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Industry Agriculture Medicine and the

Environment 1st Edition Alka Dwevedi
(Auth.)
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Agriculture, and Environment 1st Edition Rajesh Singh
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Alka Dwevedi

Enzyme
Immobilization
Advances in Industry, Agriculture,
Medicine, and the Environment
Enzyme Immobilization
Alka Dwevedi

Enzyme Immobilization
Advances in Industry, Agriculture,
Medicine, and the Environment

13
Alka Dwevedi
Sri Aurobindo College
University of Delhi
New Delhi
India

ISBN 978-3-319-41416-4 ISBN 978-3-319-41418-8 (eBook)

DOI 10.1007/978-3-319-41418-8

Library of Congress Control Number: 2016943793

© Springer International Publishing Switzerland 2016

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Printed on acid-free paper

This Springer imprint is published by Springer Nature

The registered company is Springer International Publishing AG Switzerland
Preface

Immobilizing body at a particular position is a mechanism of meditation that concentrates

complete energy and allows its linear alignment from head to toe.

Chapter 1: The concept of enzyme immobilization first arose in 1916 when it was
found that enzymes could perform catalysis even in a fixed state with movement
only at the active site. Technology has evolved tremendously since then, particu-
larly with respect to immobilizing matrices. Enzyme immobilization has solutions
to various problems related to the industrial, agricultural and environmental sec-
tors, and it has a higher number of patents across the world than any other technol-
ogy known to date. However, the connectivity to their arrival in the market and
patents filed is not very appreciative. An immobilized enzyme has various height-
ened and additional properties with respect to its soluble state, such as higher
stability, more reusability, longer storage time, a broad range of activities in the
presence of various physical and chemical factors, as well as easier product recov-
ery. Chapter 1 is the compiled summary of the innovative research carried out in
the field over the last 100 years.
Chapter 2: Immobilized enzymes have a broad range of applications, including
synthesis of complex drug intermediates; chemical synthesis without toxic by-
products under mild conditions; remediation of polluted water, air and soil; and
disease diagnosis and its treatment. Enzyme immobilization is preferable to other
known technologies due to the convenience of enzyme handling, the ease of prod-
uct recovery, the possibility of enzyme reusability, the stability under extreme
physical and chemical conditions, the ease of shipment and the fact that it is appli-
cable for all reactor types and enables easier process control. There are numerous
protocols for enzyme immobilization and several modifications are emerging to
make it adaptable for any process. However, it is still a technique of trial and error;
this is supported by the fact that enzyme behavior could not be predicted with the
given matrix being implemented when a number of enzymes with similar struc-
tures that were from the same family were investigated. It has been found from a
number of studies that the immobilizing matrix plays a key role in the properties

v
vi Preface

of the immobilized enzyme. Chapter 2 is the compiled summary of recent devel-

opments in immobilization techniques with respect to the types of matrices and the
immobilization methods. Furthermore, it also discusses immobilizing enzymes in
the absence of a matrix, and the associated properties.
Chapter 3: There are a number of enzyme sources, among the most important
of which are bacteria, fungi, plants and animals. Structural studies of enzymes
from any of these sources have found a similarity of more than 70 % with an
almost negligible difference at their active sites. Bacterial and fungal sources are
widely used for various industrial processes such as the production of organic
acids, amino acids, antibiotics, food and beverages, including alcohol, cleaning
supplies, clothing, paper products, transportation fuels, agrochemicals, monitor-
ing devices, and pharmaceuticals, as well as in disease diagnosis and chemical
feedstock. This is a result of the ease with which they can be cultured and the
associated high enzyme recovery. With the evolution in purification protocols
and improvement of novel chromatographic techniques as well as instrumenta-
tion, the concept has moved for enzymes usage from microbial to plant sources.
Furthermore, plant enzymes have good catalytic properties and are high in abun-
dance. Plant carbohydrases and proteases are the main enzyme classes which
are found to have extensive industrial applications. Financial statistics of the
global market have revealed that there is tremendous requirement for enzymes.
Therefore, enzymes obtained from the best source for a particular process would
accelerate it by several fold. In addition, enzymes from plant sources have addi-
tional benefits due to the generation of huge biomass, which is of economic sig-
nificance. Chapter 3 is the compiled summary of the physiological and industrial
significance of enzymes from plants. Furthermore, it also discusses the usage of
leftover biomass for various applications.
Chapter 4: Enzymes are now known to be the important constituents of our
daily diet due to their capabilities for treating several diseases. It has been found
that eating highly processed food laden with preservatives is not good for health
as it hampers the body’s immune mechanisms and diverts energy to the produc-
tion of only digestive enzymes. This can lead to the development of several seri-
ous diseases such as cancer, cardiac arrest, and autoimmune diseases (allergies and
arthritis). There are several medications known that use enzymes for the treatment
of various diseases. However, the popularity of enzyme therapy has been limited
for various reasons, the most important of which are the state and route of admin-
istration. Soluble enzymes are prone to degradation inside the body due to various
factors, as well as to immunogenicity. Enzyme immobilization has the solution by
employing biocompatible matrices. Immobilized enzymes have enormous applica-
tions in bioanalytical and biomedical fields including in biosensors, disease diag-
nosis, bioreactors in the removal of waste metabolites and the correction of inborn
metabolic deficiencies, development of controlled release drug delivery systems,
prediction of species-dependent metabolic pathways, large-scale synthesis of
drug and xenobiotic metabolites. Furthermore, immobilized enzymes are helpful
in making drugs pharmacologically more active by conjugating with various side
groups. Chapter 4 is the compiled summary of the biomedical and bioanalytical
Preface vii

applications of immobilized enzymes as well as a discussion of their efficacy

­compared with other techniques known to date.
Chapter 5: Environmental pollution is responsible for about 12.6 million deaths
across the world, annually (WHO), which is much higher than any other cause.
Developing countries (which constitute one fourth of the world’s population) are
at major risk from environmental pollution due to their unstable economy, political
instability, low productivity, high rate of damage to ecosystems and almost neg-
ligible budget towards public health. Children are at a highter risk than adults as
they have a higher metabolic rate, due to which they can ingest larger concentra-
tions of pollutants and retain them for longer durations. Furthermore, pollutants
such as lead and mercury can have toxic effects even before child is born, when it
is living inside the mother’s womb, since pollutants can easily cross the placenta.
It has been found that poor sewage systems have worsened the situation by several
fold. It has been estimated that about 30–50 % of solid wastes are not collected
and disposed of properly, which creates ideal breeding conditions for mosquitoes,
rodents and other disease-bearing organisms. Furthermore, the leaching of waste
materials from unsealed dumpsites into soil and drinking water supplies as a result
of poor landfill management has increased the severity. There is an urgent need for
effective waste management via cheaper technology. Immobilized enzymes have
solutions for the remediation of various pollutants, especially from water and air.
Chapter 5 is the compiled summary of various immobilized enzymes being used in
the treatment of waste water and polluted air.
This book is the outcome of long hours of immobilizing myself onto the chair.
It has an emphasis on simplicity so as to reach all classes, whether from the field
or not. I am very thankful to my Ph.D. supervisor, Prof. Arvind M. Kayastha
(School of Biotechnology, Banaras Hindu University), who introduced me to the
field and for his continuous motivation, which has always made me move ahead
with keen interest and enthusiasm. This book would not have been completed
without the support from my family members (mummy, papa, raman, muniya,
anshu and yogesh) who have spared their time to allow me to focus on book writ-
ing. Furthermore, I make a special thanks to the various living creatures around
me; they have motivated me in various respects and for this I find no words to
express my feelings.

New Delhi, India Dr. Alka Dwevedi

Contents

1 100 Years of Enzyme Immobilization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 100 Years of Enzyme Immobilization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.1 Before 1970s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.2 Between 1970–1990. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.3 After the 1990s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3 Important Patent Applications for the Last 25 Years . . . . . . . . . . . . . 13
1.4 Commercialization of Immobilized Enzymes. . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2 Basics of Enzyme Immobilization. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2 Methods of Enzyme Immobilization. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.1 Physical Method. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.2 Chemical Method. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.3 Properties of Immobilized Enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.4 Matrices for Enzyme Immobilization. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.5 Structure Based Immobilization. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.6 Cross-Linked Enzyme Aggregates and Crystals . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.7 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3 Enzyme Immobilization: An Important Link Between
Agriculture and Industries. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.2 Plants as Source of Various Industrial Enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.3 Correlation Between Agricultural Waste and Industries . . . . . . . . . . 54
3.3.1 Applications of Agro-Wastes in the Production
of Various Industrially Valuable Compounds
Using SSF Processes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.4 Effective Ways of Immobilization of Plant Enzymes
for Commercial Applications. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.5 Connectivity of Economic Growth with Enzyme
Immobilization. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

ix
x Contents

4 Implication of Enzyme Immobilization in Therapeutics

as Well as Diagnostics of Various Diseases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.2 An Overview: Biomedical Applications of Enzymes. . . . . . . . . . . . . 67
4.2.1 Various Biological Enzyme Applications. . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.2.2 Commercialized Soluble Biomedical Enzymes. . . . . . . . . . . 70
4.3 Significance of Enzyme Immobilization for Their Biomedical
Applications. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.4 Implementation of Enzymes in the Treatment of Human
Diseases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4.1 Intra-corporeal Enzyme Therapy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4.2 Extra-Corporeal Enzyme Therapy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.5 Role of Immobilized Enzymes in Pharmaceuticals. . . . . . . . . . . . . . 78
4.5.1 Biosensors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.6 Immobilized Enzymes Used in Bioreactors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.6.1 Red Blood Cell as Enzymes Carrier. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.6.2 Liposome as a Carrier for Enzymes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.6.3 Enzymes Encapsulation in Sol-Gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.7 Immobilized Enzymes as Effective Tool for Disease
Diagnostics. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.8 Future Prospects. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
5 Enzyme Immobilization: Solution Towards Various
Environmental Issues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
5.2 Immobilized Enzymes in Waste Water Treatment. . . . . . . . . . . . . . . 89
5.3 Immobilized Enzymes in the Synthesis of Biodiesel. . . . . . . . . . . . . 97
5.4 Air Pollution and Enzyme Immobilization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.5 Effective Pollution Control Across the World
Using Immobilized Enzymes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Chapter 1
100 Years of Enzyme Immobilization

1.1 Introduction

The concept of changing freely moving enzymes (in the solvent) into a fixed state
with movement possible only at the active site came at the beginning of 1916. It
was provided by various reports emphasizing the role of the enzymatic portion
beyond the active site during catalysis. Those portions are required for the mainte-
nance of the actual shape and orientation of the active site to allow the enzyme to
accurately fit with the substrate and carry out catalysis [1, 2].
The invertase was the first enzyme to be immobilized onto matrices such as
charcoal and aluminium hydroxide in late 1916. Immobilized invertase had exhib-
ited a similar activity to that of its soluble state [3]. This discovery provided the
basis for the currently available enzyme immobilization techniques. During the
early days (before the 1940s), available immobilization techniques were based on
using a very high amount of enzyme as compared with matrix. This constricted
the use of immobilization for all enzymes, especially those not available in large
quantities.
There are more than 10,000 publications (Fig. 1.1) and a number of patents
that have been published based on enzyme immobilization, including immobili-
zation techniques, matrices and applications, and more will be published in the
future. There are various immobilized enzymes that have been commercialized for
various applications. Enzymes such as penicillin G acylase, invertase, lipases and
proteases are being implicated in various large-scale processes [4]. Even though
enzyme immobilization has come a long way, it is still a subject for research as
shown by the number of published research and review articles working on its
various aspects. The year 2010 is thought of as wondrous in the field of enzyme
immobilization since there were about 200 articles that were published in the first
6 months, as per PubMed database. Enzyme immobilization has made enzymes a
commercially valuable biomolecule due to various additional properties such as

© Springer International Publishing Switzerland 2016 1

A. Dwevedi, Enzyme Immobilization, DOI 10.1007/978-3-319-41418-8_1
2 1 100 Years of Enzyme Immobilization

2000

1600
Total Number of Publications

1200

800

400

0
1916 -1935 1936 -1955 1956 -1975 1976 -1995 1996 -2016

Fig. 1.1  Publication of articles (research and review) on enzyme immobilization (PubMed)

higher stability, more reusability, longer storage time, a broader range of activities
in the presence of various physical and chemical factors, and easier product recov-
ery. Enzymes can be attached to almost any solid support that is inert, organic,
inorganic or insoluble material. The technology of immobilized enzymes has
evolved significantly during the last 100 years but still it is known as a technique
of trial and error, as there are many attached queries that remain unanswered.
There is no field where the immobilized enzymes do not have an application. It
has become a crucial part of our daily life. Recent evolution of nanotechnology
has revolutionized enzyme immobilization due to the generation of a number of
nanomaterials. Even after 100 years of enzyme immobilization technology, it
remains a topic of interest for every biochemist, biophysicist, molecular biologist,
and now even for immunologist and cell biologist.

1.2 100 Years of Enzyme Immobilization

1.2.1 Before 1970s

1916–1940 (Early Phase)

Various immobilizing matrices were discovered, predominantly belonging majorly
to simple inorganic carriers (glass, alumina, hydrophobic compound-coated glass
etc.), for the attachment of attachment of enzyme as well as other biomolecules
like immunoglobins, organelles or complete cells [5–9]. All immobilization
1.2 100 Years of Enzyme Immobilization 3

methods used were reversible in nature, particularly based on adsorption. The

immobilization of invertase onto Al(OH)3 and charcoal was the major achievement
of the early phase as reported by Nelson and Griffin, which laid the groundwork
for enzyme immobilization [5].
1940–1965 (Underdeveloped Phase)
This phase saw the transition of the immobilization method from physical adsorp-
tion to specific ionic adsorption having more specificity and durability. Various
matrices such as phosphocellulose, DEAE-cellulose, cellulose, Amberlite XE-97,
Dowex-2 and Dowex-50 as well as their derivatives, synthetic polymers (polyami-
nostyrene and polyisocyanate) and inorganic materials (carbon, glass, kaolinite,
and clays) were used. The covalent method was also tried using these matrices
but it was not successful owing to poor retention and very high hydrophobicity
[10–14].
1965–1970 (Developing Phase)
This phase mainly focused on enzyme immobilization by the covalent method
using various chemical cross-linkers. Glutaraldehyde was introduced for enzyme
immobilization for enzyme attachment onto insoluble carrier (natural and syn-
thetic polymers). Synthetic carriers were also developed with active functional
groups such as polyanhydride, polyisothiocyanate, etc., which were used for
enzyme attachment directly to the support. Many carriers of a different physical
or chemical nature, different hydrophilicity or hydrophobicity, or a different shape
or size (e.g., beads, sheet, film, membrane or capsules) were developed in order to
provide carriers with sufficient diversity. Furthermore, introduction of active-site
titration made it possible to assess the availability of the active site and its involve-
ment during immobilization. Acrylamide polymers were used to immobilize a
number of high molecular weight biologically active molecules (e.g., microorgan-
isms, enzymes, antigens and antibodies) [15–20].

1.2.2 Between 1970–1990

1970–1980 (Developed Phase)

This phase included exploration of novel matrices for enzyme immobilization
using established basic methods including covalent, adsorption, entrapment and
encapsulation. Various other new immobilization methods such as affinity binding
and coordination binding were developed that had industrial potential. Even basic
methods were modified in order to increase their efficacies; for example, entrap-
ment of the enzyme in the gel matrix by cross-linking using covalent or affinity
adsorption in order to avoid leakage [21]. Enzyme immobilization using a suit-
able spacer was introduced, which prevented enzyme overcrowding on the carrier,
modulation of enzyme conformation, extended coupling chemistry etc. Different
polymers with defined characteristics with respect to hydrophobicity, hydrophi-
licity, particle size and binding functionality were designed for immobilization
4 1 100 Years of Enzyme Immobilization

[22, 23]. Various new chemical reactions were identified for enzyme coupling
by covalent method to carriers such as the Ugi reaction, acylation with an imi-
doester, carbohydrate coupling, use of N-hydroxysuccinimide esters for carboxyl
activation, coupling and concomitant purification via thio–disulphide interchange,
oxirane coupling, the benzoquinone method and reversible covalent coupling.
Furthermore, new strategies were developed to improve the performance of immo-
bilized enzymes including the stabilization–immobilization strategy, site-specific
enzyme immobilization on the micelle, intramolecular crosslinking and compli-
mentary multipoint attachment. These innovations in enzyme immobilization were
very useful for broader enzyme applications [24–26]. The most important achieve-
ment was usage of immobilized penicillin G acylase for the production of 6-APA
(intermediate in the synthesis of β-lactam antibiotics) and production of fructose
syrup by using immobilized glucose isomerase [27, 28]. Furthermore, immobi-
lized enzymes were also used as drugs and in various biomedical applications viz.
disease diagnosis, synthesis of artificial organs etc. [29].
The concept of immobilization of enzymes/proteins onto insoluble poly-
meric supports was well accepted and found to have wider applicability in study-
ing complex biological systems. The immobilization of active enzymes/proteins
led to various physical and chemical changes; foremost among these changes
were thermal stability, changes in reaction kinetics and substrate specificity [30].
Enzyme immobilization was used in the synthesis of thromboresistant surface
[31]. Enzymes were modified by the attachment of various reactive groups, which
further helped in their immobilization and increased the number of carriers that
could be used for immobilization. This methodology was used in immobiliza-
tion of α-amylase onto erythrocytes [32]. Cellulose xanthate was discovered as a
matrix for the immobilization of various biological molecules including proteins/
enzymes. It contains mercapto-groups, which could be used for formation of disul-
phide bridges with l-cysteine present on proteins/enzymes. It involved the least
damage to active site, and, in addition, led to higher reusability and stability as
compared with other matrices being used for immobilization. Furthermore, it is
cheap and involved a very simple coupling reaction. However, the process is selec-
tively reversible [33].
Sugars like lactose, saccharose and maltose could be estimated in the given
samples using electrochemical sensors with enzymes immobilized on magnetic
membranes attached to sensor electrodes [34]. It was the first time when more than
one enzyme was used for immobilization. It was called multienzyme system and
had wide applicability, particularly in medicine and industry. For example, a bien-
zyme system containing glucose oxidase and peroxidase was used in the estima-
tion of glucose in blood samples of diabetic patients. The usage of multienzyme
system on a sensor helped in the measurement of various metabolites and, thus,
was an effective tool in disease diagnosis [35]. Immobilization was used to study
the three-dimensional structure of chymotrypsinogen [36]. Sand was used for the
immobilization of various enzymes like alcohol dehydrogenase, lactate dehydro-
genase and urease [37]. Sand cannot be used as a matrix in its native form but had
to be derivatized using diazotization to form alkylamine sand, with a number of
1.2 100 Years of Enzyme Immobilization 5

amine groups used for enzyme immobilization [38]. The enzymes, luciferase and
oxidoreductase (NADPH: FMN) isolated from Beneckea harveyi were covalently
linked to arylamine porous glass beads via diazotization. Immobilized enzymes
were able to produce light through cyclic oxidation: reduction of NADH or
NADPH. These immobilized enzymes have a similar substrate and pH optima to
that of soluble enzymes with higher stability, reusability; in addition, the process
was inexpensive [39]. Woven silk was found to be useful in the immobilization of
various enzymes [40]. Aluminium hydroxide was found to be helpful in the deter-
mination of three-dimensional enzyme structures [41].
1980–1990 (Post Developed Phase)
This phase focused on designing immobilized enzymes with very high selectiv-
ity and specificity in order to make them useful in almost every sector, including
medicine, agriculture, environment and industry. It was aimed at replacing almost
all chemical-based processes due to their various disadvantages. Various enzymes
were re-discovered that were catalytically active and stable in a wide range of
organic solvents. Various immobilization techniques were found to elucidate the
effect of carriers on the catalytic behaviour of the immobilized enzymes. These
findings were helpful to widen the capabilities of immobilized enzymes in various
sectors.
1980
The H2 gas was produced from water by immobilizing chloroplasts containing
dehydrogenase enzyme onto grids of nylon and stainless steel using calcium algi-
nate in presence of sunlight. This system has two modifications involving the pres-
ence of a one or two-stage reactor based on the concept of cyclic and non-cyclic
photophosphorylation PSI and PSII, respectively. The amount of H2 gas produced
is much higher with respect to chemical processes without consumption of exter-
nal energy and toxic compounds [42].
During this period, immobilization was used for number of enzymes with med-
ical applications; for example glucose oxidase, glucose peroxidase, urokinase onto
thin membranes inside polyvinyl chloride tubes and on polyethylene films by radi-
ation-induced polymerization at –78 °C. Immobilized glucose oxidase and glucose
peroxidase were used for diagnostic purpose while immobilized urokinase was
used for thrombus formation [43].
1981
Immobilization was used for structural studies of proteins and enzymes. The pro-
cess involved enzyme immobilization via cysteinyl residues onto insoluble carrier
followed by proteolysis using cysteine protease. Proteolytic fragments of soluble
and immobilized were separated, followed by comparative analyses of missing
fragments corresponding to immobilized protein/enzyme, which gives the exact
position of disulfide linkage as well as their location (i.e., on protein surface or
inside it). Here, chicken pepsin was used, which was coupled using spacer arm
onto poly-N-hydroxymethyl acrylamide by thioether bond [44].
6 1 100 Years of Enzyme Immobilization

1984
Aspartic acid was produced using immobilized aspartase from Escherichia coli.
Enzyme immobilization was carried out by covalent attachment and entrapment with
polyazetidine. Here, immobilized aspartase was stable for more than 2 years at 25 °C
due to double immobilization; one being inside E. coli cells and other by entrapment.
The present immobilized system has wider commercial applications [45].
1985
Magnetic materials as a carrier for enzyme immobilization were used and imple-
mented for various applications, viz. technological processes (i.e., separation of
unbound enzymes from the reaction mixture, lesser enzyme loss during immobi-
lization), immunological studies (i.e., separation of antibodies against cell surface
components being tagged magnetized enzymes) and in vivo drug targeting into
particular tissues when applied with external magnetic field. However, they led to
excessive aggregation when used in concentrated suspensions. It has been effec-
tively rectified by synthesizing magnetic materials with uniform size and magnetic
properties, viz. magnetic Sephadex (uniform bead size) has been used to immobi-
lize α-chymotrypsin and found to have excellent physicochemical properties with
respect to soluble enzyme.
Artificial sweetener is commonly called as aspartame, which is chemically,
N-(Benzyloxycarbonyl)-l-aspartyl-l-phenylalanine methylester). The stirred tank
reactor was implemented for large scale production of aspartame, packed with
immobilized thermolysin. The reactor was operated in continuous mode, i.e., con-
tinuous addition of substrate and production of sweetener with the yield of 90 %
after operation of 300 h [47]. ADVANTAME is one of the commercially used arti-
ficial sweeteners and is 20,000 times sweeter than table sugar.
1987
Heparinase is an enzyme known to cleave heparin present in the blood for coagula-
tion. An experiment showed that immobilized heparinase packed in an appropriate
reactor can be used for the hemodialysis of sheep via extracorporeal circuit. It was
found that with a blood flow of 200 ml/min, the clearance rate of heparin ranged
from 50 to 70 ml/min based on 16 samples. Furthermore, this assembly could be
used repeatedly in adult sheep for over 10 weeks. There were no changes in the
number of RBCs, WBCs, platelets and total hemoglobin after treatment with the
prepared assembly [48]. Eukaryotic enzymes are generally glycosylated with num-
ber of attached oligosaccharides chains. It was found that these chains could also
be used during immobilization for coupling to matrix causing minimum damage to
active site of the enzymes [49]. The presence of arginine residues on enzymes had
been also helpful during immobilization, viz. polyacrylamide beads activated with
4-(oxyacetyl) phenoxyacetic acid (OAPA) can be used for immobilization of all
enzymes containing arginine at their surface [50]. The enzymes bound via arginine
residues forms N-alpha-acetyl-l-arginine, a stable linkage. Once enzymes were
attached to the beads, other active groups present on polyacrylamide beads were
1.2 100 Years of Enzyme Immobilization 7

blocked using ubiquitin. This technology was also helpful in the synthesis of spe-
cialized affinity chromatographic media. Enzymes can be bound from concentra-
tion, 0.5–11 mg/ml depending on number of arginine residues present on enzymes.
However, this immobilization method was not successful in case of horse liver
alcohol dehydrogenase due to inactivation by OAPA [51].
1988
The co-immobilized metabolizing enzymes (cytochrome P-450, UDP-
glucuronyltransferases, glutathione S-transferases, S-methyltransferases, and
N-acetyltransferases) were used to study drug metabolism, synthesis of xenobiotic
metabolites and extracorporeal detoxification. Furthermore, they were also used in
the prediction of species-dependent metabolic pathways [52].

1.2.3 After the 1990s

1990–2016 (Rational Design of Immobilized Enzymes)

Advanced immobilization techniques have been used to develop robust immobi-
lized enzymes that have almost similar catalytic ability to that of soluble enzyme
with higher operational stability. Major emphasis has been given to synthesizing
robust immobilized enzymes with desired geometric properties such as shape,
size and length, thus meeting the requisite for any process. The most important
achievement is the development of cross linked enzyme crystals (CLEC) with the
ability for bio-transformations in non-aqueous media or in organic water mixtures
even under hostile conditions. It involves protein crystallization with homogene-
ous enzyme conformation to work effectively for catalysis. The enzyme should
have active conformation for getting highly stable and active CLEC, which is con-
trolled by using a specific method of cross-linking. Furthermore, physical enzyme
aggregates (not forming crystals) can be cross-linked to form catalytically active
cross-linked enzyme aggregates (CLEA) with appreciable mechanical stability,
applicability to any reaction system, reactor configuration and reaction medium.
Therefore, it has been found that enzyme immobilization can be done even in the
absence of carrier with more catalysis and opened possibility for designing robust,
highly active, stable and selective immobilized enzymes for various applications.
1990
An inexpensive method for the serologic diagnosis of HIV infections was formu-
lated by the immobilization of HIV-1 envelope glycoproteins in microtiter wells
coated with concanavalin A (ConA). Blood samples of HIV-1 infected patients
containing antibodies to viral glycoproteins get bound into HIV-1 envelope glyco-
proteins coated microtiter wells. Once, patients’ antibodies are bound to microtiter
wells containing immobilized ConA, it is followed by attachment of peroxidase-
conjugated antibodies specific for ConA which produces a colored product con-
firming the presence of HIV infection [53].
1.4 Commercialization of Immobilized Enzymes 19

oxygen concentration to the glucose concentration. Yellow Springs Instrument

Company commercialized it in 1975 with name of Model 23A YSI analyzer.
However, it could not reach common household as it was costly (due to expen-
sive platinum electrode) and could not be used for the estimation of glucose in
biological fluids due to interference by ascorbic acid, uric acids, certain drugs
and lower oxygen solubility.
2. Second-generation: The above-mentioned limitations were overcome by sec-
ond-generation glucose biosensors. These replaced estimation of oxygen and
rather involved estimation of electrons produced using redox mediators (fer-
rocene, ferricyanide, tetracyanoquinodimethane, quinines, methylene blue,
tetrathialfulvalene, thionine, and methyl viologen) at a working electrode with
immobilized glucose oxidase (GOx) and glucose dehydrogenase-pyrrole-quin-
olinequinone (GDH-PQQ). Ferrocenes was the best redox mediator due to its
very high stability in both oxidized and reduced forms. It does not react with
oxygen, is not affected by pH changes and has very good electron transfer
kinetics. This biosensor generated amperometric signals based on the reduction
and oxidation of redox mediator with electrons released from enzymatic action
of GOx and GDH-PQQ onto glucose. Sensor performance has been further
improved by introduction of screen-printed strips which can be self monitored
for blood glucose estimation, modified with more sensitive electrodes and tai-
lored membranes. In 1987, it was commercialized by Medisense Inc. under the
name ExacTech and had a shape resembling that of a pen. It is the first glucose
biosensor to have the self-monitoring ability of estimating glucose in diabetic
patients.
3. Third-generation: The third-generation glucose biosensors do not involve any
mediators but there is direct electron transfer between enzyme and electrode.
Thus, they have the least toxicity due to non-usage of mediators. Here, con-
ducting organic salts such as tetrathiafulvalene-tetracyanoquinodimethane
is used to mediate electron transfer between enzymes (GOx-GDH-PQQ) and
boron-doped diamond electrode. The third-generation glucose biosensors are
needle shaped and have the highest selectivity and ability of in vivo monitoring
blood glucose continuously. Companies such as Bayer, MediSense and Roche
Diagnostics have commercialized third generation glucose biosensor in the
market.
Flow-type and implantable glucose biosensors have not achieved much success as
compared with hand-held glucose biosensors. A great deal of work is being done
for the removal of various technical problems associated with implantable glu-
cose biosensor. The foremost important issues are biocompatibility and easier
installation. Recently, Medtronic Minimed developed an implantable glucose bio-
sensor device called Medtronic for diabetes management. It contains a tiny enzyme-
based sensor implanted inside the skin that can work non-stop for 3 days without
any enzyme loss. A compilation summary on studies on biosensors has indicated
this to be a huge success with respect to glucose biosensors. Now, a number of
small companies have introduced various handheld biosensors in the market.
20 1 100 Years of Enzyme Immobilization

For example, Chemel (Lund, Sweden) has developed a portable biosensor

(SIRE biosensor) for measuring various sugars and alcohols. Sensor Tech. Ltd.
(Cambridge, UK) have developed a biosensor with the trade name Universal
Transducer System (UTS™), with in vitro diagnostic applications due to their high
stability (~4 months), fast (<15 min), reproducibility (CV < 5 % at 0.1 ng/mL), and
sensitivity (~50 fM). The University of Ulster developed a biosensor recently for the
determination of flavanols in given plant tissue using immobilized polyphenoloxi-
dases or tyrosinase onto a carbon paste electrode. Development is being made in the
area of disposable sensors in conjunction with handheld devices, with disposable
sensors using micro-fabrication technology. i-STAT has developed the world’s first
hand-held device for assaying blood electrolytes (Na+, K+, Cl−, Ca2+, pH), gases
(CO2, O2) and molecules (urea, glucose, hematocrit) with the trade name i-STAT
Portable Clinical Analyser™. Oxford Biosensors have developed a portable hand-
held device (Multisense™) for cholesterol detection consisting of disposable test
strips (microelectrodes) [89].
Biosensors have been introduced recently in genomic and proteomic analyses
by companies like Affymetrix and Agilent. Optical sensors employing SPR detec-
tion have been commercialized successfully as BIAcore™ (Biacore AB, Uppsala,
Sweden) and IAsys (Affinity Sensors, Cambridge, UK) for the detection and
evaluation of biomolecular interactions. Pharmacia Biosensor AB, which is now
called BIAcore AB, is pioneering since it holds ~90 % of the market across the
world. BIAcore comes in the market in different range with various specifications.
However, due to their very high cost they have not been approached in various
sectors [www.gelifesciences.com/biacore]. Texas Instruments have recently devel-
oped a low cost, rapid, and portable SPR-based biosensor (SpreetaTM). Its mar-
ket statistics are yet to be evaluated but it is predicted to be more acceptable and
widely used.
Biosensors have significant role in various sectors including medical/health,
pharmaceutical monitoring, food/agricultural and environmental monitoring.
However, the rate of development of biosensors at laboratories and its commer-
cialization is very slow. Most of the studies are done using simple clean buffer
solutions rather than using complex biological fluids for testing of biosensors at
laboratory scale. Further other issues are: sensitivity/detection limit of the biosen-
sor, cost, stage of disease monitoring, response time, versatility, continuous moni-
toring and maintenance. There are various viral diseases, e.g., SARS, Hendra and
avian influenza, for which no biosensors have been developed. Nanotechnology
has been significantly helpful in combating various limitations due to development
of variety of nanoparticles with excellent electromagnetic and optical properties.
However, there are still various pillars to be touched in the field of biosensors and
enzyme immobilization to make them highly commendable in the commercial
markets.
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The Project Gutenberg eBook of España y
América
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eBook.

Title: España y América

estudios históricos y literarios

Author: Antonio Sánchez Moguel

Release date: August 31, 2023 [eBook #71533]

Language: Spanish

Original publication: Madrid: Imprenta y litografía del asilo de

huerfanos, 1895

Credits: Adrian Mastronardi and the Online Distributed

Proofreading Team at https://www.pgdp.net (This file
was produced from images generously made available
by The Internet Archive)

*** START OF THE PROJECT GUTENBERG EBOOK ESPAÑA Y

AMÉRICA ***
 SÁNCHEZ MOGUEL

ESPAÑA Y AMÉRICA

ESTUDIOS HISTÓRICOS Y LITERARIOS

MADRID
IMPRENTA Y LITOGRAFÍA DEL ASILO DE HUÉRFANOS
DEL SAGRADO CORAZÓN DE JESÚS
Juan Bravo, núm. 5.
1895
 REAL ACADEMIA DE LA HISTORIA

INFORME
SI interesante es el libro publicado hace un año por D. Antonio
Sánchez Moguel con el título de Reparaciones históricas, no lo
es menos el que acaba de dar á luz con el de España y América,
libro que bien pudiera considerarse como segunda parte de aquel
primero, y cuyo examen é informe, para los efectos del Real decreto
de 12 de Marzo de 1875, me han sido encomendados por nuestro
digno Presidente, Director de esta Real Academia.
Si la intención patriótica, también, en que se inspiraba aquel
escrito era laudable, como dirigida á estimular tendencias á la
conciliación que vienen observándose entre portugueses y
españoles, tan plausible es y del momento la nueva tarea
emprendida por nuestro erudito compañero para reanudar y apretar
los lazos que nos unieron y debieran para siempre unirnos con
nuestros también hermanos de América, aquellos cuyos Estados
formaron parte de la Monarquía española hasta principios del
presente siglo.
Allí, la historia peregrina de los desdichados amores de Inés de
Castro y la de su legendaria coronación después de muerta; la de la
Santa Reina de Portugal, nieta de Jaime el Conquistador, y la de
Doña Blanca, que lo era de Alfonso el Sabio; con otras varias de
compatriotas nuestros y de portugueses tan dignos de memoria
perdurable como el Dr. Eximio, Fray Luis de Granada y el Infante
Don Enrique, Nuño Álvarez Pereira y muchos más entre unos y
otros. Aquí, por otro lado, las gestas de los más insignes
descubridores del Nuevo Mundo, las de los que más favorecieron el
portentoso y entonces incomprensible proyecto de Colón, y el
examen y juicio de los congresos, certámenes y fiestas con que se
celebró en Europa y América el cuarto centenario del
descubrimiento de tan hermosa parte del globo.
El pensamiento no puede ser más feliz ni más conveniente, y su
desarrollo y ejecución corresponden á tan patriótico objeto.
Decíamos en un escrito á propósito del primero de esos libros: «El
Sr. Sánchez Moguel tiende precisamente á convencer á los
portugueses de que ni ahora ni nunca han debida ver en los
españoles, y menos en nuestros soberanos, los desdenes, mala
voluntad y rigores que se han forjado en su acalorada y recelosa
imaginación. Amante de aquel país, á punto de haberse hecho aquí
proverbiales sus aficiones lusitanas, lo ha estudiado detenidamente
en las varias expediciones que sin otro objeto ha hecho á él, y ha
podida comprobar, así como los prejuicios que suponía, el giro
reciente que se verifica en los de muchos, y la consistencia de las
ideas de conciliación, verdaderamente patrióticas, que van
arraigando en las clases más ilustradas, en el mundo científico,
sobre todo, y literario del reino portugués. Y siendo las glorias que
pudiéramos decir peninsulares comunes, no pocas veces, á las dos
naciones, nuestro Académico de la Historia ha procurado no
deslindarlas como han hecho otros, excitados quizás por
imprudentes controversias, sino amalgamarlas, para así concentrar
en una general las aspiraciones más legítimas de ambas.»
Pues bien: de igual modo, con idea parecida y procedimiento en
nada desemejante, procura el Sr. Sánchez Moguel atraer los
americanos á su antigua metrópoli, lo mismo en las conferencias
celebradas por el Ateneo de Madrid, á cuyo éxito en ese sentido
contribuyó eficazmente, como en los varios escritos que dio á luz en
La Ilustración Española y Americana, algunos de los cuales
aparecen en el libro sometido al examen de esta Academia, y no
pocos nuevos ó inéditos que ahora se presentan en él.
Y ciertamente que el tino, como antes he indicado, en la ejecución
ha correspondido al fin á que se dirigía tan excelente pensamiento.
 Cada capítulo del nuevo libro de nuestro asiduo colaborador en
los trabajos encomendados á la Academia, exigiría un comentario
tan extenso y erudito como el capítulo mismo, y, en algunos, como
el libro entero, de haber de apreciar debidamente la importancia que
entrañan casi todos, el espíritu en que se inspiran y la forma y
adornos de que están revestidos. La vasta erudición de su autor, el
dominio absoluto, si cabe, del asunto, y la dificilísima facilidad que
posee para darlo á conocer tan clara como lacónicamente, hacen
del libro del Sr. Sánchez Moguel uno en gran parte nuevo por las
investigaciones, nuevas también, que contiene, y comentario breve
quizás de cuanto se ha escrito y discutido sobre la historia del
descubrimiento de América, la de los más conspicuos personajes
que en él intervinieron, y la de cuantos, al celebrarse en el pasado
año de 1892, lo aplaudieron y ensalzaron en congresos, academias,
libros, revistas y periódicos.
Todo eso se necesita, y una gran perseverancia y aptitudes de
investigación y crítica, hasta fortuna para ejercitarlas, si ha de darse
vado á obra que abarca tan distintos asuntos, aunque todos estén
dentro del general y sintético que dió motivo al Centenario del
hallazgo de Colón en las tinieblas del Atlántico. Las conferencias
americanistas del Ateneo, que se extendieron al estudio é historia
de regiones que no llegó á ver Colón, abren el campo á las
investigaciones de nuestro ilustrado colega; y arrancando también
de aquel palenque literario, aparece en su libro la acción de los
Reyes Católicos en tan estupendo suceso, acción reciamente
disputada por el espíritu de regionalismo, no sé si útil ó pernicioso
en España. La personalidad, después, del Rey Fernando, la del
célebre Almirante de las Indias, tan expuesta desde el día, y aun
antes también de su maravilloso descubrimiento, á los tiros de sus
émulos; la de varios de los que en esferas más ó menos elevadas,
unos guiados por la luz de una inteligencia superior, como el
Cardenal Mendoza y Fray Diego de Deza, por ejemplo, y cegados
otros por su ignorancia ó torpes preocupaciones de escuela; la de
ilustres varones tan hábiles como esforzados, cuales Pedro de
Valdivia y Gonzalo Jiménez de Quesada, historiadores, dramaturgos
y hasta egregias damas, pendencieras amazonas y monjas literatas,
contribuyendo todas á la historia de América y su esclarecimiento,
son tratadas por el Sr. Sánchez Moguel con la más severa
imparcialidad y con tino, en mi concepto, suficiente para darlas á
conocer en su verdadera significación, que en este caso pudiéramos
calificar de americanista.
La patria de Colón, su españolismo y el concepto que de él se ha
formado en las publicaciones italianas del Centenario, han sido
también objeto de examen especial en el libro á que se refiere este
informe; examen á veces detenido, como sucede en el primero y
tercero de esos tres capítulos, así por la importancia que se ha dado
al conocimiento del lugar en que nació el insigne nauta, como por la
grandísima que tiene la Raccolta di documenti e studi publicati dalla
R. Commisione colombiana del quarto centenario dalla scoperta dell’
America.
No será quien esto escribe el que meta su hoz en mies cuya siega
corresponde á otro, y menos en la confiada á la peritísima mano de
un distinguido compañero, muy versado en materias americanistas,
ajenas á mis estudios predilectos; limitándome así á manifestar que
el Sr. Sánchez Moguel, después de definir la composición de la junta
de hombres ilustres encargada de la Raccolta, señala los trabajos á
que se debía dedicar con cuantos detalles pueden necesitarse para
formar idea exacta de una obra en cuyo elogio acaba por decir: «De
todos modos, la Raccolta merece bien de los estudios históricos, y
será, en lo sucesivo, una de las fuentes más copiosas para los
futuros trabajos colombinos, en los que, sin convencionales y
mezquinas divisiones de nación ó de secta, se estudie el
descubrimiento de América á la luz de la ciencia y dentro
únicamente de los sagrados fueros de la verdad histórica.»
Lo cual quiere decir también que, transcurridos cuatro siglos y
después de haberse escrito y publicado tantos y tan voluminosos y,
al parecer, concienzudos trabajos sobre Colón y su admirable
descubrimiento, estamos todavía muy lejos de oir la última palabra.
Pasan días y días en disputas, no pocas veces enojosas por la
pasión que las provoca y la candente también que las mantiene,
para, al pensar que sacudimos un error, caer quizás en ciento sobre
puntos esencialísimos de una polémica que viene el Sr. Sánchez
Moguel á decirnos que durará todavía largo tiempo.
 El deseo, repito, de hallar motivos de conciliación entre España y
las repúblicas hispano-americanas ha conducido al Sr. Sánchez
Moguel á recoger cuantas noticias nos llegan del Nuevo Mundo
sobre las muestras de simpatía que allí se nos dieron al celebrarse
el Centenario. Y para mejor satisfacer su patriótico anhelo, evoca en
su libro el recuerdo de los honores tributados en Chile y el Perú á la
memoria de Valdivia y de Pizarro; allí, coronando la ciudad de
Santiago con la estatua del bravo conquistador de aquella tierra
venturosa, y en Lima dando so las naves de la Catedral digna
sepultura á los restos gloriosísimos de su insigne fundador.
Ese afán lleva al Sr. Sánchez Moguel á, recordando lo de la
estatua de Valdivia, exclamar en su libro: «Aún no tienen estatuas:
en Méjico, Hernán Cortés; en Lima, Pizarro; en Bogotá, Quesada;
en Buenos Aires, Garay; y así otros grandes conquistadores de
pueblos y fundadores de ciudades. Lejos de mi ánimo acusar de
ingratas, sino de perezosas, á las naciones que se encuentran en
este caso. Estoy seguro de que no ha de tardar mucho tiempo en
que todas honrarán á sus conquistadores, como Chile á Valdivia.»
No es poco lo que, en su patriotismo, pretende el Sr. Sánchez
Moguel. Es verdad que debe animarle á ello el discurso, que
también estampa, del Alcalde de Lima al entregar en la Catedral los
restos de Pizarro, en el que se dice: «Don Francisco Pizarro fué el
conquistador del Perú, el fundador de esta capital, el que en sus
propios hombros cargó el primer madero que sirvió para la
fabricación del templo en que nos encontramos; y, lo que es más,
fué el que nos legó la Religión que profesamos, dándonos hasta su
última hora pruebas del respeto y de la veneración que tenia por
ella; pues recordaréis que besando la Cruz del Calvario, que con su
propia sangre y puño había formado para elevar sus preces al
Todopoderoso, exhaló su último aliento.
Esto es para alentar al más escéptico en la obra que parece
proponerse nuestro digno compañero.
La contestación al discurso leído por el señor Asensio el día de su
recepción en esta Academia, cierra el libro España y América, de
que voy dando cuenta; y, como tan recientemente pronunciada, es
muy conocida para que haya de recordar yo ahora las bellezas en
que abunda. La Academia la premió en aquella solemnidad con sus
aplausos.
Aun por este, mejor que extracto, breve índice de los asuntos
tratados en el nuevo libro del Sr. Sánchez Moguel, se hace fácil
conjeturar cuáles sean las condiciones históricas que puedan
avalorarlo en el concepto público, una vez destinado á tomar carta
de naturaleza en las bibliotecas del Estado y populares, donde será
muy útil su lectura, tan instructiva como amena.
Porque bajo este último aspecto, el de su amenidad, el libro
ofrece atractivos que en nada ceden á los del científico, ya por la
variedad de asuntos, ya por lo fácil, según dije antes, de su
exposición, lo conciso y propio del lenguaje y lo elegante del estilo
en que está escrito.
Un poco dogmático el autor, como dedicado al ejercicio de la
cátedra, y batallador á veces por propia índole y la de su tierra natal,
que tan hiperbólicamente nos describe en el último capítulo, no se
entrega, sin embargo, á exponer las ideas y doctrina que abriga
sobre las cuestiones interesantísimas en que se ocupa sin cuidarse
de confirmarlas con documentos y datos de grande autoridad. Allá
se las avenga con los que no acepten esas ideas; que no le faltará,
como al Sr. Asensio y tantos otros de la misma escuela, quien las
desapruebe y rechace. No entra en mi cometido la misión de
discutirlas, dando á este informe las proporciones de un libro tan
voluminoso como el que estoy describiendo; pero, de un modo ú
otro, el del Sr. Sánchez Moguel nunca dejará de ofrecer un
grandísimo interés y enseñanzas verdaderamente magistrales.
En resumen: el de España y América es un libro que reune todas
las condiciones exigidas en el Real decreto de 12 de Marzo de
1875, siendo original, de relevante mérito y de utilidad para las
Bibliotecas, según terminantemente previene aquella soberana
disposición. La Academia, pues, podría recomendarlo á la Dirección
general de Instrucción pública para que adquiriese el número de
ejemplares que exige el mejor servicio del Estado en sus centros
literarios y bibliotecas populares.
Esta es, al menos, la opinión del que suscribe[1].
[1] Leido este informe en junta celebrada por la Real Academia
de la Historia el 28 de Junio, fué aprobado por unanimidad.
Madrid 28 de Junio de 1895.
José Gómez de Arteche.
 LAS CONFERENCIAS
AMERICANISTAS DEL ATENEO[2]
[2] Discurso resumen leído el 19 de Junio de 1892.
Señoras y Señores:
EL Ateneo de Madrid, que desde hace más de medio siglo viene
consagrando á la cultura de la patria el concurso meritorio de sus
luces; que, fiel á sus tradiciones, había de contribuir al cuarto
Centenario del descubrimiento de América en el modo y forma más
adecuados á su instituto; que, á este fin, estimó preferible á toda
obra la de preparar al país para la celebración del Centenario,
mediante una serie de conferencias públicas relativas al
descubrimiento, conquista y civilización del Nuevo Mundo, hoy, que
esta obra toca felizmente á su término, al considerar los resultados
obtenidos, al ver que oradores y escritores de toda filiación política y
científica, militares y marinos, sacerdotes y seglares; y lo que es
más hermoso todavía, americanos, portugueses y españoles, en
armonioso concierto, han contribuído un día y otro día, durante dos
años, á la ejecución de su pensamiento, se complace en publicar
solemnemente su gratitud á todos y cada uno de sus generosos
cooperadores, y en declarar muy alto que es su deseo, su
aspiración más viva, que la campaña terminada no sea la última,
sino la primera en pro de la fraternidad de los pueblos peninsulares
y de sus hijos al otro lado del Atlántico.
 Si la empresa de España y de Colón puso en contacto dos
continentes, sea la conmemoración del singular acontecimiento el
hecho venturoso que estreche los vínculos de uno y otro mundo;
vínculos más apretados y duraderos que los antiguos de la
conquista: los indestructibles vínculos de la fraternidad y del
derecho.
Empequeñecidos por nuestras discordias, viviendo casi en
exclusivo para los intereses y las luchas del momento, al acercarse
el cuarto Centenario de nuestra gloria mayor, habíamos ya casi
perdido la conciencia de la solidaridad nacional, los alientos para los
combates regeneradores, la esperanza en los destinos de la patria,
y hasta la memoria de lo que fuimos y de lo que hicieron nuestros
padres.
Ni en la cátedra ni en los libros, bien lo sabéis, la historia del
descubrimiento de América ha tenido hasta ahora la plaza que en
justicia le corresponde. Si doctas corporaciones, como la Real
Academia de la Historia y la Sociedad Geográfica, han consagrado
alguna parte de su labor al estudio de la historia americana; si no
han faltado nunca en nuestra patria entendidos americanistas, los
trabajos de éstos y las publicaciones de aquéllas, apenas si habían
trascendido más allá del contado número de los eruditos. La gran
mayoría de los españoles, ignorante de estos estudios, satisfacía su
escasa curiosidad por las cosas americanas en libros más
novelescos que históricos; y hubiera llegado seguramente á los días
del Centenario incapacitada para conmemorar dignamente hechos
que ignoraba ó que conocía únicamente en relatos superficiales ó
fabulosos, que es peor todavía.
Era, pues, necesario, imprescindible, despertar la atención y el
interés del país por el conocimiento positivo y completo de la
empresa descubridora, y esclarecer una por una, en numerosas
conferencias, las cuestiones que entraña su estudio.
Estas conferencias, primero en los oyentes, después impresas, en
toda clase de lectores responderían amplia y eficazmente á las
exigencias de la cultura general, con tanto mayor motivo, cuanto que
ninguna corporación había pensado en llenar este vacío. Las
empresas imaginadas ó acometidas por los centros oficiales y
particulares, exposiciones, monumentos, congresos, certámenes,
publicaciones bibliográficas y eruditas, trabajos indudablemente
valiosos, pero de distinta clase, y destinados todos para los días
mismos del Centenario, estaban bien lejos de proponerse la
preparación de este gran acontecimiento, ilustrando desde luego á
la nación mediante una serie especial de conferencias apropiadas al
efecto.
Para promoverla y llevarla á cabo, ninguna corporación tan
adecuada como el Ateneo de Madrid, centro de la cultura nacional,
tribuna siempre abierta á la libre propagación de todas las doctrinas,
preparación y complemento al par de la vida científica de las demás
corporaciones. La separación entre lo oficial y lo particular, como las
divisiones en partidos, sectas y escuelas, son extrañas á su instituto.
Templo de la tolerancia, caben en él todas las ideas, como en el
Panteón romano todos los dioses.
Su historia es la historia del progreso intelectual en nuestra patria.
Político, filosófico y literario, principalmente, en sus orígenes,
siguiendo después las fases y etapas de la evolución científica, fué
luego cultivador de las ciencias históricas. Si éstas, en tiempos
anteriores, no tuvieron la vida fecunda de las ciencias morales y
políticas, y las exactas, físicas y naturales, que contaban desde la
fundación de este Centro con secciones propias, hay que reconocer
en justicia que de algunos años acá alcanzan en sus tareas igual ó
semejante participación que estas otras ciencias, sobre todo desde
el establecimiento de una sección especial de Ciencias históricas.
Autor de este pensamiento, me es muy grato poder asegurar que el
Ateneo entero lo acogió favorablemente desde el primer instante,
como se reciben siempre las ideas que sólo necesitan ser
enunciadas para pasar de la categoría de proyectos á la de hechos
consumados.
Interesantes y animadas discusiones sobre materias históricas,
así como las notables conferencias dadas durante los cursos de
1885 á 1886 y de 1886 á 1887, sobre La España del siglo XIX,
aseguraron á los estudios históricos en la vida del Ateneo la
participación que les correspondía y que hoy alcanzan en el
movimiento científico contemporáneo.
El Centenario del descubrimiento de América debía llevar con
preferencia la atención á la historia del Nuevo Mundo, á sentir la
necesidad de darle entrada en la labor histórica del Ateneo, y al
pensamiento de cooperar á la celebración del Centenario con el
importante contingente de sus valiosos elementos. La bondad del
Ateneo, elevándome á la presidencia de la sección de Ciencias
históricas, en Junio de 1890, me proporcionó la honra de iniciar ya
entonces esta obra, cuya ejecución me fué luego encomendada, y
en la que he venido ocupándome hasta el día, no sé si con cabal
acierto, pero sí con verdadera solicitud y entusiasmo.
Ante todo, las conferencias debían corresponder cumplidamente á
la naturaleza del Centenario, que no era, como algunos habían dado
en apellidarle, Centenario de Colón, sino Centenario del
descubrimiento de América, y que comprendía, por lo tanto, no sólo
los primeros descubrimientos del gran navegante, por principales
que fuesen, sino también los verificados con posterioridad, así como
los precedentes que pudieran tener en tiempos anteriores. Tampoco,
por celebrarse en España, habían de reducirse los estudios á los
descubrimientos de los españoles, sino abarcar igualmente todos
los relativos á la tierra americana verificados por otras gentes, y
asimismo los relacionados íntimamente con ellos en África, Asia y
Oceanía. Por último, el examen de los descubrimientos, para ser
completo, debía enlazarse con el conocimiento de la América
prehispánica: el suelo, la flora, la fauna, las razas, las civilizaciones;
del mismo modo que con el de la obra europea en América:
conquistas, colonización, instituciones; en suma, debía estudiarse la
historia americana, ya que no hasta la emancipación colonial, al
menos en los primeros tiempos, y, como coronamiento de este vasto
estudio, las influencias que en la vida de Europa vino á ejercer á su
vez el descubrimiento de América, por ejemplo, en las ciencias
geográficas, las ciencias médicas, etc., etc.
Obra, en primer término, eminentemente nacional, no debía el
Ateneo limitarse en su ejecución á sus propias fuerzas, á la labor
exclusiva de sus socios, sino, por el contrario, solicitar la
cooperación de todas las personas competentes del país, ya
conocidas por sus trabajos americanistas, ya entendidas en estudios
históricos, que pudieran cultivar ahora los referentes á América,
dando así á estos estudios la extensión y alcance que no tenían en
nuestra patria.
Á todas, importa decirlo, á todas igualmente se dirigió el
llamamiento del Ateneo, sin distinción de clases, doctrinas y
partidos: todas, con excepciones contadísimas, respondieron á este
patriótico llamamiento: la Iglesia, la Marina, el Ejército, las
Corporaciones científicas y literarias, oficiales y particulares,
especialmente la Universidad Central, la Academia de la Historia y
la Sociedad Geográfica. Algunos de los conferenciantes, como el Sr.
Pí y Margall, hacía ya muchos años que estaban alejados por
completo de la vida ateneística; otros, como el Sr. Marqués de
Cerralbo, no habían atrevesado ni una vez siquiera los umbrales del
Ateneo. Por vez primera en España, historiadores, geógrafos,
literatos, naturalistas, han tomado parte juntos en una misma obra:
la obra gloriosa de nuestros padres.
Ninguna institución tan elevada como la Iglesia, ni de tan
considerable influjo en la vida de la nación descubridora y en la de
sus hijos americanos: ninguna, por consiguiente, con mayores
derechos y deberes en la celebración del Centenario. ¿Cómo, pues,
era imposible que el Ateneo desconociera aquellos derechos,
dejando de invocar la cooperación de la Iglesia en la obra de sus
conferencias? ¿Ni cómo, tampoco, que la Iglesia olvidara sus
deberes dejando de responder al llamamiento del Ateneo?
De los sacerdotes llamados á compartir nuestras tareas,
solamente aceptó su encargo el Sr. Jardiel, Canónigo de Zaragoza.
Acaso, y sin acaso, la absoluta libertad que en el Ateneo disfrutan
todas las doctrinas haya sido causa de que los otros sacerdotes
invitados no hayan querido ó podido aceptar igualmente las
conferencias encomendadas. Es innegable que dicha libertad no ha
sido nunca muy del gusto de algunos católicos, como no lo es
menos que otros, muchísimos por cierto, han creído más
conveniente aceptarla y emplearla en la defensa y propagación de
sus ideas y sentimientos genuinamente católicos.
 Socios del Ateneo fueron sacerdotes tan insignes como Lista y
Gallego, cuyos retratos figuran en la galería de ateneístas ilustres.
En los bancos de nuestra casa hemos visto hasta ha poco al
inolvidable D. Miguel Sánchez, librando descomunales batallas en
pro de la ortodoxia más pura, con admiración y aplauso de todos.
Entendía el docto Presbítero más conforme con el espíritu del
Evangelio propagar sus creencias en abierto combate que
abstenerse de toda lucha, que es como igualmente lo han entendido
y entienden hoy, no ya simples sacerdotes, sino príncipes de la
Iglesia.
He aquí la importancia excepcional que tuvo la solemnidad
celebrada en el Ateneo el 21 de Marzo último: la entrada de la
Iglesia en el Ateneo, en la persona del respetable Arzobispo de
Santiago de Cuba, que presidió el acto, y del distinguido sacerdote
aragonés encargado de llevar juntamente la voz de la Iglesia y del
Ateneo en aquella noche memorable.
En la aceptación y venida del Sr. Jardiel corresponde participación
altísima á su Prelado, el Emmo. Cardenal Benavides, Arzobispo de
Zaragoza. «Ayer di cuenta al Emmo. Sr. Cardenal de la carta de
usted (me escribía el señor Jardiel el 30 de Octubre del año
pasado), y no sólo me concede permiso para aceptar el encargo que
usted me propone, sino que me ha animado á ello con
señaladas muestras de satisfacción.»
Al obrar así el Arzobispo cesaraugustano, respondía
cumplidamente, no sólo á patrióticos sentimientos, sino á antiguas y
arraigadas convicciones. En su Oración fúnebre en las honras de
Cervantes, celebradas por la Real Academia Española en 1863, se
hallan estas hermosas palabras: «¿Acaso la dulce y sonora voz
evangélica será extraña al progreso intelectual? ¿No llevará con
igual amor sus consuelos y sus lecciones al ignorante y al sabio?
¿Por ventura haremos odiosas distinciones que el divino Maestro
rechazaba, entre el judío y el gentil, el griego y el romano, el bárbaro
y el escita?»
Con la memoria de tan fausto acontecimiento se enlaza el
recuerdo de otros también nuevos é importantes, no sólo en el
Ateneo, sino en la celebración del Centenario. Antes que ninguna
otra corporación, la nuestra, desde un principio, acordó solicitar el
concurso de americanos y portugueses, teniendo en cuenta que la
obra de Portugal en los descubrimientos es inseparable de la
puramente española, y que á los americanos importaba tanto como
á los peninsulares el esclarecimiento de hechos históricos de igual
valor y alcance para toda la familia. Así, además de la importancia
científica de la cooperación prestada por americanos y portugueses,
podría darse el hermoso y trascendental espectáculo de aparecer
por primera vez unidos portugueses, americanos y españoles en
una misma empresa, principio fecundo de tantas otras en que,
siempre á salvo las respectivas independencias políticas, están
obligados á intervenir de igual modo, como la común historia
reclama y el común interés exige.
No es de extrañar que no todos los portugueses y americanos que
el Ateneo invitó aceptasen igualmente las conferencias ofrecidas,
con sólo tener en cuenta la carencia de precedentes análogos. Por
fortuna, el Sr. Oliveira Martins y los Sres. Riva Palacio, Solar y
Zorrilla de San Martín, han venido á establecerlos, llevando
dignamente en la empresa ateneísta, el primero la representación
de Portugal, y los segundos la de América, con gratitud y regocijo,
no ya del Ateneo, sino de España entera.
De este modo, nuestras conferencias, encaminadas ante todo á
ilustrar la historia americana y á preparar al país para la celebración
del Centenario, han contribuído además á estrechar fraternales
vínculos, por una parte entre las diferentes instituciones y elementos
de nuestra patria, y por otra entre los pueblos peninsulares y
americanos; precediendo en esta obra á todas las corporaciones, no
sólo en el campo de las teorías, sino en la esfera fecunda de la
práctica. Bien puede decirse, en este sentido, que al Ateneo
corresponde, en primer término, la gloria de abrir el camino y
señalar el rumbo que debía seguirse en la celebración del
Centenario.
Que no todas las conferencias son de igual mérito ni científico ni
literario, que unas han sido fruto de nuevas investigaciones y otras
mera vulgarización de conocimientos ya sabidos de los doctos, no
hay que decirlo. Que unas y otras han servido, en mayor ó menor
grado, á la cultura general, es evidente. La crítica digna de este
nombre no podrá menos de reconocer en justicia que el Ateneo ha
hecho cuanto le ha sido dable al mejor logro de su intento, y que si
no ha hecho más no ha sido por falta de iniciativa y de deseo, sino
porque no lo ha consentido el estado de los estudios históricos en
España.
Temerario sería, señores, pretender compendiar en modo alguno
el contenido de las conferencias, ni mucho menos aquilatarlo
cumplidamente. ¿Quién, dentro ni fuera de nuestro país, posee á un
tiempo aptitudes y conocimientos científicos de tan diversa índole
para examinar obra tan vasta y tan compleja? ¿Ni quién menos
autorizado que yo para intentarlo, ya por mi propia insuficiencia, ya
por la parte que he tenido en esta obra? Sólo me es posible
bosquejar ligeramente los caracteres generales que las conferencias
han tenido, por vía de ojeada al conjunto y á sus partes principales,
sin entrar en el examen analítico de todas y y cada una de las
cuestiones estudiadas.
Como era de esperar, el descubridor del Nuevo Mundo ha sido
objeto de distintas conferencias, en las cuales la erudición de
primera mano y la verdadera crítica histórica han imperado algunas
veces, y en otras las dos diversas leyendas colombinas, esto es, la
apologética y la demoledora, la que diviniza á Colón y la que rebaja
sus merecimientos reales y efectivos en pro de figuras subalternas ó
en aras de un mal entendido patriotismo. En una y otra se rompe la
unión esencial é indivisible que en el orden histórico existirá siempre
entre los nombres de España y Colón, factores inseparables del
descubrimiento de América, sacrificando con igual injusticia, ya
España á Colón, ya Colón á España.
En la leyenda apologética, la más general y extendida, Colón no
es un hombre, capaz, por su humana naturaleza, de errores y de
culpas; es un santo, profeta de un Nuevo Mundo, á él solo revelado,
y mártir de la ignorancia, la ingratitud y la barbarie de España. La
nación descubridora, única en comprender los proyectos
colombinos, única también en dar para su ejecución su patrocinio,
sus recursos, sus naves, sus propios hijos, esa nación, salvo alguna