostatycznej
płytek krwi. Metoda ta jest mało czuła i specyficzna, szczególnie w wersji znanej jako metoda
Duke’a.
Wersja klinicznie uŜyteczna to metoda Ivy’ego. W obecnej chwili nie ma wskazań do
rutynowego zlecania wykonania czasu krwawienia. Badanie to wypierane jest przez
instrumentalne metody badania płytek krwi (np. PFA-100).
W przypadku podejrzenia występowania skazy krwotocznej istnieją wskazania do wykonania
czasu krwawienia. W przypadku wydłuŜonego czasu krwawienia konieczne jest zbadanie
funkcji płytek krwi.

Metody pomiaru agregacji płytek krwi:

1. agregacja turbidymetryczna
2. agregacja we krwi pełnej: metoda impedancyjna, określanie ubytku płytek po
aktywacji
3. pomiar czasu okluzji – PFA-100 (adhezja/agregacja płytek)

Hemostaza wtórna
2
Końcowym efektem działania układu hemostazy jest przekształcenie przez trombinę
rozpuszczalnego fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę.

Czynniki krzepnięcia występujące w osoczu w postaci nieaktywnej po aktywacji układu

krzepnięcia tworzą trzy zespoły enzymatyczne. KaŜdy kompleks składa się z kofaktora
zakotwiczonego w dwuwarstwie fosfolipidów błony komórkowej oraz z migrujących, zaleŜnych
do witaminy K, proteaz serynowych. Nieczynne zymogeny, przyłączając się do kompleksów
enzymatycznych, przekształcane są w formy aktywne przemieszczające się między
kompleksami. Występuje nieustanny dopływ nieaktywnych form enzymów z osocza, ich
aktywacja w obrębie kompleksów, oraz przemieszczanie aktywnych form między kompleksami.
Kompleksy wytwarzają aktywne formy enzymów przenoszących między kompleksami sygnał
aktywacji (IXa, Xa, IIa).
W toku ewolucji wykształcone zostały liczne sprzęŜenia zwrotne oraz alternatywne ścieŜki
generacji trombiny. Prosty i klarowny schemat kaskadowy niestety ma juŜ jedynie wartość
historyczną.

Kompleksy te to:

Kompleks związany z czynnikiem tkankowym (rdzeń-TF, VII, VIIa, przejściowo nieaktywne

czynniki IX, X, aktywne Xa, IXa)
Kompleks tenazy (rdzeń VIII, przejściowo nieaktywne X, aktywne IXa, Xa)
Kompleks protrombinazy (rdzeń V przejściowo II, IIa, Xa)

Po uszkodzeniu naczynia krwionośnego eksponowany wówczas TF rozpoznawany jest przez

krąŜącą formę aktywnego cz. VII, która jest w stanie rozpoznać TF, lecz posiada nieaktywne
centrum serynowe i dopiero po połączeniu z TF nabywa zdolności aktywowania kolejnych
cząsteczek czynnika VII, a po przekroczeniu „progu masy krytycznej” efektywnie aktywuje
czynnik IX i czynnik X.
Czynnik X w obecności czynnika V łączy się w kompleks protrombinazy i ostatecznie
protrombina przekształcana jest w trombinę.
Ten fragment jest języczkiem spustowym aktywacji układu krzepnięcia i zostaje szybko
wyhamowany przez inhibitor tkankowego aktywatora (TFPI, Tissue Factor Pathway Inhibitor).
JednakŜe minimalna ilość wygenerowanej trombiny (jak iskra na beczce prochu) wystarcza do
uruchomienia układu wzmoŜonej generacji trombiny (dawniej zwanym „wewnątrzpochodnym”
szlakiem aktywacji). Powstaje kompleks tenazy (X-azy). Powstanie kompleksu, a następnie
uruchomienie głównego szlaku generacji trombiny odbywa się za pośrednictwem głównie
czynnika VIII, istotną rolę odgrywa takŜe czynnik IX. Co do roli czynnika XI zdania są
podzielone (sądzi się, Ŝe jest aktywowany przez trombinę powstałą w kompleksie z TF i
aktywuje czynnik IX). Uaktywnione przez trombinę powstałą w kompleksie TF wymienione
czynniki (czynnik IX prawdopodobnie uruchamiany jest takŜe przez kompleks czynnika
tkankowego) mają wielokrotnie większą wydajność (50 razy) generowania trombiny niŜ
„wygaszony” szlak TF. Dopiero ta droga generacji aktywnej formy czynnika X pozwala
wytworzyć wystarczającą ilość ognisk aktywacji (kompleksów protrombinazy) do wytworzenia
takiej ilości trombiny, która przekształca fibrynogen we włóknik. Włączają się takŜe systemy
samoograniczające. Prawdopodobnie uruchamiane są one w momencie lokalnego
przekroczenia pewnego progu stęŜenia trombiny. Uruchamiany zostaje system
antykoagulacyny. Układ białka C, układ antytrombiny, równolegle do aktywacji krzepnięcia
uruchomiony juŜ został układ fibrynolityczny.

Diagnostyka laboratoryjna

3
Wykonanie oznaczenia czasu protrombinowego (PT) symuluje aktywację układu krzepnięcia
przez tromboplastynę tkankową powstającą po uszkodzeniu naczynia i częściowej degradacji
tkanki. Układ jest oczywiście sztuczny, lecz ze wszystkich badań najbardziej zbliŜony do
rzeczywistości.

W świetle aktualnej wiedzy aktywacja tzw. „szlaku wewnątrzpochodnego” nie ma znaczenia

fizjologicznego, jednakŜe w warunkach laboratoryjnych moŜliwe jest zastosowanie tak wysokich
stęŜeń aktywatorów powierzchniowych, które uruchamiają zespół czynników kontaktu.
W powszechnie wykonywanym badaniu – APTT (czas częściowej tromboplastyny po
aktywacji) wykorzystywane są aktywatory powierzchniowo czynne (kaolin, celit) i fosfolipidy
(rekompensata braku płytek krwi).

Badania podstawowe:
diagnostyka skaz krwotocznych: płytki, czas krwawienia, PT, TT, APTT, fibrynogen
diagnostyka stanów nadkrzepliwości: APCR, białko C, białko S, AT, D-dimer.

Badania molekularne:
ELISA: t-PA, PAI, F1+2, PAP, TAT, β-TG; chromatografia - homocysteina; cytometria
przepływowa – diagnostyka białaczek, ocena funkcji płytek krwi

Badania genetyczne:
PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy): wykrywanie mutacji Leiden cz. V, mutacji 20210 genu
protrombiny

W jakim celu wykonujemy badania?

Diagnostyka skaz krwotocznych

Skazy krwotoczne – stany, w których występuje niewydolność jednej lub kilku składowych
ustrojowego układu hemostazy. Ogólnie mówiąc skaza krwotoczna to skłonność do krwawień:
długotrwałych, zbyt obfitych, pojawiających się bez istotnej przyczyny. Skazy krwotoczne mogą
być uwarunkowane genetycznie lub mają charakter nabyty.
Uwzględniając trzy podstawowe elementy hemostazy wyodrębnia się skazy naczyniowe,
skazy płytkowe i zaburzenia krzepnięcia krwi. Jest to jednak podział uproszczony, poniewaŜ
w wielu nabytych skazach krwotocznych występują złoŜone zaburzenia dotyczące zarówno
osoczowych czynników krzepnięcia jak i drobnych naczyń krwionośnych czy płytek krwi.

Naczyniowe skazy krwotoczne związane są z zaburzeniami budowy i czynności drobnych

naczyń krwionośnych – tętniczek, naczyń włosowatych i małych naczyń Ŝylnych. U podłoŜa
tego typu zaburzeń są wrodzone wady naczyń lub nabyte uszkodzenie ściany naczyniowej na
tle immunologicznym, w wyniku działania toksyn, leków, w przebiegu zakaŜeń, zmian
zakrzepowych a takŜe zmiany naczyń związane z procesem starzenia, działania urazów
mechanicznych czy nieznanych dotąd czynników. Skaza objawia się najczęściej wybroczynami
lub krwotocznymi wykwitami na skórze i błonie śluzowej, krwawieniami z dziąseł i łatwym
siniaczeniem. Rzadziej występują krwawienia z nosa, dróg rodnych, dróg moczowych czy
przewodu pokarmowego. W badaniach laboratoryjnych nie stwierdza się odchyleń w zakresie
badań płytek krwi, osoczowych czynników krzepnięcia i fibrynolizy. Zwraca uwagę natomiast
dodatni objaw opaskowy.
Najczęściej występujące skazy naczyniowe (plamice):
Wrodzone:
choroba Rendu-Oslera (wrodzona naczyniakowatość krwotoczna)
zespół Marfana

4
 Nabyte:
zespół Schonleina-Henocha
plamice polekowe
plamice w przebiegu zakaŜeń
plamica w dysproteinemiach
plamica starcza
plamice związane ze wzrostem ciśnienia Ŝylnego
Plamice naczyniowe o nieznanej etiologii
plamica zwykła
plamica psychogenna

Płytkowe skazy krwotoczne są związane z nieprawidłową liczbą płytek (małopłytkowości,

nadpłytkowości) lub/i z zaburzeniami czynności płytek krwi (trombocytopatie).
Do najczęściej występujących płytkowych skaz krwotocznych naleŜą małopłytkowości.
Mechanizm ich powstawania polega na niedostatecznym wytwarzaniu (małopłytkowości
„centralne”) lub nadmiernie szybkim usuwaniu płytek z krąŜenia (małopłytkowości „obwodowe”),
nieprawidłowym rozdziale płytek w organizmie lub ich rozcieńczeniu. Objawy skazy pojawiają
się zwykle wtedy, gdy liczba płytek jest mniejsza niŜ 30 x 109/L. W wielu przypadkach nie
obserwuje się jednak korelacji między liczbą płytek, długością czasu krwawienia a nasileniem
skazy. W diagnostyce małopłytkowości „centralnych” duŜe znaczenie ma badanie aspiracyjne
szpiku, które umoŜliwia ocenę ilości i morfologii magakariocytów. Z zastosowaniem cytometrii
przepływowej moŜna określić frakcję młodych płytek (płytek retykulocytarnych). Inne badanie
diagnostyczne to oznaczenie stęŜenia trombopoetyny we krwi. Charakterystyczną cechą skazy
małopłytkowej są krwawienia skórno-śluzówkowe – pojawienie się wybroczyn na skórze
kończyn, tułowia, rzadziej twarzy, oraz błonie śluzowej jamy ustnej. Często występują
krwawienia z nosa, dziąseł i dróg rodnych u kobiet. Do cięŜkich powikłań naleŜą krwawienia z
przewodu pokarmowego lub krwawienia śródczaszkowe. Małopłytkowości mogą mieć charakter
wrodzony (dziedziczna małopłytkowość, niedobór trombopoetyny) lub nabyty (małopłytkowość o
podłoŜu immunologicznym, małopłytkowości polekowe, zakrzepowa plamica małopłytkowa). W
diagnostyce waŜny problem stanowi wykluczenie tzw. małopłytkowości rzekomej
(pseudotrombocytopenia), która jest artefaktem pomiarowym, wynikającym z aglutynacji płytek
we krwi pobranej na EDTA.
W nadpłytkowościach liczba płytek krwi przekracza 500 x 109/L i wiąŜe się ze zwiększeniem
wytwarzania płytek przy prawidłowym czasie ich przeŜycia. W zaleŜności od przyczyn
nadpłytkowości dzielimy na pierwotne i wtórne. W nadpłytkowościach pierwotnych zwiększenie
liczby płytek jest wynikiem autonomicznego procesu rozrostowego (samoistna nadpłytkowość,
zespoły mieloproliferacyjne), we wtórnych – objawem innych chorób (ostre i przewlekłe
zapalenia, choroba nowotworowa). Nadpłytkowości pierwotne objawiają się nawracającymi
krwawieniami z przewodu pokarmowego, dróg moczowych lub zmianami zakrzepowymi w
obrębie naczyń śledzionowych, krezkowych czy mózgowych. Nadpłytkowości wtórne
najczęściej przebiegają bezobjawowo a zmniejszenie liczby płytek następuje po wyleczeniu
choroby podstawowej.
PrzedłuŜenie czasu krwawienia przy prawidłowej ilości płytek krwi moŜe być związane z
wrodzonym lub nabytym zaburzeniem czynności płytek. Wrodzone zaburzenia czynności
płytek krwi obejmują:
• anomalie błony płytkowej: zespół Bernarda-Souliera (przedłuŜony czas krwawienia,
nieznaczna małopłytkowość, olbrzymie i morfologicznie nieprawidłowe płytki),
trombastenia Glanzmanna (przedłuŜony czas krwawienia, brak agregacji płytek pod
wpływem ADP, kolagenu), defekt receptora kolagenu, zaburzenie prokoagulacyjnej
aktywności płytek (zespół Scotta),
• zaburzenia sekrecji ziarnistości płytkowych: choroba puli magazynowej, zaburzenia
mechanizmu sekrecji.
Nabyte zaburzenia czynności płytek są często występującym ubocznym skutkiem działania
wielu leków (kwas acetylosalicylowy, antybiotyki laktamowe) i niektórych produktów
5
spoŜywczych (wysokonienasycone kwasy tłuszczowe, alkohol etylowy, cebula, czosnek), mogą
pojawić się równieŜ w schorzeniach niehematologicznych (mocznica, choroby wątroby).

Osoczowe skazy krwotoczne związane są z wrodzonymi lub nabytymi niedoborami,

zaburzeniami funkcji czynników krzepnięcia krwi.

Wrodzone:
• Choroba von Willebranda
• Hemofilia A
• Hemofilia B
Nabyte
• W przebiegu chorób wątroby
• Zespół rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego (DIC)
• Masywne transfuzje

Hemofilia (inaczej zwana "krwawiączką" czy teŜ "chorobą królów") – grupa chorób
spowodowanych genetycznie uwarunkowanym niedoborem czynników krzepnięcia.
Cecha ta dziedziczy się z chromosomem X, co oznacza, iŜ chorują jedynie osoby z pełną
ekspresją recesywnego genu.
Hemofilia (niezaleŜnie od typu) występuje w Polsce z częstością 1 : 12300 mieszkańców (1 :
5600 męŜczyzn).
• Hemofilia A - niedobór VIII czynnika krzepnięcia krwi (czynnika antyhemolitycznego),
"klasyczna hemofilia"
• Hemofilia B - niedobór IX czynnika krzepnięcia krwi (czynnika Christmasa), "choroba
Christmasa"
Stosunek częstości występowania hemofilii A do B wynosi w Polsce 6,2 : 1
ZaleŜnie od niedoboru czynnika wyróŜniamy trzy postacie hemofilii.
• postać cięŜka - poziom czynnika poniŜej 1% normy. Charakteryzuje się częstymi
wylewami pourazowymi i występowaniem tzw. krwotoków samoistnych (bez wyraźnej
przyczyny urazowej)
• postać umiarkowana - poziom czynnika poniŜej 1-5% normy,
• postać lekka - poziom czynnika powyŜej 5% normy.

Choroba von Willebranda najczęściej występująca skaza krwotoczna (1 osoba na 8000

mieszkańców).
Rozpoznanie i właściwa klasyfikacja tej choroby, ze względu na małą dostępność wiarygodnych
badań przesiewowych (pomiar czasu okluzji w analizatorze PFA-100) sprawia wiele trudności.
WyróŜniane są trzy typy z kolejnymi podtypami chvW.
TYP 1 (80% chorych) obniŜenie poziomu ale czynnik jest prawidłowy
TYP 2 (20% chorych) budowa i funkcja czynnika jest nieprawidłowa, poziom moŜe być
prawidłowy lub obniŜony
TYP 3 (rzadki) o cięŜkim przebiegu klinicznym z bardzo niskim poziomem czynnika von
Willebranda i czynnika VIII.
Godna odnotowania jest częstość występowania niedoboru czynników VII i XII (około 1:400000
mieszkańców),. pozostałe niedobory występują bardzo rzadko.

Zespół rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego - zespół DIC (disseminated

intravascular coagulation), zespół chorobowy polegający na niekontrolowanej aktywacji (w
przebiegu róŜnych chorób) kaskady krzepnięcia i wytworzenie licznych „rozsianych”
mikrozakrzepów w świetle małych naczyń krwionośnych. Dochodzi do zuŜycia czynników
krzepnięcia oraz płytek krwi, powodując z jednej strony niewydolność narządów a z drugiej
objawy skazy krwotocznej ("koagulopatia ze zuŜycia").

6
DIC występuje jako powikłanie w wielu sytuacjach klinicznych
• uogólnione zakaŜenie (sepsa), najczęściej bakteriami gram-ujemnymi,
• powikłania ginekologiczne - zator wodami płodowymi, przedwczesne odklejenie
łoŜyska,
• uszkodzenia tkanek, takie jak przy oparzeniach, po zabiegu chirurgicznym, po
wypadku,
• hemolityczna reakcja poprzetoczeniowa,
• gorączki krwotoczne wywołane przez róŜne wirusy (Ebola),
• ostra białaczka promielocytowa,
• ukąszenie przez niektóre jadowite węŜe,
• choroby trzustki (rak, nawracające zapalenia).

Rozpoznanie skazy krwotocznej opiera się na wywiadzie, badaniu przedmiotowym i

badaniach laboratoryjnych i sprowadza się do ustalenia czy skaza ma charakter wrodzony lub
nabyty, czy towarzyszy innej chorobie lub jest wynikiem stosowanych leków, jaki jest charakter i
nasilenie skazy.

Dla podsumowania, do najczęściej stosowanych testów przesiewowych w diagnozie skaz

krwotocznych stosuje się badanie liczby płytek krwi, czasu krwawienia oraz oznaczenie czasów
krzepnięcia: czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT), czas protrombinowy (INR),
czas trombinowy.
W przypadku badań przesiewowych w kierunku występowania choroby von Willebranda naleŜy
zwrócić szczególną uwagę na stosowanie odpowiednio czułych odczynników do wykonania
APTT. Pomiary czasu okluzji w analizatorze PFA-100, mimo ich potwierdzonej wartości w
wykrywaniu chvW, w Polsce, ze względu na wysokie koszty są wykonywane bardzo rzadko.
Badania specjalistyczne obejmują natomiast oznaczenie funkcji płytek krwi, poziomu
czynników krzepnięcia oraz inhibitorów krzepnięcia.
Pod względem przebiegu i obrazu klinicznego skazy naczyniowe i płytkowe róŜnią się od skaz
uwarunkowanych zaburzeniem krzepnięcia krwi (tabela).

Objawy kliniczne skaz krwotocznych

Skazy osoczowe Skazy płytkowe i naczyniowe
Najczęstsze objawy wylewy krwi do mięśni i plamica, skłonność do
stawów, późne krwawienia siniaczenia, krwawienia z
pourazowe błon śluzowych
Krwawienia pooperacyjne często późne krwawienia, krwawienia podczas zabiegu,
bardzo niebezpieczne mało niebezpieczne
Wybroczyny i sińce wybroczyny występują często liczne wybroczyny i
rzadko, sińce pojedyncze sińce
Wynik ucisku miejsca po zwolnieniu ucisku krwawienie zatrzymuje się
krwawienia nawrót krwawień często na stałe

7
Diagnostyka laboratoryjna skaz krwotocznych

Przykłady zestawów badań koagulologicznych

koagulogram: liczba płytek krwi, czas krwawienia (BT), czas protrombinowy, APTT, stęŜenie
fibrynogenu.
skrócony koagulogram: liczba płytek krwi, czas protrombinowy, APTT.
Przykłady zastosowania wypranych badań układu hemostazy w diagnostyce skaz krwotocznych

Wyniki badań
Rodzaj zaburzenia
PT APTT Fg BT
Skazy płytkowo-naczyniowe
N N N ⇑

Choroba von Willebrandta N ⇑ N ⇑

Hemofilia A i B, niedobór czynników XI, XII,
N ⇑ N N
krąŜące antykoagulanty
Hypo-, dysfibrynogenemie ⇑ ⇑ ⇓ N

NaleŜy zaznaczyć, Ŝe w badaniach przesiewowych, w diagnostyce choroby von Willebranda

często stosowany jest analizator PFA-100. WydłuŜony czas okluzji sugeruje konieczność
dalszej diagnostyki w tym kierunku.

Przykładowe zmiany parametrów układu hemostazy w zespole rozsianego wykrzepiania

wewnątrznaczyniowego - zespół DIC
9
• ObniŜone miano płytek krwi < 100 x 10 /L z tendencją spadkową. PrzedłuŜone
„czasy”(PT, APTT).
• Istotnie podwyŜszone stęŜenie FDP/D-Dimerów.
• ObniŜone stęŜenie inhibitorów (AT, białka C).ObniŜone stęŜenie czynników
krzepnięcia (V, VIII, X, XIII).

Diagnostyka zaburzeń układu hemostazy po zabiegach chirurgicznych

ZaleŜnie od rodzaju zabiegu chirurgicznego występuje róŜne ryzyko powikłać ze strony układu
hemostazy, moŜemy mieć do czynienia zarówno z krwawieniami jak i zakrzepicą.
Ze szczególnie duŜym ryzykiem powikłań naleŜy się liczyć w przypadku zabiegów
kardiochirurgicznych, ortopedycznych a takŜe, w pewnych przypadkach w czasie zabiegów
ginekologicznych.
• W okresie operacyjnym.
aktywacja układu krzepnięcia, aktywacja układu fibrynolizy, aktywacja płytek krwi
• W okresie okołooperacyjnym (do 6 godzin po zabiegu).
wzmoŜona fibrynoliza, dysfunkcja układu krzepnięcia (zuŜycie czynników krzepnięcia oraz
efekt niezneutralizowanej heparyny, spadek liczby płytek krwi i ich dysfunkcja (osłabiona
agregacja) mogą prowadzić do krwawień – obserwujemy wydłuŜenie PT, APTT, TT, spadek
stęŜenia fibrynogenu i miana płytek krwi.
• W okresie pooperacyjnym (powyŜej drugiej doby po zabiegu)
zahamowanie układy fibrynolizy, wzrost stęŜenia czynników układu krzepnięcia i białek
ostrej fazy (fibrynogen), zwiększona liczba płytek krwi i wzmoŜona ich reaktywność.

8
 Praktyczne zastosowanie podstawowych badań układu krzepnięcia

1) Czas protrombinowy (PT)

1. Testowanie sprawności szlaku aktywacji uruchamianego przez TF

2. Monitorowanie leczenia doustnymi antykoagukantami
Sposoby wyraŜania czasu protrombinowego:

• wskaźnik % -PT (sek) wzorcowe x 100

PT (sek) badane
• % aktywności – obliczany z krzywej rozcieńczeń osocza prawidłowego
• współczynnik - PT (sek) badane
PT (sek) wzorcowe
ISI
• INR - ( współczynnik )
ISI – międzynarodowy współczynnik czułości (wyliczany w laboratorium wykonującym PT)
W celu ujednolicenia wyraŜania czasu protrombinowego, dla potrzeb monitorowania leczenia
doustnymi antykoagulantami, wprowadzono międzynarodowy współczynnik znormalizowany
INR (International Normalized Ratio). Współczynnik INR uwzględnia róŜnice w czułości
stosowanych odczynników i aparatury.

Laboratoryjna kontrola leczenia doustnymi antykoagulantami:

INR – zakres terapeutyczny

Mechaniczne zastawki serca: 3.0 – 4.0

Biologiczne zastawki serca: 2.0 – 3.0
Migotanie przedsionków: 2.0 – 3.0
Leczenie śChZZ: 2.0 – 3.0
Leczenie zatoru tętnicy płucnej: 2.0 – 3.0

2) Czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT)

1. Testowanie sprawności szlaku aktywacji uruchamianego przez czynniki kontaktu.

2. Monitorowanie leczenia heparyną, wykrywanie hemofilii.

Laboratoryjna kontrola leczenia heparyną niefrakcjonowaną:

Do uzyskania terapeutycznego konieczne jest utrzymanie w osoczu aktywności heparynowej w

granicach 0.2 – 0.6 j./ml
metoda
Czas krzepnięcia met. LW:
Czas krzepnięcia po aktywacji (ACT):
APTT:
zakres terapeutyczny
przedłuŜenie 1.5 – 3.0 razy
przedłuŜenie 1.5 – 3.0 razy
przedłuŜenie 1.5 – 2.5 razy

9
Instrukcja wykonania ćwiczenia

1. Omówienie wykonania objawu opaskowego

2. Wykonanie (prezentacja) oznaczenia czasu krwawienia – 2 grupy po 5 osób

Materiały: noŜyki do nakłuwania, gaziki, spirytus, rękawiczki jednorazowe
Czas krwawienia metodą Duke’a.
Płatek ucha nakłuwa się igłą. Wypływającą krew usuwa się gazikiem do chwili ustania wypływu
krwi.

Prezentacja czasu krwawienia wykonywanego metodą Ivy’ego.

Sposób przedstawiania wyników: czas wyraŜony sekundach

3. Badania układu krzepnięcia

Pięcioosobowe grupy studentów mają wykonać oznaczenia, które ułatwią zrozumienie

złoŜonych mechanizmów regulacyjnych hemostazy wtórnej (badania układu krzepnięcia i
fibrynolizy).

Aktywacja układu krzepnięcia

a. aktywacja za pomocą tromboplastyny tkankowej (w tzw. dawniej w układzie
„zewnątrzpochodnym”) – wykonanie oznaczenia czasu protrombinowego
b. badanie układu wspomagającego (tzw. dawniej układ „wewnątrzpochodny”) - wykonanie
oznaczenia APTT

Materiały: łaźnia wodna, pipety na 100 µl, końcówki do pipet, odczynniki (tromboplastyna, APTT
reagent), chlorek wapnia, probówki, osocze mroŜone, rękawiczki

3a. Wykonanie oznaczenia czasu protrombinowego

Czas protrombinowy wg Quicka:

Zasada. Po dodaniu do osocza tromboplastyny i chlorku wapniowego następuje aktywacja

protrombiny, a następnie zamiana fibrynogenu w fibrynę. Wynik pomiaru zaleŜy od zawartości
w osoczu protrombiny, czynników V, VII i X oraz fibrynogenu.
Odczynniki
tromboplastyna
0.025 M roztwór CaCl2

Wykonanie. Do probówki zawierającej 100 µl osocza ubogopłytkowego naleŜy dodać 100 µl

roztworu tromboplastyny. Całość dokładnie wymieszać i inkubować przez
1 min. w łaźni wodnej (37oC). Po inkubacji dodać 100 µl roztworu CaCl2. Mierzyć czas
upływający od momentu dodania chlorku do wykrzepienia próby.

10
Zadanie do wykonania

Oznaczyć PT w dwóch oznakowanych próbkach osocza. Wynik czasu protrombinowego

przedstawić w postaci wskaźnika czasu protrombinowego, współczynnika czasu
protrombinowego oraz INR (ISI=1.0). Porównać i zinterpretować otrzymane wyniki.

Interpretacja wyników: Wartości prawidłowe wynoszą 10-16 sekund. Czas protrombinowy jest
przedłuŜony w następstwie obniŜenia aktywności 3 spośród 4 czynników krzepnięcia zaleŜnych
od witaminy K (II, VII i X). PrzedłuŜenie czasu protrombinowego obserwuje się w awitaminozie
K, chorobach miąŜszu wątroby czy w zespole rozsianego krzepnięcia śródnaczyniowego.

3b. Wykonanie oznaczenia APTT

(czas częściowej tromboplastyny po aktywacji – Activated Partial Thromboplastin Time)

Zasada. Mierzy się czas krzepnięcia osocza zmieszanego z cytrynianem po maksymalnej

aktywacji czynników XI i XII oraz w obecności stałych stęŜeń fosfolipidu. Czynniki XI i XII są
aktywowane podczas wstępnej inkubacji osocza z zawiesiną kaolinu (zamiast kaolinu moŜe być
celit). Kaolin jest odpowiednikiem kolagenu, natomiast kefalina – fosfolipidów. Efektem opisanej
reakcji jest wytrącenie włóknika i wytworzenie skrzepu.

1. Do dwóch ogrzanych probówek dodać:

100 µl osocza,

100 µl odczynnika aktywującego (fosfolipidy + aktywator powierzchniowy),

inkubować 2 min.,

dodać 100 µl CaCL2 i zmierzyć czas krzepnięcia.

2. Do dwóch ogrzanych probówek dodać:

100 µl osocza,

100 µl odczynnika aktywującego (fosfolipidy + aktywator powierzchniowy),

Do jednej probówki dodać 10 µl odczynnika A do drugiej 10 µl odczynnika B,

inkubować 2 min.,dodać 100 µl CaCL2 i zmierzyć czas krzepnięcia.


Sposoby wyraŜania APTT:
czas wyraŜony sekundach
Współczynnik: czas próby badanej/ czas próby kontrolnej

Zadanie do wykonania
Oznaczyć APTT w dwóch probówkach, naleŜy porównać i zinterpretować otrzymane
wyniki.

Interpretacja wyników: Wartości prawidłowe zaleŜą od zastosowanego testu i wynoszą 25-40

sekund. Nieprawidłowy czas APTT występuje u pacjentów leczonych doustnie lub parenteralnie
lekami przeciwzakrzepowymi oraz gdy poziom czynników krzepnięcia toru wewnętrznego
(prekalikreina, wysokocząsteczkowy kininogen HMGH, czynniki VIII, IX, XI, XII) lub wspólnego
(I, II, V, X) uległ obniŜeniu do 30-40% wartości wyjściowych. Jednoczesne stwierdzenie
prawidłowego czasu protrombinowego pozwala wykluczyć niedobór protrombiny, czynników V,
VII i X i hipofibrynogemię jako przyczynę przedłuŜania APTT.

11
4. Wykonanie agregacji płytek we krwi pełnej

Pomiar agregacji metodą ubytkową - SPC (Single Platelet Couting)

Zasada. Oznaczamy miano płytek we krwi pobranej na EDTAK2 przed i po dodaniu ADP
(aktywatora płytek krwi). Agonista powoduje tworzenie agregatów płytkowych i spadek miana
płytek w badanej krwi. Obliczamy współczynnik ubytku płytek jako miara tworzenia agregatów
płytkowych:
wsp. agreg. = ((Plt0 – Pltaktyw)/Plt0)*100

Odczynniki
roztwór 1 (0.9% NaCl)
roztwór 2 (1 mM ADP)

Zadanie do wykonania

Do dwóch probówek dodajemy (po zamieszaniu) po 0,5 ml krwi pełnej;

oznaczyć miano płytek w obu probówkach,

do jednej probówki dodać 10 µl roztworu 1, a do drugiej 10 µl roztworu 2, mieszamy,

inkubować 3 minuty,

oznaczyć miano płytek krwi,

oznaczyć współczynnik agregacji.

Współczynnik agregacji wyraŜany jest w procentach.

Interpretacja wyników: Wartości prawidłowe agregacji wynoszą > 60 %, niŜsze wyniki

związane są z dysfunkcją płytek lub stosowaniem leków przeciwpłytkowych.

12