Kinetika

Mihaelis-Menten-ova jednaina

Mihaelis-Menten-ov mehanizam
Enzim-supstrat kompleks je u
ravnotei sa
slobodnim enzimom i supstratom
ES kompleks Mihaelisov kompleks
Ks konstanta disocijacije ES
kompleksa
Korak koji odredjuje brzinu reakcije je
raspad kompleksa ES na E i P

Brigs-Haldan-ov mehanizam

Uvode pojam ravnotenog stanja: ukoliko je brzina reakcije konstantna u

odredjenom vremenskom intervalu, i koncentracija ES je takodje konstantna

Km = (k2 + k-1)k1
Ks = k-1/k1
Km = Ks + k2/k1

Linearni oblici Mihaelis-Menten-ove jednaine

Lineweaver-Burk

Hanes

Eadie-Hofstee

Distribucija greke za razliite metode linearizacije

Km: 10-1 10-7 M

Konstanta specifinosti

Mehanizam sa intermedijerima

-kcat je konstanta prvog reda koja se odnosti na osobine i reakcije ES, E-intermedijer i EP
-Km: prividna konstanta disocijacije koja se moze smatrati optom konstantom
disocijacije za sve komplekse koje gradi E
-Znaenje kcat/Km: konstanta specifinosti; odnosi se na svojstva i reakcije
slobodnog enzima i slobodnog supstrata

Prolazna vremena vs. konstante brzine

Enzimske reakcije koje ukljuuju vie intermedijera! (Himotripsin)

Briggs-Haldan-ov mehanizam

Prolazna vremena su aditivna.

Integralni oblik MM jednaine

Krive progresa reakcije (jedna konc. S vie merenja)

1. Enzim mora da bude stabilan tokom

itavog merenja
2. Povratna reakcija mora da bude
zanimarljiva
3. Proizvod ne sme da inhibira enzim

Kompetujui supstrati

Specifinost prema kompetujuim supstratima

Haldanova jednaina

Da li ravnotea u reverzibilnim enzimima katalizovanim reakcijama zavisi od prisustva enzima?

Ravnotea na povrini enzima

Ravnotene konstante na povrini enzima su drugaije od konstanti u rastvoru .
Razlozi: 1. napon; 2. neproduktivno vezivanje; 3. entropijski faktor

Inhibicije

Izuavanje sloenih metabolikih puteva

Izuavanje sloenih multisupstratnih
reakcija
Enzimske inaktivacije i zdravlje (trovanje i
lekovi)
Tipovi inhibicije:
-

reverzibilna (kompletna i parcijalna) i

ireverzibilna (inaktivacija)

Tipovi reverzibilne inhibicije:

- Kompetitivna
- Antikompetitivna
- Meovita
- Nekompetativna

Kompetitivna inhibicija
Inhibitor (I) i supstrat se vezuju za isto mesto na enzimu
Jednostavni MM mehanizam
Km se menja, ali ne i Vmax

Linearizovani oblici MM jednaine za

kompetitivnu inhibiciju

Sekundarni grafik za
odredjivanje Ki u sluaju
kompetitivne inhibicije LB
metodom

Akompetitivni tip inhibicije

Inhibitor se vezuje za kompleks ES, ali ne i za slobodan

enzim
Uspostavlja se ravnoteno stanje, pri emu je kompleks
ESI u ravnotei sa ES

Linearizovani oblici MM jednaine za

ampetitivnu inhibiciju

Sekundarni grafik za
odredjivanje Ki u sluaju
akompetitivne inhibicije LB
metodom

Meovita inhibicija (specijalni sluaj

nekompetitivna inhibicija)

Linearizovani oblici MM jednaine za meovitu

inhibiciju

Sekundarni grafici za
odreivanje Ki i Ki u
sluaju meovite inhibicije
LB metodom

Nekompetitivna inhibicija

*Inhibitor utie samo na katalitiku funkciju enzima, ali ne i na vezivanje supstrata

*Vaan tip inhibicije za multisupstratne enzime
*Pri niskim koncentracijama S, efekat inhibitora se moe zanemariti

Linearizovani oblici MM jednaine za

nekompetitivnu inhibiciju

Sekundarni grafici za
odreivanje Ki i u sluaju
nekompetitivne inhibicije
LB metodom

Efekti razliitih inhibitora na

parametre u MM jednaini
Km app.
Km
Km
Km/
*

*Specijalan sluaj: =, nekompetitivna inhibicija, Km se ne menja,

Vmax se smanjuje za faktor

Km/

Odstupanje od MM jednaine
Inhibicija (aktivacija) supstratom

Neproduktivno vezivanje

Km i kcat se smanjuju
Km je manje od Ks

Vai i za reakcione mehanizme u kojima nastaju intermedijeri!

`
=

Praktini aspekti odreivanja u

enzimologiji

Odredjivanja enzimskih aktivnosti

Optimalni uslovi
Prisustvo supstrata
Prisustvo kofaktora

Kinetika odredjivanja

Kinetiki parametri

Enzimska aktivnost (IU ili U, Katal)

Specifina aktivnost (U/mg)
Koncentracija enzimske aktivnosti
U/mL
Turnover number, molekulska
aktivnost (1/min, 1/s)
Aktivnost katalitikog centra (kcat)

Preiavanje enzima

- Neophodan je odgovarajui test enzimske aktivnosti

- Odgovarajui test za odredjivanje koncentracije proteina
- Definicije: specifina aktivnost, prinos, stepen preienja,
preienja, broj izmena
- Dnevnik postupka izolovanja i preiavanja (zapremina
(zapremina,, conc., akt.)
- Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u istoi
Neke osnovne definicije:
Jedinica aktivnosti (1 U): Ona koliina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola
sup
supstrata po minuti pri standardnim uslovima*.
1 Katal 1 mol supstrata u 1 s
Primer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti. Specifina aktivnost ovog
rastvora e biti 100 U/mg
U/mg proteina.

*Standardni uslovi:
uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je mogue:
- Temperatura 30 oC
- pH optimum za dati sistem Enz-Sub
Koncentracija substrata na 10x poluzasienja substratom (10 Km)

Vrste merenja

Kontinualne
Diskontinualne
Direktne
Indiriktne

Kuplovani testovi

4. Kuplovani testovi

Praktine metode za odredjivanje kinetike i

ravnotee

1.

Spektrofotometrija
(prirodne hromofore,
NADH 340 nm;
vetake hromofore na
bazi pNP estara) radni
opseg instrumenta,
Lambert-Ber-ov zakon

2.

Spektrofluorimetrija
(prirodne fluorofore,
NADH 340 nm 460
nm, Trp 280 nm 335
nm; 4metillumbeliferon)

3.

Cirkularni dihroizam

5. Automatska titracija kiseline i baze

6. Elektrohemijske metode

7. Radioaktivne procedure

8. Manometrijske metode - prati se promena parcijalnog pritiska gasa

iznad rastvora

9. Hromatografske metode