Microbiology of food chain

General requirements and guidance for

microbiological examinations
ISO 7218:2024

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

นายสัตวแพทย์เชี่ยวชาญ
 ISO/TC 34/SC 9 Food products - Microbiology

Lake Geneva and the Swiss Alps on the other side.

Place Nestle Headquarters Switzerland น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

ISO/TC 34/SC 9 Food products - Microbiology

43rd meeting
Meeting dates 11 June 2024 to 14 June 2024

Place USA
MilliporeSigma
2909 Laclede Ave, St. Louis, MO 63103

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
 ISO 7218 คืออะไร?
ISO 7218 เป็ นมาตรฐานทีม ่ โี ครงสร้างประกอบด้วย ข้อกาหนดและเทคนิคทั่วไปสาหรับ
การวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาของอาหารและอาหารสัตว์ โดยมีกรอบงานทีค่ รอบคลุม
เพือ่ ให้ห้องปฏิบัตกิ ารสามารถทดสอบทางจุลชีววิทยาได้ถูกต้องอย่างสม่าเสมอ
มาตรฐานนีค้ รอบคลุมทุกขั้นตอนตัง้ แต่การเตรียมตัวอย่าง การจัดการตัวอย่างไปจนถึง
การใช้วธิ ีเฉพาะทางจุลชีววิทยา
เหตุใด ISO 7218 จึงมีความสาคัญ?
ISO 7218 มีความสาคัญอย่างยิง่ ต่อความมั่นใจในความปลอดภัยและคุณภาพของ
ผลิตภัณฑ์อาหารและอาหารสัตว์ ทัง้ นีก้ ารทาให้กระบวนการทดสอบทางจุลชีววิทยาเป็ น
มาตรฐานขึน้ มา จะช่วยให้ห้องปฏิบัตกิ ารตรวจพบเชือ้ ก่อโรคและจุลนิ ทรียท์ ก่ี ่อให้เกิด
การเน่าเสียได้อย่างมีประสิทธิภาพ จึงสามารถป้ องกันโรคจากอาหารและมั่นใจได้ว่า
ผลิตภัณฑ์อาหารต่างๆปลอดภัยสาหรับการบริโภค ดังนั้นมาตรฐานนีจ้ งึ มีความสาคัญต่อ
ผู้ผลิตอาหาร หน่วยงานกากับดูแล และห้องปฏิบัตกิ ารทดสอบ เพราะนอกจากจะช่วย
รักษาสถานภาพด้านสุขภาพของประชาชนแล้วยังช่วยให้เกิดการยืนยันเกีย่ วกับความ
สอดคล้องกับข้อกฎหมายและระเบียบด้านความปลอดภัยอาหารระหว่างประเทศอีกด้วย
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
หัวข้อใน ISO 7218

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

หัวข้อใน ISO 7218

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

หัวข้อใน ISO 7218

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

วัตถุประสงค์การปรับปรุ งของ ISO 7218:2024
1. Clearify / Simplfy and Harmonize

2. Improve realiability of test results

3. Strengthen process control

4. Integration of new technologies

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

 คานา
เอกสารฉบับนี้ ได้ยกเลิกและแทนทีฉ่ บับ ISO 7218:2007 และฉบับแก้ไขทางเทคนิค ISO
7218:2007/Amd 1 :2013

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

 คานา
เอกสารฉบับนี้ ได้ยกเลิกและแทนทีฉ่ บับ ISO 7218:2007 และฉบับแก้ไขทางเทคนิค ISO
7218:2007/Amd 1 :2013

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

 คานา
การเปลี่ยนแปลงหลักๆของฉบับนี้ มีดงั นี:้

❑ การคานวณ ได้รับการทาให้งา่ ยขึน้ และเพิม่ โปรแกรมสูตรคานวณอีก

2 โปรแกรม
❑ เครื่องมืออุปกรณ์ได้มีการจัดระเบียบใหม่ ให้อยู่เป็ นกลุ่มทีม่ ี
วัตถุประสงค์ และข้อกาหนดทีค่ ล้ายคลึงกัน

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

การเปลีย่ นแปลงหลักๆ มีดังนี้

❑ เพิม่ cross-references ไปยังมาตรฐานด้านจุลชีววิทยาทั่วไปอืน่ ๆ เช่น

มาตรฐาน culture media, validation and verification, and uncertainty เพือ่ ลด
การทาซา้

❑ เพิม่ ข้อมูลเกีย่ วกับการควบคุมคุณภาพของห้องปฏิบัตกิ าร(laboratory quality

control)

และลักษณะเฉพาะของจุลินทรียค์ วบคุม (characterization of control

microorganisms)
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
การเปลีย่ นแปลงหลักๆ มีดังนี้

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

1. ขอบข่าย

เอกสารฉบับนีร้ ะบุข้อกาหนดทั่วไปและคาแนะนาสาหรับตรวจวิเคราะห์เชือ้ จุลนิ ทรีย ์

สามารถนาไปใช้ได้กับ
• การปฏิบัตติ ามมาตรฐานทีก่ าหนดโดยคณะกรรมการ ISO/TC 34/SC 9 หรือ ISO/TC
34/SC 5 ในการนาไปใช้สาหรับการวิเคราะห์จล ุ นิ ทรียท์ งั้ เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ
• การปฏิบัตทิ ด่ี ขี องห้องปฏิบตั กิ าร (GLP) จุลชีววิทยาทีว่ เิ คราะห์ตวั อย่างอาหาร
• มาตรฐาน ISO/IEC 17025 ของห้องปฏิบัตกิ ารจุลชีววิทยาทีว่ เิ คราะห์ตวั อย่างอาหาร
ข้อกาหนดต่างๆในมาตรฐานทั่วไปฉบับนี้ จะถูกแทนทีด่ ้วยสิง่ ทีม่ อี ยูใ่ นมาตรฐานเฉพาะ
เช่น คาแนะนาเพิม่ เติมในการตรวจวิเคราะห์โดยวิธี PCR (polymerase chain
reaction) จะระบุไว้ใน ISO 22174 ซึง่ เป็ นมาตรฐานเฉพาะ ดังนั้นการวิเคราะห์ PCR
จะต้องใช้ISO 22174
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
1. ขอบข่าย
เอกสารนี้ครอบคลุมการวิเคราะห์ bacteria yeasts และ moulds และยังใช้
วิเคราะห์ไ ด้กับ parasitesและ viruses อีกด้วย หากเสริ มด้ วยค าแนะน าเฉพาะ แต่ ใ ช้
ไม่ได้กับการวิเคราะห์สารพิษและเมตะบอไลต์อื่นๆ เช่น amines จากจุลินทรีย ์
สาหรับตัวอย่างที่จะวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยากับมาตรฐานฉบับนี้คือตัวอย่างใน
ห่วงโซ่อาหาร ตัง้ แต่ ตัวอย่างทีเ่ ป็ นการผลิตขั้นต้น(primary production stage) ไปจนถึง
ผลิตภัณฑ์อาหารและอาหารสัตว์และรวมถึงตัวอย่างสภาพแวดล้อมของการผลิตอาหาร
และตัวอย่างจากการจัดการอาหาร
เอกสารนีย้ ังใช้ได้กับการวิเคราะห์ตัวอย่างน้าทีใ่ ช้ในการผลิตอาหารหรือตัวอย่าง
นา้ ทีเ่ ป็ นอาหารตามกฎหมายแห่งชาติ
จุดประสงค์ของเอกสารฉบับนีเ้ พื่อช่วยทาให้ม่ันใจความถูกต้องของการวิเคราะห์
ทางจุ ลชีววิทยาอาหาร โดยเฉพาะอย่างยิ่งเพื่อให้ม่ั นใจว่าเทคนิ คทั่วไปในการตรวจ
วิ เ คราะห์มี ค วามเหมื อ นกั น ทุ ก ห้ อ งปฏิ บั ติ ก าร เพื่ อ ให้ ไ ด้ ผ ลลั พ ธ์ ที่ ส ม่ า เสมอใน
ห้ อ งปฏิ บั ติ ก ารแม้ จ ะต่ า งที่ กั น และเพื่ อ น าไปสู่ ค วามปลอดภั ย ของเจ้ า หน้ า ที่ ใ น
ห้องปฏิบัตกิ ารโดยป้ องกันความเสี่ยงจากการติดเชือ้ น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
New ISO 7218:2024 Standard:

What’s Different?

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

4 สถานที่ 4.4 พืน้ ทีห่ อ้ งปฏิบัตกิ าร
ISO 7218:2024 strongly encourages separating sample preparation flows
based on their nature and potential contamination (Section 4.4.2).

4.4.2 พืน้ ทีท่ เ่ี กี่ยวข้องกับตัวอย่างและการทดสอบ

- พืน้ ทีเ่ ตรียม laboratory samplesและ test portions (ให้แยกพืน้ ทีว่ เิ คราะห์ตัวอย่างผง
และตัวอย่างทีม่ แี นวโน้มหรือทราบว่ามีจุลนิ ทรียอ์ ยู่มาก ออกไปจากตัวอย่างอืน่ เพือ่
ลดความเสีย่ งของการปนเปื้ อนข้าม และให้แยกพืน ้ ทีเ่ ตรียมอาหารทีเ่ ป็ นการค้าพร้อม
ใช้งานทีผ่ ่านการฆ่าเชือ้ แล้ว เพือ่ ป้ องกันการปนเปื้ อนข้ามทีม่ าจากตัวอย่างอืน่ ๆ)
- พืน้ ทีเ่ ตรียมและทดสอบตัวอย่างด้วยวิธี PCR nucleic acid amplification (ดูรายละเอียด
ใน ISO 22174)
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
4 สถานที่
4.5 แผนผังและองค์ประกอบของสถานที่
4.5.1 กาหนดทิศทางการไหลเวียนของอากาศให้เหมาะสม ทัง้ เข้าและ
ออกจากห้องปฏิบัตกิ าร เพือ่ ลดความเสีย่ งของการปนเปื้ อนเชือ้ จุลนิ ทรียล์ งใน
ตัวอย่างขณะทาการทดสอบ หรือกาหนดทิศทางการไหลเวียนของอากาศจาก
โรงงานผลิตอาหาร(ถ้าอยู่ตดิ กัน)

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

4 สถานที่
4.5 แผนผังและองค์ประกอบของสถานที่
4.5.3 การจัดการอืน่ ๆ สาหรับสถานทีห่ อ้ งปฏิบัตกิ าร(ต่อ)

- ห้ามมีเฟอร์นิเจอร์ เอกสาร หรือสิง่ ของอืน่ ใดนอกเหนือจากสิง่ ทีจ่ าเป็ นสาหรับ

กิจกรรมการวิเคราะห์ทดสอบ ในพืน้ ทีว่ เิ คราะห์ทดสอบ มือถือ!
- จัดหาสารต่างๆทีใ่ ช้ในการล้างมือ (หรือนา้ ยาพิเศษหรือเจลทีม่ แี อลกอฮอล์) เอาไว้ในห้อง
ทดสอบแต่ละห้อง โดยควรอยู่ใกล้ประตู
- จัดหาอุปกรณ์ใส่สารทีใ่ ช้ในการล้างมือ โดยเฉพาะอย่างยิง่ ใช้งานแบบแฮนด์ฟรี ทีท่ างเข้า/
ออกพืน้ ทีท่ ดสอบเชือ้ ก่อโรค

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

4 สถานที่
4.5.4 การทาความสะอาดและการฆ่าเชือ้ โรค
ในการทาความสะอาดและฆ่าเชือ้ โรคต้องพิจารณาวิธีการ ความถี่ และการควบคุม ตาม
ระดับความเสีย่ ง
ใช้อุปกรณ์ทาความสะอาดทีเ่ ฉพาะกับทุกพืน้ ทีข่ องห้องปฏิบัตกิ ารจุลชีววิทยา เช่นใช้
อุปกรณ์แยกต่างหากสาหรับพืน้ ทีท่ มี่ คี วามเสีย่ งสูง เช่น ห้องปฏิบัตกิ ารเชือ้ ก่อโรค
เฝ้ าระวังระดับการปนเปื้ อนทางจุลชีววิทยาของ อากาศair พืน้ ผิวsurfaceทีท่ างาน
ภายในห้องปฏิบัตกิ าร และพืน้ ผิวสัมผัสของตัวพนักงาน(hand) อย่างสม่าเสมอ (ความถี่ ขึน้ อยู่
กับผลการตรวจสอบก่อนหน้านี้ และความเสีย่ งต่อความถูกต้องของผลการทดสอบ)

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

4 สถานที่

มาตรฐานก่อนหน้านีค้ รอบคลุมถึงการปนเปื้ อนข้าม แต่มาตรฐาน

เวอร์ชันใหม่ของปี 2024 มีแนวทางทีล่ ะเอียดกว่าและข้อกาหนดที่
เข้มงวดยิง่ ขึน้ เพือ่ ให้แน่ใจว่าห้องปฏิบัตกิ ารได้ปฏิบัตติ ามแนวทาง
ปฏิบัตทิ ดี่ ที สี่ ุด เพือ่ ลดความเสี่ยงการปนเปื้ อนข้าม ให้เหลือน้อยทีส่ ุด
5. บุคลากร
5.4 สุขอนามัย
- สวมเสือ้ ผ้าห้องปฏิบัตกิ ารทีร่ ัดกุม เสือ้ กาวน์สาหรับ
ห้องปฏิบัตกิ ารโดยเฉพาะและควรเป็ นเสือ้ แขนยาวและมีปลอกแขนยางยืด
- สวมรองเท้าของห้องปฏิบัตกิ ารในพืน้ ทีท่ ดี่ าเนินการกับเชือ้ ก่อ
โรค อย่าสวมชุดห้องปฏิบัตกิ ารออกนอกพืน้ ทีท่ างานของห้องปฏิบัตกิ าร
(และนอกห้องเปลีย่ นเสือ้ ผ้า)
- เก็บเสือ้ ผ้าและทรัพย์สนิ ส่วนตัวไว้ข้างนอก เช่น โทรศัพท์ หูฟัง
และเครื่องประดับ ก่อนเข้าห้องปฏิบัตกิ าร เพราะสิง่ เหล่านีอ้ าจเป็ นแหล่ง
ปนเปื้ อน

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

6. เครื่องมือ อุปกรณ์และวัสดุสนิ้ เปลือง

6.1 ทั่วไป
กล่าวถึง Performance testing of thermal cyclers ว่าจาเป็ นต้องมีการสอบ \
เทียบหรือไม่ ให้พจิ ารณาใน ISO 20836:2021: Polymerase chain reaction
(PCR) for the detection of microorganisms — Thermal performance testing
of thermal cyclers

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

6. เครื่องมือ อุปกรณ์และวัสดุสนิ้ เปลือง
6.3 Temperature controlled equipment and monitoring devices
6.3.2 Incubator
6.3.2.4 การทวนสอบ (ต่อ)
ใช้ข้อมูลจากการทาแผนทีm ่ apping/การทาprofilingอุณหภูมใิ ช้งานนี้ เพือ่ กาหนดช่วง
การทางานทีย่ อมรับได้ของตู้Incubatorและกาหนดตาแหน่งทีเ่ หมาะสมของอุปกรณ์ตรวจสอบอุณหภูมหิ รือ
recording thermocouple ซึง่ ใช้เพือ่ เฝ้ าระวังอุณหภูมทิ ใ่ี ช้งาน ตัวอย่างเช่น เพือ่ ให้ได้อุณหภูมเิ ป้ าหมายที่
(37 ± 1) °C เมือ่ ข้อมูลการทาโปรไฟล์/แผนทีอ่ ุณหภูมทิ งั้ ตู้9จุด แสดงช่วงต่าสุด 36.8 °C ถึง สูงสุด 37.2 °C
ให้ใช้การเปลีย่ นแปลงอุณหภูมทิ สี่ ังเกตได้ ± 0.2 °C ทาการกาหนดขีดจากัดการทางานของตู้Incubatorไป
ช่วงการทางาน(อุณหภูมิ)ทีย่ อมรับได้ของตู้Incubator
ปรับแก้ไขช่วงอุณหภูมดิ ้านล่างจาก36°Cเป็ น 36.2°C และขีดจากัดบนจาก38°Cเป็ น 37.8 °C เพือ่ ให้แน่ใจ
ว่าทุกพืน้ ทีข่ องตู้Incubator มีอุณหภูมไิ ด้ตามเป้ าหมาย(37 ± 1) °C
เมือ่ กาหนดช่วงการทางานของอุณหภูมใิ หม่ ควรคานึงถึงความไม่แน่นอนของการวัด
ของอุปกรณ์ตรวจสอบอุณหภูมขิ องตู้Incubatorด้วย แม้ว่าโดยปกติแล้วจะน้อยทีส่ ุดก็ตาม
 ตัวอย่างใบรับรองผลการสอบเทียบและการอ่านผล
ผลการทวนสอบ การสอบเทียบเพือ่ ใช้งาน Incubator วิธีทดสอบกาหนดอุณหภูมิ 32±1 ;31-33 °c
Verification parameter Position1 Position2 Position3 Position4 Position5 Position6 Position7 Position8 Position9

UUC reading temp. 32 32 32 32 32 32 32 32 32

Reference reading temp. 31.84 31.91 31.76 31.68 31.73 31.74 31.63 31.68 31.53

Error 0.16 0.09 0.24 0.32 0.27 0.26 0.37 0.32 0.47

Uncertainty± 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

UUC reading -Error -Unc. 31.59 31.66 31.51 31.43 31.48 31.49 31.38 31.43 31.28

UUC reading -Error+ Unc. 32.09 32.16 32.01 31.93 31.98 31.99 31.88 31.93 31.78

Result of verification passed passed passed passed passed passed passed passed passed

Maximum permissible error 32±1 °c ดังนั้นอุณหภูมิทห

ี่ น้ าจอต้ องอยู่ในช่ วง
31+(32-31.28=0.72) =31.72
33+(32- 32.16=-0.16) =32.84 จึงจะสอดคล้ องตามทีว่ ธิ ีทดสอบกาหนด
6. เครื่องมือ อุปกรณ์และวัสดุสนิ้ เปลือง
6.3 Temperature controlled equipment and monitoring devices
6.3.2 Incubator
6.3.2.4 การทวนสอบ (ต่อ)
นอกจากนี้ ควรทวนสอบโปรไฟล์อุณหภูม(ิ temperature profiling)ของenrichment
broths (ทีป่ ริมาตรมากๆ) ก่อนนาไปใช้กับวิธีทดสอบหรือเมือ่ ทาการเปลีย่ นขนาดของtest portionเพือ่ ให้
มั่นใจว่าเวลาทีใ่ ช้ให้ไปถึงอุณหภูมเิ ป้ าหมายทีใ่ ช้บ่ม ได้มกี ารพิจารณาว่าสอดคล้องตามระยะเวลาทีร่ ะบุไว้
ในมาตรฐานเฉพาะแล้ว (ดูข้อ 12.2 ข้อ 12.2) หากจาเป็ นก็ให้แยกตู่บ่มสาหรับอุ่นbrothsก่อนใช้เลีย้ งเชือ้
เพือ่ ให้ระยะเวลาในการรออุณหภูมขิ องbrothsขึน้ มาถึงอุณหภูมเิ ป้ าหมาย จะไม่กระทบต่อผลการทดสอบ
6. เครื่องมือ อุปกรณ์และวัสดุสนิ้ เปลือง
6.4 Defined volume inoculation equipment
6.4.3 Spiral platers
6.4.3.2 การใช้งาน

ให้ฆ่าเชือ้ ระบบแจกจ่ายแล้วล้างออกด้วยนา้ กลั่นหรือนา้ ปราศจากไอออน

นา้ เกลือปราศจากเชือ้ 0.9 % หรือสารละลายอืน่ ๆทีป่ ราศจากเชือ้ ซึง่ ระบุโดยผู้ผลิตก่อนและหลังการ
ใช้งาน และคั่นกลางระหว่างแต่ละตัวอย่าง ( ละเอียดกว่าVersionเดิม)
8. การเตรียมและการใช้อาหารเลีย้ งเชือ้

วิธีการทดสอบประสิทธิภาพของอาหารเลีย้ งเชือ้ และreagent ทางจุลชีววิทยาแต่ละชนิดกาหนดไว้ใน

ISO 11133 และสายพันธุ ์ QC ทีแ่ นะนาให้ใช้สาหรับอาหารเลีย้ งเชือ้ แต่ละชนิดจะระบุไว้ในวิธีมาตรฐาน
เฉพาะ ทัง้ วิธีทเึ่ ป็ นdetection, enumeration หรือ confirmation of microorganisms

อาหารเลีย้ งเชือ้ แบบพร้อมใช้งานทีผ่ ่านการทดสอบตามมาตรฐาน ISO 11133 โดยผู้ขายแล้ว

ห้องปฏิบัตกิ ารของผู้ใช้ ยังจาเป็ นต้องทดสอบแต่ให้น้อยลงได้ หากได้ปฏิบัตติ ามเงือ่ นไขการขนส่งและการ
จัดเก็บอย่างถูกต้อง

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

9. Laboratory samples
9.2 การขนส่งตัวอย่าง(ต่อ)
ถ้าหากไม่กาหนดเป็ นอย่างอืน่ ตามมาตรฐานเฉพาะ (เช่น ISO 6887-3)
Recommended(แนะนา)ให้ใช้อุณหภูมติ ่อไปนีร้ ะหว่างการขนส่ง :
- ผลิตภัณฑ์ทมี่ คี วามเสถียร: อุณหภูมหิ ้อง (18 °C ถึง 27 °C)
- ผลิตภัณฑ์ frozen หรือ deep-frozen: ต่ากว่า −15 °C, ถ้าจะให้ดคี วรต่ากว่า −18 °C;
- ผลิตภัณฑ์อนื่ ๆทีไ่ ม่เสถียรทีอ่ ุณหภูมหิ ้อง: 5 °C ± 3 °C;
- surface samples: แช่เย็นทีอ่ ุณหภูมิ 1 °C ถึง 8 °C (ดู ISO 18593 และ ISO 17604)
เมือ่ ใดทีไ่ ม่ได้ระบุเงือ่ นไขใดๆ ไว้ แนะนาให้ทุกฝ่ ายทีเ่ กีย่ วข้องตกลงเกีย่ วกับระยะเวลาและอุณหภูมิ
ของการขนส่ง

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

9. Laboratory samples EXPERT MEETING SEP 2024

surface samples

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

9. Laboratory samples
9.3 Sample receipt การรับตัวอย่าง
เมือ่ ได้รับตัวอย่างทีเ่ น่าเสียง่าย ให้บันทึกอุณหภูมขิ องการขนส่งหรืออุณหภูมขิ องตัวอย่างด้วย
ทดสอบตัวอย่างโดยเร็วทีส่ ุดหลังจากทีไ่ ด้รับไว้ และควรทดสอบภายใน 24 ชั่วโมง หรือตามทีต่ กลงไว้กับผู้ท่ี
เกีย่ วข้อง
สาหรับผลิตภัณฑ์ทเี่ น่าเสียง่ายมาก (เช่น หอย) หรือในกรณีอนื่ ทีม่ รี ะบุ (เช่น water และswab) ให้
ทดสอบภายใน 24 ชั่วโมงหลังจากสุ่มตัวอย่าง สาหรับผลิตภัณฑ์ทเ่ี น่าเสียง่ายอืน่ ๆ (เช่น ปลา นา้ นมดิบ ) ควร
ทดสอบภายใน 36 ชั่วโมง
ไม่อนุญาตให้แช่แข็งตัวอย่างก่อนทาการทดสอบ ยกเว้นผลิตภัณฑ์ทแี่ ช่แข็งแล้ว เนื่องจากการกระทา
ดังกล่าวอาจส่งผลต่อผลการทดสอบโดยทาให้ปริมาณจุลนิ ทรียเ์ ปลีย่ นแปลงไป

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

 การเก็บรักษาและนาส่ งตัวอย่ าง

⚫ นาขวดตัวอย่ างทั้งหมดใส่ ลงในถุงพลาสติกอย่ างน้ อยสองชั้นแล้วมัด

ปากถุงให้ แน่ น บรรจุลงในกล่องเพื่อรักษาอุณหภูมิตวั อย่ างให้ อยู่
ในช่ วง 0-4 องศาเซลเซียส ส่ งห้ องปฏิบัติการของ สตส. หรื อ
ศวพ. ให้ เร็วทีส่ ุ ดภายใน 24 ชั่วโมง
9. Laboratory samples
9.4 การจัดการตัวอย่าง
9.4.2 การเก็บรักษาก่อนการตรวจ
จัดเก็บตัวอย่างเพือ่ รอทดสอบภายใต้สภาวะทีจ่ ะลดการเปลีย่ นแปลงของจานวนเชือ้ จุลนิ ทรีย ์
แนะนาให้ใช้อุณหภูมใิ นการจัดเก็บต่อไปนี้ :
- ผลิตภัณฑ์ทมี่ คี วามเสถียร: อุณหภูมหิ ้อง (18 °C ถึง 27 °C);
- ผลิตภัณฑ์ frozen หรือ deep-frozen: ต่ากว่า −15 °C, ถ้าจะให้ดคี วรต่ากว่า −18 °C;
- ผลิตภัณฑ์อน่ื ๆทีไ่ ม่เสถียรทีอ่ ุณหภูมหิ ้อง: 5 °C ± 3 °C;
- surface samples: แช่เย็นทีอ่ ุณหภูมิ 1 °C ถึง 8 °C (ดู ISO 18593 และ ISO 17604)

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

9. Laboratory samples EXPERT MEETING SEP 2024

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

9. Laboratory samples
9.4 การจัดการตัวอย่าง
9.4.3 การจัดเก็บตัวอย่างห้องปฏิบัตกิ ารหลังการตรวจ
ให้เก็บตัวอย่างในห้องปฏิบัตกิ ารหรือส่วนทีเ่ ป็ นตัวแทนไว้จนกว่าจะได้ผลลัพธ์ทงั้ หมด
หรือนานกว่านั้นหากลูกค้าต้องการ จะยกเว้นในกรณีพเิ ศษทีไ่ ม่สามารถเก็บตัวอย่างได้ เช่นตัวอย่าง
waters หรือ surface samples
ต้องบรรจุตัวอย่างในภาชนะทีป่ ราศจากเชือ้ (เช่น ขวด ถุงพลาสติก) และเก็บในทีท่ ม่ี ี
สภาวะการจัดเก็บตามทีร่ ะบุใน 9.4.1

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

 9. Laboratory samples EXPERT MEETING SEP 2024
9.4 การจัดการตัวอย่าง
9.4.3 การจัดเก็บตัวอย่างห้องปฏิบัตกิ ารหลังการตรวจ
การทดสอบซา้ กับตัวอย่างทีเ่ ก็บไว้ ไม่เป็ นทีย่ อมรับ เนื่องจากการกระจายตัวของจุลินทรีย์ใน
ตัวอย่างในห้ องปฏิบัติการนัน้ ไม่เป็ นเนือ้ เดียวกัน และประชากรของจุลินทรีย์อาจมีการเปลีย่ นแปลงใน
ระหว่างการเก็บรักษา

มาตรฐานห้ามการทดสอบซา้ ตัวอย่างทีว่ เิ คราะห์แล้ว เพียงเพือ่ ให้ได้ผลลัพธ์ท่ี "ดีขนึ้ " เท่านั้น ข้อ

ห้ามนีส้ อดคล้องกับคาแนะนาของ Codex หลายปี มาแล้ว
ห้องปฏิบัตกิ ารบางแห่งซึง่ เคยชินกับการแช่แข็งตัวอย่างของลูกค้า เพือ่ อานวยความสะดวกในการ
จัดการห้องปฏิบัตกิ ารนั้น จะต้องเรียนรู้ทจ่ี ะทางานในรู ปแบบทีต่ ่างจากเดิม เช่น เริ่มการวิเคราะห์เมือ่
ได้รับตัวอย่าง หรือต้องทางานในวันเสาร์และอาทิตย์ หรือใช้ incubatorsแบบแช่เย็น(refrigerated
incubators) น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
10. การทดสอบ
10.1 ข้อควรระวังด้านสุขอนามัยระหว่างการเตรียมตัวอย่างและการทดสอบ
10.1.6 การควบคุมกระบวนการทดสอบ
เมือ่ ใช้สายพันธ์เชือ้ เป้ าหมายมาควบคุมกระบวนการ (ดู16.2.2) ควบคู่ไปกับการทดสอบ
โดยเฉพาะอย่างยิง่ กรณีทใี่ ช้เป็ น positive controls, จะต้องลดโอกาสของเกิดfalse-positive results
อันเนื่องจากการปนเปื้ อนข้ามของpositive controls โดย :
- การใส่เชือ้ เพือ่ ควบคุมกระบวนการทัง้ NegและPos Control ให้ทาในพืน้ ทีแ่ ยก
ต่างหากจากตัวอย่างทดสอบหรือให้แยกเวลา
- การใส่เชือ้ เพือ่ ควบคุมกระบวนการทัง้ PosและNegControlให้ทาเมือ่ สิน้ สุดการ
ทดสอบตัวอย่าง
- เลือกPos Control ทีเ่ ฉพาะเจาะจงทีแ่ ตกต่างชัดเจนจากตัวอย่างทีท่ ดสอบ
ตามปกติของห้องปฏิบัตกิ าร ตัวอย่างเช่น ใช้สายพันธุท์ ไี่ ม่เคยพบ
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
10. การทดสอบ
10.1 ข้อควรระวังด้านสุขอนามัยระหว่างการเตรียมตัวอย่างและการทดสอบ
10.1.6 การควบคุมกระบวนการ(ต่อ)

- ใช้สายพันธุค์ วบคุมทีด่ ัดแปลงพันธุกรรมทีม่ คี ุณลักษณะตรวจพบได้ง่าย

เช่น สายพันธุท์ ี่ luminescence หรือ fluorescence.
หมายเหตุ การใช้สายพันธุค์ วบคุมทีด่ ัดแปลงพันธุกรรม บางทีจะถูกจากัดโดย
ระเบียบ ข้อบังคับระดับชาติหรือระดับภูมภิ าค

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

10. การทดสอบ
10.1 ข้อควรระวังด้านสุขอนามัยระหว่างการเตรียมตัวอย่างและการทดสอบ
10.2 Preparation of initial suspension and dilutions
10.2.1 ทั่วไป
การเตรียมinitial suspensionและการทาdilutionsให้ทาตามทีเ่ กีย่ วข้องใน ISO 6887
ซึง่ ระยะเวลาทีใ่ ช้ระหว่างทีส่ นิ้ สุดของการเตรียมinitial suspensionและ เวลาทีเ่ ชือ้ สัมผัสกับอาหาร
เลีย้ งเชือ้ ทางทฤษฎีควรน้อยกว่า 20 นาที(เพิม่ ใหม่) แต่ต้องไม่เกิน 45 นาที เว้นแต่จะมีเงือ่ นไขเฉพาะ
ทีม่ กี าหนดไว้ในมาตรฐานเฉพาะ เช่น การแช่ตัวอย่างทีd่ ehydrate(แห้ง)เพือ่ ลด osmotic shockของเชือ้

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

11. Enumeration (quantitative) methods
11.1 ทั่วไป
อย่างไรก็ตาม หากเมทริกซ์ประกอบด้วยก้อนเล็กๆ(particles) ซึง่ อาจสับสนกับโคโลนีในจานในขณะ
นับจานวนโคโลนี ควรแยกอนุภาคเหล่านีอ้ อกก่อนโดยปล่อยให้สารแขวนลอย ตกตะกอนหรือใช้ถุงกรอง
ในบางกรณี เชือ้ ในplateสามารถเก็บโดยแช่เย็นไว้ทอ่ี ุณหภูมิ 5 °C ± 3 °C ก่อน incubation ได้ไม่เกิน24 h
เพือ่ เปรียบเทียบกันหลังการบ่ม (ดูข้อ 11.2.5)
ถ้าระดับของแบคทีเรียต่ามาก (เช่น < 10 cfu/ml) จะไม่สามารถใช้การนับบนอาหารแข็งได้ หากไม่
แยกจุลินทรียเ์ ป้ าหมายออกจากเมทริกซ์ก่อน เช่น ใช้การคัดแยกจุลินทรียโ์ ดยเทคนิคด้านอิมมูโนหรือการ
ทาให้เข้มข้นโดยการกรองหรือการปั่ นเหวีย่ ง (ดู 10.2.2)
วิธีแก้ปัญหาอีกวิธีหนึ่งในกรณีทค่ี าดว่าจะมีแบคทีเรียปริมาณน้อยคือการเพิม่ ปริมาตรของเชือ้ ทีเ่ พาะ
(เช่น > 1 มล.) ในการเพาะเชือ้ แบบ pour plate แต่จะต้องรักษาอัตราส่วนระหว่างปริมาตรของเชือ้ เพาะ
และปริมาณของวุ้นทีเ่ ติมลงไปสาหรับเชือ้ เพาะ 1 มล. ไว้
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
11. Enumeration (quantitative) methods
11.2 การนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
11.2.6 Calculation and expression of results obtained with solid media
11.2.6.1 Plate counts

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

11. Enumeration (quantitative) methods
11.2 การนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
11.2.6 Calculation and expression of results obtained with solid media
11.2.6.1 Plate counts
หลังจากทีไ่ ด้บ่มเชือ้ ตามทีร่ ะบุไว้ในมาตรฐานวิธีทดสอบเฉพาะนั้นๆ ให้นับ
โคโลนี (โคโลนีทงั้ หมด หรือโคโลนีทส่ี ันนิษฐาน:presumptive colonies ) จากจานเพาะเชือ้ จากจานแรก
ของ dilutionต่ากว่า (เชือ้ เข้มข้นสูงกว่า) แต่เชือ้ ทัง้ หมดต้องไม่เกิน 300 โคโลนี หรือไม่เกิน
150 typical or presumptive colonies (สาหรับจานเพาะเชือ้ เส้นผ่านศูนย์กลาง 90 มม.) หรือจานวน
สูงสุดตามทีร่ ะบุไว้ในมาตรฐานวิธีทดสอบเฉพาะ
ให้นับโคโลนีจาก1จานเพาะเชือ้ ใดๆด้วย ถ้าจานวนโคโลนีอยู่ภายในช่วง
ระหว่างจานวนทีน่ ับได้สูงสุดบวก 1 (เช่น 301 สาหรับโคโลนีสูงสุด 300 โคโลนี) ถึง ขีดจากัดบนของ
ช่วงความเชือ่ มั่นที่ 95 % probability ของจานวนโคโลนีสูงสุดทีน่ ับได้ (เช่น ขีดจากัดบน โคโลนี 300
โคโลนี คือ 334 ) ( ดูตารางที่ B.1) น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
ตารางที่ B.1 – ค่าเฉลีย่ ถ่วงนา้ หนักและช่วงความเชือ่ มั่น δ (95%) สาหรับจานวนโคโลนีทเี่ กีย่ วข้อง

หมายเหตุ รายการที่เป็ นตัวหนาเป็ นค่าที่เหมาะสมที่สดุ สาหรับการใช้งานตามปกติ น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

11. Enumeration (quantitative) methods
11.2.6.1 Plate counts

โดยทัว้ ไป Plate 90 centimeter

จานแรกของ dilutionต่ากว่า (เชือ้ เข้มข้นสูงกว่า) แต่เชือ้ ทัง้ หมดต้องไม่เกิน 300 โคโลนี
หรือไม่เกิน 150 typical or presumptive colonies

(ขีดจากัดบน)

300
334
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
 ภาคผนวก B
(informative)
Confidence intervals for colony count technique
B.1 ช่วงความเชือ่ มั่นของเทคนิคการนับโคโลนี
การตีความผลทดสอบ จาเป็ นต้องประเมินความถูกต้องของผลลัพธ์และเพือ่ หลีกเลีย่ งการ
ตีความทีเ่ ข้มงวดเกินไป จาเป็ นต้องประมาณค่าความไม่แน่นอนในการวัด (ISO 19036) หรือหากไม่
สามารถทาได้ ให้ประเมินช่วงความเชือ่ มั่นซึง่ เป็ นการกระจายทางสถิตขิ องจุลนิ ทรียใ์ นตัวอย่าง
เมือ่ ไม่มคี ่าความไม่แน่นอนในการวัด จะใช้ช่วงความเชือ่ มั่น δ ซึง่ เป็ นแสดงการกระจายของ
จุลินทรียซ์ ง่ึ สามารถคานวณได้โดยใช้สูตร (B.1) (โดยมีความน่าจะเป็ น 95 %)

(B.1)

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

 ภาคผนวก B
(informative)
Confidence intervals for colony count technique
B.1 ช่วงความเชือ่ มั่นของเทคนิคการนับโคโลนี

โดยที่
δ คือ ช่วงความเชือ่ มั่นทีค่ วามน่าจะเป็ น 95 % ( เริ่มจาก δ1 ถึง δ2 )
V คือ ปริมาตรของเชือ้ ทีใ่ ส่ในแต่ละจาน หน่วยเป็ นมิลลิลติ ร
n1 คือ จานวนจานในระดับการเจือจางแรกทีน่ ับ
n2 คือ จานวนจานในระดับการเจือจางถัดมาทีต่ ดิ ต่อกัน
ΣC คือ ผลรวมของโคโลนีทนี่ ับได้จากจานทัง้ หมดจากการเจือจางสองระดับติดต่อกัน
d คือ ระดับการเจือจางแรกทีน่ ับ
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
 ภาคผนวก B
(informative)
Confidence intervals for colony count technique
B.1 ช่วงความเชือ่ มั่นของเทคนิคการนับโคโลนี
ตัวอย่างที่ 1
การนับให้ผลลัพธ์ต่อไปนี้ (ระบบทีใ่ ช้ 1 เพลตต่อการเจือจาง) :
ระดับการเจือจางแรกทีน่ ับ (10-2 ) : 215 โคโลนี
ระดับการเจือจางถัดมาทีต่ ดิ ต่อกัน (10-3) : 14 โคโลนี

เมือ่ ปั ดเศษผลลัพธ์ จานวนจุลนิ ทรียค์ อื 21,000 หรือ 2,1 x 104 ต่อมิลลิลิตรหรือต่อกรัม

Weighted mean of number of
ของตัวอย่าง colonies counted on two
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
successive dilutions
 ภาคผนวก B
(informative)
Confidence intervals for colony count technique
B.1 ช่วงความเชือ่ มั่นของเทคนิคการนับโคโลนี
เนื่องจาก N = 2,1 x 104 ต่อมิลลิลติ รหรือต่อกรัมและโคโลนีทนี่ ับได้ 229 โคโลนี ช่วงความเชือ่ มั่น δ(95%) คือ
:

ดังนั้น ขีดจากัดของช่วงความเชือ่ มั่น คือ

คือขีดจากัดบนของช่วงความเชือ่ มั่น
240 ที่ 95 % probability
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
 ภาคผนวก B
(informative)
Confidence intervals for colony count technique
B.1 ช่วงความเชือ่ มั่นของเทคนิคการนับโคโลนี
ตัวอย่างที่ 2
การนับให้ผลลัพธ์ต่อไปนี้ (ระบบทีใ่ ช้ 2 เพลตต่อการเจือจาง) :
ระดับการเจือจางแรกทีน่ ับ (10-2) : 168 โคโลนี และ 215 โคโลนี
ระดับการเจือจางถัดมาทีต่ ดิ ต่อกัน (10-3) : 14 โคโลนี และ 25 โคโลนี

เมือ่ ปั ดเศษผลลัพธ์ จานวนจุลนิ ทรียค์ อื 19,000 หรือ 1,9 x 104 ต่อมิลลิลิตรหรือต่อกรัม

ของตัวอย่าง
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
 ภาคผนวก B
(informative)
Confidence intervals for colony count technique
B.1 ช่วงความเชือ่ มั่นของเทคนิคการนับโคโลนี
เนื่องจาก N = 2,1 x 104 ต่อกรัม และโคโลนีทนี่ ับได้ 422 โคโลนีท่ีช่วงความเชื่อมั่น δ (95%) คือ :

ดังนั้นขีดจากัดของช่วงความเชือ่ มั่นคือ

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

11. Enumeration (quantitative) methods
11.2 การนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
11.2.6 Calculation and expression of results obtained with solid media
11.2.6.1 Plate counts(ต่อ)
กรณีทใี่ ช้จานเพาะเชือ้ ทีม่ เี ส้นผ่านศูนย์กลางต่างกัน จานวนโคโลนีสูงสุดจะต้อง
เพิม่ ขึน้ หรือลดลงตามสัดส่วนของพืน้ ทีผ่ ิวของจาน (หรือพืน้ ทีผ่ ิวเมมเบรน) (เช่น 110 โคโลนีสาหรับจาน
55 มม. 300 โคโลนี สาหรับจาน 90 มม.หรือ 730 โคโลนีสาหรับจาน 140 มม.)
เกณฑ์การพิจารณา ถ้าเชือ้ spreadingหรือเป็ นสายของโคโลนี กรณีนีใ้ ห้นับเป็ น
1 โคโลนี ส่วนกรณีทพ ี่ นื้ ทีน่ ้อยกว่าหนึ่งในสีข่ องจาน ถูกโคโลนีของเชือ้ เจริญทับ ให้นับโคโลนีเฉพาะส่วน
ทีไ่ ม่ได้รับผลกระทบแล้วคานวณจานวนทางทฤษฎีโดยการประมาณค่าและรายงานเป็ นestimated result
แต่ถ้าในกรณีทพ ่ี นื้ ทีม่ ากกว่าหนึ่งในสีข่ องจาน ถูกโคโลนีของเชือ้ เจริญทับ ให้ยกเลิกการนับ
ตามภาพดังนี้
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
11. Enumeration (quantitative) methods
กรณีทพ ี่ นื้ ทีน่ ้อยกว่าหนึ่งในสี่ของจาน ถูกโคโลนีของเชือ้ เจริญทับ ให้นับโคโลนีเฉพาะส่วนที่
ไม่ได้รับผลกระทบแล้วคานวณจานวนทางทฤษฎีโดยการประมาณค่าและรายงานเป็ น
estimated result

แต่ถ้าในกรณีทพ ี่ นื้ ทีม่ ากกว่าหนึ่งใน

สีข่ องจาน ถูกโคโลนีของเชือ้ เจริญทับ ให้ยกเลิกการนับ

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

11. Enumeration (quantitative) methods
11.2 การนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
11.2.6 Calculation and expression of results obtained with solid media
11.2.6.1 Plate counts(ต่อ)
กรณีดังเช่นในข้อ11.1 ทั่วไปจานวนจุลนิ ทรียท์ นี่ ับได้มนี ้อยจากการเพาะเชือ้ ใน
จานเพาะเชือ้ จานวนหนึ่งทีม่ ากกว่า1จานด้วยปริมาตรทีม่ ากกว่ากันในระดับการเจือจางเดียวกัน ให้
ถือว่าจานเพาะเชือ้ ทัง้ หมดนีเ้ ป็ นเพียง 1 นับเท่านั้น(ให้นับรวมกัน)
อาจมีกรณีพเิ ศษเกิดขึน้ เป็ นบางครั้ง (เช่น อัตราส่วนของdilution factorทีใ่ ช้
สาหรับการเจือจางสองความเข้มข้นทีต่ ดิ กันแตกต่างกันมาก) จาเป็ นต้องทวนสอบและตีความ
ผลลัพธ์โดยนักจุลชีววิทยาทีม่ คี ุณสมบัตเิ หมาะสม และหากจาเป็ น ให้rejectทิง้ ไป

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

11. Enumeration (quantitative) methods
11.2 การนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
11.2.6 Calculation and expression of results obtained with solid media
11.2.6.1 Plate counts(ต่อ)
ขีดจากัดทีย่ อมรับได้(Acceptability limits)ของความแตกต่างระหว่างจานวน
โคโลนีจากduplicate platesได้มกี ารกาหนดขึน้ ตามความน่าจะเป็ นของความสอดคล้องซึง่ ประเมินโดย
ใช้สูตรทีก่ าหนดใน ISO 14461-2 (ข้อ 7.1) ซึง่ รวมไว้ในcolony count techniques (CCT) calculator
ดูได้ท่ี : http://standards.iso.org/iso/7218/ พร้อมด้วยรายงานผลของสูตรคานวณนี้
ในทานองเดียวกัน ขีดจากัดทีย่ อมรับได้ของความแตกต่างระหว่างจานวน
โคโลนี10-fold dilution ทีต่ ดิ กันสองdilutionนั้นสามารถกาหนดได้โดยใช้สูตรทีก่ าหนดใน
ISO 14461-2 (ข้อ 7.2) ซึง่ รวมไว้ในcolony count techniques (CCT) calculator ข้างต้นด้วย
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
ตัวอย่าง
การนับให้ผลลัพธ์ต่อไปนี้ (ระบบทีใ่ ช้ 2 เพลตต่อการเจือจาง) :
ระดับการเจือจางแรกทีน่ ับ (10-2) : 168 โคโลนี และ 215 โคโลนี
ระดับการเจือจางถัดมาทีต่ ดิ ต่อกัน (10-3) : 14 โคโลนี และ 25 โคโลนี

ขีดจากัดทีย่ อมรับได้ของความแตกต่างระหว่างจานวนโคโลนีจากduplicate plates

ขีดจากัดทีย่ อมรับได้ของความแตกต่างระหว่างจานวนโคโลนี10-fold dilution ทีต่ ดิ กันสองdilution น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

 สมมติได้ 22 segment1
11. Enumeration (quantitative) methods
11.2 การนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
11.2.6 Calculation and expression of results obtained with solid media สมมติได้ 18
Segment 3
11.2.6.2 Spiral plating
สาหรับspiral plate จะใช้ตะแกรงนับ(counting grids)ตามคาแนะนาของผู้ผลิต
วางจานทีเ่ พาะเชือ้ แล้วไว้ตรงกลางcounting grids เลือกsegmentใดก็ได้และนับ
โคโลนีของsegmentนั้น จากขอบด้านนอกเข้ามาตรงกลางจนกว่าจะนับโคโลนีครบ 20 โคโลนี ซึง่ เมือ่ ถึง
โคโลนีที่ 20 ให้นับโคโลนีทเี่ หลือจนเต็มพืน้ ที(่ ทีเ่ ป็ น segment หรือ subdivision of segment) สมมติได้ 22
แล้วจึงนับโคโลนีในพืน้ ทีเ่ ดียวกันทีด่ ้านตรงข้ามของจาน สมมติได้ 18 รวมจานวนของโคโลนีในพืน้ ทีท่ งั้
สอง(40) และหารด้วยปริมาตรทีท่ ราบของพืน้ ทีท่ น่ี ับ (provided by the supplier =40 microlitre) จะได้จานวน
โคโลนีของเชือ้ ต่อมิลลิลิตร
= 22 + 18 = 1.0 x103 CFU/ml
40 x10-3 น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
 segment1
11. Enumeration (quantitative) methods
11.2 การนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
11.2.6 Calculation and expression of results obtained with solid media
Segment 3
11.2.6.2 Spiral plating(ต่อ)

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

11. Enumeration (quantitative) methods
11.2 การนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
11.2.6 Calculation and expression of results obtained with solid media
11.2.6.4 การแสดงผลทดสอบ(ต่อ)
สาหรับวิธีplate count methods ทางจุลชีววิทยาส่วนใหญ่ นอกเหนือจากspiral
plating (11.2.6.2ระบุ=20โคโลนี) โดยทั่วไปแล้วplateทีม่ ี 10 โคโลนี จะยอมรับว่าเป็ นการนับทีเ่ ชือ่ ถือ
ได้ต่าทีส่ ุด และดังนั้นจึงเป็ นขีดจากัดล่างของการนับ สาหรับการมีอยู่ของสิง่ มีชวี ติ เป้ าหมายนั้น
ผลลัพธ์ทตี่ ่ากว่าขีดจากัดล่าง สามารถระบุว่าdetectedได้ แต่ไม่สามารถระบุปริมาณให้เชือ่ ถือได้
ดังนั้น หากเพลตนั้น (หรือทัง้ สองเพลต) ทีร่ ะดับการเจือจางแรก มีโคโลนีน้อยกว่า
10 โคโลนี ให้แสดงผลลัพธ์สุดท้ายเป็ น estimated number” (NE)
หมายเหตุ 1 คาว่า “ estimated number " หมายถึง a less precise estimate of the true value
หากจานวนโคโลนีทงั้ หมด <4 (เช่น 1,2 หรือ 3) ความแม่นยาของผลลัพธ์จะต่ามากและผลลัพธ์สุดท้ายจะแสดงเป็ น
"less than 4/Vd per gram or per ml" เนื่องจากค่าตัวเลขโดยประมาณนั้นไม่น่าเชื่อถือทางสถิติ (ISO 8199) น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
11. Enumeration (quantitative) methods
11.2.6.4 การแสดงผลทดสอบ(ต่อ)

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

11. Enumeration (quantitative) methods
11.2 การนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
11.2.7 การคานวณสาหรับวิธีการนับเชิงปริมาณ
11.2.7.1 ทั่วไป
สูตรการคานวณของวิธีการนับเชิงปริมาณทัง้ หมดทีใ่ ช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็ง
แสดงไว้ในข้อ 11.2.7.2และ11.2.7.3 พร้อมกับตัวอย่าง
เพือ่ ให้ผลทดสอบถูกต้อง (ดู 11.2.1) โดยทั่วไปถือว่าจาเป็ นต้องใช้plates อย่างน้อย 2 plates
(เป็ นduplicate plates จากdilutionเดียวกัน หรือplates จาก 2 dilutionทีต่ ดิ กัน)

11.2.7.2 Plate count calculations (การคานวณจากcolonyทีน่ ับได้บนPlate)

การคานวณมีทงั้ สาหรับกรณีท่วั ไป การนับหลังจากการยืนยัน และกรณีพเิ ศษแสดง
ไว้ในตารางที่ 1 ถึง 5 ด้านล่าง (ข้อ11.2.7.2.2 to 11.2.7.2.7) การคานวณจะพิจารณาการเจือจางแบบ10-fold
dilutionเท่านั้น น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
11. Enumeration (quantitative) methods
11.2.6.4 การแสดงผลทดสอบ(ต่อ)

spiral plating
spiral plating (11.2.6.2) ขีดจากัดล่างของการนับ = 20

กรณีของแข็งต้อง
ทาsuspension เริ่มต้น
–1
ที่ 10 g
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
11. Enumeration (quantitative) methods
clauses 11.2.7.2.3 ตารางที่ 2 - Plate count calculation: Count after confirmation
เมือ่ วิธีทดสอบต้องการการยืนยันของจานวนโคโลนี A ทีก่ าหนด (โดยทั่วไปคือ 5โคโลนี ) ของ
presumptive colonies ซึง่ จะต้องยืนยันจากเชือ้ ในแต่ละจานทีเ่ ก็บไว้เพือ่ ยืนยันการนับ
หลังจากการยืนยัน คานวณ สาหรับแต่ละจาน จานวนโคโลนี ตัวอย่าง : นับจากsurface plating methodได้ผลลัพธ์
(a) ที่เป็ นไปตามเกณฑ์การระบุโดยใช้สตู ร (2) ดังต่อไปนี ้ :
ระดับการเจือจางแรกที่นบั (10-1) : 75 โคโลนี จาก 75 โคโลนี
ซึง่ : นา5 โคโลนีมาทดสอบ ผล 3 โคโลนีได้รบั การยืนยันบวก :
A คือ จานวนของ presumptive coloniesที่เลือกมายืนยัน
จากจานเพาะเชือ้ แต่ละจาน
b คือ จานวนโคโลนีท่ียืนยันบวกจาก A
ระดับการเจือจางถัดมาทีต่ ดิ กัน (10-2) : 4 โคโลนี จาก 4
C คือ จานวนpresumptive coloniesทัง้ หมดในจานเพาะเชือ้ โคโลนี 4 โคโลนีทดสอบ ผล 1 โคโลนีได้รบั การยืนยันบวก :
Σa = จานวนโคโลนีทยี่ ืนยันบวกจากทุกจานเพาะเชือ้
และแทนที่ ΣC ด้วย Σa ในสูตร (1) แทนที่ ΣC ด้วย Σa ในสูตร (1)
หมายเหตุ ถ้า Σa < 10 ผลลัพธ์สุดท้ายจะแสดงเป็ นค่าประมาณ
(Estimated) น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
 11. Enumeration (quantitative) methods
clauses 11.2.7.2.4 - ตารางที่ 3:Plate count calculation, special case: no colonies
detected
หากจานเพาะเชือ้ ไม่มโี คโลนีใดๆ (หรือpresumptive ตัวอย่าง : นับจากวิธีpour plate methodไม่ก่อให้เกิดโคโลนีใน
coloniesยังไม่ได้รับการยืนยัน) ให้รายงานผลดังนี้ ระดับการเจือจางแรกทีน่ ับ 10-1 :

ซึง่ : ซึง่ :
V คือ ปริมาตรของเชือ ้ ทีใ่ ส่ในจานเพาะเชือ้ แต่ละจาน หน่วย ้ ทีใ่ ส่ในจานเพาะเชือ้ แต่ละจาน
V = 1 มิลลิลิตรคือปริมาตรของเชือ
เป็ นมิลลิลิตร (มล.) d = 0.1 = 10-1 คือdilution factor ของระดับการเจือจางแรกทีน
่ ับ
d คือ dilution factor ของระดับการเจือจางแรกทีน ่ ับ (d=1
สาหรับผลิตภัณฑ์ของเหลวทีไ่ ม่เจือจาง)

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

 11. Enumeration (quantitative) methods
clauses11.2.7.2.5 ตารางที่ 4 - Plate count calculation,special case: more than the
maximum number of typical colonies
หากจานเพาะเชือ้ ทัง้ หมดมีจานวนโคโลนีมากกว่าจานวนสูงสุดที่ ตัวอย่าง : วิธีspread plate method มีโคโลนีนับได้
ระบุไว้ในมาตรฐานเฉพาะ (ปกติคอื 300 หรือ 150 โคโลนี) ให้ มากกว่า 150 โคโลนี (จานวนโคโลนีสูงสุดทีร่ ะบุในวิธีทดสอบคือ150
รายงานผลดังต่อไปนี้ : โคโลนี ) ทัง้ ใน 2 dilution ทีด่ าเนินการ (10-1 และ 10-2)

ซึง่ :
C คือจานวนโคโลนีสูงสุดทีร่ ะบุไว้ในมาตรฐานเฉพาะ
ซึง่ :
้ ทีใ่ ช้กับจานเพาะเชือ้ แต่ละจาน หน่วย C = 150 (จานวนโคโลนีสูงสุดทีร่ ะบุในวิธี)
V คือ ปริมาตรของเชือ
เป็ นมิลลิลิตร (มล.) ่ ีดในแต่ละจานเพาะเชือ้
V = 0.1 มิลลิลิตรทีฉ
d คือ dilution factor ของระดับการเจือจางสูงสุดทีน ่ ับ (d=1 d = 0.01 = 10-2 =dilution factor ของระดับการเจือจางสูงสุดที่
สาหรับผลิตภัณฑ์ของเหลวทีไ่ ม่เจือจาง) นับ
หมายเหตุ สาหรับโคโลนีหลังการยืนยัน ให้ประมาณค่า “a” ตาม
สูตร (2) และแทนที่ C ด้วย a น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
 11. Enumeration (quantitative) methods
11.3 การแจงนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของเหลว
11.3.8 การหาค่า MPN โดยใช้เครื่องคานวณ MPN
ขอแนะนาให้ใช้โปรแกรมคานวณ MPN เพือ่ ระบุค่า MPN จากการรวมกันของ
ผลบวกและลบทีอ่ ่านได้จากหลอด flask ขวด หรือmicroplate wellsของ แต่ละdilution
โปรแกรมคานวณเหล่านีช้ อบให้เราใส่ผลทดสอบจากทุก test portionsทีท่ ดสอบ
มากกว่าทีจ่ ะจากัดการใช้จานวนdilutionและreplicatesตามทีก่ าหนดไว้ในตาราง MPN
ผลลัพธ์ของการคานวณค่าMPN ควรมีค่าประมาณของช่วงความเชือ่ มั่น 95 % พร้อม
กับการบ่งชีข้ องความน่าจะเป็ นของการเกิดขึน้ ของการรวมกันของผลลัพธ์ทเี่ ป็ นให้ค่าMPNนั้น (ซึง่
อาจเป็ นrarity index, rarity categoryหรือทัง้ สองอย่าง ; ดู11.3.9)
โปรแกรมคานวณทีเ่ ป็ นไปตามข้อกาหนดเหล่านีส้ าหรับ
test portions10กรัมและ100กรัมที่ http://standards.iso.org/iso/7218/
11. Enumeration (quantitative) methods
11.3 การแจงนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของเหลว
11.3.8 การกาหนดค่า MPN โดยใช้เครื่องคานวณ MPN
โปรแกรมคานวณใช้ Excel®1 และสามารถใช้สาหรับserial dilutionได้ถงึ 10 ระดับ ซึง่ รายละเอียด
การคานวณอธิบายไว้ในเอกสารอ้างอิง iso/7218
คาแนะนาเกีย่ วกับการใช้โปรแกรมคานวณ 10g มีอยู่ในลิงค์ดังกล่าวพร้อมด้วยเอกสารverify
คาแนะนาเกีย่ วกับการใช้โปรแกรมคานวณ 100g ซึง่ ออกแบบมาโดยเฉพาะสาหรับการทดสอบตัวอย่าง
หอย ตามมาตรฐาน ISO 16649-3 รวมอยู่ในโปรโตคอลการคานวณทีส่ ร้างขึน้ นีด้ ้วย นอกจากนีย้ งั มีอยู่ใน
ลิงค์ด้านบนพร้อมด้วยเอกสารverify
ให้ใช้ผลบวกและลบจากหลอดหรือหลุมทัง้ หมดทีไ่ ด้ทดสอบทีท ่ ุกdilutionsใส่ลงใน
โปรแกรมคานวณ MPN เพือ่ หาค่า MPN ทัง้ นีไ้ ม่เหมาะสมทีจ่ ะเลือกเพียงsubsetของdilutionเพือ่ หาค่า
1 Excel เป็ นชือ่ ทางการค้าของผลิตภัณฑ์ทจี่ ัดทาโดย Microsoft ข้อมูลนีจ้ ัดทาขึน้ เพือ่ ความสะดวกของผู้ใช้เอกสารนี้ และไม่ถอื เป็ นการรับรองโดย
ISO ของผลิตภัณฑ์ทรี่ ะบุชอื่ อาจใช้ผลิตภัณฑ์ทเี่ ทียบเท่ากันหากสามารถแสดงผลลัพธ์ทเี่ หมือนกันได้
11. Enumeration (quantitative) methods
11.3 การแจงนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของเหลว
11.3.9 Rarity categories

โปรแกรมคานวณ MPN ยังให้ค่าลอการิทมึ ทีเ่ ป็ นทศนิยมของค่า MPN รวมทัง้ ค่าstandard

deviation (SD) และ standard error of the MPN SE(log10mˆ) , lower confidence limits และupper
confidence limits ทีร่ ะดับช่วงความเชือ่ มั่นที่ 95 % พร้อมกับ ‘Rarity index' และ 'Rarity categories’
ค่าRarityนีใ้ ห้แนวทางทีง่ ่ายกว่าในการประเมินความเป็ นไปได้ทจ่ี ะเกิดผลทดสอบนั้นขึน้ มาได้จริงจากการ
ทดสอบ
การรวมกันของหลอดบวกมีแนวโน้มทีจ่ ะเกิดขึน้ มากกว่าหลอดอืน่ ตัวอย่างเช่น ชุดค่าผสม
ของผลลัพธ์ทเ่ี ป็ นบวก 0 - 0 - 3 มีโอกาสเกิดขึน้ น้อยกว่าชุดค่าผสม 3 - 2 - 1 มาก Rarity index ถูกใช้เพือ่ วัด
ค่าความน่าจะเป็ นหรือความเป็ นไปได้ของผลทดสอบนี้
11. Enumeration (quantitative) methods
11.3 การแจงนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของเหลว
11.3.9Rarity categories

Rarity index คือค่าระหว่าง 0 ถึง 1 ซึง่ ถ้าเป็ น 1 จะหมายถึงว่าผลการทดสอบserial dilutionมี

ค่าความเข้มข้นทีเ่ ป็ นไปได้มากทีส่ ุดทีเ่ ท่ากับค่า MPN ทีป่ ระมาณไว้ แต่หากมีค่าใกล้เคียงกับ 0 จะหมายถึง
ว่าผลการทดสอบserial dilutionนั้นมีค่าความเข้มข้นทีไ่ ม่น่าเป็ นไปได้สาหรับความเข้มข้นทีเ่ ท่ากับ MPN ที่
ประมาณไว้ ตามแนวทางของReference[46] ผลการทดสอบจะถูกจาแนกออกเป็ น3 categoriesของrarity คือ
Category 1: ค่า MPN มีแนวโน้มสูงทีจ่ ะเป็ นค่าMPNนั้น หากค่าrarity indexของมันอยู่
ในช่วง 0,05 ถึง 1,00 (0,05 ≤ n ≤ 1,00);กล่าวคือ ผลทดสอบดังกล่าวน่าจะมีโอกาสเป็ นค่าMPNนั้น ถึง 95%
11. Enumeration (quantitative) methods
11.3 การแจงนับโดยใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของเหลว
11.3.9Rarity categories

Category 2: ค่า MPN มีแนวโน้มน้อยมากทีจ่ ะเป็ นค่าMPNนั้น หากค่าrarity index ของมันอยู่

ในช่วง 0,01 ถึง 0,05 (0,01 ≤ n ≤ 0,05);กล่าวคือผลทดสอบดังกล่าวน่าจะมีโอกาสเป็ นค่าMPNนั้น
น้อยกว่า 5 % และควรรายงานด้วยความระมัดระวัง
Category 3: ค่า MPN มีแนวโน้มน้อยมากทีส่ ุดทีจ่ ะเป็ นค่าMPNนั้น หากค่าrarity index ของ
มันอยู่ในช่วง 0 ถึง 0,01,(0 ≤ n ≤ 0,01); นั่นคือผลทดสอบดังกล่าวน่าจะมีโอกาสเป็ นค่าMPNนั้น
น้อยกว่า1 ครั้งในการทดสอบ 100 ครั้ง
หากโปรแกรมคานวณ MPN ไฮไลต์ค่าชุดของหลอดว่าไม่น่าจะเป็ นไปได้ (เช่น
Category 3) ห้ามรายงานค่า MPN ทีเ่ กีย่ วข้อง หากเป็ นไปได้ ให้ขอตัวอย่างทาซา้
11. Enumeration (quantitative) methods
Category rarity index

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

11. Enumeration (quantitative) methods
11.4 ค่าประมาณความไม่แน่นอนของผลการทดสอบ
ในการตรวจทางจุลชีววิทยา ผลการทดสอบเชิงปริมาณ (แบบนับจานวน) จะมีความไม่แน่นอน
(ความไม่แม่นยา)อยู่ด้วย ซึง่ สามารถประมาณได้และนามาใช้พจิ ารณาเมือ่ มีการรายงาน
มีการศึกษาและทบทวนแง่มุมต่าง ๆ ของหัวข้อนีท้ ใี่ ช้กับการทดสอบทางจุลชีววิทยา และ
ตัวอย่างบางส่วนมีอยู่ในเอกสารอ้างอิง
ISO 19036 ให้รายละเอียดเกีย่ วกับทฤษฎีความไม่แน่นอนทีใ่ ช้กับการตรวจทางจุลชีววิทยาเชิง
ปริมาณ และรวมถึงวิธีการสาหรับห้องปฏิบัตกิ ารเพือ่ หาค่าประมาณความไม่แน่นอนของผลการทดสอบ
แบบนับจานวน โดยใช้ได้กับทัง้ อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีเ่ ป็ นของแข็งและของเหลว

Higher the matrix interference the higher the uncertainty factor,

and consequently, the higher the asymmetry for the interval
around the measurement.
12. Detection (qualitative) methods
12.1 ทั่วไป
ปริมาณผลิตภัณฑ์ทที่ ดสอบนั้นเชือ่ มโยงกับเกณฑ์ทางจุลชีววิทยา และตัวอย่างทั่วไปได้แก่ 10 กรัม
หรือ 25 กรัม test portionสามารถเพิม่ ขนาดได้ เช่น เป็ น 375 กรัม โดยการใช้test portionเดียว ทีใ่ หญ่
ขึน้ หรือโดยการpoolเข้าด้วยกันในแต่ละประเภท เช่น Laboratory samples, test portion หรือpre- enriched
test portions ก็สามารถpoolเข้าด้วยกันได้ รายละเอียดเพิม่ เติมมีอยู่ในมาตรฐานเฉพาะและ ISO 6887 แต่
ต้องพิจารณาเรื่องอุณหภูมทิ ใ่ี ช้เวลาเข้าถึงช้ากว่าทีร่ ะบุในวิธี ดังนั้นต้องตรวจสอบก่อน

ข้อกาหนดนีจ้ ะให้ข้อมูลทั่วไปเกีย่ วกับวิธีทเ่ี กีย่ วข้องกับการเพาะเลีย้ งเชือ้ จุลนิ ทรียท์ ต่ี ้องการหา แต่ยัง
มีวธิ ี PCRทีส่ ามารถตรวจหาจุลนิ ทรียเ์ ป้ าหมายทีเ่ ฉพาะได้ ซึง่ รายละเอียดเพิม่ เติม มีระบุไว้ในมาตรฐาน
เฉพาะISO 22174 และอืน่ ๆ
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
13. Confirmation and identification methods
13.1 ทั่วไป
วิธCี onfirmation and identification methodsใช้เพือ่ ยืนยัน presumptive isolatesซึง่ มาจากทัง้ วิธี
เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ (Sero)typing จะใช้ในการระบุคุณลักษณะเพิม่ เติมของ presumptive
isolatesได้ เมือ่ ต้องการทราบให้ละเอียด ตัวอย่างเช่น serotypesทีท่ ราบว่าก่อโรค
มีหลักการ 2 วิธี ในการยืนยันการแยก presumptive isolates:
• วิธีการยืนยัน(confirmation method)ทีใ่ ห้ผลบวกหรือลบ เช่น latex agglutination tests,
nucleic acid hybridization, molecular amplification
• วิธีการพิสูจน์เอกลักษณ์ (identification methods) ทีใ่ ห้เอกลักษณ์ของ presumptive
isolates ออกมาเป็ นผลการยืนยัน เช่น biochemical galleries, mass spectrometry, sequencing

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

13. Confirmation and identification methods
13.2 การเตรียมเชือ้ บริสุทธิ์
เริ่มต้นโดยเลือกโคโลนีเดีย่ วบนหรือในอาหารเลีย้ งเชือ้ เพาะโคโลนีทเี่ ลือกลงบนnon-
selective agar medium หลังจากบ่มแล้ว ให้เลือกโคโลนีทแี่ ยกได้ด(ี well-isolated colony) เพือ่ ใช้
สาหรับทดสอบยืนยันในภายหลัง ทาซา้ หากจาเป็ น จนกว่าจะได้เชือ้ ทีบ่ ริสุทธิ์
หากเป็ นไปได้ ต้องทาการทดสอบยืนยันโดยใช้เซลล์ทมี่ าจากโคโลนีเดียว หากมีเซลล์ในหนึ่ง
โคโลนีไม่เพียงพอต่อการใช้งาน ต้องsubculture ลงใน liquid medium หรือ agar slant หรือ
agar plate หลังจากนั้นจึงสามารถใช้เชือ้ ทีs่ ubcultureนีส้ าหรับการทดสอบได้

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

13. Confirmation and identification methods
13.3 Confirmation methods
13.3.1 Latex agglutination test
เป็ นวิธีทดสอบทีร่ วดเร็วมีจาหน่ายในเชิงพาณิชย์ ซึง่ ใช้latex particlesทีเ่ คลือบด้วย
กลุ่มของlatex particles ใช้สาหรับยืนยันเชือ้ จุลนิ ทรีย ์ เช่น Salmonella spp. coagulase-positive
staphylococci แอนติเจนใน microbial suspension ได้มกี ารนามาทดสอบกับlatex reagentsหลาย
ประเภท
เมือ่ ใช้latex testในการทาserotyping กับเชือ้ เช่น Escherichia coli O157 ให้ทา
หลังจากทา confirmation/identification ของ genus และ species.
เมือ่ ใช้รีเอเจนต์ ต้องมีการทา positive และnegative controls ทีเ่ หมาะสมด้วย หากไม่มี
internal latex controls ในชุดทดสอบ
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
13. Confirmation and identification methods
13.3 Confirmation methods
13.3.2 Nucleic acid hybridization or molecular amplification methods
Molecular hybridizationคือ กระบวนการทีโ่ มเลกุลของsingle-stranded DNAและ/
หรือ single-stranded RNA มาจับกันเพือ่ สร้างโมเลกุลสายคู่ การจับคู่จะขึน้ อยู่กับการจับคู่เบสที่
เหมาะสมระหว่างโมเลกุลสายเดีย่ วสองโมเลกุล
ห้องปฏิบัตกิ ารต้องระบุสายพันธุเ์ ชือ้ ควบคุมทีใ่ ช้ในการทวนสอบ ไพรเมอร์ โพรบ และ
ประสิทธิภาพของmolecular reactions ในกรณีทเี่ หมาะสม ต้องนาโคโลนีจากspecific agar(ทีใ่ ช้ในการ
เจริญเติบโตของโคโลนีทแ่ี ยกได้) มาsuspended ใน ultrapure water (หรือสารเจือจางอืน่ ทีเ่ หมาะสม
หากvalidateแล้ว เพือ่ ใช้ในspecific method) ก่อนการสกัดกรดนิวคลีอิก

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

13. Confirmation and identification methods
13.3 Confirmation methods
13.3.2 Nucleic acid hybridization or molecular amplification methods(ต่อ)
สาหรับ PCR ต้องปฏิบัตติ ามข้อกาหนดทีก่ าหนดใน ISO 22174 นอกจากนีย้ ังมี ISO
22118 ระบุรายละเอียดทั่วไปเกีย่ วกับ performance characteristics สาหรับ PCR
13.3.3 Slide agglutination tests
จะใช้เมือ่ จาเป็ นต้องมีการตรวจคุณลักษณะทางซีร่ัมวิทยา ให้ใช้isolated colonies
หลังจากทีท่ าconfirmation/identification ของ genusและ species

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

13. Confirmation and identification methods
13.4 Identification methods
13.4.1 Biochemical galleries
ใช้เพือ่ identification of isolated colonies
ให้ทวนสอบ(Verify)ว่าแกลเลอรีมคี วามเหมาะสม โดยใช้ข้อมูลจาก evaluation studies
ทีจ่ ัดทาโดยผู้ผลิตหรือตีพมิ พ์ในวารสารทางวิทยาศาสตร์ระดับนานาชาติ โดยเฉพาะอย่างยิง่ วารสารที่
เกีย่ วข้องกับจุลชีววิทยาอาหาร
ผู้ผลิตต้องระบุcontrol strainเพือ่ ให้ห้องปฏิบัตกิ ารสามารถทวนสอบVerifyประสิทธิภาพ
ของnew batches ในการใช้งานประจา
ต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่า galleries ได้รวมถึงbiochemical test ทีถ่ ูกอธิบายอยู่ใน
มาตรฐานเฉพาะหรือเสริมอยู่ในการทดสอบทีเ่ หมาะสมอืน่ ๆ และต้องปฏิบัตติ ามคาแนะนาการใช้งาน
ของผู้ผลิต
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
13. Confirmation and identification methods
13.4 Identification methods
13.4.2 DNA sequencing
เทคโนโลยีนี้ สร้างsequencesของDNAซึง่ เป็ นunique signatureสาหรับจุลินทรียแ์ ต่ละตัว
การระบุจุลินทรียท์ แี่ ม่นยาในระดับสกุลหรือสปี ชีสไ์ ด้มาจากการเปรียบเทียบsequencesของDNAกับ
ฐานข้อมูลหรือไลบรารี Sequencing methods should be validated for use in accordance with the
appropriate part of the ISO 16140 series.
13.4.3 Mass spectrometry
เทคโนโลยีนีส้ ร้างmass spectral fingerprintทีม่ ลี ักษณะเฉพาะของสเปกตรัมซึง่ เป็ น
ความจาเพาะของจุลินทรียแ์ ต่ละชนิด การระบุจุลินทรียท์ แ่ี ม่นยาในระดับ genus หรือspeciesได้มา
จากการเปรียบเทียบสเปกตรัมกับฐานข้อมูลเชิงพาณิชย์ เทคโนโลยีแมสสเปกโตรเมทรีทใี่ ช้มากทีส่ ุด
คือ Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI ToF MS)
Mass spectrometry should be validated for use in accordance with the appropriate part of the ISO 16140 series. น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
14. การคัดเลือกและคุณลักษณะของจุลินทรียค์ วบคุม

14.1 ทั่วไป
จุลินทรียแ์ ละอนุพันธ์ของจุลินทรีย ์ ใช้สาหรับการควบคุมคุณภาพ ของ
อาหารเลีย้ งเชือ้ และการทดสอบ, method validation , verification, และ
challenge test
นอกจากนีย้ ังใช้สาหรับการเตรียมตัวอย่างเพือ่ ทดสอบความชานาญ
จุลนิ ทรียเ์ หล่านีไ้ ด้รับการคัดเลือกมาใช้งาน
โดยทั่วไปแล้ว positive controlจะมีคุณลักษณะเฉพาะเหมือนกับเชือ้
เป้ าหมายในการทดสอบ ในขณะทีn่ egative control คือกลุ่มทีไ่ ม่มคี ุณลักษณะ
เหมือนกับเชือ้ เป้ าหมาย การรวมเอาทัง้ positive control และnegative control
ไว้ในการทดสอบเพือ่ ใช้ยนื ยันความถูกต้องของผลการทดสอบ
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
 14. การคัดเลือกและคุณลักษณะของจุลินทรียค์ วบคุม
14.2 คุณลักษณะของจุลินทรีย ์
14.2.1 ทั่วไป
จุลินทรียจ์ ะต้องแสดงคุณลักษณะเฉพาะออกมา เมือ่ ใช้เทคนิคทีเ่ หมาะสม เพือ่ การใช้งานของ
มันตามความต้องการ
14.2.2 คุณลักษณะทางฟี โนไทป์
โดยทั่วไปแล้ว จุลนิ ทรียจ์ ะจาแนกได้โดยปรากฏบนอาหารเลีย้ งเชือ้ สัณฐานวิทยาระดับจุลภาค
ปฏิกริ ิยาต่อการย้อมแกรมและการทดสอบการเคลือ่ นที่ (ดูภาคผนวก C) รวมทัง้ ปฏิกริ ิยาต่อการทดสอบทาง
ชีวเคมีและซีร่ัมวิทยา คุณลักษณะเหล่านีถ้ ูกนามาใช้เพือ่ แยกและระบุเชือ้ เป้ าหมายในวิธีทอี่ าศัยการเพาะเลีย้ ง
14.2.3 คุณลักษณะเฉพาะทางโมเลกุล
จุลินทรียจ์ ะจาแนกได้โดยคุณสมบัตทิ างโมเลกุลเช่น DNA, RNA, โปรตีน, รู ปแบบคาร์โบไฮเดรต
ฯลฯ ลักษณะเฉพาะของโมเลกุลเหล่านีใ้ ช้ในการระบุและ/หรือจาแนกจุลินทรียเ์ ป้ าหมาย
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
14. การคัดเลือกและคุณลักษณะของจุลินทรียค์ วบคุม
14.3 การคัดเลือกจุลินทรียค์ วบคุม
การคัดเลือกจุลินทรียค์ วบคุมการทดสอบ มีความสาคัญเนื่องจากจุลนิ ทรีย ์ รวมทัง้ สายพันธุภ์ ายใน
speciesเดียวกัน สามารถผันแปรได้ทงั้ ทางจีโนไทป์ และฟี โนไทป์ ได้
สายพันธุค์ วบคุมทีใ่ ช้จะต้องเหมาะสมกับวัตถุประสงค์ทตี่ งั้ ใจไว้ การทดสอบทีอ่ าศัยปฏิกริ ิยาทาง
ชีวเคมีจาเป็ นต้องมีการแสดงคุณลักษณะเฉพาะทางฟี โนไทป์ ในขณะทีก่ ารทดสอบทีอ่ าศัยmolecular make-up
ของเชือ้ เป้ าหมายนั้น ต้องการคุณลักษณะเฉพาะทางmolecular
เป็ นแนวทางปฏิบัตทิ ดี่ ใี นการใช้สายพันธุจ์ าก biological resource centersทีไ่ ด้รับการยอมรับ ซึง่ มี
คุณลักษณะครบถ้วนและแสดงคุณสมบัตทิ จี่ าเป็ นสาหรับการใช้งานขั้นสุดท้าย สายพันธุใ์ นห้องปฏิบัตกิ ารทีม่ ี
คุณลักษณะเฉพาะทีเ่ หมาะสมจากแหล่งทีเ่ กีย่ วข้อง (อาหาร อาหารสัตว์ สิง่ แวดล้อม ตัวอย่างทางคลินิกจาก
การระบาด ฯลฯ) บางครั้งเรียกว่าสายพันธุ ์ "ป่ า" สามารถใช้ได้ เช่นเดียวกับสายพันธุจ์ ากculture collections
สายพันธุใ์ นห้องปฏิบัตกิ ารเหล่านีค้ วรได้รับการบารุ งรักษาเพือ่ ให้แน่ใจว่ามีการเบีย่ งเบนทางพันธุกรรมน้อย
ทีส่ ุด (ดู ISO 11133) น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
15. รายงานผลการทดสอบ
ระบุข้อมูลบางส่วนหรือทัง้ หมดต่อไปนีใ้ นรายงานการทดสอบ ขึน้ อยู่กับความต้องการของลูกค้า :
- รายละเอียดทัง้ หมดทีจ่ าเป็ นในการระบุตัวอย่างอย่างสมบูรณ์
- วิธที ดสอบทีใ่ ช้(ทีร่ วมถึงปี ด้วย) อุณหภูมขิ องการบ่ม ถ้าจาเป็ น และผลลัพธ์ทไ่ี ด้
- รายละเอียดการทางานใด ๆ ทีไ่ ม่ได้ระบุไว้ในวิธีมาตรฐานทีใ่ ช้ รวมถึงรายละเอียดทีถ่ อื เป็ นทางเลือก
- รายละเอียดของการดาเนินการหรือการเบีย่ งเบนจากวิธีการทีอ่ าจส่งผลต่อผลลัพธ์
- การทดสอบเพิม่ เติมทีอ่ าจดาเนินการโดยห้องปฏิบัตกิ ารอ้างอิงหรือผู้รับเหมาช่วง และหากดาเนินการ
ทดสอบดังกล่าวแล้ว ผลลัพธ์จะเป็ นอย่างไร
- หากเหมาะสมหรือได้รับการร้องขอจากลูกค้า ข้อมูลทัง้ หมดทีจ่ าเป็ นสาหรับการตีความผลการทดสอบ
- เมือ่ จาเป็ น (เช่น สาหรับตัวอย่างทีเ่ ป็ นทางการหรือตามกฎข้อบังคับ) หรือหากลูกค้าร้องขอ ให้รวม
ค่าประมาณความไม่แน่นอนของผลการทดสอบเชิงปริมาณ (ดู ISO 19036)
หมายเหตุ การประมาณค่าความไม่แน่นอนอาจจาเป็ นเช่นกันเมือ่ รายงาน statements of conformity
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.1 ทั่วไป
การวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาเกีย่ วข้องกับการดาเนินการทีซ่ ับซ้อนหลายอย่าง ตัง้ แต่การสุ่ม
ตัวอย่างไปจนถึงการคานวณและการออกรายงานผล ซึง่ ทัง้ หมดนีต้ ้องดาเนินการอย่างมีความสามารถ
เพือ่ ให้ผลการทดสอบถูกต้อง
การดาเนินการเหล่านีจ้ ะกล่าวถึงในข้อ 4-17 และแสดงไว้ในรู ปที่ 1

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

รูปที่ 1: ปั จจัยทีม่ ผี ลต่อความถูกต้อง
ของผลการทดสอบทางจุลชีววิทยา

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.1 ทั่วไป
การควบคุมคุณภาพ(Quality control)เป็ นส่วนสาคัญของโปรแกรมการประกันคุณภาพ(quality
assurance programme) เพือ่ ให้ม่ันใจถึงความน่าเชือ่ ถือของผลการทดสอบ โปรแกรมการประกัน
คุณภาพควรครอบคลุมถึงอุปกรณ์เครื่องมืและวัสดุสนิ้ เปลือง อาหารเลีย้ งเชือ้ และรีเอเจนต์ทงั้ หมด
ตลอดจนการฝึ กอบรมและความสามารถของบุคลากร
การควบคุมคุณภาพ(Quality control)ในแต่ละขั้นตอนของกระบวนการทดสอบตัง้ แต่เริ่มจนจบ
ทาให้ม่ันใจในความถูกต้องของผลการทดสอบ องค์ประกอบหลักเพิม่ เติมของโปรแกรมการประกัน
คุณภาพคือการควบคุมคุณภาพภายใน (IQC) ทีด่ าเนินการควบคู่ไปกับการวิเคราะห์ตัวอย่างและการ
ประกันคุณภาพภายนอก (EQA) ผ่านการเข้าร่วมในโครงการทดสอบความชานาญ (PT) ทีเ่ หมาะสม

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.2 การควบคุมคุณภาพภายใน (IQC)
16.2.1 ทั่วไป
วัตถุประสงค์หลักของการควบคุมคุณภาพภายในคือเพือ่ ให้แน่ใจว่าโปรแกรม IQC ควร
เป็ นสัดส่วนกับผลกระทบทีอ่ าจเกิดขึน้ ผลลัพธ์ในแต่ละวันมีความสอดคล้องกันและสอดคล้องกับ
เกณฑ์ทกี่ าหนดไว้ล่วงหน้า กับความถูกต้องของผลการตรวจทางห้องปฏิบัตกิ าร และได้รับการ
ออกแบบให้สะท้อนถึงความถีข่ องการทดสอบแต่ละครั้งทีด่ าเนินการ
กิจกรรมการควบคุมคุณภาพภายในสามารถช่วยในการระบุการทดสอบทีห่ รือไม่อยู่
ภายใต้การควบคุมอีกต่อไป ควรทาการตรวจสอบการทดสอบทีอ่ ยู่นอกการควบคุม (การวิเคราะห์
สาเหตุ) และหากจาเป็ น ให้ดาเนินการแก้ไขทีเ่ หมาะสมตามมา

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.2 การควบคุมคุณภาพภายใน (IQC)
16.2.2 การควบคุมกระบวนการ
16.2.2.1 การควบคุมกระบวนการ คือการดาเนินการต่างๆทีค่ วบคู่ไปกับการทดสอบปกติประจาวัน
ตามความถีท่ กี่ าหนดโดยห้องปฏิบัตกิ าร อาจรวมถึงแต่ไม่จากัด เช่นการทา blanks, positive
controls of the target organism และ negative controls of a non-target or atypical organism ด้วย
การใช้ culture suspensions หรือ spiked samples,
16.2.2.2 การทา blanks samples
Blank samples หรือ sterilized food samples ทีร่ วมเอา matrix effectsไว้ จะให้ความมั่นใจ
ในความปลอดเชือ้ ของอาหารเลีย้ งเชือ้ และวัสดุอนื่ ๆทีใ่ ช้ และยังรวมถึงความปลอดเชือ้ ของการ
ดาเนินการทดสอบทัง้ หมด การเจริญเติบโตของเชือ้ ไม่ควรเกิดขึน้ แต่การมีเชือ้ ในระดับต่าของ
วิธีการนับจานวน (เชิงปริมาณ) อาจยอมได้หากมีเกณฑ์เฉพาะกาหนดไว้
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.2 การควบคุมคุณภาพภายใน (IQC)
16.2.2 การควบคุมกระบวนการ(ต่อ)
16.2.2.3 Positive control organisms
Positive controls ต้องเป็ น target organisms ทีต่ ้องการหา และสร้าง typical
colonies บน agar หรือสร้าง positive reactions ใน broth และในconfirmation tests ตามความ
เหมาะสม
positive control เป็ นสิง่ สาคัญทีแ่ สดงให้เห็นว่า การทดสอบดาเนินการอย่างถูกต้อง
- สาหรับวิธีทดสอบเชิงคุณภาพ ระดับของcontrol organism ควรอยู่ใกล้กับlevel of
detection (เช่น 3 ถึง 5 cfu/test portion)
- สาหรับวิธีทดสอบเชิงปริมาณ ระดับของcontrol organisms ควรมีโคโลนีประมาณ
50 -100 โคโลนี ผลทดสอบสามารถplot โดยทาแผนภูมคิ วบคุมหรือcontrol charts (ดู 16.2.5)
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.2 การควบคุมคุณภาพภายใน (IQC)
16.2.2 การควบคุมกระบวนการ(ต่อ)
16.2.2.4 Negative control organisms (เชือ้ ทีเ่ ป็ นatypical และ ไม่ใช่เชือ้ เป้ าหมาย) :
ในขั้นตอนการทดสอบยืนยัน เพือ่ ให้ม่ันใจในการรายงานผล จะมีความ
เหมาะสมกว่าหากมีการใช้เชือ้ ควบคุมทีเ่ ป็ นatypical และไม่ใช่เชือ้ เป้ าหมาย ทีม่ ันสามารถเติบโตบน
อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีใ่ ช้ทดสอบ แต่สร้างatypical colonies บนอาหารเลีย้ งเชือ้ (หรือสร้างปฏิกริ ิยาในbroth
ได้แต่กผ็ ิดจากเชือ้ เป้ าหมาย)
16.2.2.5 Negative control organisms(เชือ้ ทีถ่ ูกinhibit):
เชือ้ negative controlsเหล่านีจ้ ะถูกยับยัง้ โดย test mediumทีใ่ ช้ทดสอบซึง่ มี
ประโยชน์ต่อการควบคุมคุณภาพอาหารเลีย้ งเชือ้ (media QC) แต่แทบจะไม่ทากันในการทา routine
IQC
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.2 การควบคุมคุณภาพภายใน (IQC)
16.2.3 การทดสอบซา้ Replicate testing หมายถึงการทดสอบซา้ ๆ(repeating)กับportionsที่
แบ่งเป็ นส่วนๆ ของตัวอย่างเดียวกันซึง่ อาจมากกว่า2ส่วน(Duplicate) reference samples
หรือ artificially contaminated (spiked) matrices
Replicate testing จะให้ค่า repeatabilityหรือreproducibility ซึง่ จะแสดงถึง
ความสามารถของบุคลากรของห้องปฏิบัตกิ าร
Duplicate data (2 Data)มักถูกใช้บ่อยทีส่ ุด แต่ในบางกรณี อาจมีการพิจารณา >2 Data
Resultsของการทดสอบซา้ ยังสามารถนาไปใช้เป็ นแหล่งข้ อมูลของการค่าประมาณความ
ไม่แน่นอนของผลทดสอบได้ (ดู ISO 19036)

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.2 การควบคุมคุณภาพภายใน (IQC)
16.2.4 Spiked samples
แนะนาให้ใช้ตัวอย่างSpiked samples(เมือ่ ทาการทดสอบตัวอย่างตามปกติแล้วisolate
เชือ้ จุลนิ ทรียเ์ ป้ าหมายได้ยาก) ตัวอย่างSpiked samplesเตรียมโดยใช้จุลินทรียท์ งั้ ทีเ่ ป็ น typical
microorganisms และatypical microorganisms และให้บุคลากรทดสอบแบบblind sample
โปรแกรมปกติของการทดสอบตัวอย่างSpiked samples โดยใช้เมทริกซ์ต่างๆทีม่ อี ยู่ใน
ห้องปฏิบัตกิ ารจะมีประโยชน์ในการฝึ กอบรมหรือเพิม่ เติมความชานาญของผู้ทดสอบเกีย่ วกับวิธี
ทดสอบทีท่ าเป็ นประจา และเป็ นส่วนเสริมของExternal Quality Assurance ซึง่ อาจทาได้ไม่บ่อย
นักและมีค่าใช้จ่ายสูง

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.2 การควบคุมคุณภาพภายใน (IQC)
16.2.5 การประเมิน IQC โดยใช้แผนภูมคิ วบคุม(control charts)
ข้อมูลการควบคุมคุณภาพภายในต้องได้รับการประเมินทางสถิตเิ พือ่ จะได้ใช้พจิ ารณา
เกีย่ วกับการยอมรับ
สาหรับการทดสอบเชิงปริมาณ สามารถใช้ control charts ได้ เมือ่ มีข้อมูลเพียงพอ
ในการplot(ลงจุด) และหาค่าเฉลีย่ รวมถึงส่วนเบีย่ งเบนมาตรฐานสาหรับการทดสอบแต่ละครั้ง
สาหรับการทดสอบเชิงคุณภาพ การเฝ้ าระวังผลทดสอบทีถ่ กู ต้องในระยะยาว ควบคู่ไป
กับระดับของการspike สามารถช่วยให้เห็นข้อมูลได้ เช่น
ระดับของการspike เชือ้ Salmonella 5 cfu / test portion
เดือนที่ 1 ผลทดสอบทีถ่ กู ต้อง 100 %ของจานวนครั้งทีs่ pike
เดือนที่ 2 ผลทดสอบทีถ่ ูกต้อง 97 %ของจานวนครั้งทีs่ pike
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
16. การควบคุมคุณภาพห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา
16.3 การประเมินคุณภาพภายนอก (EQA)
การเข้าร่วมในการทดสอบความชานาญ (PT) หรือการทดสอบเปรียบเทียบระหว่างห้องปฏิบัตกิ าร
(ILC) ทาให้สามารถเปรียบเทียบประสิทธิภาพของห้องปฏิบัตกิ ารผู้ใช้ กับห้องปฏิบัตกิ ารอืน่ ๆได้
เมือ่ ประเมินผลการทดสอบความชานาญ สิง่ สาคัญไม่เพียงแต่ต้องดูทคี่ ่าคะแนนแต่ละรายการ
แต่ยังต้องทบทวนแนวโน้ม และหากจาเป็ น ต้องแก้ไขการเบีย่ งเบนทีอ่ อกนอกเกินเกณฑ์กาหนด
องค์กรทีจ่ ัดทาตัวอย่าง PT ต้องได้รับการประเมินโดยห้องปฏิบัตกิ ารของผู้ใช้ว่าสอดคล้องตาม
ตามมาตรฐาน ISO 17043 สาหรับข้อกาหนดทั่วไป และ ISO 22117 สาหรับข้อกาหนดเฉพาะ และ
คาแนะนาสาหรับองค์กร PT สิง่ สาคัญคือจานวนตัวอย่างทีเ่ ป็ นลบและบวก (โดยเฉพาะอย่างยิง่
สาหรับวิธีทดสอบเชิงคุณภาพ) และระดับการปนเปื้ อนเหมาะสมหรือไม่รวมทัง้ ประเภทของเมทริกซ์
หากไม่มี PT หรือ EQA อืน่ ๆกับจุลนิ ทรียท์ เี่ ฉพาะ อาจใช้ ILC กับห้องปฏิบัตกิ ารอืน่ ๆทีม่ กี าร
ทดสอบตัวอย่างคล้ายคลึงกัน และต้องมีการประเมินผลโดยใช้สถิตทิ เี่ หมาะสม
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
17. Validation and verification of microbiological methods
17.1 ทั่วไป
ทัง้ Validationและverification วิธีทดสอบทางจุลชีววิทยาได้กล่าวถึงในรายละเอียดใน ISO 17468
และ ISO 16140 Series
Performance characteristics of standardized reference methods ถูกกาหนดโดยการทา
validation studiesและมีอยู่ในบางมาตรฐานทีเ่ ป็ น International Reference Standards วิธีทดสอบ
Reference Standards เหล่านี้ ช่วยให้ห้องปฏิบัตกิ ารของผู้ใช้สามารถทาแค่ verify วิธีทดสอบ
Reference Standards ทีต่ นเองนามาใช้ โดยทาการเปรียบเทียบคุณลักษณะทีอ่ ยู่ในวิธีมาตรฐาน กับ
ผลทดสอบจากการverifyของตนเอง

น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร

 น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร
โทร 081 374 0366
E mail Somchai_ 6@yahoo.com
น.สพ. สมชาย วงศ์สมุทร