FLUORESCENCIJA

Nastanak i osobine fluorescencije

Neki atomi i molekuli apsorpcijom kvanta svetlosne
energije prelaze u ekscitovano stanje.
Apsorbovana svetlost moe se da "izrai" kao toplota
u tzv. neradijacionim prelazima, kada ekscitovani molekuli
gube viak energije u sudarima sa molekulima okoline.
Drugi nain gubitka energije su radijacioni prelazi
kada se apsorbovana energija najee emituje u obliku
svetlosti koja se odlikuje veim talasnim duinama tj.
manjim energijama nego apsorbovana svetlost.
1

Ova

pojava
fotoluminescencija.

se

naziva

Prema vremenu trajanja pobuenog

stanja, tj. vremenu koje protekne od
pobuivanja do emisije svetlosti, deli se na

fluorescenciju i fosforescenciju.
Fotoluminescencija koja nije trajala due
od ozraivanja supstancije, naziva se
fluorescencija, a ona koja traje i po prekidu
ozraivanja, naziva se fosforescencija. 2

Na slici je ematski prikazano nastajanje apsorpcije, fluorescencije i

fosforescencije, kao i odgovarajui spektri.

Horizontalnim linijama su oznaeni razliiti vibracioni

nivoi (v = 0, 1, 2, ....) osnovnog elektronskog stanja (S o),
kao i vibracioni nivoi ekscitovanog elektronskog stanja (S1').
Apsorpcijom svetlosti molekul iz osnovnog
elektronskog stanja So prelazi u razliite vibracione nivoe
pobuenog elektronskog stanja S1'.
Iako je vreme ivota pobuenog stanja vrlo kratko ~
10-9-10-7 s, pre povratka molekula u osnovno elektronsko
stanje (deaktivacija), moe doi do promene vibracionih
stanja za koje je potrebno 10-13-10-11 s, kao posledica:
4

Dalja deaktivacija molekula do osnovnog elektronskog stanja moe da

se odvija na dva naina:

unutranjom konverzijom: prenosom vika

energije

na molekule okoline

odavanjem vika energije u obliku zraenja

neradijacioni
prenos

fluorescencija
5

ematski prikaz fluorescencije:

1. Ekscitacija
2. vibraciona relaksacija i
3. fluorescentna emisija
(1) Ekscitacije
Elektron u osnovnom elektronskom stanju apsorbuje foton energije EXh i prelazi na
bilo koji vibracioni nivo ekscitovanog elektronskog stanja S1'.
(2) Vibracione relaksacije
Molekul gubi energiju usled konformacijskih promenena, ili usled sudara sa molekulima
okoline. Kao rezultat ovih procesa, molekul prelazi iz ekscitovanog elektronskog stanja
S1' u osnovni vibracioni nivo ekscitovanog elektronskog stanja S1.
(3) Fluorescentne emisije
Molekul se vraa u osnovno elektronsko stanje, So emisijom fotona, tj. energije EMh.
Zbog odavanja dela apsorbovane energije molekulima okoline (u procesu ), energija
emitovanog fotona je manja od energije ekscitovanog fotona, a talasna duina je vea.
Razlika u ovim energijama, EX

- EM h naziva se Stoksovo pomeranje

10

11

12

13

Fluorescentni i apsorpcioni spektar triptofana (Trp)

14

15

Fosforescencija je pojava u osnovi slina fluorescenciji, a razlika

je u vremenu trajanja ekscitovanog stanja koje u ovom sluaju iznosi
~10-2 - 102 s.
Apsorpcijom fotona, neki molekuli mogu da predju neradijacionim
prelazom iz ekscitovanog stanja (S1') u odgovarajue ekscitovano stanje
(T1) (sl. 1). Dalja deaktivacija molekula do osnovnog elektronskog stanja
(So) moe da se ostvari:
neradijacionim nainom odavanja vika energije, ili
emisijom svetlosti, tj. fosforescencijom

Fosforescencija je spontana emisija zraenja koja nastaje

prelazima sa najnieg vibracionog nivoa ekscitovanog
elektronskog stanja T1 na bilo koji vibracioni nivo
osnovnog elektronskog stanja So.
16

Kako je stanje T1 "dugo-ivee stanje,

fosforencija
traje
due
nego
fluorescencija; ona traje i posle
uklanjanja izvora ekscitirajue svetlosti.

Fosforescentni spektri su, u odnosu

na apsorpcione spektre, znaajnije
pomereni prema dugotalasnoj strani
spektra, a po obliku i intenzitetu ne
lie na apsorpcione spektre.
17

Fosforescencija se retko koristi u analitike svrhe zbog veeg

broja uslova koji moraju biti zadovoljeni da bi se fosforescencija
pojavila.
Kako je vreme ivota ekscitovanog stanja T1 znatno due
nego vreme potrebno za meusobne sudare molekula u rastvoru,
deaktivacija sudarima verovatnija je od deaktivacije emisijom
zraenja.
Zbog toga se fosforescencija rastvora retko moe zapaziti
na sobnoj temperaturi, ve uglavnom na vrlo niskim
temperaturama.

Poloaj fosforescentnih maksimuma, kvantni prinos i

vreme ivota fosforescencije zavise od prirode date
supstancije, tako da se fosforescencija moe koristiti za
identifikaciju supstancija.
18

19

20

21

Osnovne karakteristike fluorescencije:

Spektralna raspodela:
talasna duina maksimuma fluorescentne emisije (npr. kod tritofana (Trp) 340 nm)
talasna duinu maksimuma apsorpcije (kod Trp 280 nm)
rastojanje izmenu poloaja apsorpcionog i fluorescentnog maksimuma (Stoksovo
pomeranje).

Intenzitet fluorescencije (IF) koji za fluorescenciju rastvora, zavisi od:

prirode rastvaraa (polarniji i viskozniji rastvara dovodi do porasta efikasnosti
fluorescencije, dok graenje vodonine veze izmeu molekula rastvaraa i
fluorescentne supstance dovodi do gaenja fluorescencije (raste verovatnoa za
dezaktivaciju neradijacionim putem)
koncentracije (sa porastom koncentracije IF raste priblino linearno do neke
odreene vrednosti kada dolazi do smanjenja IF zbog porasta broja sudara izmeu
molekula (koncentraciono gaenje), ili formiranja dimera i drugih asocijata koji ne
fluoresciraju, kao i formiranja novih molekulskih vrsta koje dovode do pojave nove
fluorescencije
temperature (sa porastom temperature IF obino opada, jer raste broj sudara izmenu
molekula, a time i verovatnoa deaktivacije sudarima)
prisustva "stranih" molekula (obino prouzrokuju smanjenje intenziteta
fluorescencije jer mogu da apsorbuju pobuujuu svetlost, kao i da deaktiviraju deo
pobuenih molekula pri sudaru
22
pH (neophodno je izabrati oblast pH u kojoj je IF konstantan)

Kvantni prinos fluorescencije (Q):

predstavlja efikasnost fluorescencije supstancije i ima vrednost od 0 do 1 (npr.
Triptofan ima Q ~ 0,2). Pri konstantnim spoljanjim uslovima vrednost Q je
karakteristina za datu vrstu molekula, to je znaajno za identifikaciju
nepoznatog jedinjenja.

Vreme ivota (), ili vreme trajanja fluorescencije, je vreme boravka molekula
u ekscitovanom stanju.

"Idealni" nosioci fluorescencije su molekuli ili delovi molekula

(fluorofore) koji imaju veliki:
molarni apsorpcioni koeficijent (a)
kvantni prinos (Q)
Stoksovo pomeranje
energiju emisije
23

Najee, "idealni" nosioci fluorescencije su nesupstituisani

aromatini ugljovodonici (benzen, antracen, itd.), molekuli planarne
strukture sa zatvorenim prstenovima (fluorescein, rodamin B ili akridinske
boje), kao i molekuli koji sadre estocikline ili tetracikline prstenove,
smetene izmenu benzolovih prstenova (piron, oksazin, azin, tiazin i sl.).
Od biolokih supstancija sposobnost da fluoresciraju imaju:
hlorofil, vitamin B2, neke soli bilirubina, razni alkaloidi i sl.
One supstancije koje ne fluoresciraju, mogu se da se uine
fluorescentnim hemijskim vezivanjem pogodnog fluorescentnog molekula,
tzv. sonde.
Nukleinske kiseline ne fluoresciraju. Meutim, i one mogu da se
prouavaju fluorescentnom spektrometrijom, ako se za njih vee neki
manji molekul koji slui kao sonda, npr. etidijum bromid (Fluorescentna
boja, koja se moe umetati izmeu baznih parova dvostrukog lanca DNK, i stoga
se mnogo koristi da oboji DNK u gelovima. Boja fluorescira kada je ispoljena UV
svetlost. Ova boja je poznata kao jak mutagen, a takoe i kao karcinogen i
teratogen)

Kod veine proteina, fluorescencija potie od triptofana

24

25

26

27

28

29

Izvor zraenja:
u fluorimetrima se najee koristi ksenonska lampa
koja daje intenzivan kontinualan spektar u oblasti od 200800 nm, kao i ivine lampe pod visokim pritiskom
(intenzivan linijski spektar atoma ive, skup linija oko 366
nm) i niskim pritiskom (skup linija oko 254 nm).
Kako je intenzitet fluorescencije proporcionalan
intenzitetu ekscitirajue svetlosti, vrlo je vano da se
izvor svetlosti odlikuje velikom stabilnou i intenzivnim
zraenjem pogodne spektralne raspodele

30

Ureaji
za
selekciju
ekscitovanog
i
emitovanog
zraenja
(monohromatori) su optiki delovi fluorimetra koji izdvajaju odreenu talasnu duinu
ekcitovanog i emitovanog zraenja.
Kao monohromatori se najee koriste prizme i difrakcione reetke, a u
sluajevima merenja intenziteta fluorescencije na jednoj talasnoj duini mogu da se
korise i obojeni stakleni filtri.
Kako najiru primenu ima fluorescencija rastvora, svaki fluorimetar je snabdeven
setom kvarcnih kiveta (ree staklenih), a moe imati, u zavisnosti od vrste uzoraka
koji se analizira, i elije za ispitivanje gasovitih supstanci, kao i drae za vrste
uzorke.
Kod fluorescencije, od velikog znaaja je nain postavljanja uzorka u
odnosu na smer upadne svetlosti i smer u kome emitovana svetlost pada na detektor.
Najbolji raspored (sl. 4), i jedini preporuljiv za merenje fluorescencije u analitike
svrhe, je onaj u kome se fluorescencija posmatra pod pravim uglom u odnosu na
upadnu svetlost: u ovom sluaju detektor je osvetljen samo emitovanom
svetlou, a ne i svetlou koja se reflektuje sa povrine zida kivete, ili
proputenom svetlou.
31

Detekcija fluorescentne emisije vri se pomou

osetljivih fotoelektrinih ureaja (fotomultiplikatorska
elektronska cev), mada se moe vriti i vizuelno, ili
fotoelektrino pomou spektrografa.
Dobijeni signal direktna je mera relativnog
intenziteta emisije, koji je proporcionalan koncentraciji
supstancije koja emituje; male promene intenziteta
fluorescentne emisije uslovljene malim promenama
niskih koncentracije rastvora, mogu se lako detektovati
pomou osetljivih fotoelektrinih ureaja, jer je intenzitet
fluorescencije direktno proporcionalan koncentraciji.
Kako je intenzitet fluorescentne svetlosti i pri vrlo niskom
koncentracijama veoma veliki, fluorescentna merenja
mogu se vriti i u oblastima vrlo niskih koncentracija
analiziranih supstancija reda veliine 10-12 mol/ L to
32
ovu metodu ini vrlo osetljivom.

33

34

Fluorescencija je kvalitativna i kvantitativna metoda

odreivanja supstanci u oblasti organske, neorganske i fizike
hemije, a s obzirom da se ovom metodom detektuju vrlo niske
koncentracije supstanci (~10-12 mol/L) fluorescencija se u
znaajnoj meri primenjuje i u analizi farmaceutskih,
biohemijskih i medicinskih uzoraka.
Kvantitativna analiza zasniva se na linearnoj zavisnosti (neto sloenija od
odgovarajue zakonitosti apsorpcije svetlosti (Berov zakon)) fluorescencije
ispitivane supstancije od koncentracije:

35

U sluaju vrlo razblaenih rastvora, kod kojih je deo apsorbovane

svetlosti mali, izraz moe da se transformie u:

Fluorescencija je vrlo osetljiva metoda (~ 100 puta osetljivija od

apsorpcione spektroskopije) i iroko se primenjuje u kvantitativnoj
analizi mikrogramskih koliina supstancija.
Fluorimetrijsko odreivanje koncentracije se
sastav

uzorka)

standarne)

konstruisanjem

izvodi (ako je poznat

kalibracione (radne, ili

krive

koja se dobija merenjem intenziteta

fluorescencije rastvora poznatih i bliskih koncentracija fluorescentne
supstance (standardnih rastvora)
Sa kalibracione krive, grafikom interpolacijom, moe da se odredi
koncentracija ispitivanog rastvora
36

37

Fluorescentna metoda moe da se koristi za kvantitativna

odreivanja samo u oblasti gde postoji linearna zavisnost
intenziteta fluorescencije svetlosti i koncentracije (oblast
I).
Kada se IF priblii nekoj maksimalnoj vrednosti dolazi do
odstupanja od linearnosti usled pojave unutranjeg filter efekta
( oblast II). Ova pojava prouzrokovana je veom apsorpcijom
emitovane svetlosti u slojevima rastvora bliim izvoru, ili
apsorpcijom svetlosti od strane prisutnih molekula.
Izvan ovih oblasti, pri veim koncentracijama, intenzitet
fluorescencije znatno opada, to je poznato kao gaenje
fluorescencije (oblast III). Gaenje fluorescencije moe da se
ukloni razblaivanjem rastvora, tako da koncentracija i u oblasti
III mogu neometano da se odreuju.
38

39

40