Izolovanje i preiavanje

enzima

 Zato izolujemo enzime?

Strategija preiavanja
- maksimalna preienost
- maksimalni prinos
- maksimalno sauvana aktivnost

Izvor enzima
- obilnost
- dostupnost (ekonomska, geografska, etika)
- komparativne studije (izoenzimi)
- lokalizacija

Ekstrakt (homogenizacija, ili preiavanje organela + homogenizacija)

Sirovi preparat (large-scale separacija)
ist enzim (small-scale separacija, ili afinitetna hromatografija direktno
iz ekstrakta)

Faze u izolovanju

Zahtevi za istoom se definiu prema konanoj upotrebi preparata

1. vrlo visoka (99 % i vie) terapeutska primena, in vivo studije

2. umereno visoka (95-99 %) x-ray kristalografija, karakterizacija fizikohemijskim metodama

3. umerena izolovanje antigena za proizvodnju antitela, N-terminalno
sekvenciranje

Identifikujte kljune neistoe

Proverite stabilnost enzima (pH, jonska sila) i u skladu sa tim osmislite
strategiju izolovanja i preiavanja
Ukoliko niste zadovoljni istoom preparata, ukljuite nove korake
Kontaminante koji mogu da inaktiviraju enzim, ili ga denaturiu,
potrebno je ukloniti (ili inaktivirati npr. proteaze) to ranije iz smee
(najbolje ve u prvom koraku).

Osobine proteina koje se koriste

tokom preiavanja
Naelektrisanje
Veliina
Hidrofobnost
Bioprepoznavanje

Jonoizmenjivaka
hromatografija (IEX)
Gel filtracija (GF)
Hidrofobna hromatografija
(HIC), RPC
Afinitetna hromatografija

Enzimi dobijeni rekombinantnom tehnologijom

Neke proteine je izuzetno teko izolovati iz prirodnih izvora
Gen (cDNA) manipulacijom DNK se ubacuje u odgovarajui vektor
Vektor se ubacuje u odgovarajui sistem za ekspresiju (proizvodnju):
bakterijski, biljni, insektni, sisarski.
Manipulacijom na nivou cDNA, rekombinantni protein moe da dobije
ekstra aminokiseline, ili itave proteine (GST), u vidu fuzionog
produkta, koji ne utiu na aktivnost, ili 3D, ali mogu da olakaju
postupak izolovanja (His tag).
Koliko je protein dobijen rekombinantnom tehnologijom slian
(identian) prirodnom proteinu?
Karakterizacija...
Primena...

Primer postupka preiavanja rekombinantnog

enzima

Deacetoksicefalosporin C sintetaza (rDAOCS) je enzim osetljiv na kiseonik. Protein je overexpressed u rastvornoj formi u citoplazmi E. coli. U prvom koraku, elije su lizirane mehanikom
silom. Pufer za lizu je sadravao inhibitore proteaza, pored ostalih komponenti (DTT).

Odredjivanje molekulske mase GF i SDS PAGE

Odredjivanje strukture rDAOCS

Afinitetetna hromatografija
Enzim analog supstrata, inhibitor, kofaktor
Antitelo antigen, virus, elija
Lektin polisaharid, glikoprotein, receptor na povrini
elija, elija
Nukleinska kiselina komplementarni lanac, histoni, NK
polimeraze, NK vezujui proteini
Hormoni, vitamini receptor, transportni protein (nosa)
Glutation Glutation-S-transferaza ili GST fuzioni proteini
Joni metala Poli(His) fuzionisani proteini, proteini bogati
His, Cys, Trp ostacima na povrini

Protein

Vrsta kolone

GST fuzionisani proteini

GSTrap FF

Albumin i enzimi koji vezuju nukleotide

HiTrap Blue HP

Protein i peptidi sa izloenim His, Cys ili HiTrap Chelating HP

Trp ostacima (kao i (His)6 fuzionisani
proteini
DNK vezujui proteini i koagulacioni
faktori

HiTrap Heparin HP

Tripsinu sline proteaze (Faktor Xa,

trombin i tripsin)

HiTrap Benzamidine FF

Preiavanje enzima: onovni problemi i postavke

Neophodan je odgovarajui test enzimske aktivnosti
Odgovarajui test za odredjivanje koncentracije proteina
Definicije: specifina aktivnost, prinos, stepen preienja, broj izmena
Dnevnik postupka izolovanja i preiavanja (zapremina, conc., akt.)
Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u istoi
Neke osnovne definicije:
- Jedinica aktivnosti (1 U): Ona koliina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola supstrata po minuti pri
standardnim uslovima*.
- 1 Katal 1 mol supstrata u 1 s
Primer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti. Specifina aktivnost ovog rastvora e biti 100 U/mg proteina.

*Standardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je mogue:
Temperatura 30 oC
pH optimum za dati sistem Enz-Sub
Koncentracija substrata na 10x poluzasienja substratom (10 Km)

Brzina: promena koncentracije reaktanata u vremenu.

Reakciona brzina koja se odredjuje u kinetikim eksperimentima odgovara
poetnoj brzini reakcije (vi, vo).
Spreava se efekat povratne reakcije, inhibicija proizvodom se svodi na
minimum.

- Poluzasienje
-

Brzina enzimske reakcije postie zasienje kada je koncentracija substrata toliko visoka da su sva aktivna
mesta zauzeta (maksimalna brzina Vmax).
Poluzasienje enzima substratom je ona konc. substrata kada se postie 50 % Vmax (Km merilo afiniteta
enzima za odgovarajui substrat)
Poznavanje vrednosti Km za dati sistem je mogue ukoliko se poznaje Vmax ili nakon serije eksperimenata za
odredjivanje brzine za razliite konc. substrata i fitovanja tih podataka u jednainu koja opisuje oblik ove
krive prema nepoznatim vrendostima (Km i Vmax).
Koju jednainu koristiti...

Nekoliko hemijskih kinetikih modela

daje sline jednaine oblika: Y = aX/(b+X)

Analitika proteina
Elektroforetske tehnike
-

Nativna elektroforeza
Elektroforeza u prisustvu uree
SDS PAGE
Gradijentni gelovi
Izoelektrofokusiranje
Dvodimenzionalne elektroforeze
Kapilarna elektroforeza

Detekcija nakon elektroforetskog razdvajanja

-

SDS PAGE proteina ekstrakta ploda kivija

(levo neredukujui uslovi, desno redukujui)

Proteini (CBB, Ag)

Glikoproteini (ifovo bojenje)
Antigeni (uz odgovarajue antitelo, najee nakon transfera na membranu imunoblot)
Enzimi: kao i nakon hromatografskih razdvajanja, uglavnom podrazumeva nativne uslove tj. tehnike separacije koje zadravaju
korektnu tercijernu strukturu proteina/enzima

Detekcija enzimske aktivnosti nakon elektroforetskog razdvajanja

-

Sa solubilnim supstratom podrazumeva prethodnu eluciju proteina iz gela (zametna i

neprecizna tehnika)
Sa precipitirajuim supstratom koji daje proizvod koji se moe detektovati (u gelu ili
na membrani) enzim nativan ili renaturisan
Tehnika zimograma (za proteolitike enzime)

Aktinidin detektovan bojenjem CBB-om, nakon 2D PAGE

u razliitim uzorcima ekstrakta ploda kivija.

Aktininidin razvojen 2D PAGE i detektovan tehnikom zimograma