TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC



PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ

 NỘI DUNG CHƯƠNG 2
 2.1. Nguyên tắc và phân loại các
phương pháp sắc ký lỏng
 2.2. Pha tĩnh và pha động trong sắc
ký lỏng
 2.3. Thiết bị trong sắc ký lỏng và sắc
ký lỏng cao áp
 2.4. Ứng dụng của sắc ký lỏng
2.1. Nguyên tắc và phân loại
các phương pháp sắc ký lỏng
GIỚI THIỆU VÀ PHÂN LOẠI
 ĐỘ PHÂN CỰC CỦA PHA

• Pha thường hay còn gọi là pha thuận

(normal phase): pha tĩnh phân cực 
dung môi không phân cực
• Pha đảo (reverse phase): pha tĩnh không
phân cực  dung môi phân cực
 Sắc ký lỏng – lỏng (LLC)
sắc ký lỏng - rắn (SLC)
• SLC: Pha tĩnh là chất rắn, phổ biến nhất là
silicagel pha này thuộc dạng pha thường
• LLC: Pha tĩnh là chất lỏng có phủ một lớp
chất rắn bảo vệ (giống cột nhồi trong GC)
• Pha tĩnh trong LLC có thể phân cực hoặc
không phân cực, pha động thì ngược lại
• LLC ít được sử dụng
 CỘT ÁP SUẤT THẤP
• Áp suất thấp: cột mở (open tubular), cho
đến nay vẫn còn sử dụng loại cột này tuy
nhiên chỉ tách được các mẫu tương đối
đơn giản
– Đường kính
– Cột: > 1cm
– Hạt > 37m
 CỘT ÁP SUẤT CAO
• Cột kín, hạt nhỏ và đồng nhất (< 12m)
• Độ phân giải cao nhưng thiết bị đắt
• Áp suất lên tới 5000 psi
THUẬN LỢI CỦA HPLC
Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN I- Introductory classifications

Example of high speed HPLC

Example of high resolution HPLC

Example of high sensitivity HPLC

BẤT LỢI CỦA HPLC
 Isocratic và gradient elution
• Isocractic elution: chế độ chạy đẳng dung
môi
• Gradient elution: chế độ chạy theo
chương trình dung môi, thông thường sẽ
thay đổi từ hệ dung môi có năng suất rửa
giải thấp tới cao.
– Sử dung cho những mẫu phức tạp
– Hỗn hợp các chất có ái lực khác nhau
– Giảm được thời gian phân tích
Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN I- Introductory classifications

Analysis of a complex mixture :

Isocratic mode
Gradient mode
First few peaks : too close of dead peak
too strong mobile phase

Last peaks : short and broad, long tR

too weak mobile phase
Solution = gradient elution
Begin with a weaker solvent and gradually increase the solvent strength
Resolution of ealier peaks improved
Widths of later peaks drecreased and heights increased
 2.2. Pha tĩnh và pha
động trong sắc ký lỏng
PHA TĨNH
 Silica gel
• Đường kính của hạt
• 1 - 12m (nhỏ hơn
GC)
• Cỡ hạt từ 5 – 400nm
• Kích thước hạt nhỏ  Pressure drop (bar)

áp suất cột tăng 

cho cột ngắn lại

Average velocity Flow rate

PHA ĐẢO
Synthesis of RP Packings
RP Column Preparation
Common RP Packings
RP Mechanism (Simple)
PHA ĐỘNG TRONG HPLC
BẢNG SO SÁNH ĐỘ MẠNH CỦA
DUNG MÔI TRÊN NỀN Al2O3
Một số thông tin về dung môi
QUAN HỆ GIỮA CÁC CHẤT HẤP
THỤ KHÁC
 Những thông số quan trọng trong
pha đảo

• Độ mạnh của dung môi

• Sự chọn lựa dung môi

• pH của pha động

• Hoạt tính của silanol

 Độ mạnh của dung môi

• Nước là dung môi yếu

• Tăng dung môi hữu cơ  giảm tR

• Dung môi HC này phải hòa tan trong nước

Hiệu quả tách của dung môi
 ảnh hưởng của pH
• Ảnh hưởng của hợp chất ion hóa
– Axit hữu cơ
– Bazơ hữu cơ

• Trong HPLC-RP cần phải ngăn chặn quá

trình này
• Cần thiết phải điều chỉnh đúng giá trị pH
pH ảnh hưởng tới tR

1. Salicylic acid
2. Phenobarbitone
3. Phenacetin
4. Nicotine
5. Methylampohetamine

30x0.4 cm C-18, 10 m, 2

mL/min, UV 220 nm

Snyder and Kirkland, Introduction to Modern

Liquid Chromatography, Wiley, 1979, p. 288.
 Sử dụng dung dịch đệm

• Ph của dung dịch đệm chọn sao cho

– Sử dụng được: pH = pKa ± 1

– Tốt nhất là: pH = pKa

• Tính đệm phải yếu (100 mM hoặc nhỏ hơn)

• Kiểm tra tính tan của chúng

MỘT SỐ ĐỆM PHỔ BIẾN

Buffer compatible with detector

Common concentration of buffer : 10-50 mM
 Hoạt tính của silanol
• RP chiếm khoảng 50% nhóm –OH của
silicagel
• Có tính axit yếu
Bề mặt Silica
 CÁCH CHỌN DUNG MÔI

• Độ phân cực thích hợp

• Độ nhớt thấp

• Tương thích với detector

• Tính bay hơi

Cột của một số hãng
 MỘT SỐ KÝ TỰ VIẾT TẮT
• ODS: octadecylsilylated
• TMS: trimethylchlorosilane
• THF: tetrahydrofolate
 MỘT SỐ VÍ DỤ
• Sườn silica gel • TMS – silica gel

• ODS - silica gel

ION PAIR HPLC (IPC)
Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN II- Classification of HPLC modes

Distinction between :
- short alkyl chain ion pair reagents as sodium octanesulfonate
- long alkyl chain ion pair reagent as sodium dodecylsulfate, hexadecyl
trimethyl ammonium bromide : surfactant properties and CMC
‘surfactant’ or ‘soap’ chromatography

2 proposed mechanisms :
- first model : ion pairs formed in mobile phase nonionic moieties
with the same behavior than other molecules in RPLC (distribution
between stationary and mobile phase)

SM + CIM (CI-S)M
S : solute
CI : counterion
SM + CIS (CI-S)S
VÍ DỤ
Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN II- Classification of HPLC modes

Most common ionic sites (cation and anion types) :

Cation exchanger Anion exchanger

Strongly acidic weakly acidic Strongly basic weakly basic

sulfonate carboxylic IVry ammonium I, II, III protonated

amine --N+HR2
--SO3- --CO2 - --NR3+

sulfopropryl (SP): Carboxymethyl (CM) triethylmammonium Diethylaminoethyl (DEAE)

--CH2CH2CH2SO3- --CH2CO2- --N(CH3)3+ --CH2CH2N+H(CH2CH3)2

Limit of usable pH for weak exchangers :

-  6 for cation resins
-  8 for anion resins

Capacity of resins determined by number of ionic sites on the resin: typical

values 2-5 mequiv/g small enough samples
 2.3. Thiết bị trong sắc ký
lỏng và sắc ký lỏng cao áp
THIẾT BỊ HPLC
 DUNG MÔI
• Tất cả các dung môi trong HPLC phải là
dạng “grade”.
• Khi sử dụng phải lọc qua cục lọc 0.2m
• Việc lọc sạch dung môi giúp kéo dài tuổi
thọ của cột và bơm.
• Đuổi khí trước khi sử dụng, vì các bọt khí
khi qua cột và detector sẽ gặp vấn đề
 BỘ TIÊM MẪU
(INJECTOR)

• syringe: kim tiêm

• Loop

• injector
SYRINGE
LOOP
LOOP
INJECTOR
 LOAD (the sample loop)

Inject (move the sample

loop into the mobile
phase flow)
INJECTOR
INJECTOR
CỘT BẢO VỆ (GUARD COLUMN)
CỘT PHÂN TÍCH
CÁC LOẠI CỘT
BƠM CAO ÁP
DETECTOR HPLC

Electrochemical
Others
Refractive 8%
5%
Index 5%
DETECTOR UV-VIS
DETECTOR HUỲNH QUANG
DETECTOR DAD
DETECTOR MS
2.4. Ứng dụng của sắc ký lỏng