FIZIKA BIOPOLIMERA

Uvod
Fizika biopolimera odnosi se na strukturu i funkcionalnost
biolokih makromolekula, proteina i nukleinskih kiselina
(DNK i RNK), i njihovu povezanost sa problemom
genetskog koda

Istorija problema
U XIX veku roena su tri velika principa biologije:
1. Darvinova i Valasova teorija evolucije kroz prirodnu selekciju
2. lajdenova i vanova teorija elije po kojoj su svi organizmi
sastavljeni od elija koje se razmnoavaju deobom
3. Satonova hromozomska teorija nasleivanja zasnovana na
Mendelovim zakonima nasleivanja. Funkcija elijskih
hromozoma, sastavljenih od gena je da kontroliu naslee.

 elije su osnovne strukturne jedinice svih ivih organizama;

Tkiva nastaju udruivanjem elija pomou meuelijskih
kontaktnih spojeva;
Organi nastaju povezivanjem osnovnih tkiva, koje spaja
proteinski vanelijski matriks vezivnog tkiva;
Sistemi organa nastaju funkcionalnim povezivanjem organa,
i tako je izgraen organizam svih kimenjaka, pa i ljudski
organizam.
Tako se obavljaju osnovne funkcije neophodne za ivot
svakog organizma, ukljuujui disanje, krvotok, ishranu,
kretanje, odstranjivanje nepotrebnih materija i
razmnoavanje.

Postoje dva tipa elijske deobe & jedan tip oploenja:

(a) Mitoza od diploidne roditeljske elije (2N hromozoma) posle

deobe dobijaju se dve erke elije sa hromozomskim garniturama
identinim garnituri elije roditelja sa 2N hromozoma
(b) Mejoza od diploidne roditeljske elije (2N hromozoma) broj
hromozoma elija erki je prepolovljen i nastaju haploidne polne
elije (spermatozoidi i jajne elije) sa po N hromozoma
(c) Fertilizacija polno oploenje tj. muke i enske haploidne elije
spajanjem daju jednu diploidnu eliju (zigot) sa 2N hromozoma

 Mendelovi zakoni nasleivanja 1865. god.

- Fenotip (izgled individue)
- Genotip (genetiki sadraj individue)
- Jedinke sa indentinim fenotipom mogu imati razliit genotip

Eksperimenti sa grakom:
- Dominantne osobine su one koje se javljaju u potomstvu
- Recesivne osobine se ne javljaju u F1prvoj filijalnoj generaciji
- Mendel je svoje zakone interpretirao postojanjem gena od kojih
jedni potiu od mukog, a drugi od enskog tako da se pri
oploenju geni roditelja kombinuju dajui razliite genotipe i
fenotipe

 Mendelovi zakoni

Princip nezavisne sagregacije

(Prvi zakon)

Princip nezavisnog svrstavanja

(Drugi zakon)

Fier (1900-ih) je utvrdio da se proteini sastoje iz aminokiselina meusobno

povezanih peptidnim vezama -NH-COSamner (1926) je pokazao da su enzimi proteini (belanevine) i kristaliu
Tokom 1940-ih razvijene su tehnike fizike hemije kojima biomolekuli ostaju
bioaktivni i koje otkrivaju homogenost proizvoda i daju podatke o veliini
biomolekula (sedimentacijom u ultracentrifugi (Svedberg),odnosno
molekulskoj teini biomolekula hromatografijom na papiru (Martin & Sind),
proirenjem X-kristalografije na biopolimere (Pauling))
Averi (1944) je pokazao da se nasledne osobine bakterija mogu promeniti
paljivim dodavanjem DNK, a argaf (1947) je korienjem hromatografije
na papiru utvrdio da 4 nukleotida nisu ravnomerno zastupljena u DNK,
ukazujui da je uzajamni poloaj nukleotida odgovoran za genetiku
specifinost
Votson & Krik (1953) otkrili su korienjem rendgenske difrakcije strukturu
dvolanane spirale DNK iji se lanci dopunjuju, to je ukazalo da jedan od
lanaca slui kao specifina matrica na kojoj se drugi sintetie-replikacijagena
Peruc & Kendrju (1959) su metodom vezivanja atoma tekog metala za
molekul proteina razvili efikasnu kompjuterizovanu metodu za odreivanje
strukture proteina

Primarna, sekundarna, tercijarna i

kvaternarna struktura biopolimera
Primarna struktura polimera je odreena rasporedom karika u
polimernom lancu
Sekundarna struktura polimera je odreena prostornom konformacijom
karika u lancu (konformeri / rotameri / rotacioni izomeri)
Tercijarna struktura polimera dobija se sklupavanjem konformera u
manje (klupko) ili vie (globula) kompaktnu formu
Kvaternarna struktura polimera dobija se prostornim slaganjem
tercijarnih struktura po principu najgueg pakovanja

Primarna struktura je
stabilizovana jakim
hemijskim kovalentnim
vezama izmeu atoma.
Vie strukture odreene su
slabim hemijskim vezama
izmeu atoma i molekula.

Polimerne strukture:
a) Primarna
b) Sekundarna
c) Tercijarna

Struktura proteina
Proteini imaju najznaajniju ulogu kao enzimi - katalizatori:
biohemijskih reakcija u eliji (replikacija DNK, transkripcija DNK,
regulacija genetske funkcije nukleinskih kiselina)
elektrohemijskih procesa (aktivni transport molekula i jona kroz
elijsku membranu, generisanje i rasprostiranje nervnog impulsa)
mehanohemijskih procesa (miina kontrakcija)
akumulacije i prenosa kiseonika (mioglobin i hemoglobin)
hormonskog delovanja (polipeptidi)
imunolokih procesa (antitela)
ali i kao nosioci gradivnih svojstava (vezivna tkiva, koa)

 Primarna struktura proteinskog lanca nastaje sintezom, putem

polikondenzacije aminokiselina uz izdvajanje vode

Primarna struktura jednog segmenta proteina (sa osenenim lancem

peptidnih veza, preko kojih su spojene aminokiseline u proteinu).

 Sekundarna struktura odreena je minimumom ukupne energije

proteina. Postoje tri tipa: -forma, paralelna i antiparalelna -forma

-forma je 1D kristal oblika -

spirale u kojoj su vodonine veze

obrazovane izmeu C=O grupe
date karike i N-H grupe etvrte
prethodne karike
-forme predstavljaju 2D kristal,

slojevite strukture (-slojevi), pri

emu peptidne veze svakog lanca
imaju planarnu strukturu

 Tercijarna struktura nastaje sklupavanjem globula kao

dominantne posledice hidrofobnih interakcija. One su bazirane na
tome to voda odbija nepolarne kiselinske ostatke, dok privlai
polarne. Formiranje tercijarne strukture je kooperativan proces
Bioloka funkcionalnost globularnih proteina odreena je
tercijarnom & kvaternanrnom strukturom, tako da dva proteina
razliite primarne i sekundarne strukture, a sline tercijarne i
kvaternarne mogu imati sline bioloke funkcije
Fibrilarni proteini, za razliku od globularnih, imaju vlaknastu
tercijarnu i kvaternarnu strukturu. Ona nastaje kao rezultat
minimizacije energije, sa stabilizujuom ulogom molekula vode
sadranih u fibrilarnim proteinima

Struktura nukleinskih kiselina (DNK i RNK)

Nukleinske kiseline su informacioni biopolimeri koji reguliu
nasledne osobine (zakonodavna uloga)
Geni su fragmenti DNK i oni programiraju sintezu proteina
(izvrna uloga)
Genetski kod odreuje vezu izmeu uzastopnosti nukleotida u
DNK i informacionoj ili matrinoj RNK (mRNK) & uzastopnosti
aminokiselinskih ostataka u proteinskom lancu
DNK sadri 4 glavna nukleotida koji se sastoje od eera
dezoksiriboze, purinskih (adenin i guanin) i pirimidinskih (citozin i
timin) baza i molekula PO4
RNK sadri 4 glavna nukleotida s tim to umesto dezoksiriboze
ima eer ribozu i umesto timina sadri uracil

 Glavni nukleotidi koji uestvuju u izgradnji DNK

 Nukleotidi DNK su povezani u lancu fosfodiestarskim vezama, preko

fosfatnih (PO4) i hidroksilnih (OH) grupa koje se nalaze na eernim
komponentama
Primarna struktura DNK sastoji se od 2 polinukleotidna lanca koji su
meusobno spojeni vodoninim vezama izmeu specifinih baza:
- Adenin i Timin (dvostruka vodonina veza)
- Guanin i Citozin (trostruka vodonina veza)
Sekundarna struktura DNK je dvolanana spirala, gde se dva
antiparalelna lanca uvijaju jedan oko drugog (spojeni vodoninim
vezama izmeu AT i GC parova susednih lanaca)! DNK moe
kristalisati u razliitim dvospiralnim formama (A, B i C forme), koje se
razlikuju prema geometrijskim parametrima spirala.
Tercijarna stuktura DNK je u formi slabog klupka, poto je krutost
molekula velika, dok kvaternarna struktura DNK praktino i ne postoji
Bioloka funkcionalnost DNK odreena je primarnom i sekundarnom
strukturom

Primarna struktura jednog polinukleotidnog lanca (sa osenenim prikazom

fosfodisterskih veza izmeu nukleotida u lancu).

Votson-Krikovi parovi nukleotidnih baza (AT i GC)

u DNK, meusobno spojeni vodoninim vezama.

 Replikacija dvolanane DNK odigrava se

pri deobi elije (mitozi) - kada se genetski
materijal elije udvostruuje
Mehanizam replikacije je polukonzervativan
pri kome dve DNK spirale erki sadre svaka
po jedan novi i po jedan stari lanac - pri emu
stari lanac slui kao matrica za sitnezu novog
komplementarnog lanca
Ceo proces se odigrava uz katalitiko
delovanje proteinskog enzima polimeraze koji se pomera du dvostruke spirale
omoguavajui sintezu

Sekundarna struktura RNK, koji

su jednolanani biopolimeri, ima
dvospiralne segmente (zbog
tendencije sparivanja AU i
GC baza), ali poto ovde
nema komplementarnih lanaca
(kao kod DNK), to e postojati
odnosi A/U1 i G/C1, odnosno
bie i petlji sa nesparenim
delovima izuvijanog RNK-lanca.

Problem genetskog koda

Gen je deo molekula DNK odgovoran za sintezu jednog
proteinskog lanca
DNK sadri informaciju o primarnoj strukturi proteina (ona je
zapisana u rasporedu nukleotida)
Problem genetskog koda jeste korespondencija rasporeda
nukleotida u DNK i aminokiselina u proteinskom lancu
Broj nukleotida koji kodiraju jedan aminokiselinski ostatak ne
moe biti manji od tri. Poto je time kodirano 64 varijacija sa
3
64
ponavljanjem tripleta od ukupno4 4
nukleotida
(43=64), dok ima
samo 20 aminokiselina pa poto je 64>20, znai da je genetski
kod degenerisan (v. Tabl)
Genetski kod je tripletan, neprekrivajui, linearan, bez blankova

 Deifrovana korespondencija 64 kodona (nukleotidna tripleta) i

20 aminokiselina (Nirenberg, 1961; Korana, 1966; Krik, 1966)
Mesto 1

Mesto 2

Mesto 3

(5' - kraj)

(3' - kraj)

Phe

Ser

Tyr

Cys

Phe

Ser

Tyr

Cys

Leu

Ser

Terma

Term

Leu

Ser

Term

Trp

Leu

Pro

His

Arg

Leu

Pro

His

Arg

Leu

Pro

GluN

Arg

Leu

Pro

GluN

Arg

Ileu

Thr

AspN

Ser

Ileu

Thr

AspN

Ser

Ileu

Thr

Lys

Arg

Meth

Thr

Lys

Arg

Val

Ala

Asp

Gly

Val

Ala

Asp

Gly

Val

Ala

Glu

Gly

Val

Ala

Glu

Gly

Biosinteza proteina
Prepisivanje je proces genetski kodirane biosinteze mRNK,
kojim se prepisuje genetska informacija sa DNK na mRNK
Prevoenje je proces genetski kodirane biosinteze proteina,
kojim se prevodi genetska informacija sa mRNK na protein
(na ribozomima)

mRNK prenosi genetsku informaciju od hromozoma ka

ribozomima na kojima se odigrava biosinteza proteina
Za biosintezu proteina potrebno je uloiti energiju koja je
sadrana u molekulima adenozin trifosfata (ATF)

ATF ADF + H3PO4 + E (30,7 kJ/mol)

ema sinteze proteina u eliji

 Aktivirane aminokiseline vezuju se za specifinu transportnu tRNK

Ribozomi obezbeuju interakciju mRNK sa tRNK. Svaka tRNK
svojim antikodonom komplementarno interaguje sa odgovarajuim
kodonom mRNK
Sve etape biosinteze karakterisane su jedinstvenim principom
tj. molekularnim prepoznavanjem
Sve somatske elije datog vieelijskog organizma sadre isti skup
gena
U razliitim elijama istog organizma funkcioniu razliiti proteini, tj.
ekspresuju se razliiti geni
Induktori i represori upravljaju poetkom i zavretkom sinteze
specifinog proteina

 Mutacije se odigravaju ili spontano ili pod uticajem spoljanjih

faktora (hemijskih ili radijacionih delovanja na hromozome i gene)
Postoje hromozomske mutacije (izmena nadmolekularne
hromozomske strukture) i takaste tj. genske mutacije (izmena
rasporeda u nukleotidima DNK i mRNK)
Stabilnost genetskog koda u odnosu na genske mutacije (jer su
mutacije kod kojih su purinski nukleotidi zamenjeni pirimidinskim, i
obratno, koje utiu na promenu hidrofobnosti odgovarajuih
aminokiselinskih ostataka oko 2 puta ree od nemih - kod kojih se
ne ispoljavaju funkcionalne promene elijskih proteina)

Fizika interakcije ferment-supstrat:

molekularno prepoznavanje
Fermenti (enzimi) su katalizatori svih biohemijskih reakcija
Katalizator uestvuje u reakciji i ubrzava je, a pri tom se ne troi
Konstanta brzine reakcije k (Arenijusov zakon):

k Ae

RT

pri emu je G energija aktivacije, koja karakterie energetsku

barijeru
Fermenti sniavaju energiju barijere

 U povratnoj reakciji,
drugom smeru su:

brzine reakcije u jednom i u

v k1C A , v k 1C B.

U ravnotei je

v v

i konstanta ravnotee K se definie kao:

K

CBeq
CeAq

k1
k

Razlika slobodnih energija polaznog reagenta (A) i produkta

reakcije (B) je:

G RT ln K H TS

gde je H - razlika entalpija, a S - razlika entropija reagenata

Reakcija je mogua samo ako je G < 0, tj. ako se sniava

slobodna energija
Katalizator sniava aktivacionu barijeru

ematski prikaz uticaja fermenta na sniavanje aktivacione barijere ( G1 F G1 )

hemijske reakcije
; je koordinata hemijske reakcije koja oznaava
skup relativnih poloaja svih N atoma l12 , l13 ,...l N 1N u meuatomskim
konfiguracijama (tako da presek G() du nekog lij daje presek energetske
hiperpovri u vidu krive slobodne energije u datoj ravanskoj projekciji
variranih meuatomskih rastojanja i-tog i j-tog atoma)

 Iz reakcije:
gde je S supstrat, P produkt, Fo ferment i F1 fermentno-supstratni kompleks
- dobija se Mihaelis-Mentenova jednaina za brzinu hemijske reakcije

k 2C S C F
vm C S
v

,
K M CS
K M CS
gde je Cs koncentracija supstrata S, CF koncentracija fermenta F i KM
Mihaelisova konstanta (v. Zad. 1)

ematski prikaz zavisnosti brzina fermentativnih reakcija

 Kooperativne fermentativne reakcije:

Molekul fermenta se moe nalaziti u tri stanja:
F00 (oba centra slobodna), F01= F10 (jedan
centar zauzet supstratom, drugi slobodan) i
F11 (oba centa zauzeta supstratom)
ema kooperativne
fermentativne reakcije

Brzina kooperativnog obrazovanja produkta P dobija se u obliku (v.

Zad. 2):

C S K
v 2k 2C F C S 2
,
2
C S 2 KC S K

Za = = 1 izraz se svodi na Mihaelis-Mentenov izraz za brzinu

nekooperativnog obrazovanja produkta
Kooperativnost procesa objanjava se postojanjem kvaternarne
strukture fermenta

ema obrazovanja ferment-supstrat kompleksa posredstvom

indukovane strukturne korespondencije:
(a) ferment i supstrat pre interakcije
(b) fermentno-supstratni kompleks (FSK)
(c) i (d) nemogunost obrazovanja FSK za molekule manje od
supstrata mada njemu sline po obliku

Konformaciona svojstva fermenata

Konformaciona labilnost proteina obezbeuje mogunost njegove
specifine interakcije sa supstratom
Molekularno prepoznavanje odigrava se posredstvom
konformacionih transformacija ime se ostvaruje strukturna
korespodencija fermenta i supstrata
Elektronskokonformacione interakcije (EKI) imaju najvei znaaj
za fermentativnu katalizu
Smanjenje energije aktivacije posledica je irenja parabole pod
dejstvom dodatne sile pritiska elektrona, to dovodi do pomeranja
take preseka sa susednom parabolom (Ga ' ), v. narednu Sliku
Ubrzanje biohemijske reakcije rezultat je snienja aktivacione
energije

ematski prikaz dva semi-klasina modela EKI, sa elektronima u

(a) pravougaonoj potencijalnoj jami sa beskonano visokim pokretnim
zidovima i (b) parabolinoj potencijalnoj jami sa pokretnim zidovima

Semi-klasini model EKI i biomolekularnog prepoznavanja

Dozvoljene vrednosti energije 2n elektrona na n nivoa jame izraunavaju se
primenom de Broljijevog uslova stojeih elektronskih talasa u jami irine L:

e
L , (n 1,2,...);
2

S druge strane je talasna duina elektrona e data de Broljijevom relacijom

h
h
e

.
p e me v e
Kombinovanjem prethodna dva izraza dobija se brzina elektrona ve=nh/2meL
pa je energija elektrona u jami jednaka 2

me v e
n2h2
Ee

.
2
2
8m e L

Odatle se moe izraunati sila pritiska elektrona

na zid jame,
2 2

fe

dE e
n h

.
3
dL
4me L

Promenom ravnotee (pobuenjem elektrona (raste n), ili dodavanjem

elektrona sistemu (raste broj elektrona, odnosno broj udara u zid jame),
zidovi jame se pomeraju u novi ravnoteni poloaj (L + L) odnosno rad za
premetanje jezgara (feL) vri se na raun umanjenja energije elektrona -

Kvantni model EKI i biomolekularnog prepoznavanja

Dva otvorena pitanja semi-klasino postavljenih problema u molekularnoj
biofizici jesu:
(i) Nerazumno dugo vreme potrebno za izmenu biomolekularnih konformacija
(Levintal, 1968),
(ii) Dugodometna usmerenost selektivnih procesa biomolekularnog
prepoznavanja.
Kvantnomehanika reenja ovih otvorenih pitanja sugeriu:
Teorija neradijativnih rezonantnih strukturnih prelaza (Gribov, 2001), kroz
intermedijarne kvantno-koherentne superpozicije okruenjem pobuenih
elektronsko-vibracionih stanja reagenata u molekularnim reakcijama,
Model kvantne dekoherencije (Rakovi et al, 2004-6), kroz okruenjem
indukovane konformacione prelaze u biomolekularnom prepoznavanju, uz
mogunost razmatranja ovog procesa na nivou cele elije kao Hopfildove
kvantno-holografske asocijativne neuronske mree (sa tretiranjem svih
biomolekula iste vrste u eliji kao dinamiki spregnutih identinih kvantnih
estica, implicirajui time dublji kvantni holizam elije),
Model rezonantnog prepoznavanja RRM (osi, 1997; Veljkovi, 1980),
baziran na otkriu da informacioni biomolekuli i njihovi supstrati imaju isti
zajedniki RRM-frekventni pik ali skoro suprotne faze.

Perspektive za molekularnu elektroniku

i nanomedicinu
Molekularno prepoznavanje ferment-supstrat moe imati veoma znaajne
tehnoloke implikacije u molekularnoj elektronici & nanomedicini.
Analogni bioipovi mogli bi koristiti enzime kao inteligentne
molekularne prekidae
Negativno svojstvo ovih analognih molekularnih prekidaa je da enzimi
funkcioniu relativno sporo
Ovi analogni prekidai bi se mogli efikasno koristiti kao biosenzori za
prepoznavanje supstrata
Bioipovi se mogu napraviti, ali je potrebno reiti jo mnoge praktine
probleme

 Vetake nanostrukture (poput nanoestica i nanonaprava) mogu

kontrolisano interagovati sa biomolekulima istih veliina, kako na povrini
tako i unutar elije.
Nanomedicina je primena nanotehnologija u zdravstvu, i ine je tri
meusobno povezana pravca: (1) nanodijagnostika; (2) regenerativna
medicina; (3) ciljana dostava lekova.
Nanodijagnostika ima konaan cilj identifikovanja bolesti u to ranijoj
fazi, idealno na novou jedne elije. Da bi se postigao ovaj cilj treba da se
preduzmu aktivnosti u istraivanju i razvoju radi poboljanja efikasnosti in
vivo i in vitro dijagnostike.
Regenerativna medicina je fokusirana na mehanizme vlastitog oporavka
tela u preventivi i leenju hroninih bolesti, poput dijabetesa, osteoartritisa
i degenerativnih oboljenja kardiovaskularnog i centralnog nervnog
sistema, i pomoi rtvama povreda.
Ciljana dostava lekova ima za cilj razvoj novih tehnika dostave lekova
radi efikasnijeg transporta leka na mesto bolesti, poboljane reakcije
pacijenata, smanjenja cene zdravstvene nege, ali i zbog identifikovanja
novih naina dostave novih klasa medikamenata koji ne mogu biti
efikasno dostavljeni konvencionalnim sredstvima.

Metode karakterizacije biopolimera

Hemijske metode deifruju primarnu strukturu biopolimera,
strukturu aktivnih centara proteinskih globula itd, ali ne mogu
deifrovati prostornu strukturu proteina i nukleinskih kiselina
Fizike metode odreuju molekulsku teinu biopolimera, njihovu
sekundarnu, tercijarnu i kvaternarnu strukturu
Molekulska teina izgraivakih molekula biomaterijala odreuje
se metodom masene spektroskopije, mada se koriste i druge metode
poput osmometrije, viskozimetrije, sedimentacije u centrifugi, rasejanja
svetlosti.
Prostorna struktura biomaterijala odreuje se metodama difrakcije
(rentgenska, neutronska, elektronska), mikroskopije (optika,
elektronska, skenirajuom probom) i spektroskopije (elektronske,
vibracione, magnetne).

Metode karakterizacije molekulske teine

Masena spektroskopija zasnovana je na odreivanju specifinog
naelektrisanja (q/m) jonizovanih biomolekula, merenjem na fotoluminiscentnom zaklonu poloaja horizontalnog otklona (r = mv/qB)
jona poznate brzine (v) u magnetnom polju (B) normalnom na njihovu
krunu Lorencovu trajektoriju.

Prikaz skretanja jona po krunoj trajektoriji u

masenom spektrografu, usled delovanja Lorencove sile

 Osmometrija je zasnovana na merenju osmotskog pritiska (posm)

rastvora biomaterijala. Odatle se moe odrediti molekulska teina
biomolekula (M) iz Vant-Hofovog zakona: posm/C = RT/M (C je
koncentracija rastvora u g/cm3).
Viskozimetrija je zasnovana na merenju viskoznosti rastvora (),
viskoznosti istog rastvaraa (0), i odreivanju karakteristine
viskoznosti rastvora biomaterijala ([] = lim( - 0)/0C, C0).
Molekulska teina biomolekula odreuje se iz relacije [] = AM, gde se
parametri a (0,5 a 1, zavisno od promoivosti klupka biomolekula) i
A odreuju drugim metodama.
Sedimentacija u centrifugi sastoji se od taloenja biomolekula pod
dejstvom centrifugalne sile u ultracentrifugi (sa ekvivalentnim
ubrzanjima 350.000 g). Kiveta sa rastvorom biomaterijala ima prozrane
kristalne kvarcne zidove, to omoguava optiku registraciju brzine
kretanja prelazne zone izmeu istog rastvaraa i rastvora
biomaterijala. Molekulska teina biomolekula dobija se iz Svedbergove
formule: M=RTs/(1-0/M)D, gde je D koeficijent difuzije biomolekula u
rastvoru, M gustina biomolekula, 0 gustina rastvaraa, s koeficijent
sedimentacije.

 Rasejanje svetlosti u rastvoru biomaterijala zavisi od molekulske teine

biomolekula. Zbog rasejanja, intenzivnost upadnog snopa (I0) slabi po
zakonu:

I Ioe

gde je l debljina sloja rastvora kroz koji prolazi svetlosni snop, a

koeficijent mutnosti rastvora: = 8HCM/3 (tu je H poznata funkcija n0 i n
(indeksa prelamanja rastvaraa i rastvora), C (koncentracije rastvora) i v
(talasne duine svetlosti)). Molekulska teina biomolekula (M) odreuje
se iz koeficijenta mutnosti rastvora ().

Difrakcione metode karakterizacije

Rentgenska difrakcija koristi efekat
difrakcije X-zraka ( x ~ 0,1 nm) na
kristalnoj reetki, gde se difrakcioni
maksimumi ostvaruju pod uslovom
da se rasejani zraci na kristalnim
ravnima nalaze u fazi odakle sledi
Bragov zakon: n x = 2dsin ( x je
talasna duina X-zraka, d rastojanje
izmeu kristalnih ravni na kojima se
ostvaruje difrakcija, difrakcioni
ugao izmeu pravca upadnog Xzraka i kristalne ravni pri kome se
ostvaruje difrakcioni maksimum,
n = 0,1,2, ...).
U sluaju sloenih kristalnih struktura, sa vieatomskim bazisom od s
razliitih atoma u primitivnoj eliji, neophodno je uraunati i geometrijski
strukturni faktor: SK = j fj exp(iKdj) (gde sumiranje ide po svim bazisnim
atomima, j = 1,2,...,s; fj je atomski form faktor j-tog atoma u bazisu, K vektor
translacije reciprone reetke, a dj vektor poloaja j-tog atoma bazisa
primitivne elije) - koji modifikuje intenzivnost difrakcionih maksimuma, ime
je mogue odrediti raspodelu elektronske gustine u kristalu.

 Neutronska difrakcija koristi termalne neutrone male energije

(En 0,08 eV) koji imaju talasnu duinu reda meuatomskih rastojanja
u kristalu ( n 0,1 nm). Za razliku od difrakcije X-zraka, ona
omoguava odreivanje poloaja atoma vodonika (H) na kojima se
termalni neutroni intenzivno rasejavaju, to se uoava na neutronskom
difraktogramu. Neutronsko rasejanje je pogodno i za odreivanje
vodoninih veza, to je od velikog znaaja za biomaterijale.
Elektronska difrakcija koristi spore elektrone male energije
(Ee 150 eV), koji imaju talasnu duinu reda meuatomskih
rastojanja u kristalu ( e 0,1 nm). Zbog svoje male energije i jakih
kulonovskih odbojnih interakcija sa elektronskim omotaima atoma
ispitivanog biomaterijala, spori elektroni prodiru plitko u uzorak, usled
ega je njihova difrakciona slika skoro iskljuivo odreena povrinskim
atomima kristalnog uzorka, pa se ova metoda koristi za karakterizaciju
povrine biomaterijala.

Mikroskopijske metode karakterizacije

OPTIKA / METALOGRAFSKA MIKROSKOPIJA jedna je od
najprostijih metoda za ispitivanje makroskopskih detalja prostorne
strukture materijala.
Poto je talasna duina vidljivog zraenja v ~ 10-10 nm, to je zbog
difrakcije njena mo razdvajanja ograniena na detalje strukture istog
reda veliine, to spada u domen ispitivanja makroskopskih defekata.
Ova metoda naroito je pogodna za ispitivanje povrinske strukture
neprovidnih biomaterijala, kao i za izuavanje strukture u tenokristalnim fazama, posebno ispitivanjem u polarizovanoj svetlosti.

ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA koristi talasna svojstva elektrona,

omoguavajui istraivanje detalja prostorne strukture i do nekoliko meuatomskih rastojanja. Najznaajnije varijante elektronske mikroskopije jesu
skenirajua elektronska mikroskopija i transmisiona elektronska
mikroskopija.
Skenirajua elektronska mikroskopija (SEM) jedna je od najvie
korienih metoda u karakterizaciji biomaterijala. SEM ureaji rade na
uveanjima od 10 do preko 300.000, a osim morfologije ispitivanog
biomaterijala u mogunosti su da prue preciznu informaciju o hemijskom
sastavu biomaterijala u blizini njegove povrine.
U tipinom SEM eksperimentu generie se snop primarnih elektrona
fokusiran u fini spot prenika priblino 5 nm, sa energijama elektrona koje
variraju od 100 eV do 50.000 eV.
U sluaju neelastinog rasejanja primarni elektroni predaju deo svoje
energije elektronima u materijalu, ime se stvaraju uslovi za njihovu emisiju
kao sekundarnih elektrona koji obino imaju energiju manju od 50 eV.
Deo neelasino predate energije primarnih elektrona dovodi i do
izbacivanja elektrona iz elektronskih ljuski atoma, a tako pobueni atomi
deeksituju se u osnovno stanje ili emisijom fotona karakteristinog Xzraenja ili emisijom Oeovog elektrona.
Deo elastino rasejanih primarnih elektrona vraa se iz materijala kroz
povrinu kao kontrarasejani elektroni sa verovatnoom proporcionalnom
atomskom broju regiona biomaterijala razliitog sastava.

 Transmisiona elektronska mikroskopija (TEM) ima izuzetno veliki

opseg uveanja od 50 do 106 puta i mogunost dobijanja slike
biomaterijala veoma visoke rezolucije, zajedno sa elektronskim
difrakcionim podacima.
U tipinom TEM eksperimentu primarni elektroni se ubrzavaju do
energija od 100 keV do 1 MeV (e ~ U-1/2 0,1 nm) i usmeravaju na tanak
uzorak biomaterijala (do 200 nm).
Neelastino rasejanje dela primarnih elektrona na nehomogenostima u
materijalu (granice zrna, dislokacije, defekti, prisustvo druge faze, ...)
proizvodi lokalne prostorne varijacije u intenzitetu transmitovanog
elektronskog snopa i omoguava dobijanje klasine elektronske
transmisione slike biomaterijala.
Elastino rasejanje dela primarnih elektrona na kristalnoj reetki
materijala odgovorno je za nastanak difrakcionih slika biomaterijala.

snimak prelomne povrine -PLLA kompozita (rezolucije ~1 m, levo) i

TEM snimak HAp nanokeramike (rezolucije ~35 nm, desno)

MIKROSKOPIJA SKENIRAJUOM PROBOM (SPM) jeste familija

mikroskopijskih tehnika zasnovanih na razliitim interakcijama probe sa
silama na povrini ispitivanog materijala. SPM je jedina mikroskopijska
metoda koja daje 3D (topografske) slike ispitivanog uzorka u realnom
prostoru.
Skenirajua tunelska mikroskopija (STM)
bazirana je na kvantnom tuneliranju
elektrona izmeu vrha probe (tip od W ili PtIr legure, na piezoelektrinom elementu) i
provodne povrine ispitivanog materijala.
Kada se uspostavi napon U izmeu tipa i
povrine uzorka, dolazi do promene oblika
energetske barijere i do eksponencijalno
opadajue struje tuneliranja elektrona kroz
barijeru: I ~ exp(-kz), gde je z rastojanje
izmeu tipa i povrine, k = [2m(eU-E)]/h
je funkcija primenjenog napona U, m masa
elektrona, e naelektrisanje elektrona, E
energija elektrona, a h Plankova konstanta.
U STM eksperimentu odrava se
konstantnom struja tuneliranja tj. rastojanje
izmeu tipa i povrine, to se softverski
pretvara u raznim takama skenirane x-y
ravni u 3D topografsku sliku povrine.

Princip STM mikroskopije

 Mikroskopija atomskih sila (AFM) razvijena je

za prevazilaenje osnovnog ogranienja STM,
odnosno za istraivanje neprovodnih materijala.
Kod AFM tip se montira na kraju lagane, veoma
elastine i visokoreflektujue ploice (kantiliver)
pod uglom od 90, tako da prati promenu nagiba
kantilivera koji se menja pri paranju tipa po
povrini biomaterijala, ime se menja i ugao
reflektovanog laserskog snopa usmerenog na
kantiliver, to se softverski pretvara u 3D sliku
ispitivanog uzorka.
Na malim rastojanjima izmeu tipa i povrine
materijala predominantan uticaj na vertikalno
pomeranje tipa i savijanje kantilivera ima
kratkodometna van der Valsova interakcija, dok
na veim rastojanjima dominantan uticaj imaju
duedometne elektrostatike i kapilarne sile.
Moderni AFM ureaji koriste kantilivere izuzetno
male mase ime je omoguena detekcija sila
koje deluju na tip ~ 10-18 N. AFM se veoma
mnogo koristi i za lokalizovana merenja
elastinosti i viskoznosti povrine materijala,
odreivanjem zavisnosti sila-rastojanje na
izabranim mestima na povrini biomaterijala.

Princip AFM mikroskopije

SPM podvarijante zasnovane na drugim interakcijama tipa i podloge:

Mikroskopija elektrostatikim silama (EFM) odreuje raspodelu
naelektrisanja na povrini biomaterijala na osnovu lokalnih promena
elektrostatikih sila koje deluju izmeu tipa i povrine,
Mikroskopija magnetnim silama (MFM) prati promene u magnetnoj
interakciji izmeu magnetnog tipa i povrine magnetnog materijala,
Skenirajua termalna mikroskopija (SThM) koristi tip funkcionalizovan
u minijaturni termopar ijim se skeniranjem dobija visokorezoluciona
temperaturska raspodela na ispitivanoj povrini biomaterijala,
Skenirajua kapacitivna mikroskopija (SCM) meri promenu elektrine
kapacitivnosti izmeu tipa i povrine,
Mikroskopija kelvinovom probom (KPM) koristi prostorno lokalizovana
merenja hemijskog potencijala.
Mnoge od pobrojanih metoda kombinuju se zajedno sa STM i AFM u
specifine ureaje koji u jednom postupku (merenju) odreuju visokorezolucionu topografiju povrine materijala i daju prostorno lokalizovane
vrednosti jednog ili vie svojstava materijala.

Spektroskopske metode karakterizacije

SPEKTROSKOPSKE METODE omoguavaju odreivanje poloaja
energetskih nivoa razliitih eksitacija (elektronskih, vibracionih, rotacionih
ili njihovih kombinacija) u ispitivanom uzorku.
Informacije koje se dobijaju od razliitih eksitacija komplementarne su,
dajui potpuniju sliku o strukturi ispitivanog biomaterijala.

ELEKTRONSKA SPEKTROSKOPIJA bazirana je na merenju

karakteristika elektronskih prelaza (energije, intenzivnosti, polarizacije
ili vremena prelaza) u spektrima rasejanja, apsorpcije, prelamanja i
luminiscence infracrvene (IC), vidljive (V), ultraljubiaste (UV) ili
rentgenske (X) svetlosti od strane biomolekula u slobodnom ili
kondenzovanom (vrstom ili tenom) stanju.
Rasejanje svetlosti (od vidljive do X-zraka) omoguava odreivanje
oblika i unutranje strukture biomolekula. Merenjem intenzivnosti
rasejanog snopa (I) pod uglom , u odnosu na upadnu (I0), odreuje se
funkcija rasejanja (P=I/I0), koja se moe i teorijski proraunati za razne
geometrijske oblike (sfera, elipsoid, tap) i njihove meusobne prostorne
rasporede - to je omoguilo odreivanje tercijarne i kvaternarne
strukture nekih proteina.
Apsorpcioni spektri mogu biti elektronski (UV,V) i vibracioni (IC), i
omoguavaju brzu identifikaciju karakteristinih delova primarne (i
sekundarne) strukture biomolekula zbog prisustva karakteristinih
apsorpcionih traka za razliite atomske grupe! Elektronski apsorpcioni
spektri omoguavaju i detekciju rezonantne preraspodele energije i
intenzivnosti pobuenja hromofornih grupa biomolekula (tzv. eksitona) to je posebno osetljivo na strukturni prelaz spirala-klupko kod proteina!

U kondenzovanom stanju, apsorpcioni spektri omoguavaju i odreivanje

veliine i vrste energetskog procepa biomaterijala, nalaenjem energije
apsorpcionog praga upadne svetlosti (promenljive frekvencije) pri kojoj
poinje njena intenzivna apsorpcija, koja karakterie meuzonske
elektronske prelaze u biomaterijalu.

Odreivanje veliine i tipa energetskog procepa biomaterijala iz poloaja

minimalnih energija (a) direktnog i (b) indirektnog prelaza, Eg = min {Edir, Eind}.

 Luminescenca se pokazuje kao

informativna spektroskopija
biomolekula, ne toliko po talasnoj
duini maksimuma traka, koliko
po intenzivnosti, polarizaciji i
vremenu luminesciranja
(naknadnog svetlenja eksitiranog
biomolekula, 1-10 ns, a
ponekad i znatno due).

U osnovi sve luminescentne

tehnike zasnivaju se na
detekciji i analizi emitovanog
EM zraenja iz materijala,
indukovanog spoljanjom
energetskom perturbacijom

Fotoluminescenca se posebno istie prema znaaju i obimu

korienja u karakterizaciji biomaterijala, i deli se na fluorescencu
(prelaz elektrona sa ouvanjem spina) i fosforescencu (prelaz sa
promenom spina).

Hemiluminescenca poiva na hemijskoj reakciji u kojoj se gradi novo

jedinjenje uz emisiju svetlosti. Mnoge hemijske reakcije proizvode i
svetlost i toplotu - ali znatno je manji broj hemijskih reakcija u kojima
se kao proizvod javlja emisija svetlosti bez oslobaanja toplote.

Elektroluminescenca nastaje primenom elektromagnetnog polja,

koje eksitira molekule materijala. Triboluminescenca je poseban vid
elektroluminescence koji se javlja kada se materijal zagrebe, zgnjei
ili mehaniki stresira na bilo koji drugi nain, usled ega dolazi najpre
do prostornog razdvajanja naelektrisanja u materijalu, a posle
odreenog vremena i do rekombinacije uz emisiju fotona (svetlosti).

Radioluminescenca (scintilacija) javlja se usled eksitacije esticama

visoke energije ili radijacijom. U zavisnosti od izvora eksitacije moe
se govoriti o -luminescenci, jonoluminescenci i X-luminescenci.

 Fluorescenca X-zraka (XRF) je od velikog znaaja jer omoguava

kvalitativno i kvantitativno odreivanje sastava biomaterijala (identifikaciju
elemenata i njihovog odnosa u biomaterijalu), ime je mogue odrediti sve
elemente osim H, He i Li.
XRF se zasniva na prethodnom pobuivanju elektrona unutranjih ljuski
primarnim X-zraenjem i potonjoj detekciji i analizi karakteristinih,
sekundarnih X-zraka, emitovanih iz biomaterijala (fluorescentno zraenje)
preraspodelom elektrona spoljanjih ljuski, poto kvadratni koren
karakteristinih linija sekundarnih X-zraka zavisi linearno od atomskog
broja elementa koji ih emituje (Mozlijev zakon).

Prelamanje i apsorpcija
polarisane svetlosti posebno
su znaajni za istraivanje
biopolimera, koji imaju hiralnu
strukturu (nemaju ni centar ni ravni
simetrije, odnosno njihov lik u
ogledalu se ne poklapa sa njima
samima). Pri prolasku linijski
polarisane svetlosti (talasne
duine ) kroz sloj biopolimernog
rastvora (debljine l), ravan
polarizacije rotira za realni deo
kompleksnog ugla rotacije ravni
polarizacije (nL i nD su indeksi
prelamanja a L i D koeficijenti
apsorpcije za levo- i desnocirkularno polarisanu svetlost):

(nL nD ) i ( L D )

 VIBRACIONA SPEKTROSKOPIJA bazirana je na uporednom proraunu

i merenju karakteristika vibracionih prelaza (energije, intenzivnosti,
polarizacije) u meusobno komplementarnim spektrima rasejanja i
apsorpcije infracvene svetlosti od strane biomolekula u slobodnom ili
kondenzovanom (vrstom ili tenom) stanju.
* Ramanovo rasejanje ima visoku rezoluciju, i omoguava odreivanje
prostorne strukture, raspodele elektronske gustine, i elektronskovibracionih (elektron-fonon) interakcija kako kod biomolekula (posebno
onih sa hromoforama, kod kojih se primenjuje rezonantno Ramanovo
rasejanje, sa laserskom pobudom u domenu apsorpcije hromofora), tako
i u nadmolekularnom kondenzovanom stanju.
* Apsorpcioni spektri zbog prisustva karakteristinih infracrvenih
apsorpcionih traka atomskih grupa, omoguavaju brzu identifikaciju
karakteristinih delova molekularne primarne (i sekundarne) strukture
biomolekula.
ROTACIONA SPEKTROSKOPIJA od manjeg je praktinog znaaja,
zbog nedovoljne monohromatinosti dananjih optikih ureaja, to po
redu veliine daleko prevazilazi finu rotacionu strukturu spektralnih linija.

 MAGNETNA SPEKTROSKOPIJA bazirana je na merenju rezonantnih

apsorpcionih linija magnetnih dipola, i zbog velike osetljivosti magnetnih
dipola na lokalno magnetno okruenje odgovarajue metode nuklearne
magnetne rezonance (NMR) i elektronske paramagnetne rezonance
(EPR) imaju veliki znaaj u karakterizaciji biomolekula.
Nuklearna magnetna rezonanca (NMR) ima ogromnu primenu na
biomolekulima koji sadre atome elemenata sa neiezavajuim totalnim
momentom jezgra J. Princip NMR-spektroskopije je da u stalnom
magnetnom polju indukcije B dolazi do uklanjanja (2J+1)-struke
degeneracije spinskih nivoa jezgra, pri emu je cepanje spinskih
energetskih nivoa jednako E = gn nB, gde je gn nuklearni Landeov
faktor, a n = e/2mn nuklearni magneton (mn je masa a e naelektrisanje
elektrona).
Ovo cepanje je mogue registrovati pomou rezonantne apsorpcije
fotona uestanosti = gn nB/h 108 Hz (za B 10 T). Magnetna
indukcija B ne mora biti samo spoljanja, ve moe biti uslovljena i
dipolnim magnetnim momentom susednih jona u biomolekulu - to daje
kvantitativnu informaciju o rasporedu i interakcijama atomskih jezgara
biomolekula. Primenom NMR-spektroskopije na izotope 31P i 13C
prouena je dinamika izmene ATP pri kontrakciji miia, to moe biti od
znaaja i u kardiologiji; osim toga, izuena je i konformacija biomolekula,
interakcija ferment-supstrat, antigen-antitelo, itd).

 Elektronska paramagnetna rezonanca (EPR)

ima ogromnu primenu kod biomolekula sa
slobodnim radikalima ili sa neparnim brojem
elektrona, tako da je rezultujui spin atoma ili
atomske grupe S = 1/2. U polju magnetne
indukcije B ovaj spinski nivo se cepa na 2
energetska nivoa (v. Sliku), sa energijom
cepanja E = ge BB, gde je ge elektronski
Landeov faktor, a B = e/2me Borov magneton.
Ovo cepanje se registruje rezonantnom
apsorpcijom fotona uestanosti = ge BB/h
1011 Hz. I u ovom sluaju magnetna polja
susednih jezgara utiu na cepanje linija i
pojavu hiperfine strukture u EPR-spektru.
EPR-spektroskopija primenjuje se za
izuavanje fermentativnih procesa sa ueem
slobodnih radikala, strukture proteina sa
metaloorganskim aktivnim centrima
(hemoproteina), kao i uopte biomolekula u
koje se vetaki ubacuju slobodni radikali
(tzv. spinske mete)!