SPEKTROFOTOMETRE

Doç. Dr. Hilal ŞEHİTOĞLU

ÇOMÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya AD
 FOTOMETRİ-FOTOMETRE

Bir çözelti içindeki madde miktarını; çözeltiden

geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından
faydalanarak ölçme işlemine fotometri, cihaza ise
fotometre denir.
 SPEKTROFOTOMETRE

Spektrumdan ayrılan tek dalga boyundaki ışın

(monokromatik) kullanılarak ölçüm yapan
fotometrelere spektrofotometre denir.

Renk yerine ışık ölçüldüğü için renksiz çözeltiler de

ölçülebilir.
 SPEKTRUM

IŞIK farklı dalga boyları

monokromatör
 DALGA BOYU

 İki dalganın en yüksek noktaları arasındaki mesafedir.

Uzun dalga boyu Kısa dalga boyu

Dalga boyu birimi olarak Angstrom(Ao) kullanılırken,

spektrofotometrik ölçümlerde daha çok nanometre(nm),
mikrometre(µm) veya milimikron (mµ) birimleri kullanılır.
10Ao = 1nm = 1mµ
 Elektromagnetik ışınlar dalga boylarına göre farklı
adlarla anılırlar.

 Dalga boyu;

180-380 nm olanları ultraviyole,

380-750 nm arasında olanları görünür,
750-2000 nm arasında olanları ise kızılötesi ışınlar olarak
adlandırılır.
Dalga Boyu (nm) Bölge Adı Gözlenen renk

< 380 Ultraviyole Gözlenemez

380 - 440 Görünür (visible) Menekşe
440 - 500 Görünür (visible) Mavi
500 - 580 Görünür (visible) Yeşil
580 - 600 Görünür (visible) Sarı
600 - 620 Görünür (visible) Orange
620 - 750 Görünür (visible) Kırmızı
800 - 2500 Near IR Gözlenemez
2500 - 15000 Mid IR Gözlenemez
15000-1000000 Far IR Gözlenemez
 ELEKTROMANYETİK SPEKTRUM

n(Hz) 1020 1018 1016 1014 1012 108

Görünür
Cosmic g-rays X-rays UV IR m-dalga Radio

l(m) 10-12 10-11 10-8 10-6 10-3 10-1

l(nm): 400 500 600 700 800

 ABSORBSİYON-TRANSMİSYON

Herhangi bir çözeltiye gönderilen ışığın çözelti

tarafından tutulmasına absorbsiyon, ışığın
çözeltiden geçişine ise transmisyon denir.

Spektrofotometrik ölçümün temeli ;

IŞIN ABSORBLANMASINA dayanır.

I0: Çözeltiye gelen ışığın şiddeti

I : Çözeltiden çıkan ışığın şiddeti

I = I0 x 10-abc
I0 I
 I = I0 x 10-abc

I I
= 10-abc = Transmitans (T)
I0 I0

T = 10-abc
Her iki tarafın 10 tabanına göre logaritması alınırsa,

logT = -abc -logT = abc = A

Absorbans (A) = abc

 A = abc

A = Absorbans

a = Absorptivite olarak
tanımlanan orantı sabiti

b = ışığın çözelti içerisinde kat

ettiği yoldur ve sabittir (cm)

c = konsantrasyon (mol/litre)
 %TRANSMİTANS

Çözeltiye giren ışığın yüzde kaçının çözeltiden çıktığını

gösterir. Transmittans değerinin 100 ile çarpılması ile
elde edilir.
%T = 100 x T

-logT = log/T..... %T’ye çevrilecek olursa , 100 ile

çarpılacağından,
log 100 / %T = log100 + log/ %T
= 2 + log/ %T = 2 - log %T

A = 2 - log %T
 A = 2 - log %T

%T, 0-100 arasında değişeceğinden A, 0 ile sonsuz

arasında değişir.

%T = 100 ise….. A = 2 – log100…..2 – 2 = 0

%T = 10 ise …… A = 2 – log10……2 – 1 = 1
%T = 1 ise……… A = 2 – log1 …….2 – 0 = 2

Rutin çalışmalarda absorbans değerinin 0-2

arasındaki kısmı kullanılır.
Bu aralık %T’nin 1-100 arasına karşılık gelir.
Absorbsiyon Fotometrisinde Genel Kural

Mutlak ve nispi hataları azaltmak için okumalar

%T=20 ve %T=80 aralığında yapılmalıdır.

Bunlar:
A = 2 – log20 = 2 – 1.30 = 0.700
 A = 2 – log80 = 2 – 1.90 = 0.100

Demek ki iyi sonuç için:

Okumalar 0.100-0.700 arasında olmalıdır.
T veya %T direkt olarak ölçülebilirken, A
ölçülemez.
Ancak T değerinden matematiksel işlemle
hesaplanarak elde edilir.
 ε(MOLAR ABSORBTİVİTE KATSAYISI)

A = abc
• “b” 1 cm olduğunda ve “c” mol/litre olarak ifade
edildiğinde, “a” sabiti yerine ε (epsilon) kullanılır.

• Sabit bir değerdir.

 LAMBERT – BEER KANUNU

 Lambert (1760) bir çözeltiden geçen ışık miktarının ışığın

çözelti içinde kat ettiği yolla logaritmik olarak ters orantılı,

 Beer (1852) ise çözeltiden geçen ışık şiddetinin çözeltideki

madde konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı
olduğunu ortaya koymuştur.

 Bu her iki kanun Lambert – Beer Kanunu olarak bilinir.

Bu kanuna göre,
Bir çözeltiden geçen ışık miktarı;Işığın çözelti içinde
kat ettiği yol ve çözelti konsantrasyonu ile ters
orantılıdır.
Emilen ışık miktarı ise konsantrasyonla doğru
orantılıdır.
Absorbans ile konsantrasyon arasındaki ilişki
Yüzde Transmitans % T %T ile Konsantrasyon arasındaki ilişki

80

60

40

20

Konsantrasyon
400 500 600 700
(yarı logaritmik kağıt)
 Beer kanunu aşağıdaki koşullarda geçerlidir

 Işık monokromatik olmalı

 Çözücünün absorbansı önemsiz olmalı

 Madde konsantrasyonu belirli sınırlar arasında olmalı

 Optik etkileşim (interferans) söz konusu olmamalı

 Beer Yasasının Uygulanması

 Spektrofotometrede iyi bir ölçüm yapabilmek için o

maddenin Beer kanununa uyması gerekir.

 !!! Beer kanununa uyan bir maddede

ölçülen maddenin konsantrasyonu ile

absorbans değeri arasında doğrusal bir ilişki vardır.
Spektrofotometrelerin Başlıca Kısımları
SPEKTROFOTOMETRELERİN BAŞLICA KISIMLARI

1. Işık kaynağı
2. Giriş sliti
3. Monokromatör
4. Çıkış sliti
5. Numune küveti
6. Detektör
7. Okuma sistemleri
 IŞIK KAYNAĞI

Kullanılan ışık kaynağının şu şartları sağlaması

gerekir:

1. Enerjisi büyük olmalıdır

2. Sürekli spektrum vermelidir,istenen dalga
boyunu sağlamalıdır.
3. Enerjisi sabit olmalıdır.
 LAMBA ÇEŞİTLERİ

1. Tungsten lamba- görünür bölge

2. Civa buharlı lamba
3. Düşük basınçlı civa lamba
4. Yüksek basınçlı civa lamba
5. Döterium lamba- 320nm ve altı
6. Ksenon lamba
7. Kuartz Halojen Lamba
8. Hidrojen lamba
 SPEKTROFOTOMETRE TİPLERİ

1.Tek ışık - hüzmeli Spektrofotometre

2.Çift ışık - hüzmeli Spektrofotometre

A.) Double-Beam in space

B.) Double-Beam in time

 DOUBLE-BEAM İN SPACE

Işık kaynağından çıkan ışık iki kısma ayrılıp 2 monokromatör

ve 2 küvetten geçtikten sonra 2 farklı detektörde ölçülür.

Işık kaynağı Monokromatör Numune küveti Detektör

metre

Ayna
Referans küvet
Numune ile kör aynı anda ölçülmüş olur

Cihaz tarafından numune değerinden referans

değeri çıkarılarak net sonuç göstergeye yansıtılır
 DOUBLE-BEAM İN TİME

Numune ve referans küvetleri farklı olmakla birlikte ışık kaynağı,

monokromatör ve dedektör ortaktır
 Aynalı bir düzenekle numune ve referans küvetlerinin
ölçümü farklı zamanlarda yapılır

 Tek hüzmeli de olduğu gibi testten önce ve test aralarında

körle sıfırlama gereklidir
 FOTOMETRİK ÖLÇÜMÜN YAPILIŞI

 Bir maddenin fotometrik tayininin yapılabilmesi için ;

-maddenin ışık absorbansı göstermesi gerekir.

-Kantitatif ölçüm için ya o maddenin molar absorbitivite katsayısını bilmek
gerekir.
-Spektrofotometre uygun dalga boyuna ayarlanır.
- Numune küvet içinde yerleştirilir.
- Solüsyonun maksimum absorbe ettiği dalga boyundaki ışık küvet üzerine
düşürülür.
- Bu ışığın bir kısmı solüsyon tarafından absorbe edilir, bir kısmı ise küvetten
geçer.
- Absorbe edilmeyen ışık miktarı detektör tarafından saptanır.
- Işık kaynağından çıkan ışık miktarı ile karşılaştırılarak ne kadarının solüsyon
tarafından absorbe edildiği hesaplanır.
Ölçüm için;

 kör,
standart
numune olmak üzere 3 tüp hazırlanır.
Fotometrik ölçümler esas olarak 2 tipte yapılır.
End point
Kinetik ölçümlerdir.
 END POİNT OKUMA

Fotometrik okumanın reaksiyon bittikten sonra

yapılmasına end point okuma denir.

Bunun için reaksiyon karışımı belli bir süre ve belli bir

sıcaklıkta inkübe edilir.

Reaksiyon tamamlanıp ürünlerin ve renk oluşumu

tamamlandıktan sonra okuma yapılır.
 KİNETİK OKUMA

• Birim zamandaki absorbans değeri ölçülür.

• Genellikle enzimlerin katalitik aktivitelerinin tayininde

kullanılır.

• Analiz tüpüne reaktif ve numune konup belirtilen

sıcaklıkta inkübasyona bırakılır.
TEŞEKKÜRLER