Univerza v Mariboru Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Maja Habulin, Mateja Primoi

Biokemijska tehnika Navodila za laboratorijske vaje (zbrano gradivo)

Recenzent: izr. prof. dr. Mojca kerget

Maribor, 2008

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

Navodila za delo v mikrobiolokem laboratoriju

1. V laboratorij vstopamo v zaitnih haljah. Pri delu uporabljamo zaitne rokavice. 2. V laboratoriju ne jemo in ne pijemo!!! Ker se lahko inficiramo skozi usta, nos, oi in koo, pri delu ne dajemo niesar v usta (svinnik, peresa, steklovina itd.). 3. Z ivimi mikrobi delamo previdno in aseptino ob plamenu plinskega gorilnika. 4. Pri delu z gorilnikom pazimo, da nam plamen ne oge koe, las ali halje. 5. Med delom z mikrobi in kunino so vrata in okna zaprta, da zrani tok ne nosi mikrobov po laboratoriju.

6. Pri delu pazimo, da mikrobnih kultur ne polivamo po mizi, po tleh in obleki. Z rokami se ne dotikamo kolonij in suspenzij ivih mikrobov. e pride kunina v stik s koo ali delavno povrino, obvestimo asistenta ali tehninega sodelavca. Kontaminirano delovno povrino pokrijemo s stanievino in jo prelijemo z razkuilom. Razkuilo pustimo delovati najmanj 20 minut. Kontaminirano mesto na telesu ali obleki razkuimo in nato speremo z vodo. 7. Kontaminiran material odlagamo v odlagalnike ali na oznaeno mesto in ga nato avtoklaviramo.

8. Kovinske predmete, ki pridejo v stik s kunino (pincete, bakterioloke zanke itd.) sproti oigamo v plamenu. Oigamo tudi vratove epruvet, erlenmajeric in steklenic z mikrobi, preden jih odpremo in po uporabi. 9. Po opravljenem delu pospravimo za seboj in razkuimo delovne povrine. Prepriamo se, da so dovodi plina do gorilnikov zaprti. 10. Pred in po zaetku izvajanja vaj si skrbno umijemo roke z milom. e je potrebno roke tudi razkuimo.

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

Aseptino delo in osnove mikrobioloke tehnike

Aseptino delo Delo v mikrobiolokem laboratoriju zahteva aseptino tehniko. Vse mikrobioloke preiskave, od odvzema vzorca in do konne identifikacije mikrobov, morajo biti opravljene aseptino. To pomeni, da s kunino ali kulturami mikroorganizmov delamo tako, da; 1. onemogoimo dostop nezaelenim mikroorganizmom, ki bi kontaminirali nae kulture in zaradi katerih bi bili rezultati poskusov napani; 2. pazimo, da mikroorganizmov ne razirjamo, kajti utegnili bi inficirati sebe ali druge.

Za aseptino delo je nujno, da so steklovina, predmeti in pripomoki za delo ter gojia za gojenje mikroorganizmov sterilni. Le pri aseptini tehniki bodo rezultati preiskav pravilni, zato je pomembno, da delamo ob plamenu plinskega gorilnika, cepilno zanko in steklovino med delom oigamo in da delovno povrino redno istimo z razkuili. Tudi ob skrbnem upotevanju pravil aseptinega dela je mono, da pride do kontaminacije okolice ali kulture s katero delamo.

Osnove mikrobioloke tehnike Mikrobiologijo delimo na razlina podroja (npr. klinina mikrobiologija z odkrivanjem in identifikacijo povzroiteljev bolezni, sanitarna mikrobiologija z nadzorom vode in ivil itd.). Glede na podroja, s katerimi se ukvarjajo, v razlinih mikrobiolokih laboratorijih uporabljajo razline tehnike. Nekatere tehnike so osnovne in jih mora obvladati vsak laboratorij. Med osnovne mikrobioloke tehnike pritevamo:

- gojenje bakterij Bakterije najlaje prouujemo, e jih znamo gojiti v laboratorijskih razmerah. Obiajno rastejo na trdnih ali v tekoih gojiih. Na svea gojia kulture precepljamo s cepilno zanko, lahko pa tudi z vatenko ali s pipeto. Za dobro rast moramo mikroorganizmom zagotoviti primerna hranila za rast in primerne razmere (ustrezen pH okolja, ustrezna temperatura za rast, pravilna aeracija itd.).

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika - mikroskopijo Morfoloke znailnosti mikroorganizmov lahko opazujemo le z razlinimi mikroskopskimi tehnikami. Mikroskop uporabljamo tudi za kvantifikacijo populacij ali za preverjanje monih kontaminacij.

- identifikacijo Uvranje seva v vrsto, rod ali v iro skupino je pomembno, saj na ta nain lahko predvidimo nekatere njegove lastnosti.

- sterilizacijo Sterilizacija je postopek, s katerim uniimo ali odstranimo vse ive mikroorganizme. Metode in sredstva za sterilizacijo in dezinfekcijo:

1. Fizikalne metode a) sterilizacija s toploto - s suho toploto (Steriliziramo laboratorijsko steklovino v sterilizatorjih. Postopek traja dalj asa, poteka pri viji temperaturi in je manj uinkovit od sterilizacije z vlano toploto).

- z vlano toploto

(Uporabimo avtoklav, kjer z vodno paro pod tlakom pri 121 C (15 minut) uniimo vse ive celice in spore.)

- tindalizacija

(To metodo (30 minut od 80 100 C, 3 dni zapored) uporabljamo za sterilizacijo snovi, ki bi jih vija temperatura uniila ali inaktivirala.)

b) sterilizacija z obsevanjem - z ultravijolinimi arki - z ionizirajoimi arki (To sevanje se uporablja za sterilizacijo prostorov in laminarjev). (Sterilizacija z gama arki se uporablja v komercialne namene npr. za sterilizacijo toplotno obutljivih predmetov, vejih koliin plastinih izdelkov ali hrane.)

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika c) sterilizacija s filtracijo S filtracijo steriliziramo pline ali temperaturno obutljive tekoine tako, da mikroorganizme odstranimo. Snov prehaja skozi filter, ki zadri delce doloene velikosti. ) sterilizacija s plini Pline uporabljamo za sterilizacijo prostorov in materiala, ki ga ne moremo sterilizirati na drugaen nain. Najpogosteje se uporabljata etilen oksid in pare formaldehida (al sta zdravju kodljiva). Vse pogosteje se uporablja vodikov peroksid, ki je manj toksien. 2. Kemina sredstva Pri uporabi kemijskih bakteriocidnih sredstev moramo vedeti, da univerzalnega bakteriocidnega sredstva ne poznamo, zato moramo vedno izbrati najprimernejega. e elimo, da bo razkuevaje uspeno, moramo upotevati antimikrobni spekter, optimalno koncentracijo, temperaturo in as delovanja dezinficiensa (po navodilih proizvajalca) ter okolje, v katerem se mikrobi nahajajo. Za razkuevanje povrin in prostorov uporabljamo dezinfekcijska sredstva, za razkuevanje tkiv pa antiseptike. Kemina sredstva lahko delujejo na mikroorganizme bakteriocidno (ubijajo), bakteriostatino (inhibirajo rast) ali bakteriolitino (ubijajo celice z lizo). Kemina sredstva delujejo na vegetativne celice, le redka tudi na spore.

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 1: Dokaz sterilnega dela in izolacija bakterij z razlinih povrin

Dokaz sterilnega dela

Material: tri sterilne epruvete epruveta s hranilno juho infuzijska steklenika z vodo ploa hranilnega agarja pipete (1 ml in 0,1 ml)

Potek vaje: V tri epruvete odpipetirajte 0,9 ml hranilne juhe. Sterilno vodo redite v pripravljeni hranilni juhi tako, da v prvo epruveto odpipetirajte 0,1

ml vode, nato z novo pipeto prenesite 0,1 ml iz prve epruvete v drugo ter ponovno z novo pipeto 0,1 ml iz druge epruvete v tretjo. Z novo pipeto meanico vedno najprej pomeate tako, da tekoino najprej potegnete v pipeto in jo nato izpustite iz nje. To ponovite trikrat. Iz zadnje epruvete cepite s cepilno zanko na ploo hranilnega agarja. Vse tri epruvete in ploo inkubirajte na 37 C dva dni.

Opomba: Ploe hranilega agarja so vedno, razen pri pregledovanju, obrnjene z gojiem navzgor.

Rezultati in diskusija: Opiite namen vaje, shematsko prikaite nain priprave razredin ter cepljenja vzorca na ploo hranilnega agarja. Opiite bakterijsko rast v posamezni epruveti in na ploi. Kaj pomeni rast bakterij v posamezni epruveti oz. na ploi?

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Izolacija bakterij z razlinih povrin Material: sterilne vatenke majhna epruveta s fizioloko raztopino ploa hranilnega agarja

Potek vaje: Vatenko namoite v fizioloko raztopino. S tako pripravljeno vatenko naredite bris izbrane povrine (tla, grlo, nos, delovna Kunino razmaite po delu ploe hranilnega agarja. S cepilno zanko naredite nato nekaj

povrina itd.). pravokotnih potez ez prvi premaz, nato nadaljujte v isti smeri cepljenja, ne da bi se dotikali prvega premaza (Slika 1.). Ploo oznaite in inkubirajte do dva dni na 37 C.

Slika 1: Razmaz brisa na ploi hranilnega agarja. Rezultati in diskusija: Opiite namen vaje, zapiite mesto odvzema vzorca in shematsko ponazorite tipe kolonij, ki so se razmnoili na pripadajoi ploi hranilnega agarja. Ali se bakterije iz razlinih vzorcev med seboj razlikujejo? Diskusija.

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

Izolacija iste kulture

Vzorci obiajno vsebujejo veliko razlinih vrst mikroorganizmov in vsak od njih ima doloene fizioloke in morfoloke lastnosti. Le z osamitvijo vsake bakterijske vrste posebej v isti kulturi je mogoe posamezne vrste preuevati in jih okarakterizirati. Tudi za spoznavo e znanih vrst je praviloma potrebna ista kultura. Bakterijsko vrsto, ki jo prouujemo, vselej najprej gojimo v isti kulturi. V isti kulturi je samo ena vrsta bakterije in zato so lastnosti kulture lastnosti te bakterijske vrste. Govorimo o izolaciji ali osamitvi bakterije. V meani kulturi je ve kot ena vrsta bakterij. V taknih kulturah doloeno lastnost ni mogoe pripisati samo eni od vrst bakterij v kulturi. Iz meane kulture izoliramo bakterije po ve metodah. Tako dobimo posamezne bakterijske kolonije iste vrste v isti kulturi, saj je le na ta nain mogoe preuevati vsako vrsto bakterijeske kulture posebej.

istost kulture in izolacija iste kulture

Vsaki kulturi je potrebno preveriti njeno istost. istost tekoe kulture je mogoe preveriti pod mikroskopom. Obiajno preparat iste kulture vsebuje le celice iste oblike, izjemoma pa so lahko bakterijske kulture pleomorfne (vsebujejo celice razlinih oblik). Problem lahko predstavljajo tudi razline bakterije, ki imajo podobno obliko in jih je zato pod mikroskopom teko med seboj loiti. V takem primeru je potrebno tekoo kulturo cepiti na ploo hranilnega agarja. Na taknem gojiu se bo vsaka bakterijska celica namnoila in nastala bo kolonija, ki jo lahko v veini primerov dobro razloimo tudi s prostim oesom. V kolikor se na ploah pojavi le ena vrsta kolonij, lahko sklepamo, da je kultura ista. Kolonije razlinih vrst mikroorganizmov se med seboj loijo po izgledu (Slika 2.). Loijo se glede na: barvo (prozorne, bele, v rumenih do rdeih tonih, vijoliaste, fluoroscenne ...); povrino (gladka, mokra, suha, nagubana, razbrazdana ...); velikost (premer manji od 1 mm, 1 mm ... ); preni prerez (ploska, dvignjena, konveksna, umbicilarna ...); obliko (okrogle, nepravilne, filamentozne, rizoidne ...); rob (gladek, valovit, korenast, s poglobitvami, naagan, arkast (nitast) ...);

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika ustroj (krhke, trde, mazave, sluzne ...).

istost kulture lahko preverimo le, e je ploa dobro cepljena (kolone morajo biti dovolj narazen, da lahko zrastejo do za vrsto znailne velikosti in razvijejo druge znailnosti). Tak nain cepljenja imenujemo cepljenje do posameznih kolonij.

Slika 2: Oblike in profili mikrobiolokih kultur.

Zaeleno vrsto mikororganizmov lahko iz izhodnega materiala izoliramo na ve nainov: z direktno metodo (Material suspendiramo in primerno reimo ter nato pod mikroskopom prenesemo eno samo celico v svee gojie (Primerna metoda za delo s kvasovkami.)). z inidrektno metodo (Maano kulturo najprej cepimo na gojie do posameznih kolonij (Slika 3.). Na ploi z meano kulturo izberemo kolonijo bakterije, ki jo elimo izolirati v isti kulturi, ter jo s cepilno zanko precepimo na sveo ploo. Pri izolaciji iste kulture je ponavadi potrebnih ve zaporednih precepljanj). Bakterijske kulture lahko shranjujemo na ve nainov: s precepljanjem na ploah ali poevnih gojiih,

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika z zamrzovanjem ( 20 C, 70 C, v tekoem duiku pri 196 C z dodajanjem zaitnih sredstev, ki prepreujejo nastanek kristalov v celici), s suenjem (na sterilnem filter papirju, v elatini, na granulah silikagela), z liofilizacijo (suspenzijo mikroorganizmov hitro zamrznemo pri temperaturi 54 C do 72 C in v vakuumu odstranimo vodo).

Slika 3: Izolacija iste kulture s cepilno zanko.

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 2: Izolacija iste kulture

Material: ploa z meano kulturo svea ploa hranilnega agarja

Potek vaje: Iz trdega gojia z meano kulturo izberite eno izmed kolonij in jo izolirajte v isti kulturi z redkim cepljenjem na sveo ploo do posameznih kolonij. Rezultati in diskusija: Opiite namen vaje ter nariite poraslo kulturo na svoji ploi. Koliko tipov kolonij opazite? Ali je kultura ista? Kaj je potrebno storiti v primeru, da kultura e zmeraj ni ista? Diskusija.

10

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

Gojenje bakterij in ugotavjanje velikosti mikrobnih populacij

Gojenje bakterij Rast bakterij pomeni rast in poveevanje tevila celic. Za gojitev bakterij potrebujemo: primerna gojia (potrebno je zagotoviti hranila in vir energije), ustrezen pH okolja, inkubacijo pri ustrezni temperaturi in pravilno aeracijo.

Hranila Koliina in kvaliteta hranilnih snovi imata kljuen pomen za hitrost celine rasti in s tem za rast mikroorganizmov. S hranljivimi snovmi bogato in po sestavi pestro okolje omogoa uinkovitejo energetsko presnovo in biosintezo celinih sestavin torej uinkovito celino in populacijsko rast. Kljune molekule rastnih potreb (t.i. hranila) so: C, N, O, P, S. Te celica akumulira v elementarni obliki ali v molekularnih agregatih. Izvor C: Pri avtotrofih je to CO2, pri heterotrofih pa organske molekule, pri emer so tevilne bakterije usposobljene izdelovati svoje organske molekule iz zelo tevilnih in razlinih virov ogljika. Npr. sevi vrste Pseudomonas, ki so znailni talni organizmi lahko rastejo na ogljikovodikih, tevilnih sladkorjih, maobah, polisaharidih in dr. Izvor N: Znailna bakterijska celica je sestavljena v 15 % iz duika (v beljakovinah, nukleinskih kislinah, celini steni). Veina bakterij sprejema ali amino skupine ali amoniak ali nitrat. Nekatere bakterije pa lahko celo fiksirajo atmosferski duik in tvorijo amoniak. Izvor P: V glavnem je na voljo kot fosfatni ion ali pa kot organsko vezan fosfor (npr. v nukleinskih kislinah). Kadar ga primanjkuje je fosfor omejevalec rasti (zato ga celice pogosto skladiijo). Izvor S: veplo je potrebno za sestavljanje aminokislin in za nekatere vitamine. Je na voljo kot sulfat (SO4--) ali sulfid (S--).

11

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Mikronutrienti: K, Mg, Ca, Fe so potrebni v majhnih a pomembnih koliinah in so udeleeni kot kofaktorji v tevilnih encimih in celinih strukturah. Prvine v sledovih: Co, Zn, Mo, Cu, Mn, Ni, W, Se so potrebne za manje tevilo encimov.

Vir energije Bakterijske vrste se razlikujejo glede na izrabo virov energije. Organotrofi pridobivajo energijo iz organske snovi, litotrofi uspejo za energetske potrebe izkoriati neorganske molekule, obojim pa pravimo, da so kemotrofni mikroorganizmi. Le-ti se bistveno razlikujejo od mikroorganizmov, ki so sposobni za svoje energetske potrebe porabljati svetlobo in jim pravimo fototrofni mikroorganizmi.

Pogoji za rast mikroorganizmov Mikroorganizmi potrebujejo za rast, enako kot vsi organizmi, doloene pogoje. Te pogoje lahko delimo v dve skupini: 1. fizikalni pogoji temperatura (Bakterije gojimo pri temperaturi, pri kateri je njihova rast optimalna. Glede na viino optimalne temperature delimo mikroorganizme v tri skupine: psihrofilni mikroorganizmi, ki rastejo pri nizkih temperaturah od 15 C do + 20 C; mezofilni mikroorganizmi imajo optimalno temperaturo rasti med + 25 C in + 40 C in termofilni mikroorganizmi pa imajo optimalno temperaturo med + 50 C in + 60 C.) kislost okolja (Veina bakterij ivi v obmoju pH, ki je blizu nevtralnemu med pH 6,5 in pH 7,5. Druge so prilagojene na bolj ekstremne vrednosti: acidofili rastejo pri pH 4 pa vse do pH 1, alkalofili pa pri vrednosti pH 9 do 10.)

osmotski pritisk

2. -

kemijski pogoji vodna aktivnost (Voda je nujno potrebna za rast mikroorganizmov. Razen tega, da deluje kot topilo, slui kot vir kisika in vodika ter kot zaita pred temperaturnimi spremembami. Koliino vode, ki jo bakterije lahko izrabljajo, izraamo kot vodno aktivnost (aw). Optimalna vrednost vodne aktivnosti za veino vrst bakterij je nad 0,99.

12

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Nekatere halofilne bakterije rastejo le pri viji koncentracijah NaCl, ki zniajo vodno aktivnost na 0,88. hranila (Kljuna hranila za rast mikroorganizmov so: C, N, O, P, S ter mikronutrienti.) kisik in drugi plini (Atmosfera, v kateri gojimo bakterije, je vir konnih akceptorjev elektronov (O2), vir substratov za oksidacijo (H2, CH4, CO) in vir duika ter CO2. Nekatere bakterije rastejo le v atmosferi z ve CO2 (kapnofilne bakterije). Organizme, ki uporabljajo molekularni kisik, imenujemo aerobni organizmi. Obligatno aerobni so tisti, ki zaivljenje nujno potrebujejo kisik. Organizme, ki sicer potrebujejo kisik, vendar lahko rastejo tudi, e kisik ni prisoten imenujemo fakultativno aerobni organizmi. Obligatno anaerobni so tisti mikroorganizmi, ki niso sposobni uporabiti molekularnega kisika za reakcijo pridobivanja energije. Ti mikroorganizmi pretvarjajo kisik v H2O2, ki lahko pokoduje celice).

rastni faktorji (Organski rastni faktorji (aminokisline, purini, pirimidini, vitamini itd.) so esencialne organske snovi, ki jih organizem sam ne more sintetizirati. Dobiti jih mora iz okolja).

Hranilne podlage ali gojia Hranilne podlage so hranilne snovi, pripravljene za gojenje mikroorganizmov v laboratorijskih razmerah. Kot gojia bi lahko oznaili vse snovi, na ali v katerih lahko rastejo mikroorganizmi. Gojia, ki se uporabljajo v mikrobiologiji, so tevilna in raznolika, saj so prilagojena potrebam mikroorganizmov in nainu uporabe (izolacija, vzdrevanje, namnoevanje in karakterizacija kulture). Gojia so vodne raztopine snovi, ki jih doloena bakterija potrebuje za rast. Glede na sestavo jih delimo na kompleksna (ne poznamo njihove natanne kemijske sestave) in definirana (vsebujejo tono doloene koncentracije istih kemikalij in se uporabljao pri tudiju mikrobnega metabolizma npr. Chujevo gojie).

13

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

Ugotavljanje velikosti mikrobnih populacij

Poznamo ve nainov za doloanje tevila mikrobnih celic. Pri nekaterih metodah merimo tevilo ivih celic, pri drugih pa teo celotne populacije, ki je neposrdno sorazmerna s tevilom celic. tevilo celic obiajno izraamo kot tevilo celic v 1 ml tekoega vzorca ali v 1 g ivila. Veina metod tetja temelji na neposrednem ali posrednem tetju majhnih vzorcev. Velikost celotne bakterijske populacije se nato izrauna. 1. Indirektne ali gojitvene metode a) tetje na trdnih gojiih je najpogosteje uporabljena metoda tetja celic. Ta metoda se uporablja predvsem za ugotavljanje tevila mikroorganizmov v tekoinah (voda, mleko, itd.) in v materialih, ki jih je mogoe suspendirati v tekoini. Pri tej metodi tejemo ive celice. V preiskovanem materialu je navadno preve bakterij, da bi jih lahko teli in je zato treba material ali kulturo najprej rediti ter primerne razredine cepiti na ploe hranilnega agarja. Gojitveni pogoji (temperatura, as inkubacije ter uporabljena gojia) so odvisni od bakterij, na katere se material preiskuje. Po 24 48-urni inkubaciji pri doloeni temperaturi (najpogosteje pri 30 C ali 37 C) kolonije pretejemo. Obiajno tejemo na ploah, ki imajo od 25 do 300 kolonij. tevilo kolonij, ki zrastejo na ploi hranilnega agarja ni zmeraj enako tevilu bakterij v kulturi. Zato pravimo, da na ploi pretejemo enote, ki tvorijo kolonije (colony forming units, CFU). Primer ugotavljanja tevila bakterij s tetjem na ploah: Iz vsake od treh epruvet z razredinami 107,108 in 109 smo cepili po 1 ml na vsako od treh plo. Po inkubaciji smo preteli naslednje tevilo kolonij: konna redenja na ploah 107 108 109

tevilo kolonij 201, 187, 223 17, 25, 19 3, 2, 1 = 678

14

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Izraun povprenega tevila kolonij: 1. nain: Potrebno je izraunati povpreje za vsako razredino posebej in nato e povpreje vseh razredin. kolonij 620 = = 206,66 10 7 ml paralelk 3 kolonij 61 = = 20,33 10 8 = 203,33 10 7 ml paralelk 3 kolonij 6 = = 2 10 9 = 200 10 7 ml paralelk 3

Za razredino 107: Za razredino 108: Za razredino 109:

vseh pop. posamezne razred. 206,66 10 7 + 203,33 10 7 + 200 10 7 = = 203,32 10 7 ml t. razred. 3 2. nain: e predpostavimo, da so vsa redenja enakovredna, lahko dodamo tevilu pretetih kolonij drugega redenja eno nilo, tevilu kolonij tretjega pa dve nili. Dobljeno vsoto vseh kolonij delimo s tevilom meritev in dobimo povpreno tevilo kolonij. Za razredino 107: 201, 187, 223 Za razredino 108: 170, 250, 190 Za razredino 109: 300, 200, 100

vseh kolonij (201 + 187 + 223) 10 7 + (170 + 250 + 190 ) 10 7 + (300 + 200 + 100 ) 10 7 = = vseh paralelk 9
vseh kolonij = 192,33 10 7 ml vseh paralelk 3. nain: e predpostavimo, da vsa redenja niso enakovredna, saj se napaka z vsakim vijim redenjem vea, pa lahko tevilo CFU ugotavljamo tudi tako, da najbolj razredenemu vzorcu pripiemo najvejo teo. Seteti je potrebno vse kolonije, ki smo jih preteli na ploah agarja in vsoto deliti s tevilom, ki je odvisno od tevila razreditev in tevila paralelk npr. tri 15

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika razline razredine s po dvema paralelkama; N=222 oz. za na primer; tri redenja, vsako s tremi paralelkami N=333.
vseh kolonij 678 = 10 9 = 203,6 10 7 ml N 333

b) Metoda najverjetnejega tevila (Most probable number (MPN)) Ta metoda temelji na opazovanju rasti mikroorganizmov (kot motnosti) in opazovanju metabolne dejavnosti mikroorganizmov (preko indikatorjev v tekoih gojiih). To je metoda, pri kateri kulturo ali preiskovani vzorec cepimo v serijo tekoih goji in glede na tevilo goji, v katerih ugotovimo bakterijsko rast z verjetnostnim raunom, ugotavljamo pribliek za tevilo bakterij v vzorcu. Ta metoda se rutinsko uporablja pri ugotavljanju tevila koliformnih bakterij v vodi.

2. Direktne ali tevne metode Pri teh metodah tejemo bakterijske celice v vzorcu, kar lahko delamo na mikroskopskih preparatih ali s posebnimi napravami (npr. Coulterjev tevec delcev). Za takno tetje uporabljamo objektne ploice s tevnimi komorami. Na oznaen kvadrat razmaemo vzorec in ga pokrijemo s krovnim stekelcem. S pomojo mikroskopa pretejemo tevilo bakterij v kvadratih in izraunamo popreno tevilo mikroorganizmov v vzorcu. 3. Fizikalne in kemijske metode - Turbidimetrija merjenje motnosti suspenzije optina gostota (optical density, OD) s spektrofotometrom. Doloena optina gostota ustreza doloeni gostoti celic in zato se lahko optina gostota odita z umeritvene krivulje kot tevilo bakterij na ml. - Ugotavljanje suhe ali mokre tee bakterij. - Ugotavljanje skupnega duika. - Membranska filtracija se uporablja za tetje bakterij v bistrih tekoih vzorcih (vodovodna voda, bistri sokovi, vino itd.) ter za tetje koliformnih bakterij, ki so kazalci fekalnih okub ivil in vode.

16

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Ohranjanje mikroorganizemskih kultur Loimo dva naina gojenja mikroorganizmov: povrinski nain, kjer se mikroorganizmi razvijejo na povrini hranilnih podlag,

- submerzijski nain, kjer se mikroorganizmi razvijejo potopljni v tekoih hranilnih

podlagah. Tako gojenje je lahko kontinuirano (v podlago neprekinjeno dotekajo svee hranilne snovi in se odstranjujejo metabolni produkti).

Kulture, ki so se razvile na hranilnih podlagah, hranimo v temnih in hladnih prostorih (v hladilniku). Pri diskontinuiranem gojenje mikroorganizmov oz. gojenju mikroorganozmov na podlagi, mikroorganizmom med njihovo rastjo ne dodajamo hranilne snovi in ne odstranjujemo metabolnih produktov mikroorganizmov. V takih razmerah so zato mikroorganizmi odvisni samo od doloene koliine hranilne snovi. Da bi prepreili izroditev ali celo izumiranje kulture, je le to potrebno precepiti na svee podlage. Pogostost precepljanja je odvisna od obutljivosti kulture (enkrat na teden, enkrat na mesec ...). iste kuture lahko ohranjamo tudi v obliki trajnih kultur, ki se lahko ohranijo pri ivljenju tudi po ve let. Trajne kulture lahko pripravimo na ve nainov: z zmrzovanjem (iste kulture hitro zmrznemo pri temperaturi od 50 C do 95 C v ustrezni raztopini sladkorjev ali krioprotektorjev, z liofilizacijo (suspenzijo mikroorganizmov hitro zmrznemo pri temperaturi od 50 C do 72 C in z vakuumom odstranimo vodo, z dehidracijo, kulturo lahko hranimo tudi na sterilnem pesku ali glini.

17

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 3: Priprava hranilnih medijev za gojenje bakterij in gliv

Trdi medij za gojenje bakterij (mesni medij)

5 g mesnega peptona 3 g mesnega ekstrakta 0,5 g NaCl 5 g D-(+)-glukoze 18 g agarja 1 l navadne vode

Vse sestavine zatehtamo v 1000 ml buko in dolijemo 1 l navadne vode. Buko z raztopino potopimo v vrelo vodno kopel ter jo ob intenzivnem meanju segrevamo dokler v raztopini ni ve opaziti delcev.

Tekoi medij za gojenje bakterij (mesni medij) 5 g mesnega peptona 3 g mesnega ekstrakta 0,5 g NaCl 5 g D-(+)-glukoze 1 l navadne vode

Vse sestavine zatehtamo v 1000 ml buko in dolijemo 1 l navadne vode. Buko z raztopino potopimo v vrelo vodno kopel ter jo ob intenzivnem meanju segrevamo dokler raztopina ne postane popolnoma bistra.

18

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Krompirjev agar za glive

39 g krompirjevega dekstroznega agarja (PDA)

Agar zatehtamo v 1000 ml buko in dolijemo 1 l navadne vode. Buko z raztopino potopimo v vrelo vodno kopel ter jo ob intenzivnem meanju segrevamo dokler v raztopini ni ve opaziti delcev.

19

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 4: Ugotavljanje tevila bakterij s tetjem na ploah

Material: bakterijska kultura na poevnem gojiu sterilne petrijevke sterilna raztopina hranilnega agarja epruvete s sterilno fizioloko raztopino (0,9 % NaCl)

Potek vaje: V 1. epruveto dodajte 1 ml fizioloke raztopine NaCl v katero smo predhodno inokulirali

bakterijsko kulturo. Z novo pipeto suspenzijo premeajte in prenesite v naslednjo epruveto 1 ml. Postopek ponovite e 6-krat in vsaki zamenjajte pipeto. 1 ml iz vsake redene kulture iz zadnjih treh epruvet odpipetirajte v sterilno petrijevko ter

prelijte s hranilnim agarjem, katerega temperatura ne sme presegati 60 C. Petrijevko pazljivo pretresite, da se razredina kulture enakomerno porazdeli po petrijevki. Na ploi oznaite konno redenje! Inkubirajte pri doloeni temperaturi dva dni. Rezultati in diskusija: Opiite namen vaje, pretejte kolonije v posameznih razredinah ter izraunajte velikost bakterijske populacije. Diskusija.

20

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 5: Ohranitev mikroorganizemskih kultur

Material: bakterijska kultura na poevnem gojiu sterilno poevno gojie za bakterije

Potek vaje: V desno roko primemo epruveto z bakerijsko kulturo zraslo na poevnem gojiu in epruveto s sterilnim poevnim gojiem za bakterije. Obema epruvetama smo predhodno preareli vratove na plinskem gorilniku, da prepreimo monost kontaminacije. Z desno roko odstranimo pokrove epruvet in s prearjeno ezo, ki smo jo ohladili na zraku, potegnemo narahlo po gojiu z zraslo kulturo. Ezo s kulturo prenesemo v svee poevno gojie in jo cepimo na povrino sveega gojia. Po konanem precepljanju epruveti z gojii zapremo s pokrovi in jima ponovno Gojie s svee precepljeno kulturo inkubiramo pri temperaturi 28 C 2-3 dni. Kulturo po

prearimo vratove. Prav tako prearimo e ezo. konani inkubaciji shranimo v hladilnik.

Rezultati in diskusija: Opiite namen vaje ter opaanja.

21

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

Ocena uinkovitosti antiseptikov in razkuil

Protimikrobna sredstva lahko v grobem delimo na fizikalna (temperatura, sevanja) in kemijska (razkuila, antiseptiki, antibiotiki). Kot antiseptike in razkuila uporabljamo razline snovi, ki bakterije uniujejo delujejo nanje baktericidno ali pa zavirajo bakterijsko rast delujejo bakteristatino. V mikrobiolokem laboratoriju uporabljamo razkuila (dezinficiense) za ubijanje mikrobov na povrinah, opremi, priboru in steklovini ter antiseptike za razkuevaje rok.

Nekatera pogosteje uporabljena razkuila so: klorovi preparati na mikrobe delujejo baktericidno, ker so moni oksidanti. Primerni so za laboratorijske povrine, manj pa za koo, ker jo mono izsuijo. fenol je organski dezinficiens in se uporablja za standard, s katerim se primerja mo razkuil (fenolovo tevilo pove, za kolikokrat je razkuilo uinkoviteje od 1-odstotne raztopine fenola). Mo dezinficiensov je mogoe ugotavljati tudi z drugimi metodami. formaldehid v plinskem stanju se uporablja za dezinfekcijo prostorov, kot formalin (5 % vodna raztopina formaldehida) pa kot teko dezinficiens. Pogosto ga dodajajo v kombinirane dezinficiense. kisline zaradi disociacije kisline zniajo pH in razkrajajo beljakovine. Za dezinfekcijo se uporabljajo peroksiocetna kislina, ki deluje oksidativno, redkeje pa tudi solna in veplena kislina. lugi hidrolizirajo beljakovine in ogljikove hidrate. Od monejih lugov se uporablja predvsem NaOH pri izbruhih posebno nevarnih infekcij. alkoholi za razkuevanje rok se uporablja etanol (70 %) in propanol (6070 %). V kozarec z etanolom odlagamo tudi pincete in karje, kadar pripravljamo razmaze ali cepimo kunino na gojia. kalijev permanganat uporabljamo kot dezinficiens predvsem pri prvi pomoi za razkuevanje koe in ran. Deluje kot oksidant. vodikov peroksid se uporablja za razkuevanje koe in ran. Deluje kot oksidant. jodovi preparati najpogosteje se uporablja jodova tinktura za razkuevanje koe, operacijskih povrin in ran.

22

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika detergenti kationske detergente, predvsem kvarterne amonijeve baze uporabljamo za razkuevanje rok v laboratoriju. Sicer pa detergente uporabljamo bolj za ienje kot za dezinfekcijo. drugi dezinficiensi sem pritevamo soli tekih kovin (npr. ivega srebra), ki prav tako delujejo dezinfekcijsko. Pri izbiri protimikrobnega sredstva moramo upotevati razline dejavnike, kot so pH, topnost, toksinost, uinkovitost (unievaje vegetativnih celic, unievanje spor), vpliv na organske materiale, korozivnost, itd. Kadar uporabljamo doloeno protimikrobno sredstvo, je potrebno uporabiti najvijo koncentracijo, ki e ni kodljiva in le tega pri dolgotrajni uporabi po doloenem asu uporabe zamenjati z drugim sredstvom. Uinkovitost protimikrobnih sredstev lahko ugotavljamo na razline naine. Difuzijska metoda je podobna antibiogramu. Razkuila nanesemo na sterilne diske ali v posebne kovinske nastavke in jih nato poloimo na ploo s kulturo. Po konani inkubaciji merimo cone inhibicije. Test z nosilcem se uporablja za doloanje uinkovitosti razkuil za razkuevanje predmetov. Kontaminirani predmet izpostavimo razkuilu razlinih koncentracij za dalji asovni interval (od 2 do 20 minut). Za ugotavljanje uinkovitosti kemikalij na osnovi fenola se uporablja fenolni koeficient, kjer se primerja delovanje fenola in testirane kemikalije na doloeni testni organizem.

23

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 6: Inhibicija rasti mikroorganizmov

Material: glivina kultura epruvete s sterilno fizioloko raztopino NaCl (1 x 9 ml in 2 x 10 ml) inhibitor rasti 9 petrijevke sterilni agar za gojenje gliv

Potek vaje: V sterilne petrijevke prelijemo po 19 ml sterilnega agarja za gojenje gliv, ki smo ga predhodno segreli utekoinili ter ga enakomerno porazdelimo. Petrijevke z agarjem postavimo v hladilnik za 30 minut, da se agar ponovno strdi. V epruveto z 10 ml sterilne fizioloke raztopine NaCl inokuliramo glivino kulturo. V

drugo epruveto z 9 ml sterilne fizioloke raztopine prav tako cepimo glivino kulturo. Po inokulaciji dodamo v epruveto e 1 ml raztopine inhibitorja rasti. V strjen agar naredimo luknjo premera 10 mm, v katero nato odpipetiramo po 100 l v prve tri petrijevke raztopino glivine kulture, v druge tri petrijevke raztopino glivine kulture z dodanim inhibitorjem in v tretje tri petrijevke sterilno fizioloko raztopino.

predhodno pripravljenih raztopin:

Gojia inkubirajte pri 28 C. Po dveh dneh inkubiranja preverite rast mikroorganizma v

posameznih petrijevkah. Petrijevke z gojii pustite inkubirat e nadaljnih 6 dni.

Rezultati in diskusija: Opiite namen vaje ter tabelarino podajte rezultate meritev rastnega premera gliv. Kaj vam povejo rezultati dobljeni za vzorec fizioloke raztopine? Diskusija.

24

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 7: Primerjava uinkovitosti razlinih razkuil

Material: razline bakterijske kulture komercialna razkuila 0,5 % vodna raztopina fenola 70 % alkohol jodova tinktura prazni epruveti deset epruvete s hranilno juho pipete

Potek vaje: 5 ml fenola in 5 ml izbranega razkuila je potrebno odpipetirati v dve prazni sterilni epruveti. Komercialno razkuilo je potrebno predhodno rediti. Za vsako od obeh razkuil pripravite pet epruvet s hranilno juho. Nanje je potrebno napisati ime razkuila in as 0, 2, 5, 10 in 20 minut. Odpipetirajte 0,5 ml bakterijske kulture v epruveto z razkuilom. Meanico rahlo v epruveto z

premeajte in takoj prenesite eno zanko kulture, inkubirane v razkuilu, gojiem (as 0).

Po 2, 5, 10 in 20 minutah prenesite polno zanko kulture, inkubirane v razkuilu, v ustrezne

epruvete z gojiem. Testne epruvete je potrebno inkubirati na temperaturi 37 C 48 ur.

Rezultati in diskusija: Opiite namen vaje ter tabelarino podajte rezultate rasti bakterij po 48 urni inkubaciji. Tabelarini prikaz naj zajema tudi rezultate preostalih skupin. Z znakoma + (rast) in (ni rasti) oznaite ali je v doloeni epruveti kultura zaela rasti ali ne. emu je potrebna kontrola pri asu 0? Katera izmed testiranih kemikalij je najbolj uinkovita? Katera izmed bakterijskih vrst je najbolj odporna proti delovanju uporabljenih razkuil? Diskusija.

25

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika ENCIMSKO KATALIZIRANE REAKCIJE

Velik del kemijskih reakcij ne poteka dovolj hitro. Potrebno aktivacijsko energijo za kemijske reakcije najpogosteje dovajamo s segrevanjem, kar vodi do povianja temperature reakcijske zmesi. Mona pot pa so tudi katalizatorji. Ti namre zniujejo potrebno koliino aktivacijske energije ter tako omogoajo potek reakcij, ki ob istih energetskih pogojih ne bi bile mone. Katalizatorji pospeujejo kemijske procese in se pri tem ne porabljajo. To pomeni, da katalizatorji vstopijo v sam proces, in ko je ta konan, izstopijo iz njega nespremenjeni. Encimi so zelo aktivni katalizatorji, ki pospeijo reakcijo tudi do 1029 krat in zaradi tega v reakcijskem mediju delujejo uspeno v malih koliinah. Reakcijo vodijo po drugi (ponavadi vestopenjski) poti, ki terja nijo aktivacijsko energijo, torej energijo, potrebno, da pri trkih med delci pride do reakcije. Reakcije v ivih organizmih se morajo odvijati po principu znianja aktivacijske energije, kar se dogaja s pomojo biokemijskih katalizatorjev, encimov. Slika 4 prikazuje znievanje aktivacijske energije s katalizatorji.

neencimska reakcija 1 Energija reaktantov

Energija

encimska reakcija 3

4 Energija produktov

Reaktanti

produkti

1 aktivacijska energija neencimske reakcije 2 aktivacijska energija za tvorbo kompleksa encim substrat 3 aktivacijska energija za encimsko reakcijo 4 sprememba notranje energije (G)

Slika 4: Znianje aktivacijske energije s katalizatorji.

26

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Potek encimske katalize lahko razdelimo v tri faze: 1. v prvi fazi se stvori kompleks encim substrat, ki ima nijo aktivacijsko energijo kot sam substrat. Nastajanje kompleksa mora biti hitro in reverzibilno; 2. v drugi fazi nastane produkt, ki je vezan na aktivno mesto encima nastane torej kompleks encim produkt; 3. v tretji fazi nastopi osvobajanje produkta. Kompleks encim produkt razpade v encim + produkt. Tako se encim regenerira in lahko ponovno vstopi v reakcijo s substratom.

Specifinost encimske katalize Za razliko od anorganskih katalizatorjev, kot so kisline, baze, kovine in kovinski oksidi, encimi kaejo lastnosti specifinosti. Nekateri encimi so strogo specifini in delujejo samo na en doloen substrat, drugi so manj specifini in katalizirajo ve razlinih reakcij, nekateri pa so specifini samo za neko skupino substratov. Specifinost encimov je pogojena z dvema dejavnikoma: 1. geometrijsko ujemanje encima in substrata: molekula substrata se mora natanno prilegati v kalup encima; 2. ujemanje v naboju in monost priblianja nabitih delov: naboja encima in substrata z nasprotnim predznakom se morata im bolj pribliati.

Faktorji, ki vplivajo na encimsko katalizirane reakcije Encimsko katalizirane reakcije so odvisne od vrste faktorjev, ki vplivajo na samo delovanje encimov. Ker so encimi proteini, so zelo obutljivi na visoko temperaturo in delujejo samo v doloenem temperaturnem intervalu. Pri nijih temperaturah so bistveno manj aktivni, pri vijih pa se lahko denaturirajo. Naboj encimov je odvisen od pH, zato delujejo samo v doloenem obmoju pH. Na encimsko katalizirane reakcije poleg temperature in pH vplivata tudi koncentracija encima in substrata.

27

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

Vpliv temperature na hitrost encimsko katalizirane reakcije

Pri poviani temperaturi encimsko katalizirane reakcije so dogajata dve stvari: 1. Povea se hitrost reakcije, tako kot pri veini kemijskih reakcij. 2. Stabilnost proteina se zmanja zaradi termine deaktivacije. Fizikalni mehanizem za ta fenomen je naslednji: z zvievanjem temperature imajo atomi v molekulah encima vijo energijo in s tem vejo tendenco h gibanju. Torej pridobijo dovolj energije, da le-ta presee energijo ibkih interakcij, zaradi katerih se obdri globularna struktura proteina. Temu sledi deaktivacija, ki je lahko reverzibilna, ireverzibilna ali kombinirana.

Za odvisnost zaetne hitrosti reakcije od temperature dobimo krivuljo zvonaste oblike, katere maksimum je asovno odvisen (Slika 5.). Zato je pojem temperaturni maksimum tono doloen s temperaturnimi parametri.

zaetna hitr ost r eakcije

temperatura

Slika 5: Vpliv temperature na hitrost rekacije.

Iz Arrheniusovega grafa lahko razberemo do katere temperature se aktivnost encima poveuje in pri kateri temperaturi nastopi deaktivacija encima.

28

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Arrheniusova enaba (1) opisuje temperaturno odvisnost aktivnosti encima:

k = Ae
kjer je : A Arrheniusova konstanta, k - konstanta reakcijske hitrosti, Ea aktivacijska energija, R plinska konstanta, T absolutna temperatura.

- Ea RT

(1)

Esterifikacija ocetne kisline z izoamil alkoholom Estri so eni izmed najpomembnejih razredov organskih komponent in jih je mogoe sintetizirati na razline naine: - z reakcijo med alkoholi in karboksilnimi kislinami (esterifikacija) z odstranitvijo vode, - z menjavo acilnih skupin med estri in kislinami (acidoliza), - z menjavo acilnih skupin med estri in alkoholi (alkoholiza) ali glicerolom (gliceroliza), - z menjavo acilnih skupin med estri (transesterifikacija). Produkti esterifikacije kislin z daljo verigo (1220 ogljikovih atomov) in vijih alkoholov (z daljo verigo) se uporabljajo kot maziva za stroje in kot mehalci za zelo natanne stroje. Estri, dobljeni z reakcijo med kislinami z daljo verigo (1220 ogljikovih atomov) in nijimi alkoholi (38 ogljikovimi atomi), se uporabljajo kot dodatki v prehrambeni, kozmetini, farmacevtski industriji in industriji detergentov. Produkti med kislinami s kratko verigo (28 ogljikovih atomov) in alkoholi so pomembne arome in komponente diav v prehrambeni, kozmetini, farmacevtski industriji in industriji pija.

29

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Etil-, izopropil-, butil-, izobutil- in amil acetati se uporabljajo pri proizvodnji lakov zaradi dobre hlapljivosti. Etil-, izobutil-, amil- in izoamil acetati se pogosto uporabljajo tudi kot komponente za diave in arome, izopropil-, benzil-, oktil- ter metilni estri pa kot dodatki k parfumom.

Izoamilni estri (posebej izoamil acetat) so aroma estri in so pomembni tudi s komercialnega vidika v prehrambeni industriji (74 000 kg/leto) zaradi mone arome banane. Veina enostavnih estrov na triu je sintetinega izvora. Estri so v velikih koliinah prisotni tudi v naravi (v maobah, oljih in voskih). Ponavadi se pridobivajo s kemijskimi reakcijami med alkoholom in organsko kislino v prisotnosti kislinskega katalizatorja ali pri ekstrakciji iz naravnih materialov. Naravni produkti, dobljeni z drugo metodo, so zelo dragi in ne zadovoljujejo koliinskim potrebam tria. Biotehnoloka proizvodnja aroma estrov z encimsko kataliziranimi reakcijami (Slika 6.) je pridobila mono na pomenu v primerjavi s klasiinimi kislinskimi katalizatorji, predvsem na podroju proizvodnje naravnih arom in diav. Vzrok za to je v regio- in stereospecifinosti veine encimov, milih reakcijskih pogojih in sprejemljivosti tako sintetiziranih produktov tudi v prehrambeni industriji.

O C H3C OH + HOCH2CH2CH(CH3)2

O encim C H3C OCH2CH2CH(CH3)2

Slika 6: Encimsko katalizirana esterifikacija med ocetno kislino in izoamil alkoholom.

Pri sintezi aroma estrov se kot katalizatorji uporabljajo encimi lipaze (EC 3.1.1.3), ki spadajo v razred hidrolaz. Le-ti so lahko prosti (nativni) ali imobilizirani na razline nosilce (smole itd.). Prednost imobiliziranih encimov pred neimobiliziranimi je predvsem v monosti vekratne uporabe, enostavni loitvi od reakcijske zmesi in najvekrat tudi v bolji termini obstojnosti. eprav

30

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika zniajo obratovalne stroke (monost vekratne uporabe), pa je njihova nabavna vrednost dokaj visoka. Lipaze, kakor tudi druge encime, lahko pridobivamo iz razlinih virov. Tako npr. so lipaze lahko ivalskega izvora (trebuna slinavka) ali mikrobnega izvora npr. iz gljiv (vrsta: Rhizopus) ali iz kvasovk (npr. rod: Candida) itd.

31

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 8: Prouevanje vpliva temperature na potek sinteze izoamil acetata in na aktivnost encima
Material: ocetna kislina (3,6 M) izoamil alkohol NaOH (0,1 M) 0,1 % raztopina fenolftaleina v etanolu nativni ali imobilizirani encim pipete vodna kopel buka s povratnim hladilnikom

Potek vaje: 1. Reakcijsko zmes inkubirajte v reakcijski buki s povratnim hladilnikom v vodni kopeli pri Iz inkubirane raztopine odvzamite pri asu t0 0,5 ml vzorca (slepi vzorec) in ga analizirajte Reakcijska zmes vsebuje izoamil alkohol in ocetno kislino v mnoinskem razmerju 2 proti

dani temperaturi.

po spodaj opisanem postopku. Nato dodajte 5 % (g/g substrata) imobiliziranega ali prostega encima lipaze (Novozym 435 - NOVO Nordisk, Danska). V trenutku, ko dodate encim v reakcijsko zmes, zanite meriti as reakcije. Nato jemljite po 0,5 ml vzorca iz reakcijske zmesi v sledeem asovnem zaporedju: 2 Vzorite s pipeto v centrifugirke. Vsak vzorec sproti analizirajte po spodaj opisani metodi.

min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 3,5 h in 4 h.

32

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Analizna metoda Doloanje prostih kislin s titracijsko metodo Vsebnost prostih kislin v reakcijski zmesi se lahko doloi s titrimetrino metodo. 0,1 g vzorca je potrebno zatehtati v erlenmajerico in razrediti z 20 ml raztopine 0,1 % fenolftaleina v etanolu ter titrirati z 0,1 M NaOH. Vsebnost prostih kislin lahko izraunamo iz enabe 2:

% (PK) =

V N MK 10 m

(2)

kjer je: MK molska masa kisline (M=60,031 g/mol), V volumen porabljenega NaOH (=0,1 mol/l), PK uteni % kisline, m masa zatehtanega vzorca (g), N normaliteta NaOH ( 0,1 N).

Izraun koncentracije nastalega estra V doloenih asovnih intervalih je potrebno meriti vsebnost prostih kislin v vzorcih, katere je potrebno predhodno stehtati. S pomojo spodaj navedenih enab lahko izraunamo koncentracijo nastalega estra.

a) V primeru uporabe nativnega encima Pred prietkom reakcije v asu t = 0 je bilo prisotnih: a mol alkohola k mol ocetne kisline = n a MA = nk MK skupno =A g =K g = G0 g

33

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Prisoten encim se v reakcijski zmesi raztaplja in tako ostaja razmerje encim/substrat po vzorenjih enako. Koncentracija encima in ostalih komponent tako s asom variira. Z vsakim molom ocetne kisline reagira 1 mol izoamil alkohola in nastane 1 mol estra in 1 mol vode. Mnoino kisline (nk) in mnoino nastalega estra (ne) pri doloenem asu (t = tn) izraunamo po sledeih enabah:

nk (t = t n ) =

% PK (t = t n ) G 0 M K 100

[mol]

(3)

ne (t = t n ) = nk (t = 0)

% PK (t = t n ) G 0 M K 100

[mol]

(4)

Koncentracija posameznih komponent (ck - mnoinska koncentracija kisline; ce mnoinska koncentracija estra) v asu t = tn:

c k (t = t n ) =

% PK (t = t n ) M K 100

[mol/g]

(5)

ce (t = t n ) =

nk (t = 0) % PK (t = t n ) G0 M K 100

[mol/g]

(6)

34

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika b) V primeru uporabe imobiliziranega encima V primeru uporabe imobiliziranega encima se koncentracija encima s asom ne spreminja. Koncentracija ostalih komponent s asom variira. Pri izraunu je potrebno upotevati da, razmerje substrat/encim ni konstantno ves as reakcije. Pri asu t = t1 se je masa reakcijske zmesi zmanjala za maso odvzetega vzorca (g1). (t = t1 ) = G0 (t = 0) g1 G0 . . za t = tn (t = t n ) = G0 (t = t n 1 ) g n G0

[g]

(7)

Mnoini posameznih komponent po odvzemu vzorca sta

(t = t n ) = nk (t = t n ) g n c k (t = t n ) nk
(t = t n ) = ne (t = t n ) g n ce (t = t n ) ne

[mol]

(8)

[mol]

(9)

Za izraun mnoin nk(t = tn) in ne(t = tn) uporabimo enabi 3 in 4. Koncentraciji obeh komponent pri asu t = tn doloimo po naslednjih enabah:

c k (t = t n ) =

(t = t n ) nk (t = t n 1 ) G0

[mol/g]

(10)

ce (t = t n ) =

(t = t n ) ne (t = t n 1 ) G0

[mol/g]

(11)

35

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Potrebno je upotevati e maso encima v reakcijski zmesi, ki je ves as reakcije konstantna. Tako se koncentracija produkta v primeru uporabe imobiliziranega encima izraa kot koncentracija na gram encima:

ce (t = t n ) =

(t = t n ) ne (t = t n 1 ) G0 mencima

[mol/g/gencima]

(12)

Rezultati in diskusija: Na diagramu prikaite odvisnost koncetracije nastalega produkta od asa poteka reakcije pri razlinih temperaturah. Doloite zaetno hitrost posamezne reakcije, nariate diagram odvisnosti zaetne hitrosti od temperature in tabelarino podajte vse meritve, kot prikazuje tabela 1 ter navedite svoja opaanja in ugotovitve. Tabela 1: Tabelarini prikaz rezultatov.
t /h 0 0,083 .... 4 modvzetega vzorca /g .... .... .... .... .... .... .... mzatehte za analizo /g VNaOH /ml PK /%

Prosti encim:
t /h 0 0,083 .... 4 PK /% .... .... .... .... .... .... .... nk /mmol ne /mmol ck /(mmol/g) ce /(mmol/g)

36

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Imobilizirani encim:

t /h 0 ... .... 4

PK /% .... .... .... ....

nk /mmol

n k /mmol

ne /mmol

n e /mmol

ck /(mmol/g)

ce /(mmol/g)

ce
/(mmol/g/g encima)

.... .... ....

.... ....

37

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

Vpliv koncentracije substrata na hitrost encimsko katalizirane reakcije

V primeru encimske reakcije, ko je koncentracija encima nespremenjena, ima vsako poveanje koncetracije substrata za posledico poveanje zaetne hitrosti vse do njene maksimalne vrednosti. Z nadaljnim poveevanjem koncentracije substrata se hitrost reakcije ne spreminja ve. Pojavi se lahko inhibicija s substratom. Slika 7 prikazuje vpliv koncentracije substrata na hitrost kemijske reakcije. V trenutku, ko doseemo maksimalno hitrost reakcije, se ves encim porabi za tvorbo kompleksa encim-substrat (ES).

Slika 7: Vpliv koncentracije substrata na hitrost kemijske reakcije.

Hitrost reakcije kot funkcijo koncentracije substrata lahko opiemo z Michaelis-Mentenino enabo 13: hitrost = v = v max [S ] [S ] + K M (13)

vmax je maksimalna hitrost reakcije doseena pri visokih koncentracijah substrata. vmax in v sta izraeni v enotah nastalega produkta na enoto asa. KM je Michaelis-Mentenina konstanta, ki predstavlja koncentracijo substrata, pri kateri je hitrost reakcije enaka polovici maksimalne hitrosti. Simbol S predstavlja koncentracijo substrata.

38

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Hidroliza karboksimetil celuloze

Celuloza je najbolj razirjen polimer v naravi. V rastlinah predstavlja skeletno substanco, ki je sestavljena iz monosaharida -D-glukoze (Slika 8.), v katerega tudi razpade s hidrolizo. -Dglukopiranozidne enote, povezane z 14 vezjo, tvorijo linearno molekulo celuloze. tevilo monomernih enot v molekuli je odvisno od izvora celuloze in naina izolacije. Tako naj bi bila veina celuloz v naravi sestavljenih iz povpreno okoli 14 000 -D-glukopiranozidnih enot, a jo postopek predelave navadno znia na okoli 2 500. Molska masa celuloze znaa nad 200 000 g/mol do ve milijonov molskih enot.

CH2OCH2COONa O O H OH H H H OH O

CH2OCH2COONa O H OH H H H OH O

CH2OCH2COONa O H OH H H H OH O

CH2OCH2COONa O H OH O H H H OH

Slika 8: Strukturna veriga karboksimetil celuloze. Karboksimetil celuloza (CMC) je zelo pomemben derivat celuloze. Z uinkovanjem monoklorocetne kisline ali njene natrijeve soli, natrijevega monokloracetata na alkali celulozo dobimo CMC. Z razliko od iste celuloze se dobro raztaplja v vodi. CMC je vsestransko uporabna v tehniki, ker ima odline emulgatorske in dispergatorske lastnosti. Uporablja se pri izdelavi klasinih mil, kot sredstvo za izboljanje kakovosti papirja, v kozmetini in prehrambeni industriji (kot gostilo ali elirno sredstvo), v farmacevtski industriji, v industriji nafte in tudi kot lepilo.

Celuloza je sladkor (polisaharid), ki daje pri hidrolizi (Slika 9.) celobiozo (disaharid) oz. glukozo (grozdni sladkor). Celuloza se lahko hidrolizira pri visokih temperaturah ob prisotnosti razredenih kislin ali pa ob prisotnosti biokatalizatorjev (encimov).

39

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

celuloza celobioza

glukoza

Slika 9: Razpad celuloze na glukozo. S pomojo encimov potekajo reakcije v mnogo milejih pogojih, pri bistveno nijih temperaturah in koncentracijah. Encimi poveajo reakcijsko hitrost tako, da zniajo energijo aktiviranja reakcije.

Celulaze (EC 3.2.1.4), ki spadajo v skupino hidrolaz (glikozidaz) so encimi, ki razgrajujejo (cepijo) -1,4 vezi med glukoznimi enotami. Celulaze imajo irok spekter uporabe (tekstilna industrija za beljenje tkanin, prehrambena industrija pri proizvodnji sokov, kot dodatek ivilski hrani za izboljanje kakovosti in prebavljivosti). Hidroliza celuloze potee po sledei enabi: (C 6 H 10 O 5 )n + n H 2 O n C 6 H 12 O 6 Glavni faktorji, ki vplivajo na zaetno hitrost reakcije so: koncentracija encima, koncetracija substrata, reakcijska temperatura in pH okolja.

Doloitev zaetne reakcijske hitrosti Med reakcijo, katalizirano z encimom, opazimo vianje koncentracije produktov in upadanje koncentracije substratov, dokler ni doseeno ravnoteje reakcije.

40

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

koncentr acija

c = d0t2 + d1t + d2

as

Slika 10: Sprememba koncentracije produkta v odvisnosti od asa za encimsko katalizirano reakcijo. Hitrost reakcije dobimo s pomojo naklona tangente na krivuljo. Reakcijsko hitrost dobimo v vsakem trenutku reakcije z naklonom tangente na krivuljo koncentracije produkta v odvisnosti od asa (Slika 10.). V t.i. zaetni fazi, preden se nakopii produkt, oz. preden drugi faktorji upoasnijo reakcijo, je tvorba produkta linearna s asom. Iz naklona tangente v zaetni fazi torej dobimo zaetno hitrost reakcije. Koncentracijo produkta podamo v odvisnosti od asa. Za doloitev zaetne reakcijske hitrosti vi (g/(Lh)) = (dc/dt) uporabimo funkcijo c = d0 + d1t + d2t2. Vrednost zaetne reakcijske hitrosti je enaka vrednosti d1.

41

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 9: Prouevanje vpliva koncentracije substrata na potek encimsko katalizirane hidrolize karboksimetil celuloze

Material: karboksimetil celuloza (CMC) fosfat-citratni pufer encim - celulaza Celluzyme 0,7T raztopina glukoze raztopina dinitrosalicinske kisline (DNS) pipete vodna kopel buka s povratnim hladilnikom

Potek vaje: Pripraviti je potrebno raztopino CMC doloene koncentracije v 25 ml fosfat-citratnega pufra. V kolikor se CMC popolnoma ne raztopi, je raztopino priporoljivo rahlo segrevati (temperatura ne sme prekoraiti 60 C). Tako pripravljeno raztopino CMC inkubirajte v reakcijski buki s povratnim hladilnikom Iz inkubirane raztopine odvzamite pri asu t0 1 ml vzorca (slepi vzorec) in ga analizirajte

v vodni kopeli pri 30 C.

po spodaj opisanem postopku. Nato dodajte encim celulazo (Celluzyme 0,7T - NOVO Nordisk, Danska) koncentracije V trenutku, ko dodate encim v reakcijsko zmes, zanite meriti as reakcije. Nato jemljite po 1 ml vzorca iz reakcijske zmesi v sledeem asovnem zaporedju: 2 min, Vsak vzorec sproti pripravite za analizo. Vzorite s pipeto v centrifugirke.

44 g/l reakcijske zmesi.

5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 3,5 h in 4 h.

42

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Analizna metoda Doloevanje glukoze z dinitrosalicinsko kolorimetrino metodo Ta metoda temelji na zaznavanju prostih karbonilnih skupin (C=O), tako imenovanih reduciranih sladkorjev. Pri sami reakciji pride do oksidacije aldehidnih funkcionalnih skupin v glukozi. 3,5 dinitrosalicinska kislina (DNS) se pri tem reducira v 3, amino, 5-nitrosalicinsko kislino. Tako en mol sladkorja reagira z enim molom 3,5-dinitrosalicinske kisline.

Priprava za analizo in merjenje absorbance 1 ml vzorca, vzetega po doloenem asu reakcije, dodamo 3 ml DNS. Centrifugirko nato potopimo za 5 minut v vrelo vodno kopel in nato e za 5 minut v mrzlo vodno kopel. Vse centrifugirke je potrebno termostatirati na sobno temperaturo, vzorec centrifugirati in izmeriti absorbanco na UV spektrofotometru pri valovni dolini 540 nm. Kot referenno raztopino uporabimo raztopino 1 ml vode in 3 ml DNS. Prav tako je potrebno izmeriti absorbanco raztopini glukoze (1 ml pripravljene raztopine glukoze dodamo 3 ml DNS). Izraun koncentracije glukoze Po konanih meritvah absorbanc je potrebno e izraunati uteno koncentracijo nastale glukoze pri encimsko katalizirani hidrolizi CMC. Utena koncentracija glukoze je definirana z enabo 14:

glukoze =

(A

vzorec

A slepi

vzorec

) 0,5

A standard glukoze

[g/L]

(14)

kjer je: Avzorec - absorbanca hidrolizatov po doloenem asu poteka reakcije, Aslepi vzorec - absorbanca hidrolizatov v asu t0, Astandard glukoze - absorbanca hidrolizatov v raztopini glukoze.

43

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Rezultati in diskusija: Narisati je potrebno graf odvisnosti koncentracije nastalega produkta od asa reakcije, doloiti zaetno hitrost posamezne reakcije, tabelarino podati vse meritve, kot prikazuje tabela 2 ter navesti svoja opaanja in ugotovitve.

Tabela 2: Podajanje rezultatov. glukoze /(g/l) 2,53 .... .... ....

t /h 0 0,083 .... 4

Vodvzetega vzorca /ml 1 1 .... ....

Avzorca 0,2593 .... .... ....

44

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

Doloevanje koncentracije proteinov

Proteini so polimeri amino kislin, kjer so amino kislinske enote med seboj povezane s peptidnimi vezmi (Slika 11.).

Slika 11: Del primarne proteinske strukture.

Kriteriji za izbiro metode za doloevanje proteinov v raztopini so odvisni od prikladnosti, uporabnosti proteinov za analizo, od prisotnosti dodatkov oz. substanc, ki motijo analizo in od potrebne stopnje natannosti analize. Nasplono velja, da z metodami za doloevanje koncentracije proteinov bolj natanno doloimo koncentracijo kompleksnim meanicam proteinov. Doloitev koncentracije raztopine istih proteinov je lahko zelo nenatanna, odvisno od naina analize, razen da je analiziran encim uporabljen tudi kot standard za umeritveno krivuljo. Razline metode za doloevanje koncentracije proteinov: 1. Doloevanje koncentracije proteinov na osnovi absorbanc Absorbanca pri 280 nm Razpon: od 20 g do 3 mg Volumen: od 200 l do 3ml ali ve Natannost: zadovoljiva Primernost: odlino

45

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Substance, ki motijo pri analizi: detergenti, nukleinske kisline, kopljice maobe Absorbanca pri 205 nm Razpon: priblino od 1 do 100 g Volumen: od 200 l do 3 ml ali ve Natannost: zadovoljiva Primernost: zelo dobro Substance, ki motijo pri analizi: detergenti, nukleinske kisline, kopljice maobe Ekstinkcijski koeficient Razpon: od 20 g do 3 mg Volumen: od 200 l do 3 ml ali ve Natannost: 2 % (zelo dobro) Primernost: zelo dobro Substance, ki motijo pri analizi: detergenti, nukleinske kisline, kapljice maobe

2. Kolorimetrina metoda za doloevanje koncentracije proteinov Modificirana Lowry-jeva metoda Razpon: od 20 do 300 g Volumen: od 1 ml naprej Natannost: dobra Primernost: zadovoljiva Substance, ki motijo pri analizi: mone kisline, natrijev sulfat, fenol, EDTA, citrati, magnezij, kalcij. Biuret-ova metoda Razpon: 1 do 10 mg Volumen: 5 ml Natannost: dobra Primernost: dobra Substance, ki motijo pri analizi: natrijeve soli

46

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Bradford-ova analiza Razpon: 1 do 20 g (mikro analiza); 20 do 200 g (makro analiza) Volumen: 1 ml (mikro); 5,5 ml (makro) Natannost: zadovoljiva Primernost: odlino Substance, ki motijo pri analizi: /

Lowry-jeva metoda za doloevanje koncetracije proteinov v raztopini Lowry-jeva metoda je metoda za doloanje proteinov iroke uporabe. Lowry-jeva metoda temelji na dveh reakcijah. Prva reakcija je formiranje bakrovega ion kompleksa z amidnimi vezmi, tvorba reduciranega bakra v alkalnih raztopinah. Druga reakcija je redukcija FolinCiocalteu-jevega reagenta (fosfomolibdat) z aromatskimi amino kislinskimi ostanki (tirozin in triptofan). Reducirani Folin-Ciocalteu-jev reagent je moder in ga je mogoe zaznati s spektrofotometrom v obmoju od 500 do 750 nm. Uporaba Folin-Ciocalteu-jevega reagenta za detekcijo bakra naredi to metodo do 100 krat bolj obutljivo kot je Bierut-ova reakcija sama. Poznanih je ve modifikacij osnovne Lowry-jeve metode za doloevanje koncentracije proteinov. Osnovno metodo so modificirali predvsem z namenom, da poenostavijo proceduro in omogoijo prisotnost nekaterih substanc v vzorcu, katerih osnovna metoda ne dopua (biomaterialov kot so lipidi).

47

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika

VAJA 10: Doloevanje koncentracije proteinov v danih vzorcih po Lawryjevi metodi za doloevanje koncentracije proteinov v raztopinah

Material: pipete epruvete reagenti

Reagent A: (1mol/l=M) Na2CO3 in 0,25 M NaOH Reagent B: CuSO4 5H2O (1 g/l) in K-Na-tartrat (20 g/l) Reagent C: Folin-Ciocalteau reagent razreden s 3X volumnom dionizirane vode (reagent : voda = 1 : 3 (v/v)).

Potek vaje: Zatehtajte doloene koliine encimskega preparata v epruvete ter dodajte po 5 ml destilirane vode v vsako epruveto. Dobro pretresite, da se proteini popolnoma raztopijo v vodi. Pripravljene raztopine razlinih koncentracij encimskega preparata ter dobljen vzorec z neznano koncetracijo centrifugirajte 10 min pri hitrosti 3000 min-1. Vsem vzorcem doloite koncentracijo prisotnih proteinov po naslednjem postopku: Odpipetirajte 2 ml vzorca doloene koncetracije dodanega encimskega preparata v epruveto. Po vrsti dodajte 2 ml reagenta A in 0,8 ml reagenta B. Vsebino epruveto pazljivo pretresite. Po 10 min dodajte 1,5 ml reagenta C. Ponovno premeajte. Epruveto z vzorcem in dodanimi reagenti pustite stati na sobni temperaturi 10 minut, da se razvije modra barva. Oditajte absorbanco pri = 700 nm. Kot referenno raztopino uporabite destilirano vodo. Nato oditajte koncentracijo prisotnih proteinov v raztopini iz umeritvene krivulje. Postopek ponovite za vse preostale vzorce.

48

Laboratorijske vaje: Biokemijska tehnika Rezultati in diskusija: Tabelarino podajte izmerjene absorbance in doloene koncentracije proteinov v pripravljenih vzorcih. Na osnovi znanih koncentracij encimskega preparata in pripadajoih koncentracij proteinov, ki ste jih doloili s pomojo zgoraj opisane metode, izraunajte odstotek prisotnih proteinov v encimskem preparatu. Doloite koncentracijo encimskega preparata v vzorcu neznane koncentracije.

49

UMERITVENA KRIVULJA ZA DOLOEVANJE KONCENTRACIJE PROTEINOV V DANIH VZORCIH

50

1,1 1,05 1 0,95 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7 0,65

y = 0,0045x + 0,1184 R2 = 0,9977

0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

y = 0,0057x + 0,0163 R2 = 0,9984

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

Literatura: Brzin, B., Budi, S., Gubina, M., Kozak, M., Likar, M., Stropnik, Z., Vozelj, M., ZajcSatler, J. Praktikum iz mikrobiologije in parazitologije. Likar, M. (ur.). Ljubljana : Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Intitut za mikrobiologijo medicinske fakultete v Ljubljani, Ljubljana : Univerza v Ljubljani, 1972.

Janc, M., Rupnik, M. Splona mikrobiologija : navodila za vaje, (Knjina zbirka Scripta, Mikrobiologija). Ljubljana : OU, tudentska zaloba, 1998.

Sssmuth, R., Eberspcher, J., Haag, R., Springer, W. Mikrobiologisch-Biochemisches Praktikum. 2. Auflage, Georg Thieme Verlag : Stuttgart New York, 1999.

Bole-Hribovek, V., Hostnik, P. Osnove dela v mikrobiolokem laboratoriju, Prironik za vaje iz mikrobiologije za veterinarje. Ljubljana : Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta, 1996. Kapun-Dolinar, A. Mikrobiologija. Kurnik, U. (ur.), Loreni, A. (ur.). 1. natis, Zavod RS za olstvo, Ljubljana, 2001.

Likar, M. Mikrobiologija. 2. izdaja, Dopisna delavska univerza Univerzum Ljubljana, 1979.

Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Demain, A.L. (ur.), Davies, J.E., (ur.), 2. izdaja, American Society for Microbiology, Washington DC, USA, 1999.

52