UNIVERZITET U BEOGRADU TEHNOLOKO-METALURKI FAKULTET

Karakteristike vrsta roda Leuconostoc

seminarski rad

Student: Slaana Davidovi broj indeksa: 4008/2011

Profesor: Maja Vukainovi

Beograd, septembar 2012

Sadraj
UVOD ................................................................................................................................................ 3 FENOTIPSKE KARAKTERISTIKE LEUKONOSTOKA ............................................................. 4 Morfoloke osobine ..................................................................................................................... 4 Fizioloke osobine ....................................................................................................................... 4 EVOLUCIJA I TAKSONOMIJA ...................................................................................................... 6 STANITA LEUKONOSTOKA ...................................................................................................... 7 Zastupljenost u razliitim niama .............................................................................................. 7 Zastupljenost u fermentisanim proizvodima ............................................................................ 8 Zastupljenost u mlenim proizvodima .................................................................................. 9 ZDRAVLJE, BOLEST I BEZBEDNOST ....................................................................................... 9 Infekcija i oportunizam ................................................................................................................ 9 Otpornost na antibiotike............................................................................................................ 10 Metabolike aktivnosti u vezi sa zdravljem ............................................................................ 10 RAST LEUKONOSTOKA ............................................................................................................. 11 Uzgajanje, odravanje i uvanje kultura ................................................................................ 11 Medijumi za izolovanje i prebrojavanje .............................................................................. 11 Odravanje (uvanje) kultura ............................................................................................... 12 Industrijska proizvodnja ............................................................................................................ 13 Uee leukonostoka u mikrobnim interakcijama ................................................................ 13 Reakcije ko-agregacije ......................................................................................................... 13 Rast i metabolizam leukonostoka u kulturama meanih sojeva..................................... 14 Krajnji proizvodi metabolizma i njihov uticaj na bakterijski rast ...................................... 15 Bakteriofagi mlenih leukonostoka ..................................................................................... 15 Bakteriocini koje proizvode mleni leukonostoci .............................................................. 15 PREIVLJAVANJE U STRESNIM USLOVIMA ........................................................................ 16 METABOLIZAM ............................................................................................................................. 17 ULOGE U TEHNOLOGIJI ............................................................................................................ 20 Uloge u tehnologiji mlenih proizvoda .................................................................................... 20 Formiranje rupa u siru ........................................................................................................... 20 Proizvodnja arome................................................................................................................. 21 Ciljano dodavanje leukonostoka kao NSLAB .................................................................... 21 Uloge u funkcionalnoj hrani...................................................................................................... 23 1

Leuconostoc kao potencijalni probiotik .............................................................................. 23 Proizvodnja polisaharida ...................................................................................................... 23 Proizvodnja manitola ............................................................................................................. 24 Hidroliza -galaktozida ......................................................................................................... 24 Proizvodnja vitamina ............................................................................................................. 24 ZAKLJUAK ................................................................................................................................... 24 Reference ....................................................................................................................................... 26

UVOD
Sojevi koji pripadaju rodu Leuconostoc su Gram-pozitivne mleno kiselinske bakterije (LAB, engl. lactic acid bacteria) od ekonomskog znaaja jer su povezane sa brojnim pozitivnim aspektima: Fermentacija hrane (kiseli kupus, kiseli krastavci, mesni proizvodi, itd.). Proizvodnja gasa (CO2) kod sireva (posebno kod plavih sireva). Proizvodnja jedinjenja koja daju aromu kod raznih mlenih proizvoda. In situ proizvodnja dekstrana kod mlenih proizvoda koji sadre saharozu, ili proizvodnja dekstrana kao polimera visoke vrednosti za industrijsku ili kliniku upotrebu, ili kao bioloki (sporedni) pomoni proizvod u naftnoj industriji. Potencijalna uloga u prehrambenoj industriji kao funkcionalna hrana. Sojevi Leuconostoc takoe su poznati i sa nekoliko negativnih aspekata , meu kojima su najznaajniji kvarenje u industriji eerne trske i kvarenje prehrambenih proizvoda povezano sa formiranjem sluzi. Neki sojevi su takoe bili identifikovani u humanim klinikim izolatima, gde je utvreno da mogu nariiti zdravlje. Meutim, sve u svemu, iz itave istorije ljudske izloenosti i potronje, dolazi se do zakljuka da je Leuconostoc. mikroorganizam koji se generalno moe smatrati bezbednim. U tehnologiji mlenih proizvoda itekako je shvaen znaaj sojeva Leuconostoc, iako su njihova genetika i fiziologija slabije ispitani nego genetika i fiziologija Lactococcus. Sojevi Leuconostoc su esto zastupljeni u mlenim starter kulturama, kao i u mlenim sredinama i zato se mogu smatrati za ne-startne mleno kiselinske bakterije (NSLAB, engl. non-starter lactic acid bacteria). Njihova uloga je esencijalna u formiranju arome i strukture (teksture) odreenih mlenih proizvoda.

FENOTIPSKE KARAKTERISTIKE LEUKONOSTOKA Morfoloke osobine

Vrste roda Leuconostoc su nepokretne koke koje ne formiraju spore. elije su Gram-pozitivne, elipsoidnog do sfernog oblika, esto izduene (posebno ako se gaje na medijumu sa glukozom); obino rastu u parovima, mada mogu biti i pojedinane, a takoe formiraju lance kratke do srednje duine. Veina sojeva obrazuje kokoidne elije kad se gaje u mleku. Kad a se gaje na vrstoj podlozi, elije su izduene i mogu se pomeati sa tapiima. Formiraju sitne, ravni kolonije, sive boje. Ne obrazuju prave elijske kapsule. Odreeni sojevi Leuconostoc mesenteroides produkuju ekstracelularne dekstrane koji obrazuju omota na povrini elije.

Fizioloke osobine
Vrste roda Leuconostoc su hemo-organotrofne, fakultativno anaerobne, katalazanegativne, nemaju citohrome. To su neproteolitiki i nehemolitiki organizmi, koji ne redukuju nitrate. Ne hidrolizuju arginin i obino ne zakieljavaju i ne zgruavaju mleko. Mogu da rastu na pH 4.5, ali nema acidofilnih vrsta i preferiraju poetni pH podloge 6.5. Optimalna temperatura za rast je izmeu 20 i 30 oC, ali rast moe da se javi i na 5 oC. Rastu u bogatom medijumu sa faktorima rasta i aminokiselinama. Sve vrste za rast zahtevaju nikotinsku kiselinu, tiamin, biotin i pantotensku kiselinu ili njene derivate. Kobalamin i p-aminobenzoeva kiselina nisu neophodni. Rast u bujonu je stimulisan dodatkom 0.05% cistein-HCl. Leukonostoci su heterofermentativne LAB. Fermentiu glukozu do ekvimolarnih koliina D-mlene kiseline, ugljen-dioksida i etanola ili acetata kombinacijom heksozo-monofosfatnog i fosfoketolaznog metabolikog puta. Nemaju fruktozo 1,6-difosfat aldolazu. Sve vrste poseduju aktivnu glukozo-6-fosfat dehidrogenazu. Ugljen-dioksid i ribulozo 5-fosfat nastaju od glukoze. Ksilulozo-5-fosfoketolaza konvertuje fermentabilne eere u etanol i D-mlenu kiselinu. Neki sojevi mogu da produkuju i acetat umesto etanola kada se gaje u prisustvu kiseonika. U prisustvu fermentabilnih eera neki sojevi dekarboksiluju L-malat do L+laktata. Polisaharidi i alkoholi, osim manitola, se ne metaboliu. Poseduju NAD-zavisnu glukozo-6fosfat dehidrogenazu. Aminokiseline koje ulaze u sastav peptidnog mosta peptidoglikana elijskog zida su alanin, serin i lizin. Fenotipske karakteristike leukonostoka date su u tabeli 1.

Tabela 1. Fenotipske karakteristike Leuconostoc vrsta

EVOLUCIJA I TAKSONOMIJA
Fenotipske karakteristike su dugo vremena koriene za izolovanje i karakterisanje leukonostoka i, ponekad, da se napravi razlika meu vrstama ili podvrstama. Poto je teko da se nedvosmisleno identifikuju vrste ili podvrste pomou ovih klasinih metoda, nove molekularne tehnike omoguavaju pouzdanu i doslednu identifikaciju, ukljuujui i vrste roda Leuconostoc. Ove tehnike se koriste pojedinano ili se meusobno kombinuju za procenjivanje molekulskog diverziteta i/ili identifikaciju vrsta ili podvrsta Na osnovu filogenetske analize 16S rRNA, rod Leuconostoc pripada porodici Leuconostocaceae, zajedno sa rodovima Oenococcus i Weissella, u okviru reda Lactobacillales. Grupa Leuconostoc je podeljena u tri zasebne evolutivne linije: Leuconostoc sensu stricto, Leuconostoc paramesenteroides, i Leuconostoc oenos. Leuconostoc paramesenteroides je reklasifikovan kao Weissella paramesenteroides, a Leuconostoc oenos kao Oenococcus oeni. Leuconostoc sensu stricto vrste Leuconostoc argentinum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides (subsp. cremoris, subsp. dextranicum i subsp. mesenteroides), i Leuconostoc pseudomesenteroides) pokazuju 97.199.5% slinosti sekvence 16S rRNA. Leuconostoc fallax imaju 9495% 16S rRNA slinosti sa nabrojanim vrstama. Leuconostoc sensu stricto linija je dalje podeljena na tri evolutivne grane ukljuujui Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gasicomitatum i Leuconostoc gelidum u prvoj grani, Leuconostoc citreum i Leuconostoc lactis u drugoj i u treoj Leuconostoc mesenteroides i Leuconostoc pseudomesenteroides. Leuconostoc argentinum je pridruen grani Leuconostoc citreum - Leuconostoc lactis. Iako su molekularne metode korisne za taksonomiju i filogeniju sojeva, fenotipske karakteristike imaju predominantnu ulogu u nauci o hrani. Zanimanje za sojeve od interesa za oveka esto se dovodi u vezu sa bar jednom vanom osobinom i razumevanje odnosa koji postoji izmeu genotipa i fenotipa predstavlja veliki izazov. Tako su sojevi Leuconostoc fallax okarakterisani pomou metoda zasnovanih na DNA, ali ovi sojevi se takoe mogu razlikovati od Leuconostoc mesenteroides pomou malat-laktat reakcije koja ne postoji kod Leuconostoc fallax ali postoji kod ovog drugog. Ovim su naglaeni znaaj i jednostavnost fenotipskog razlikovanja, koji bi se mogli koristiti rutinski i pre primene molekularnih tehnika, npr. potronja
6

arabinoze, rafinoze i fruktoze, rezistencija na vankomicin, proizvodnja CO2 i dekstrana, ili potronja citrata. Na isti nain sposobnost koncentrovanih neproliferiuih elija leukonostoka da zakisele mleko varira od pH 6.5 do 4.1 i dozvoljava razlikovanje izmeu 107 sojeva testiranih za primenu u mlenoj industriji. Slino tome, jedna studija predlae karakterizaciju LAB sojeva na osnovu neutralnih jedinjenja koje proizvode u surutki. Neke alatke koje nisu pogodne za karakterizaciju vrsta mogu, meutim, biti upotrebljene da bi se opisala redukovana grupa sojeva, npr. plazmidni profil i fermentacija ugljenih hidrata da bi se razlikovali fizioloki slini sojevi koji proizvode dekstran ili npr. metabolizam citrata, ema fermentacije ugljenih hidrata i peptidazna aktivnost da bi se odvojili mleni sojevi za tehnoloke primene.

STANITA LEUKONOSTOKA Zastupljenost u razliitim niama

Leukonostoci su obligatno fermentativni hemo-organotrofni organizmi. Probirljivi su u pogledu nutritivnih zahteva i dele mnoga stanita sa drugim LAB, posebno sa laktobacilima, pediokokama i karnobakterijama, kako prirodna, tako i ona nastala delovanjem ljudskog faktora. Sojevi leukonostoka prisutni u mnogim okruenjima vode poreklo sa zelene vegetacije i korenja koji predstavljaju njihovu prirodnu ekoloku niu, iako je njihova populacija esto mala (manje od 1%) u poreenju sa populacijama aerobnih bakterija i kvasaca. Iz ovog prirodnog stanita lako se ire po raznim niama kao to su biljni materijal, koga ine povre i silaa i fermentisani prehrambeni proizvodi poreklom od razliitih sirovih materijala. Njihovo prisustvo u mleku i, shodno tome, u mlenim proizvodima deava se zbog kontaminacije tokom mue i/ili tokom proizvodnje (prerade), to je jo i pojaano njihovom jedinstvenom osobinom da dugo vremena preivljavaju na povrinama materijala kao to su drvene posude i kalupi, a preivljavaju i pasterizaciju Podaci o povezanosti oveka i ivotinja sa vrstama roda Leuconostoc su relativno retki. Obino se ne smatraju sastojkom humane flore, iako postoje sojevi koji su izolovani iz ljudskog fecesa, uzoraka vaginalnog sekreta i mleka, kao i iz telesnih tenosti (krvi, urina i cerebrospinalne tenosti) pacijenata. U tankom i debelom crevu broj leukonostoka moe da dostigne oko 10 5/g. Iz klinikih uzoraka izolovane su vrste rezistentne na vankomicin. Leukonostoci su takoe izolovani iz mikroflore stoke, ribe, insekata, kao i iz nekih drugih sredina kao to su ostaci tretirane rude boksita. Leuconostoc su jedna od prvih prouavanih bakterijskih grupa, zbog njihovog
7

udela u komercijalnim gubicima u industriji eera. Takoe se dovode u vezu sa kvarenjem ribe i mesnih proizvoda. Vrste roda Leuconostoc su povezane sa irokim spektrom mesnih proizvoda, ukljuujui svee i vakuum-pakovano meso, ivinu, mesne preraevine i fermentisane mesne proizvode. Poznato je da Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gasicomitatum i Leuconostoc gelidum uzrokuju kvarenje odreenih mesnih proizvoda. U nekoliko sluajeva Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides i Leuconostoc citreum bili su uzronici kvarenja hladno dimljenog lososa ili pastrmke. Leuconostoc citreum je izolovan iz fermentisanih ribljih proizvoda sa niskim sadrajem soli.

Zastupljenost u fermentisanim proizvodima

LAB, ukljuujui Leuconostoc, igraju vanu ulogu u fermentaciji razliitih prehrambenih proizvoda. Izvor bakterija moe biti ili sirovi materijal, kao npr. za proizvodnju sireva od sirovog mleka, ili za kiseli kupus i neke fermentisane kobasice, ili se kao izvor bakterija mogu koristiti komercijalne starter kulture. Prvi postupak esto se primenjuje za kieljenje u privatnim domainstvima, kao i za proizvodnju nekih neindustrijskih, sireva gde se inokulum odrava tako to se uva uzorak prethodnog proizvoda, tzv. tehnika "staro-mlado". Tokom fermentacije, krajnji proizvodi metabolizma ugljenih hidrata doprinose ne samo ouvanju kvaliteta proizvoda (zahvaljui zakieljavanju, ime se i spreava kvarenje proizvoda), ve daju i aromu i teksturu proizvodu. Fermentacija takoe moe da povea nutritivnu vrednost hrane na taj nain to joj poveava svarljivost, to se deava u fermentaciji mleka do sira, ili pak tako to smanjuje njenu toksinost. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides igra znaajnu ulogu u fermentaciji povra, kao to su kiseli kupus i krastavci. Iako nije dominantna vrsta, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides inicira fermentaciju kupusa, nakon ega ulogu preuzimaju laktobacili koji su tolerantniji prema kise lom pH. Osim ove vrste, u poetnim fazama je ukljuen i Leuconostoc fallax. Krajnje pH od 3.5 je postignuto tokom fermentacije soka od kupusa, sa mlenom i siretnom kiselinom i manitolom, kao glavnim krajnjim produktima fermentacije. Leuconostoc citreum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc kimchi, i Leuconostoc mesenteroides dominiraju u poetnim stupnjevima fermentacije kimhija, korejskog tradicionalnog jela koje se priprema od kineskog kupusa, rotkvica i krastavca. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides i subsp. dextranicum su povezani sa fermentisanim proizvodima na bazi itarica. Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ima ulogu u fermentaciji kiselog testa. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides je naen u kiselim hlebovima sa kvascem i raznim proizvodima nalik na palainke; prisutan je takoe u velikom

broju u proizvodima od povra i proizvodima na bazi skroba, a uestvuje i u fermentaciju zrna kafe. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides je takoe naen i u eernoj trsci, gde produkuje polisaharide i uzrokuje zakieljavanje. Zastupljenost u mlenim proizvodima Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i Leuconostoc lactis se koriste kao starter kulture u proizvodnji pavlake, maslaca, krem-sira, tvrdih sireva (Gauda i Edam). Takoe, koriste se i u formulisanim starter kulturama za proizvodnju kefira. Leuconostoc argentinum je izolovan iz argentinskog sirovog mleka. Prisustvo leukonostoka u mnogim vrstama sira i bez dodavanja starter kulture, je esto i uobiajeno, naroito kod sireva koji se prave od sirovog mleka. U jednoj studiji, meu 4379 uzoraka iz 35 razliitih evropskih mlenih proizvoda ukljuujui 24 vrste neindustrijskih sireva, 10% sojeva su inili leukonostoci. Leukonostok je prisutan u raznim oblicima fermentisanih mlenih proizvoda. Takoe predstavlja komponentu kefirne kulture doprinosei, ne ba toliko kao kvasci, proizvodnji etanola i acetata, koji su karakteristini za ovaj proizvod.

ZDRAVLJE, BOLEST I BEZBEDNOST

Brojni kliniki izvetaji ukazuju na povezanost LAB (ukljuujui leukonostok) sa infekcijama. Panja je takoe posveena enzimskoj aktivnosti koja se odnosi na proizvodnju potencijalno tetnih supstanci.

Infekcija i oportunizam
Najpre se smatralo da leukonostok nije od klinikog znaaja, jer nije bio specifino detektovan, zatim se polako pojavljuje kao oportunistiki patogen, sve dok nije prvi put zabeleeno bakterijsko oboljenje uzrokovano leukonostokom 1985. Od tada je zabeleeno manje od 100 sluajeva i to su uglavnom bili odrasli ljudi sa ugroenim/opalim imunitetom mada je zabeleen i kod jako malog broja zdravih osoba (bez neke druge infekcije). Podlonost ovoj bakteriji veoma pokazuju ljudi koji koriste venske katetere i druge invazivne naprave koje ulaze u telo (kod traheotomije, gastrostomije ili endotrahealne cevi) kao i ljudi koji su uzimali antibiotike. Kliniki, leukonostok uzrokuje primarno bakterijska oboljenja, plune infekcije, infekcije peritonealne tenosti, endokarditis, meningitis, osteomijelitis, ventrikulitis,
9

apsces i septikemiju. Mnogi sojevi pripadaju vrsti Leuconostoc mesenteroides, izolat Leuconostoc lactis je redak, iako najvei broj vrsta izuzev Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris mogu da ive na 37 stepeni. Poreklo ovih infekcija ostaje nepoznato, mnoge se "zakae" u bolnici. Detektovane su da ive na koi oveka kao normalna flora koe i odatle se ovek moe i zaraziti, takoe se moe zaraziti tako to uu u krvotok putem gastrointestinalnog trakta. Vredi napomenuti da tretman vankomicinom moe dati leukonostoku selektivnu prednost u odreenoj ekolokoj nii jer e vankomicin unititi bakterije koje bi normalno inhibirale njegov rast, to omoguava leukonostoku da se deli i uzrokuje bolest.

Otpornost na antibiotike
Konvergentne studije o osetljivosti na antibiotike mlenih ili humanih klinikih izolata sojeva Leuconostoc pokazale su da su oni, pored vankomicina, otporni i na fosfomicin, "stare" hinoline i glikopeptide. Oni su osetljivi ili pokazuju srednju osetljivost na makrolide i tetracikline. Upotreba komercijalnih starter kultura bakterija u proizvodnji mlenih proizvoda mogla bi da predstavlja potencijalni rizik za irenje gena koji imaju rezistenciju na antimikrobne agense; korienje antibiotika u uzgoju ivotinja, biljaka ili industrijskim procesima moe da doprinese pojavi rezistencije na antibiotike i meu humanim izolatima; leukonostok je poznat kao oportunistiki patogen i antibiotik-rezistentni sojevi izolovani su sa vie mesta infekcija.

Metabolike aktivnosti u vezi sa zdravljem

Hidroliza soli unih kiselina je zavisna od dejstva crevnih bakterija na telesne sekrete. Ova reakcija olakava ekskreciju, izluivanje unih soli ali takoe moe biti ukljuena u razne bolesti. Hidrolazna aktivnost unih soli je odsutna kod sojeva Leuconostoc mesenteroides. Biogeni amini su organske baze koje ukazuju na trovanje hranom uglavnom usled konzumiranja razliite vrste hrane, ukljuujui sir, meso i proizvode od ribe, kao i crveno vino. Ovi biogeni amini se u najveoj meri sintetiu dekarboksilacijom aminokiselina i to dejstvom bakterija. Proizvodnja biogenih amina kod leukonostoka nikada nije zabeleena, tako da su sojevi Leuconostoc prvoklasni sastojci starter kultura koje se koriste u mlenoj industriji. Leuconostoc proizvodi D-laktat iz metabolizma ugljenih hidrata, ba kao i Lactobacillus delbrueckii. Odrasli ljudi metaboliu D-laktat sporo tako da preporuen dnevni unos ne bi trebalo da premai 100 mg/kg telesne mase. Ni D10

niti D/L laktat ne treba da se nalaze u hrani za decu, osim u terapeutske svrhe. Normalno konzumiranje mlenih proizvoda nee dovesti do vika D-laktata.

RAST LEUKONOSTOKA Uzgajanje, odravanje i uvanje kultura

Medijumi za izolovanje i prebrojavanje Gajenje leukonostoka se moe ostvariti korienjem bogatih tenih podloga i selektivnih ili neselektivnih medijuma, u zavisnosti od toga ta je potrebno da li treba izolovati pojedinaan rod iz smee mikroorganizama ili treba odravati izolate u kulturi. Razliite podloge koje zadovoljavaju opte zahteve u ishrani leukonostoka normalno dozvoljavaju njegovu brzu regeneraciju, bez potpune inhibicije ostalih grupa. Najee su APT, Briggs, MRS, La i BHIYE. Zbog njihove niske selektivnosti primena im je ograniena na skupine kojima dominira jedan tip ili grupa organizama. Selektivne podloge, koje sadre jedan ili vie restriktivnih faktora, i koje jo uvek omoguavaju rast leukonostoka, ali inhibiraju nepoeljne bakterijske grupe u meanoj populaciji, se preporuuju za upotrebu. Meutim, jo uvek ne postoji potpuno efikasna podloga. Veina selektivnih podloga koje se baziraju na sposobnosti organizma da metabolie/koristi citrat su se pokazale nezadovoljavajuim jer mnogi organizmi u istom stanitu (npr. Lactobacillus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis) takoe metaboliu citrat, a s druge strane postoje i sojevi Leuconostoc koji ne koriste citrat. Takoe je uzeta u obzir njihova sklonost ka kiselom kao i preferiranje mikroaerofilnih do anaerobnih uslova za ivot. Korieni su sledei inhibitorni faktori, pojedinano ili u kombinacijama: kalijum-sorbat (MRSS pH 5.7), talijum-acetat (MRST pH 6.5), natrijum-azid (MSE), antibiotici kao to su vankomicin ili tetraciklin. Uobiajena podloga za uzgoj istih sojeva Leuconostoc jeste klasina MRS podloga, modifikovana ili ne, izostavljanjem citrata i mesnog ekstrakta. Formulisane su podloge za fizioloka ispitivanja eme fermentacije eera, proizvodnje gasa, stvaranja dekstrana, degradacije citrata i ostalog. Takoe je razraena i hemijski definisana podloga koja ispunjava nutricione zahteve velikog broja reprezentativnih sojeva leukonostoka sadri laktozu, Mn2+, Mg2+, 12 aminokiselina, 8 vitamina, adenin, uracil i Tween 80. Omoguava brz i masivan rast, u poreenju sa rastom na sloenoj podlozi i pogodna je za selektivno izolovanje i odreivanje broja leukonostoka iz meanih starter-kultura.

11

Kada su istovremeno prisustne kulture Leuconostoc i Lactococcus, tada postaje jo jednostavnije identifikovati Leuconostoc na podlozi MRS koja sadri vankomicin 30 mg/mL, jer Lactococcus biva inhibiran niim koncentracijama. M17 podloga koja sadri 5% glukoze takoe moe da se koristi jer e Lactococcus dati kolonije dobre veliine posle 24 h, dok je leukonostoku za formiranje takvih kolonija potrebno 48 h. Nasuprot tome, kada se u M17 doda 5% saharoza, formiranje sluzi omoguava detekciju kolonija leukonostoka znatno pre nego kolonija laktokoka. ak tavie, ova podloga obogaena saharozom omoguava bru detekciju leukonostoka nego MRS obogaen vankomicinom ili MSE podloga, koja takoe sadri saharozu ali usporava rast, verovatno zbog prisustva natrijum azida (0,075%). -galaktozidaza (-gal) pozitivni sojevi Leuconostoc koji rastu kao plave kolonije mogu da se razlikuju od sojeva Lactococcus koji su -gal negativni na MRS agar podlogama sa 5-bromo-4-hloro-3-indolil--d-galaktopiranozidom. Ovo je takoe zgodno i za razlikovanje izmeu -gal-pozitivnih i -gal-negativnih Leuconostoc izolata. U prisustvu vankomicin rezistentnih Lactobacillus sojeva treba da se koristi LUSM podloga koja sadri vankomici, tetraciklin i sok od paradajza. Veina leukonostokasu relativno neosetljivi na kiseonik, iako se bolji rast esto zapaa u redukovanoj atmosferi. Preferiraju mikroaerofilne do anaerobne uslove. Inkubacija u prisustvu N2, H2 ili CO2, ili uz neki komercijalni kit koji generie anaerobni gas je preporuljivo. Sojevi Leuconostoc rastu na 30oC, optimalna temperatura je od 20-30 oC. Najvei broj sojeva dobro raste na 10 oC, sa minimalnom temperaturom za veinu vrsta 5oC. Zabeleen je meutim rast i na 1 oC za sojeve Leuconostoc gelidum i Leuconostoc carnosum i na 4 C kod sojeva Leuconostoc gasicomitatum. Sve tri vrste vode poreklo iz mesnih proizvoda pakovanih u modifikovanoj atmosferi i uvanih na hladnom. Nasuprot tome neki sojevi su opisani kao termodurni jer preivljavaju pasterizaciju, zadravaju se na alatu kojim se radi sa mlekom, pa moe doi do kontaminacije. Odravanje (uvanje) kultura Za kratkorono odravanje, sojevi mlenih leukonostoka se mogu uvati kao ubodne kulture u MRS medijumu (1% w/v agara) na 4 C u trajanju od 1 2 nedelje. Alternativno, kulture se mogu skladititi u lakmus mleku obogaenim sa 5% ekstrakta kvasca i 5% glukoze ili u MRS bujonu koji sadri 1% laktoze i 10% glicerola kao zatitnog agensa u trajanju od 6 meseci do godinu dana na -20 C, ili u duem periodu na -80C. Najbolji rezultati se dobijaju kada se sojevi gaje u bogatom medijumu, koji se zatim ukloni centrifugiranjem, a elije se isperu fosfatnim puferom, resuspenduju u sveoj podlozi sa 10 15% sterilnog glicerola i rasporede u male kriotube pre zamrzavanja. Liofilizacija mlenih leukonostoka u prisustvu sterilnog obranog mleka obogaenog sa 4% laktoze rezultuje
12

dugotrajnim preivljavanjem i zadravanjem metabolikih karakteristika i do nekoliko godina.

Industrijska proizvodnja
S obzirom da su sloene laboratorijske podloge esto preskupe, nisu pogodne za industrijsku proizvodnju. Zato se druge podloge koriste u industriji i njihov sastav esto nije dostupan (vlasnike procedure). Koriste se podloge zasnovane na papain-hidrolizovanom kazeinu ili mleku ili surutki. Pogodan je takoe i medijum koji se upotrebljava za Lactococcus (1,4% ekstrakt kvasca, 4% tripton, 9% laktoza). Sve ove podloge mogu da se koriste u ba kulturama pod regulisanim pH uslovima (esto pH 6.5) i kontrolisanim parametrima. Upotrebom laktoze umesto glukoze izbegava se razvoj laktoza -negativnih mikroorganizama. Meutim, dobijeni su niski prinosi (max 5x109 elija/ml) u poreenju sa prinosima kod Lactococcus i Lactobacillus pod istim uslovima. Vrsta centrifuge koja je koriena za koncentrovanje elija nije uticala na viabilnost, meutim kontinualni proces smrzavanja i suenja je imao negativne posledice (-33%) u poreenju sa ba laboratorijskim. Testirana je Proizvodnja meanih kultura sa sojevima Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i Lactobacillus rhamnosus, na komercijalnim starter podlogama. Temperatura inkubacije ima uticaj na odnose izmeu populacija, zakieljavanje i proizvodnju arome (ukusa i mirisa). Uee leukonostoka u mikrobnim interakcijama Mezofilni LAB starteri koji se koriste u mlenoj industriji predstavljaju meavine rodova, vrsta, sojeva. Zbog toga njihov sastav nije uvek poznat, naroito u sluajevima prirodnih startera. Pored toga, mikrobne interakcije, bilo da su kooperativnog ili inhibitornog tipa mogu dovesti do nekontrolisanih promena u starteru. Pozitivne interakcije mogu dovesti do boljeg rasta ili bolje proizvodnje metabolita. Interakcije su ili direktne, ukljuujui fiziki kontakt individua, ili indirektne, usled modifikacija supstrata ili promena parametara medijuma. Negativne interakcije mogu biti direktne i ukljuuju fage ili mogu takoe biti indirektne a tiu se toksinih metabolita (bakteriocina), kompeticije za potronju supstrata, i akumulacije katabolita. Reakcije ko-agregacije Ispostavilo se da ekstracelularni materijal izolovan iz Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum 663 fiziki interaguje sa elijama laktokoka uzrokujui koagregaciju. Ovo bi moglo da olaka interakcije izmeu rodova tokom procesa proizvodnje sira.
13

Rast i metabolizam leukonostoka u kulturama meanih sojeva Sojevi Leuconostoc rastu asocijativno sa laktokokama koje proizvode kiselinu i taj njihov asocijativni rast je prouavan u odnosu na metabolizam citrata i stvaranje arome. Ovaj asocijativni rast je opisan kao sinergistiki funkcionalni odnos (veza). Leukonostok metabolie citrat u pH opsegu od 6.3 do 4.5, a diacetil i acetoin se proizvode samo pri kiselom pH. Stoga, da bi se inicirao metabolizam citrata i da bi nastala jedinjenja koja daju aromu, neophodno je da Lactococcus lactis proizvede dovoljno kiseline da bi se spustila pH vrednost mleka. Manje panje je posveeno stopi rasta, proizvodnji kiseline i finalnoj biomasi ovih bakterija, koji takoe odraavaju interakcije u kulturama meanih sojeva Leuconostoc i Lactococcus. Rast leukonostoka je bio ili nepromenjen ili inhibiran tokom eksponencijalne faze i bio je sistematski inhibiran u stacionarnoj fazi. Inhibicija se uglavnom suprimira dodatkom peptida ili aminokiselina, to ukazuje na to da je kompeticija za azotne nutrijente jedna opta osobina kod kultura meanih sojeva Leuconostoc i Lactococcus u mleku. Vredi napomenuti da je u ograniavajue niskim ili preterano visokim koncentracijama azotnih nutrijenata Leuconostoc mesenteroides bio uvek u nepovoljnom poloaju u odnosu na Lactococcus lactis. Nasuprot tome, poboljan maksimalni rast Leuconostoc lactis CNRZ 1091 u kulturama meanih sojeva sa Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 u mleku prikazuje bakterijsku kooperaciju izmeu dve vrste. Razliiti tipovi interakcija se mogu deavati u zavisnosti od upotrebljenih sojeva u asocijativnom rastu u mleku, ali takoe i u zavisnosti od temperature na kojoj rastu. Ujednaen rast vrsta deava se tokom inkubacije izmeu 21 i 25 oC. Na temperaturama preko 25 oC odnos zastupljenosti bakterijskih vrsta je pomeren ka metaboliki aktivnijem Lactococcus lactis, koji ima veu stopu rasta na vioj temperaturi (izmeu 25 i 32 o C) u odnosu na Leuconostoc. Razlike u emi rasta razliitih sojeva koji ine strartere sa meanim sojevima mogu dovesti do neizbenih i znaajnih promena u njegovom sastavu u prilino kratkom periodu kultivacije. Dalje, u komercijalnim koncentratima meanih kultura koje sadre bakterije-proizvoae kiseline i Leuconostoc koji proizvodi aromu, zastupljenost leukonostoka kree se izmeu 5% i 10% ukupne kulture. Tako da se upotrebom koncentrata sa sojem Leuconostoc moe izbei nebalansiranost populacije i brza predominacija Lactococcus lactis nad Leuconostoc. Iako bi acetaldehid (100 mg/L) mogao da povea proizvodnju acetoina i diacetila, kao i da povea rast leukonostoka, normalne koncentracije acetaldehida proizvedene od strane mezofilnih kultura (3-8 mg/L) nisu dovoljne da stimuliu njegov rast u meanim starter kulturama. NSLAB mogu takoe da utiu na ponaanje leukonostoka u mlenoj tehnologiji. Devoyod i Poullain (1988) su zabeleili stimulatorno dejstvo enterokoka i kvasaca
14

na rast leukonostoka i proizvodnju gasa tokom proizvodnje aminokiselina i peptida iz degradacije kazeina. Krajnji proizvodi metabolizma i njihov uticaj na bakterijski rast Mehanizam pomou koga Leuconostoc inhibira bakterijski rast LAB-a, kao i patogenih sojeva, pripisuje se degradacionim proizvodima metabolizma ugljenih hidrata i citrata. Antimikrobni efekti organskih kiselina, ukljuujui mlenu i siretnu kiselinu, se ispoljavaju dejstvom na elisku membranu, menjajui njene osobine kao to su membranski potencijal i elijski integritet. Antibakterijske osobine diacetila i etanola takoe su opisane, iako su njihovi efekti blagi kod obinih mlenih fermentacija. U prisustvu kiseonika Leuconostoc akumulira vodonik peroksid koji moe biti inhibitoran za neke mikroorganizme. Bakteriofagi mlenih leukonostoka Spor rast sojeva Leuconostoc u meovitim starter kulturama moda bi mogao da bude posledica potekoa u prepoznavanju bakteriofaga u fermentacijama u kojima je proizvodnja kiseline normalna. Meutim, ipak su izolovani fagi koji napadaju Leuconostoc, iz mlenih proizvoda (uzoraka surutke, sira, itd). Okarakterisani su i ustanovljeno je da pripadaju familiji Siphoviridae. Bakteriocini koje proizvode mleni leukonostoci Bakteriocini su heterogena grupa proteina ili peptida sa antibakterijskim delovanjem na ogranien spektar bakterija, koje su u bliskoj vezi sa sojem koji ih produkuje. Klasian bakteriocin LAB je nisin A, koga produkuje Lactococcus lactis subsp. lactis. Nekoliko sojeva Leuconostoc produkuje bakteriocine, ukljuujui Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, koji, produkuje mezentericin Y105, zatim Leuconostoc gelidum leukocin A-VAL 187, Leuconostoc camosum karnozin 44A, Leuconostoc paramesenteroides leukonocin S. Bakteriocini produkovani od strane leukonostoka mogu, a ne moraju biti aktivni prema drugim LAB, ali svi u svom spektru dejstva ukljuuju Listeria spp. Postoje dva mogua naina za eksploataciju antagonistike aktivnosti leukonostoka u prehrambenim proizvodima. Prvi, tradicionalni nain je da se proizvedeni bakteriocini dodaju u hranu. Ovo je uspeno iskorieno sa nisinom, posebno u mlenim proizvodima. Problem je to je nisin slabo rastvorljiv i nestabilan na pH > 5; zato ovaj nain ima ogranienu primenu. Ovo ogranienje podstaklo je potranju za drugim bakteriocinima.

15

Alternativni pristup konzerviranju hrane bakteriocinima je dodavanje u hranu organizama koji produkuju ih produkuju. Njegova primena zavisi od kompatibilnosti fermentisanog proizvoda sa tim organizmima. Leukonostoci su heterofermentativne LAB koje produkuju znaajne koliine CO2 tokom fermentacije ugljenih hidrata, to moe predstavljati problem kod proizvoda koji su spakovani u hermetiki zatvorenu ambalau. Meutim, Leuconostoc spp. se koriste kao starteri u mnogim mlenim proizvodima. Bakteriocini koje produkuju imaju izraenu antilisterijalnu aktivnost, to bi moglo da bude glavni razlog za korienje ovog naina konzervisanja hrane. Iako su bakteriocini koje proizvodi Leuconostoc mlenog porekla (konkretno mezentericin Y105) bili ispitivani zarad njihove mogue upotrebe kao konzervanasa u hrani, nema pisanih podataka da su stavljani u hranu bilo producenti bakteriocina, bilo bakteriocini iz Leuconostoc. Zapravo, bakteriocini bi mogli da se koriste u sklopu nekog seta antimikrobnih faktora u cilju efikasnog suzbijanja patogena i uzronika kvarenja hrane.

PREIVLJAVANJE U STRESNIM USLOVIMA

Malo se zna o posledicama stresa na elije Leuconostoc. One su sposobne da dugo vremena preive u raznim nepovoljnim uslovima sredine, kao to su u industriji eera, ulja kao i u mlenoj industriji. Zadravaju vijabilnost tokom dueg niza godina na povrinama drvenog orua (u industriji), na glaziranim kamenim povrinama, gvozdenim ili plastinim modlama kao i na ostalom drvenom i glaziranom oruu, koje se tradicionalno koristi u proizvodnji sira. Neprijateljski uslovi ivotne sredine dovode do interakcija i takvih fenomena kao to je formiranje sluzi ili glikokaliksa u prisustvu saharoze i tragova minerala, to rezultuje u stvaranju biofilma koji titi elije od tetnih agenasa. Sastav surutke zrelog sira verovatno je takav da dozvoljava opstanak leukonostoka, koji je detektovan u visokim elijskim nivoima. Homeostaza unutranjeg pH je esencijalna za rast i opstanak svih biolokih elija, pa tako i leukonostoka, ali bakterijski rast jeste jedan samoograniavajui proces jer vremenom dolazi do zakieljavanja podloge na kojoj ive i sve vee akumulacije kiseline. Kako pH spoljanje sredine opada, unutarelijsko pH Leuconostoc mesenteroides se takoe smanjuje. Rast prestaje kada se dostigne unutranja pH vrednost od 5.4 do 5.7, nezavisno od sastava podloge. Nasuprot tome, na spoljanji ograniavajui pH je u velikoj meri je uticala podloga, tj. priroda i koncentracija organskih kiselina. Odgovor elija Leuconostoc mesenteroides na toplotni ok ogledao se preteranom ekspresijom proteina stresa, ija je N-terminalna sekvenca homologa sa visoko16

konzerviranim aperonima Escherichia coli. Ctsr homolozi su identifikovani kod Oenococcus oeni i drugih Gram-pozitivnih bakterija, pa se pretpostavlja da bi regulacija u uslovima toplotnog oka putem Ctsr mogla postojati i kod leukonostoka. Tehnologije koje se koriste u cilju spreavanja kvarenja hrane, kao to su primena visokog pritiska, kojom se kombinuje efikasno smanjenje broja klica sa maksimalnim zadravanjem hemijskih i fiziko -hemijskih osobina proizvoda, trenutno se ispituju. Tretman koji podrazumeva homogenizaciju pod visokim pritiskom na 25 stepeni u trajanju od 15 minuta i pritisku u opsegu od 100 i 300 MPa, pokazuje da Gram-pozitivne bakterije ukljuujui i Leuconostoc mesenteroides su otpornije od Gram-negativnih bakterija, pri emu struktura peptidoglikana verovatno doprinosi rezistenciji, dok se obe grupe preklapaju pri visokim hidrostatikim pritiscima. Unitavanje elija leukonostoka zavisi i od pritiska i od vremena trajanja primenjenog pritiska, pri emu je otpornost na visok pritisak manja kod Leuconostoc mesenteroides nego kod Saccharomyces cerevisiae. Posle 5 minuta na 25 stepeni i pritisku od 345 MPa gubitak vijabilnosti elija bio je preko 6 logciklusa za jedan sat.

METABOLIZAM
Vrste roda Leuconostoc imaju kompleksne nutritivne zahteve. Generalno, za rast su potrebni nikotinska kiselina, tiamin, biotin i pantotenska kiselina (ili njeni derivati), dok kobalamin i p-aminobenzoeva kiselina nisu neophodni. Leuconostoc lactis ne zahteva folnu kiselinu, dok su za rast Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides potrebne glutaminska kiselina i valin. U skladu sa potrebama za aminokiselinama vrste ovog roda se mogu podeliti u dve grupe: - prvoj grupi pripadaju sojevi koji obrazuju dekstran, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum i Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, koji zahtevaju do osam aminokiselina za rast; - drugu grupu ine sojevi koji ne obrazuju dekstran, za iji rast je potrebno vie od osam aminokiselina. Svi sojevi zahtevaju metionin, valin i glutaminsku kiselinu. esto je neophodno prisustvo riboflavina i folne kiseline u podlozi za gajenje, a neki sojevi ne rastu u odsustvu adenina, guanina, ksantina i uracila. Nijednom soju nije neophodan alanin, ali svi sojevi zahtevaju tiamin, pantotensku kiselinu i biotin. Rast zavisi od metabolizma fermentabilnih eera. Pod mikroaerofilnim uslovima glukoza se konvertuje u ekvimolarne koliine D-laktata, etanola i CO2, kombinacijom heksozo-monofosfatnog i pentozo-fosfatnog puta, sa glukozo-6-

17

fosfat-dehidrogenazom i ksilulozo-5-fosfoketolazom kao kljunim enzimima. Heterofermentativni put razgradnje glukoze prikazan je na slici 1.

Slika 1: Heterofermentativni put metabolizma glukoze

18

Fruktozo-1,6-difosfat aldolaza je odsutna. Redukovani NAD (NADH) se regenerie u NAD pomou laktat dehidrogenaze, acetaldehid-dehidrogenaze i alkoholdehidrogenaze. Meutim, u prisustvu kiseonika, sojevi Leuconostoc mesenteroides koriste NADH oksidaze i NADH peroksidaze kao alternativne mehanizme za regeneraciju NAD. Umesto etanola nastaje acetat i duplo vie ATP. Fruktozu fermentiu sve vrste roda Leuconostoc, osim Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i nekih sojeva Leuconostoc argentinum. Ako fruktoza slui kao akceptor vodonika, umesto etanola nastaje manitol. Laktozu fermentiu svi sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Leuconostoc lactis i Leuconostoc argentinum. Kako je fosfoketolaza jedan od kljunih enzima heterofermentativno g puta razgradnje laktoze, pretpostavlja se da po pravilu sve vrste fermentiu pentoze. Pokazalo se, meutim, da su fermentacioni profili arabinoze, riboze i ksiloze razliiti kod razliitih vrsta. Mogue je da su geni koji kodiraju fermentaciju pentoza povezani sa plazmidima. Obrazovanje dekstrana od saharoze zabeleeno je kod sledeih vrsta: Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides i subsp. dextranicum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gelidum i Leuconostoc gasicomitatum. Sposobnost obrazovanja dekstrana se gubi nakon nekoliko presejavanja u podloge sa veom koncentracijom soli. Ova osobina se moe povratiti zasejavanjem u medijum koji sadri sok od paradajza ili pomorande. Od organskih kiselina najee fermentiu limunsku i jabunu. Svi sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i veina mlenih leukonostoka (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum i Leuconostoc lactis) fermentiu citrat u prisustvu fermentabilnih eera. Sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides konvertuju malat u L-laktat i CO2. Citrat se metabolie do acetata i laktata. Na niim pH vrednostima, meutim, od citrata mogu nastati diacetil i acetoin. Svi sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris koriste citrat, dok s druge strane acetat i tartarat ne koriste. Poveana produkcija mirisnih materija zapaa se sa sniavanjem pH i posebno je izraena kod citrat -liaza-pozitivnih sojeva u prisustvu citrata, mada su zabeleene znaajne varijacije u kolii ni produkovanog diacetila meu sojevima Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris. Viak piruvata nastalog tokom ko-metabolizma citrata i glukoze koristi se da bi se reoksidovali koenzimi NADH i NADPH. Zbog toga, acetaldehid se ne redukuje do etanola i acetil-fosfat se konvertuje u acetat i ATP, posredstvom aktivne acetat kinaze. Povean nivo ATP-a doprinosi brem rastu u poreenju sa elijama gajenim na glukozi bez citrata. Osim generisanja vee koliine ATP -a, citrat moe

19

da slui i kao izvor ugljenika za sintezu lipida i verovatno i drugih elijskih komponenata. Malo se zna o produkciji biogenih amina kod leukonostoka. Nije primeeno obrazovanje tiramina kod sojeva vrsta Leuconostoc izolovanih iz sveeg i vakuumpakovanog mesa. Neki sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides produkuju tiramin i triptamin. Odreeni sojevi izolovani iz kiselog testa razgrauju fitinsku kiselinu. U jednoj studiji, Leuconostoc mesenteroides soj 38 poboljao je rastvorljivost Ca2+ i Mg2+ tokom 9h fermentacije fitatom bogatog integralnog peninog brana.

ULOGE U TEHNOLOGIJI
Leukonostok igra vanu ulogu u tehnologiji mlenih proizvoda, koja se prvenstveno ogleda u produkciji gasa i mirisnih jedinjenja. Uprkos tome to je esto u velikoj koliini zastupljen u proizvodu sa ustaljenom, dobro poznatom, populacijom, sve uloge leukonostoka jo uvek nisu razjanjene. Njihova uloga moe se razmatrati i sa aspekta produavanja roka trajanja fermentisanoj hrani putem inhibicije neeljenih bakterija, kao i u novim oblastima funkcionalne hrane.

Uloge u tehnologiji mlenih proizvoda

Formiranje rupa u siru Svim plavim sirevima, a naroito Rokforu, u toku procesa proizvodnje moraju se u jednom trenutku buiti rupe od povrine ka unutranjosti sira, to omoguava kolonizaciju Penicillium roqueforti. Kod mekih zrelih sireva koji su dovoljno vrsti (da se ne spljote primenom blagog pritiska) mogu da se mehaniki bue rupe, a moe da ih pravi leukonostok, koji proizvodei CO2 stvara upljine unutar sira. Kod presovanih zrelih nemakih sireva kao to su Edam i Gauda i ostalih slanih sireva iz salamure postoje sitne i malobrojne rupe unutar sira koje su nastale radom leukonostoka koji stvara CO2, a ne mehanikim putem. U ovom sluaju selektuju se sojevi koji produkuju umerene koliine CO2 da bi se spreila preterana upljikavost. U proizvodnji Rokfor sira, minimalna koncentracija leukonostoka je 10 6 elija/ml mleka. Optimalni rezultati su postignuti sa odabranim sojevima vrste Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, u obliku koncentrovanih elijskih suspenzija. U nekoliko slujeva, populacija leukonostoka prirodno prisutnih u mleku stvara eljene rupe. S druge strane, dodatak leukonostoka je obavezan
20

pasterizovanom mleku i sirovom mleku poveanog mikrobiolokog kvaliteta, koje ima mali sadraj bakterija. Maksimalna koncentracija nastalog CO2 je 16 mmol/kg sira, to odgovara iskorienju 8 mmol/l citrata prisutnog u mleku, pri emu se razlike u aktivnosti javljaju u zavisnosti od vrste i soja. Sojevi koji razgrauju citrat moraju da rstu tokom poetnih faza pravljenja sira (presovanje), iako su uobiajeni uslovi (30oC) nefavorabilni za leukonostoke. Moraju da preive i da nastave metabolizam tokom zrenja sira u odsustvu eera. Meutim, neki sojevi, aktivni na niskim pH gruanca, mogu da postanu neaktivni kada se gruanac ispere vodom pri emu se povea pH. Proizvodnja arome Glavno jedinjenje povezano sa upotrebom leukonostoka u polju mlekarstva je diacetil, acetat i etanol doprinose takoe obrazovanju arome. Nivo diacetila koji daje eljenu aromu je nizak (1.5 do 5 ppm) jer ovek za nju ima nizak prag mirisa. Dovoljan broj elija i posebni fiziko-hemijski uslovi su neophodni za optimalno iskorienje citrata i produkciju arome. Ukoliko je zakonski dozvoljeno, dodatak citrata u mleko ili u vodu za ispiranje od surutke (npr. kada se primenjuje tehnologija za uklanjanje laktoze tada se deo surutke zamenjuje vodom), jer se na ovaj nain ostvaruje intenzivnija aroma proizvoda. Leukonostok moe dalje da transformie diacetil u acetoin i 2,3 -butandiol, koji ne daju aromu. Ova nepoeljna transformacija moe biti umanjena ako se proizvodi, kao to je fermentisano mleko, ohlade nakon nastanka arome. Zreli sirevi se obino uvaju na viim temperaturama (10 13 oC) od onih koje su neophodne da bi se proces zaustavio. Inkorporacija kiseonika u fermentisane mlene proizvode favorizuje produkciju diacetila. Viak acetaldehida, koji moe biti produkovan od strane starter kultura u maslacu i fermentisanom mleku, vodi razvoju defekta zelenog mirisa. U friideru, leukonostok moe da redukuje acetaldehid u etanol, to je u najveoj meri izraeno kod Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris. U siru, nizak pH, povean sadraj soli i mala aktivnost vode, redukuju metabolisanje acetaldehida kod ove vrste.

Ciljano dodavanje leukonostoka kao NSLAB Naknadno dodavanje leukonostoka u poreenju sa ostalim bakterijama koje spadaju u NSLAB, npr. Lactobacillus, testirano je kod razliitih sireva, kod kojih inae nisu normalno prisutni, s obzirom da postoji stvarni interes za ovaj postupak, naroito za floru sirovog, nepasterizovanog mleka.
21

Sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris koji se uobiajeno koriste u proizvodnji maslaca, pavlake ili sveih (mladih) sireva se ne obnavljaju u starijem siru i imaju sasvim mali efekat, ako ga uopte imaju. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ili Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum su eljeni sojevi i broj elija u proizvodu mora da bude najmanje 107 elija/ml mleka. Najvei broj sojeva se slabo ili ba nikako razmnoava u mleku i prvom siru, gruancu, jer njihov rast suzbija Lactococcus. Mleko se takoe moe ostaviti da sazreva sa oko 106 elija/ml, u trajanju od 15 sati na 13 oC, da bi se dostigao ovaj nivo koncentracije bakterija. Kod sira tipa Gauda proizvednog u aseptinim industrijskim uslovima ovaj efekat je ostao nejasan iako je primeeno samnjenje sadraja citrata. Na pilot skali, presovani sirevi koji sadre 108 elija/gramu daju vei pH (5.3 nasuprot 5.1), vei sadraj aminokiselina i deava im se ubrzano zrenje, u poreenju sa kontrolom. Ovaj vei pH nastaje zbog blage inhibicije proizvodnje L-laktata od strane Lactococcus i delimino bi mogao da prui objanjenje za uoeno ubrzano zrenje. Leuconostoc bi zato mogao biti dobar kandidat za suprotstavljanje zakieljavajuim starterima. Ovi rezultati su potvreni eksperimentima u aseptinim uslovima uz pomo mikro-modela dizajniranog specijalno za tipove presovanih, ispranih sireva. Aroma je modifikovana kada je koncentracija elija bila iznad 5 x 106 elija/ml mleka, dok se upljikavost pojavila tek pri koncentracijama izmeu 5 x 106 i 5 x 107 elija/ml, u zavisnosti od upotrebljenog soja a mogue i u zavisnosti od njegovih autolitikih sposobnosti . Tekstura proizvoda posle samo dve nedelje bila je ista kao i tekstura proizvoda ali u odsustvu leukonostoka posle mesec dana - dakle ovim dodavanjem sojeva proces zrenja je ubrzan. Ispostavilo se da soj Leuconostoc 5201 takoe inhibira NSLAB, koji su ukljueni u proizvodnju neprijatne arome kod edar sira. Inhibicija krajnjim proizvodima metabolizma, u kombinaciji sa smanjenim oksido-redukcionim potencijalom koji postoji u siru zajedniki dovodi do inhibicije Lactobacillus plantarum Ras sir proizveden u postrojenju sa dodatkom elija tretiranih toplotnim okom (ili okom smrzavanja), ili samo sa dodatkom elijskog ekstrakta sojeva leukonostoka izolovanih iz prirodne flore francuskog sira, pokazuje smanjenu gorinu. Manego sirevi proizvedeni od pasterizovanog mleka i definisanih startera sa Leuconostoc mesenteroides zadravaju vii kvalitet arome i sveukupno lepe izgledaju nego sirevi pravljeni sa komercijalnim starterima Veoma veliki broj elija u uzorcima sira sa namerno dodatim elijama (108 elija/ml mleka) dovodi do prevelike proizvodnje rupa u siru a tu pojavu prati i pojava tipine nepoeljne krajnje arome.

22

Uloge u funkcionalnoj hrani

Pod funkcionalnom hranom smatra se hrana koja osim uobiajenih hranljivih sastojaka, sadri komponente koje unapreuju zdravlje i spreavaju pojavu bolesti. To podrazumeva dodatak probiotika i produkciju metabolita, koji doprinose poboljanju i ouvanju zdravlja. Leuconostoc kao potencijalni probiotik Leuconostoc nema sposobnost kolonizacije intestinalnog trakta. U skladu sa tim, njegov efekat na domaina e biti mali, osim u sluaju da se uzme u velikim elijskim koncentracijama. U jednoj studiji, meutim, pokazano je da konzumiranje indijskog fermentisanog mlenog proizvoda koji je sadrao 108 g-1 Lactococcus lactis i Leuconostoc mesenteroides skrauje trajanje diareje kod dece za 0.3 dana. Proizvodnja polisaharida Leuconostoc mesenteroides produkuje egzopolisaharide (EPS). EPS Leuconostoc mesenteroides su homopolisaharidi koji se sastoje od -D-glukana. Dekstrani su uglavnom sastavljeni od -1,6 ostataka glukoze, sa varijabilnim stepenom grananjima (specifinim za soj) i alternani sa -1,3 i -1,6 grananjem. Biosinteza je eksterna i zahteva prisustvo saharoze. Enzimi ukljueni u ovaj proces su specifina glikozil-transferaza i dekstran- ili levan-saharaza. Industrijski dekstrani se koriste kao matriksi za gel filtraciju, a u medicini za poveanje zapremine krvi i poboljavaju protok krvi. U tehnologiji mlenih proizvoda, dekstrani, kao i drugi EPS, se koriste kao aditivi, imaju ulogu u poboljanju teksture poveavajui viskoznost, a takoe slue i kao stabilizatori na taj nain to pojaavaju rigidnost kazeinske mree vezivanjem vode i interakcijama sa sastojcima mleka. Kao posledica toga, EPS smanjuju sinerezis i poveavaju stabilnost proizvoda. Osim tehnolokih koristi, odreeni EPS imaju i delotvorne fizioloke efekte na konzumente. Pretpostavlja se da poveana viskoznost hrane koja sadri EPS moe da produi vreme zadravanja fermentisanog mlenog proizvoda u gastrointestinalnom traktu i samim tim omogui kolonizaciju probiotskim bakterijama. -gluko-oligosaharidi koje produkuje Leuconostoc mesenteroides NRRL-B-18242 su visoko rezistentni na dejstvo digestivnih enzima. Smatra se da imaju potencijalni prebiotiki efekat kod novoroenadi, s obzirom da stimuliu rast bakterija crevne flore. Takve oligosaharide bifidobakterije i laktobacili kataboliu, za razliku od Salmonella ili E. coli, koje to ne mogu. pointing toward their effect on intestinal microflora modification
23

Proizvodnja manitola Manitol je nisko-kalorini eer koji moe da zameni saharozu, laktozu, glukozu ili fruktozu i prehrambenim proizvodima. Metabolie se nezavisno od insulina, pa se moe koristiti u proizvodima koji su namenjeni dijabetiarima. Leuconostoc pseudomesenteroides i Leuconostoc mesenteroides poznati su po proizvodnji manitola tokom fermentacije fruktoze. Hidroliza -galaktozida Ljudi i ivotinje ne mogu da metaboliu -galaktozide uobiajeno prisutne u biljkama, kao to su stahioza i rafinoza, usled nedostatka enzima -galaktozidaze u intestinalnoj mukozi, pa dolazi do naduvenosti. U cilju prevazilaenja ovih nedostataka i poveanja konzumacije inae veoma hranljivih namirnica, uinjeni su pokuaji eliminisanja -galaktozida fizikim metodama ili upotrebom galaktozidaza. Uprkos injenici da Leuconostoc ima sposobnost fermentacije galaktozida i predloga da se -galaktozidaza iz Leuconostoc mesenteroides koristi kao biotehnoloki pristup za uklanjanje -galaktozidaza, pokuaji da se ove mogunosti iskoriste nisu uinjeni. Proizvodnja vitamina Sojevi Leuconostoc mesenteroides koji produkuju znaajne koliine menahinona su okarakterisani i bili bi korisni kao starter kulture mlenim (i drugim) fermentisanim proizvodima, ili pak kao dijetetski suplementi za prevenciju bolesti uzrokovanih nedostatkom vitamina K. Dokumentovana je takoe proizvodnja folata od strane sojeva Leuconostoc lactis i Leuconostoc paramesenteroides.

ZAKLJUAK
Poslednjih decenija, nove molekularne alatke, prvenstveno tehnike zasnovane na DNA, znaajno su doprinele razjanjavanju filogenije leukonostoka i identifikovanju novih vrsta. Poznavanje ekologije mikroorganizama u razliitim niama i fermentacije mogu se poboljati zbog pojave molekularne identifikacije, iako biohemijske karakteristike zadravaju najvei znaaj za tehnoloke primene. Paralelno s tim, sekvenciranje genoma i analiza LAB, ukljuujui i Leuconostoc, e omoguiti jedan sloeniji i sveobuhvatniji pristup potencijalu mogunostima upotrebe lrukonostoka. Uzevi u obzir iroku rasprostranjenost Leuconostoc u okruenju, ogroman broj njih koje dnevno unesemo u organizam sa brojnom i raznovrsnom fermentisanom hranom (kao to su mleni proizvodi) i relativno mali broj infekcija koje uzrokuju,
24

moe se rei da ove bakterije imaju veoma malu (ako je uopte i imaju) virulentnost za zdrave ljude. Nijedan zabeleen sluaj infekcije nije direktno povezan sa konzumiranjem fermentisane hrane ili viskokom izloenosti LAB. Proizvodi koji sadre Leuconostoc (kao i Lactobacillus) takoe mogu biti znaajni izvori jona mangana. Tri aspekta metabolizma Leuconostoc treba uzeti u obzir kada je re o dizajnu funkcionalne hrane ili kada je re o iskorienju metabolikih osobenosti u cilju industrijske upotrebe. To su: 1) sposobnost leukonostoka da hidrolizuje -galaktozide kao to je rafinoza iz biljnih proizvoda (povra); 2) sposobnost leukonostoka da sintetie akarbozne analoge koji mogu poboljati glikemini profil i osetljivost na insulin kod pacijenata sa dijabetesom tip2; 3) sposobnost leukonostoka da proizvodi polimere sline inulinu, koji se mogu koristiti kao prebiotici.

25

Reference
Carr F. J., Chill D., Maida N., (2002), The Lactic Acid Bacteria: A Literature Survey. Critical Reviews in Microbiology, 28 (4), 281370 Cogan T. M., Jordan K. N., (1994), Metabolism of Leuconostoc Bacteria. Journal of Dairy Science 77 (9), 2704-2717 De Vos Paul, George M. Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer and William B. Whitman EDS, Volume three, William B. Whitman director of the editorial office Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition, Volume Three, The Firmicutes, Springer Dordrecht Heidelberg London New York, Library of Congress Control Number: 2009933884, 2009, 19841989 Bergeys Manual Trust Hemme D., Foucaud-Scheunemann C., (2004). Leuconostoc, characteristics, use in dairy technology and prospects in functional foods. International Dairy Journal, 14, 467494 Stiles M. E., (1994). Bacterloclns Produced by Leuconostoc Species. Journal of Dairy Science, 77 (9), 2718-2724 Vedamuthu E. R., (1994). The Dairy Leuconostoc: Use in Dairy Products. Journal of Dairy Science, 77 (9), 2725-2737

26