1.

Znaaj hemijske i mikrobioloke kontrole namirnica

Zdravlje nije samo odsustvo bolesti ve i puno psihiko i ekonomsko blagostanje u zdravoj okolini (SZO)

Uloga hrane u ivotu ovjeka je viestruka: Gradivna Energetska Biohemijska Zatitna

Socijalna Pored toga na organizam negativno djeluju mnoge strane materije koje se mogu unijeti zagaenom hranom i vodom Smatra se da postoji oko 60.000 kontaminata hrane i vode. Najtee posljedice unoenja stranih materija su:

Teratogene Mutagene Kancerogene Alergijske Oteenje brojnih vitalnih sistema, organa i tkiva

Uloga namirnica u ishrani zavisi od: Kvalitativnog sastava Kvantitativnog sastava i Zdravstvene ispravnosti

Kvalitet namirnica ukljuuje skup svih bitnih svojstava koji utiu na njenu upotrebljivost u ishrani ljudi. U cilju zatite zdravlja ljudi vri se kontrola kvaliteta hrane. U svim zemljama propisuju se uslovi odgovarajuim zakonima, standardima i pravilnicima, koje moraju da ispunjavaju prehrambeni proizvodi da bi mogli da se stave u promet. Hemijski sastav jedne te iste namirnice moe da bude jako promjenjljiv, s toga hemijski sastav mora da odgovara hemijskom sastavu koji je deklarisan, to se utvruje odgovarajuom analitikom metodom. Redovnim ispitivanjem koliine i sastava energetskih gradivnih i zatitnih materija utvruje se energetska i bioloka vrijednost namirnica.Ovim putem se uskrauje mogunost falcifikovanja namirnica i ugroavanje zdravlja potroaa svodi na minimum. Kada je u pitanju hemijski sastav namirnica pravilnicima su definisane Minimalne i

Maksimalne koliine

kao i materije koje ne smiju da sadre, npr. za ocjenu kvaliteta vitaminiziranog margarina isti mora da sadri najmanje 80-90% masti, 2000 IJ vitamina A, 200 IJ vitamina D i 15 mg vitamina E u 100gr proizvoda Pored hemijskog ispitivanja vri se i organoleptiko ispitivanje radi utvrivanja ukusa, mirisa boje i izgleda za dati proizvod. Zadatak analitiara- Sanitarnog inenjera je da na osnovu rezultata laboratorijske analize utvrdi da li proizvod po svom sastavu i osobinama odgovara deklaraciji i odgovarajuim zakonskim propisima. Zdravstvena ispravnost namirnica U namirnicama se mogu nai i brojne druge strane materije tu prije svega spadaju:

Mikroorganizmi i njihovi toksini Aditivi

Rezidui kontaminata Pod higijenski neispravnim namirnicama podrazumijevaju se one koje su zagaene: Patogenim mikroorganizmima Antibioticima Hormonima Mikotoksinima Aditivima u mjeri u kojoj nisu dozvoljeni Izmijenjenim organoleptikim osobinama Kontaminirane radioaktivnim materijama ili da su ozraene iznad dozvoljene granice. Namirnice moraju da zadovoljavaju sve zakonske norme predviene propisima o kvalitetu i zdravstvenoj ispravnosti da bi se mogle staviti u promet i bezbjedno koristiti u ishrani. Kod analize namirnica provodi se:

Hemijska kontrola Mikrobioloka kontrola i Radioloka kontrola

2.Uzimanje uzoraka namirnica za analizu

Uzimaju se uzorci namirnica za: organoleptiku

fiziko-hemijsku

mikrobioloku analizu. Zajedniki princip kod svih uzimanja je da uzorak predstavlja prosjek kojim se najbolje reprezentuje namjernica od koje potie.Uzorci se uzimaju u proizvodnji i prometu.

Uzorci uzeti u proizvodnji moraju da predstavljaju odgovarajuu koliinu koja se moe identifikovati tj. utvrditi njeno porijeklo,vrijeme proizvodnje, tehnoloke operacije i drugi relevantni podaci znaajni za identifikaciju. Uzorci iz prometa se uzimaju u ambalanim jedinicama iji pojedinani broj mora da bude srazmjeran veliini i koliini od koje potiu pojedinana pakovanja.

Tabela 1. Broj ambalanih jedinica koje se uzimaju kao uzorci za analizu Zapremina ambalnih Koliina ambalanih jedinica jedinica Broj uzoraka

Do 1 litra

Do 5000 za svakih daljih 3000

Najmanja po 1 Najmanje po1

Vee od 1 litar

Do 10.000 Za svakih daljih 5000

Najmanje po 1 Najmanje po1

Prilikom uzimanja uzoraka pie se zapisnik koji mora da sadri: ime vlasnika, odnosno proizvoaa vrijeme uzimanja vrstu pregleda koji se trai koliinu namirnice od koje je uzet uzorak koliinu uzetog uzorka i nain uzimanja uzorka od sporne namirnice nain uskladitenja nain uvanja namirnice i druge okolnosti koje mogu biti od znaaja pri davanju miljenja o namirnicama. Uzimaju se dva uzorka i to: za analizu

za super analizu Na zahtjev stranke moe da se uzme i trei uzorak.Zapisnik o uzimanju uzoraka sastavlja se u tri primjerka, od kojih dva zadrava organ koji uzima uzorke, a trei daje licu koje je prisustvovalo uzimanju uzorka.Uzorci koji se uzimaju stavljaju se u suhe i potpuno iste posude. Pripremanje uzoraka za fiziku ihemijsku analizu se razlikuje utoliko o kojoj namirnici se radi (Mi emo navesti primjer mlijeka kao namjernice koja se svakodnevno koristi)

Hemijskom analizom mlijeka odreuje se koliina pojedinih sastojaka i to:voda, suha materija, mlijena mast, bjelanevine, laktoza i mineralne materije. Poseban znaaj u kontroli mlijeka ima odreivanje enzima: oksoidoreduktaze fosfataze Katalaze

Od fizikih metoda najee se koristi odreivanje: gustine mlijeka indeks prelamanja svjetlosti taka mrnjenja Na osnovu navedenih analiza utvruje se kvalitet mlijeka, dobijaju informacije o higijenskoj ispravnosti (oksido-reduktaze) i provjera termike obrade mlijeka (fosfsteze i peroksidaze). Organoleptiki pregled esto ima odluujuu ulogu. Prednost ovog pregleda je to se za relativno kratko vrijeme dobije vie podataka o namirnici: ukus (kiseo, slan, gorak, bljutav)

miris (kiseo, otar, uegao, bu, miris lijekova itd.) boja (crvena, uta, plaviasta) konzistencija (zgruano, sluzavo, vodenasto) izgled namirnice (prisustvo grube neistoe, dlaka, hrane i prostirke)

Ljudska ula su osjetljivija od najpreciznijih instrumenata, te ona predstavlja nezamjenjljivu metodu za ocjenu kvaliteta namirnice. Bitno je da svako ko se bavi organoleptikim pregledom razlikuje etiri osnovna ukusa: slano, gorko, slatko i kiselo zatim da ima osjetljivo ulo mirisa i normalan vid.

3.Najznaajniji kontaminati u namirnica

Analitiaru-sanitarnom inenjeru su u analizi razliitih rezidua u namirnicama neophodne osnovne informacije o njihovim osobinama, o opasnosti koju predstavljaju po zdravlje ljudi i putevima njihovog ulaska u lanac ishrane.Dobijeni analitiki podaci o stepenu zagaenosti namirnica slue za procjenu zdravstvene ispravnosti namirnica i njihove upotrebljivosti u ishrani ljudi i ivotinja, kao i procjeni izloenosti stanovnitva djelovanju pojedinih kontaminata radi preduzimanja mjera zatite

od daljeg zagaivanja. Kontaminati koji mogu biti prisutni u namirnicama su veoma brojni, razliite strukture, fiziko-hemijskih osobina, porijekla i toksinosti.

Rezidui pesticida u namirnicama u koje spadaju: Organofosforni pesticidi Karbamati Organohlorni pesticidi sa svojim predstavnicima: a) DDT b) Lindan c) Derivati ciklodiena d) Endosulfan e) Heksahlorbenzen Fungicidi Herbicidi Rezidui hlorovanih fenola Rezidui hlorovanih derivata benzena Rezidui hlorovane siretne kiseline Rezidue polihlorovanih bifenila (PCB) Rezidue polibromovanih bifenila (PBB) Rezidue halogenovanih alkana i alkena Rezidue aromatinih ugljikovodonika Rezidui policiklinih aromatinih ugljikovodonika Mikotoksini Rezidui neorganskih kontaminata Rezidui veterinarskih lijekova Prirodni toksini i tetni sastojci namirnica Rezidue pesticida u namirnicama Radi zadovoljenja rastuih potreba za hranom koriste se razne agrotehnike mjere, u koje spada upotreba velikogbroja hemijskih sredstava. U nastojanju da se poveaju prinosi korisnih biljnih kultura i sauvaju proizvedene koliine namirnica od propadanja koriste se hemijske supstance poznate pod nazivom pesticidi. Pod pesticidima se podrazumijevaju hemijska sredstva koja se upotrebljavaju protiv uzronika biljnih bolesti,tetnih insekata, nematoda, glodara, ptica, za suzbijanje korova ili za regulisanje rasta biljaka. Koriste se i za unitavanje tetoina i gljivica u uskladitenim namirnicama. Pesticidi slue i za unitavanje insekata i drugih prenosilaca uzronika zaraznih

bolesti ljudi i ivotinja, kao i parazita kod ljudi i ivotinja. Najznaajniji primjeri medicinske upotrebe pesticida su suzbijanje epidemije tifusa, malarije i bolesti spavanja. Prema zvaninim podacima FAO u koliko se ne bi koristili pesticidi samo u toku jedne godine biljne bolesti, tetni insekti i korovi smanjili bi svjetsku proizvodnju hrane za 25 do 30%, a gubici uskladitenih namirnica poveali bi se za jo 10 do 15%.

U borbi protiv 10.000 vrsta insekata, 10.000 vrsta gljivica, 500 vrsta virusa, protiv nekoliko stotina vrsta glodara, pueva, grinja i nekoliko stotina vrsta tetnih biljnih korova, koriste se stotine jedinjenja u obliku velikog broja razliitih preparata: praka emulzije suspenzije rastvora gasoviti oblici itd. Prema namjeni pesticidi se dijele na nekoliko osnovnih grupa: insekticidi herbicidi fungicidi nematocidi akaricidi rodenticidi antihelmintici defolijanti desikanti Otra granica izmeu pojedinih grupa ne postoji, jer pojedini pesticidi mogu istovremeno da djeluju na vie vrsta tetoina. Pojedine grupe pesticida se esto klasificiraju prema svom hemijskom sastavu, stepenu toksinosti, nainu primjene, itd. Pesticidi se najee koriste za zatitu nadzemnog ili podzemnog dijela biljke, zatim za zatitu sjemena. Pri zatiti nadzemnog dijela biljke pesticidi se primjenjuju prskanjem ili zapraivanjem a za zatitu podzemnih dijelova posipa se zemljite pred sjetvu U racionalnom tretmanu biljke potrebno je na osnovu pregleda zasada, brojnosti vrste, tetoina i simptoma bolesti izvriti izbor odgovarajueg pesticida. Prilikom tretmana biljnih kultura preparatima pesticida vei dio aktivne supstance se mehaniki uklanja i odlazi u zemljite ili vodotokove, ili se dijelom razgrauje, ali se izvjesna koliina moe trajno zadrati u biljnom tkivu iz kojeg preko hrane moe dospjeti u organizam ljudi i ivotinja.

Ova koliina pesticida koja se trajno zadrava na tretiranim biljkama naziva se kao rezidualna koliina pesticida. Prema SZO rezidui predstavljaju zaostale koliine aktivne supstance,njenih metabolita i neistoa. Nekontrolisana upotreba pesticida dovodi do neeljenih posljedica za zdravlje ljudi. Dugotrajna upotreba namirnica koje sadre rezidue pesticida moe da dovede do veoma tekih poremeaja usljed hroninog trovanja organizma. U toksikolokoj hemiji se prouavaju toksikoloke osobine pojedinih grupa pesticida koji mogu biti uzrok akutnih trovanja.U okviru zdravstvene ispravnosti namirnica ukazuje se na puteve ulaska pesticida u lanac ishrane i izloenosti humane populacije njihovim rezidualnim koliinama preko hrane, kao i mogunosti njihove identifikacije i odreivanja u hrani. Koliina rezidua pesticida u namirnicama zavisi od njihove perzistencije. Perzistencija predstavlja vrijeme zadravanja nekog pesticida u prirodnoj sredini i ona zavisi od hemijskih, fizikih i biolokih faktora. Nivo pesticida u namirnicama zavisi i od potovanja karence pesticida. Karenca predstavlja period od primjene pesticida do berbe ili sjetve biljne kulture.

Poznavanje i pridravanje perioda karence utie na nivo rezidua pesticida u gotovim proizvodima i poeljno je da bude ispod granice tolerancije. Karenca pesticida je utvrena za sve aktivne materije koje se u veem broju oblika i preparata nalaze na tritu. Za insekticide karenca se kree od 7 do 42 dana, to je sluaj i kod fungicida. Pored karence postoji i radna karenca. Za veinu pesticida ona se kree od 1 do 7 dana. Ulazak pesticida u lanac ishrane

Organofosforni pesticidi Ova grupa pesticida obuhvata vie od 40 srodnih jedinjenja koja se koriste protiv insekata i nematoda. Otkriveni su 1937 godine. Opta formula ove grupe pesticida je:

R1 i R2 predstavljaju alkil, aril, amidne grupe, a X predstavlja kiselinski ostatak (fenol, cijanidna, enolna grupa, halogen). U ovu grupu jedinjenja, pored estara fosforne kiseline, spadaju i estri tiofosforne kiseline u kojima je atom kisika zamijenjen sumporom, kao estri ditiofosforne kiseline. Estri fosforne kiseline su poznati kao snani otrovi i njihovo toksino djelovanje se zasniva na inhibiciji enzima acetilholinesteraze, usljed ega se nagomilava endogeni acetilholin. Iako ovu grupu pesticida ine veoma toksina jedinjenja, njihovi rezidui u namirnicama su rijetki, zato ne predstavljaju veliku opasnost po zdravlje ljudi. Karbamati Karbamati su uglavnom estri monometil i dimetil karbonske kiseline (HO-CO-NH2). Koriste se kao insekticidi, akaricidi, herbicidi. U prometu se nalazi 25 jedinjenja iz ove grupe pesticida. Djeluju na slian nain kao organofosforni pesticidi Najpoznatija jedinjenja u ovoj grupi pesticida su karbaril i cineb, ali se cineb vie koristi kao fungicid.

Organohlorni pesticidi U ovu grupu pesticida spadaju derivati dihlor-dibenzoetana (DDT, DDD, metoksihlor idr.) Organohlorni pesticidi sa ekolokog stanovita predstavljaju mnogo vei problem. Ova jedinjenja zahtijevaju nerastvorljivost u vodi i visokoj stabilnosti prema dejstvu fizikih hemijskih i mikrobiolokih agenasa, veoma su efikasni pesticidi, ali se godinama zadravaju u vanjskoj sredini, ime je omogueno njihovo irenje vodom i vazduhom. Ova jedinjenja su rastvorljiva u mastima to omoguava njihovu kumulaciju u lipidima (mozak, jetra) Fungicidi Fungicidi su sredstva koja se koriste u borbi protiv plijesni i gljivica i oni ine 1/3 svih upotrebljivih pesticida. Oni predstavljaju soli bakra, ive, derivati ftalimida itd. Fungicidi su citotoksini to je osnova njihovog djelovanja, uz to su jo i mutageni. Kao primjer nekih fungicida naveemo organska jedinjenja ive(fenil iva II i fenil iva II hlorid). Ova jedinjenja su najtoksinija meu fungicidima, te su 1992 izbaena iz upotrebe u veini zemalja. Herbicidi Herbicidi su sredstva namijenjena unitavanju korovskih biljaka.Prema nainu djelovanja dijele se na: kontaktne i translokacione Prema karakteru djelovanja na -selektivne -kontaktne i -totalne Prema stepenu stabilnosti na -veoma stabilne -stabilne i -umjereno stabilne Ove materije su koritene u vijetnamskom ratu za unitavanje cjelokupnog bilja.

5.MIKOTOKSINI
Predstravljaju sekundarni proizvodi metabolizma nekih vrsta plijesni i gljivica koji nastaju tokom njihovog rasta na razliitim supstratima. Poznato je vie od 100.000 razliitih plijesni, od koje su

neke viestruko korisne, neke niti tetne , niti korisne ovjeku, a neke su veoma tetne i opasne. Smatra se da oko 200-300 razliitih vrsta plijesni produkuju mikotoksine. U svijetu je zabiljeen veliki broj sluajeva masovnih trovanja mikotoksinima. Procjenjuje se da je danas oko 25% svjetske godinje proizvpdnje kontaminirano mikotoksinima. Oni se javljaju u svim dijelovima svijeta kao kontaminanti stone hrane i namirnica. Neki od njih znaajno utiu na ekonomske resurse, ali i na zdravstvenu bezbjednost hrane. Poznato je da vei broj plijesni iz rodova:

Aspergilus Penicilium i Fusarium, se javljaju kao kontaminanti namirnica

Nijedan dio svijeta nije bezbjedan od ovih, tzv. "tihih ubica" a njihov negativni uticaj za ljudsko zdravlje i poljoprivredu su ogromni.Stvaraju toksine metabolite. Mikotoksini nastaju razvojem plijesni na itnim poljima, u skladitima ili tokom prerade i uvanja namirnica.U toplijim klimatskim uslovima se uglavnom formiraju afla- toksini i fumonizini, dok se u hladnijim oblastima formiraju ohratoksini, zearalenon, vomitoksin, T-2 toksin i drugi. Poznavanje geografskog porijekla uvezenih namirnica moe imati veliki znaaj za pravilnu analizu mikotoksina koje e sanitarni ininjer analitiar ciljano traiti u dostavljenom materijalu. Ulazak mikotoksina u lanac ishrane Plijesni izluuju mikotoksine preko micelija koji moe da difunduje u dublje slojeve namirnica i da ih kontaminira. Namirnice i stona hrana predstavljaju odlian supstrat za razvoj plijesni, te ba oni pradstavljaju veliku mogunost unoenja mikotoksina u organizam. Razlikuju se primarne i sekundarne mikotoksikoze u zavisnosti od naina ulaska mikotoksina u lanac ishrane (SL-1). Primarne toksikoze kod ljudi uglavnom izaziva konzumiranje biljne hrane i mesnih proizvoda. Konzumiranje pljesnive stone hrane moe dovesti do primarnih toksikoza kod ivotinja. Mikotoksini koje domae ivotinje unesu u organizam, podvrgavaju se procesu metabolizma i nakon toga mogu prei u mlijeko, miie i razne druge organe ime i oni postaju kontaminirani i na taj nain mogu ugroziti ljudsko zdravlje (sekundarne mikotoksikoze), npr. konzumiranjem 65 jedinica aflatoksina prisutnih u stonoj hrani moe se oekivati pojava jedne jedinice aflatoksina u mlijeku. Specifinost djelovanja mikotoksina Odavno je zapaena specifinost mikotoksina koja se razlikuje od ostalih toksikoza:

bolest nije infektivna izazvana je hranom i uglavnom je sezonskog karaktera medikamenti i antibiotici su bez efekta kod oboljelih

Njihovo djelovanje moe biti: akutno

hronino i specifino to zavisi od: vrste mikotoksina, duine izlaganja i otpornosti organizma

Primarne akutne mikotoksikoze izazivaju trovanja ljudi i ivotinja i mogu se zavriti letalno. Kod hroninih trovanja, zavisno od vrste mikotoksina i njihovih ciljnih tkiva i organa, osnovna uoena djelovanja mogu se podijeliti na:

hepatotoksino (aflatoksin, sterigmatocistin) nefrotoksino (citrinin, ohratoksin) kardiotoksino (penicilinska kiselina) neurotoksino (patulin) estrogeno (zearalenon) dermatoksino (sporodezmin) gastrotoksino (skirpeni).

Efekat mikotoksina na imuni sistem ljudi i ivotinja je u posljednje vrijeme u centru interasovanja naunika i smatra se da mikotoksini djeluju imunosupresorno. Njihov imunosupresorni efekat opada na sljedei nain:

Aflatoksin > vomitoksin i T-2 toksin > ohratoksini > fumonizin.

Zapaeno je da kombinacije mikotoksina imaju jai bioloki efekat nego pojedini mikotoksini. Otkrivene su sljedee kombinacije: vomitoksin + nivalenol u kukuruzu, penici i jemu vomitoksin + nivalenol + zearalenon u penici, jemu, rai T-2 toksin + ohratoksin u suncokretu Aflatoksin + fumonizin + zearalenon u kukuruzu. Prisustvo vie razliitih toksina u jednoj namirnici ini sloeniji posao sanitarnog inenjera.

Koliina mikotoksina u namirnicama Procjenjuje se da je sadraj aflatoksina u namirnicama oko 10 g/kg (u opsegu 0,5-500 g). Veina evropskih zemalja upozorava da 50% uvezenog kikirikija sadri aflatoksine. Do prije par godina najvea panja je posveivana analitici aflatoksina koji i nisu karakteristini za nae podruje, ostali mikotoksini, kao to su ohratoksini i zearalenon, tek u posljednje vrijeme posveuje im se vea panja. Aflatoksin Produkuju ga plijesni iz roda Aspergilus flavus i Aspergilus parasiticus. Otkriven je 1960 god. nakon velikog pomora urki u Engleskoj, iz kikirikijevog brana koje je sadravalo aflatoksin. Izolovana je plijesan Aspergilus flavus, kao kristalna supstanca plave fluorescencije. Ova do tada nepoznata supstanca, dobila je naziv od poetnih slogova plijesni A+FLA+TOKSIN B (blue).

Pored aflatoksina B detektovan je i aflatoksin G (green), zelene florescencije.Aflatoksini su vrste, bezbojne ili blijedoute kristalne supstance, nerastvorljive u vodi a rastvorljive u organskim rastvaraima. Termostabilne su, fluoresciraju. Najznaajniji su aflatoksini B1, B2, G1, G2, M1, M2. Aflatoksin B i G se nalaze u namirnicama biljnog porijekla i stonoj hrani. Aflatoksini M1 i M2 su kao oksidansi derivati aflatoksina B1 i B2 izolovani iz kravljeg mlijeka. Aflatoksini M1 i M2 se mogu nai u jajima i tkivima ivotinja. Ulazak aflatoksina u lanac ishrane Osnovni izvori aflatoksina u ishrani predstavljaju kikiriki, kukuruz, sjeme pamuka, zob, penica, proizvodi od voa, kakaovac, jezgrasto voe, zaini. Najee se radi o uvoznim namirnicama iz tropskog klimatskog pojasa, ali tu spadaju i itarice iz umjerenog klimatskog pojasa ukoliko je godina bila kiovita. U animalnim namirnicama mikotoksini su sekundarnog porijekla. Dodatni izvor kontaminacije aflatoksinima moe biti udisanje zagaene praine u skladitima i silosima u kojima se nalaze pljesnive namirnice ili stona hrana.

Metabolizam i toksinost Sva resorbovana koliina aflatoksina dospijeva u jetru odakle se 70-80% izluuje u une kanale u nepromijenjenom obliku. Toksino djelovanje se javlja nakon njihove metabolike aktivacije dejstvom enzima. Isti enzimi su ukljueni u njihovu detoksikaciju. Akutne aflatoksikoze se kod ovjeka odlikuju naglim pogoranjem stanja organizma, unutranjim krvarenjem i smru. Opisan je veliki broj akutnih trovanja ljudi aflatoksinima. Aflatoksini utiu na metabolizam lipida u jetri djelujui na enzime koji uestvuju u njihovoj sintezi i razgradnji. Oni utiu i na metabolizam vitamina-A. Aflatoksin B1 ima najae mutageno djelovanje i smatra se jednim od najmonijih humanih mutagena. Na djelovanje aflatoksina utiu: Pol Starost Ishrana Prisustvo zatitnih faktora u ishrani i u organizmu. Ohratoksini su proizvodi metabolizma plijesni iz roda Aspergillus i Penicillium i prvi put su izolovani iz vrste Penicillium ohraceus. Izolovani su iz kukuruza, graha, kikirikija. Ohratoksin A i C su toksiniji od ohratoksina B. Simptomi akutne toksikoze kod pacova su: Gubitak teine Nakostrijeenost dlake Poliurija Nefropatija i

Glikozurija. Osnovno djelovanje im je nefrotoksino. Prema podacima iz vie Evropskih zemalja dnevni unos ohratoksina hranom je 16 ng/kg TM, to znai da je prekoraen nivo kancerogenosti (0,7-4,2 ng/kg TM). Ohratoksin A je naen u 70% uzoraka seruma ispitanika u vedskoj, oko 50% u Njemakoj i Danskoj i 22% u Francuskoj ime je ukazano na ozbiljan nivo izloenosti opte populacije ovim kontaminantima. Fusarium mikotoksini Veliki broj Fusarium vrsta u povoljnim uslovima moe da sintetie mikotoksine. Ovu plijesan nazivaju i "bijela plijesan" a moe biti obojena ljubiasto, karmin, crveno i oker. Fusarium mikotoksini su vrlo razliitih hemijskih struktura a prema djelovanju dijele se na: Estrogene i Nekrotoksine Tu spadaju: trihoteceni fumonizini zearalenon moniliformin i fusarna kiselina Kako sprijeiti kontaminaciju namirnica mikotoksinima? Prevencija formiranja mikotoksina je jedini efikasan nain u borbi protiv njih i tu spadaju: higijenske mjere u proizvodnji preradi skladitenju i transportu namirnica upotreba fungicida izbjegavanje uslova pogodnih za razvoj plijesni

6. PRIRODNI TOKSINI I TETNI SASTOJCI NAMIRNICA

Netano je uvrijeeno moljenje da hrana koja je prirodna istovremeno mora biti "zdrava" a da namirnice kijima su dodati aditivi su potecijalno opasni. Mnoge sirove nepreraene namirnice mogu prirodno sadrati vei brij tetnih i toksinih sastojaka kao npr. eruka kiselina u ulju repice, avidin u bjelancetu jajeta i dr. Tradicionalno pripremanje hrane? "egzotina" hrana. Alternativni nain pripreme hrane? Namirnice mogu biti tetne ili toksine ukoliko:

Sadre neku tokstnu materiju kao jedan od svojih prirodnih sastojaka Prenose toksine supstance drugih organizama U procesu fermentacije formiraju tetne sastojke U kontaktu sa organizmom se sastojak hrane transformie u toksian metabolit. Poseban sluaj prisustva prirodnih toksinih sastojaka u hrani predstavlja transfer toksinih, fizioloki visoko aktivnih, biljnih komponenti preko namirnica ivotinjskog porijekla na ovjeka, npr. zabiljeeni su sluajevi trovanja medom koji je sadravao visoke koncentracije kardiotoksinih glikozida usljed ispae pela na cvjetovima oleandera. Prirodni tetni sastojci koji mogu da uu u lanac ishrane dijele se prema porijeklu na: Biljne -fitotoksine Gljivine mikotoksine ivotinjske zootoksine

Biljne tetne i toksine materije su svrstane u nekoliko grupa: antinutrimenti hormonski aktivne materije toksine aminokiseline i proteini heterozidi vazoaktivni amini pirolizidinski alkaloidi hidrazinski toksini i toksine masne kiseline Antinutrimenti su grupa materija(supstanci) biljnog porijekla koji imaju suprotno djelovanje od nutrimenata.Prema nainu djelovanja dijele se u 3 podgrupe: antienzimi antivitamini supstance koje vezuju minerale. Antienzimi utiu na aktivnost enzima na nekoliko naina: vezivanjem za enzimske strukture transformacijom enzima ometanjem biosinteze enzima pretvaranjem supstrata u nepovoljan oblik poveanjem aktivnosti enzima U biljnom svijetu su najee prisutni inhibitori enzima, poto su to bjelanevine mogu se termikom obradom denaturisati.Antienzimi ove grupe su svrstani u inhibitore: proteaza amilaza holinesteraza.

Inhibitori proteaza inhibiraju djelovanje tripsina, himotripsina, karboksioksidaza. Nalaze se u leguminozama, itaricama, krompiru. Inhibirajui aktivnost proteolitikih enzima u digestivnom traktu antienzimi ove grupe spreavaju razlaganje proteina, a samim tim i njihovu resorpciju, to dovodi do zaostajanja u rastu. Inhibitori amilaza spreavaju djelovanje amilaza pankreasa, a samim tim i hidrolizu skroba i njegovu iskoritenost. Ishrana eksperimentalnih ivotinja namirnicama koje sadre inhibitore amilaza dovodi do ekskrecije nesvarenog skroba. Standardna termika obrada namirnica inaktivira inhibitore amilaza. Inhibitori holinesteraze su najbolje proueni. Tu spadaju glikoalkaloidi krompira, a rasprostranjeni su i u drugim biljnim vrstama. Ovi inhibitori enzima blokiraju enzim holinesterazu, koji se normalno stvara na nervnim zavrecima sa ulogom da razlae acetilholin i spreava njegovo nagomilavanje. U krompiru je prisutan vei broj glikoalkaloida steroidne strukture sa antiholinesteraznom aktivnou. Zreo i zdrav krompir sadri male koliine glikoalkaloida, ali koliina u nezrelom i proklijalom krompiru moe porasti na 800-1200 mg/kg. Krompir sa 110 mg/kg solanina izaziva peckanje, a sa 200 mg/kg krompir ima gorak ukus i nepogodan je za upotrebu. Koliina solanina od 2,8 mg/kg TM kod ljudi izaziva akutno trovanje praeno smetnjama u digestivnom traktu i nervnim poremeajima. Solanin je vrlo stabilan i kuhanjem se ne moe razgraditi. Antivitamini spadaju one materije koje smanjuju ili spreavaju djelovanje vitamina. Podijeljeni su u 3 podgrupe: jedinjenja koja imaju kompetativno djelovanje sa vitaminima u metabolikim procesima. jedinjenja koja mijenjaju strukturu vitamina i usljed toga ine stabilan kompleks koji postaje neaktivan. enzimi koji razlau vitamine antivitamin vitamina A

Lipooksidaze se nalaze u veem broju namirnica biljnog porijekla (soja). Kod domaih ivotinja u ijoj je ishrani zastupljena soja (preko 30%) dolazi do deficita vitamina A. Citral se nalazi u narandinom etarskom ulju. esto se dodaje kao prirodna aroma prehrambenim proizvodima i ima antivitaminski efekat.

antivitamin E vitamina

U sirovom graku, soji i lucerki postoje supstance koje mogu dovesti do deficita vitamina E. Deficit se manifestuje nekrozom jetre i miinom distrofijom.

antivitamin vitamina K Izolovan iz pokvarene stone hrane, i pokazuje antivitaminsko djelovanje u odnosu na vitamin K. Svoju aktivnost ostvaruje kompetativnom inhibicijom sa vitaminom K. Kod domaih ivotinja javljaju se krvarenja i smrt.

antivitamin vitamina B1 Mnoge vrste povra i voa sadre supstance sa antivitaminskim djelovanjem prema vitaminu B1. Ove supstance mogu biti enzimi, polifenoli ili aditivi. Tiaminaza I i Tiaminaza II su najpoznatiji enzimi sa antiaminskim djelovanjem. Tiamin I je otkriven u ribama i koljkama, i nekim mikrooganizmima. Tiamin II je naen u kvascu bakterijama i gljivama i djeluje na molekul vitamina B1. Mnogi fenoli rasprostranjeni u biljnom svijetu mogu da mijenjaju molekul tiamina. Tako npr. polifenolno jedinjenje hlorogenske kiseline (kafa, aj) smanjuju nivo tiamina u krvi. Konzumiranjem velikih koliina napitaka kafe i aja dovodi do razaranja tiamina.

antivitamini vitamina B6 Linatin koji se nalazi u sjemenu lana ima antivitaminsko djelovanje na vitamin B6.

antivitamin vitamina PP (antinijacin) Ovaj antivitamin ne samo da inhibira djelovanje nijacina, ve istovremeno sprjeava njegovo stvaranje u triptofanu. Nalazi se u zrnu kukuruza. antivitamin biotina (antibiotin). Protein avidin iz sirovog bjelanceta jajeta u kontaktu sa biotinom ini stabilan kompleks koji se u digestivnom traktu ne resorbuje. Posljedica je deficit biotina u ishrani ili "bolest sirovog bjelanceta jaja" .

Supstance koje vezuju minerale Ca, P, Zn, Cu, Fe u stabilne komplekse tetne su jer time smanjuju stepen njihovog iskorienja, u ovu grupu spadaju antinutrimenti oksalna i fitinska kiselina. oksalna kiselina HOOC COOH prisutna je u veim koliinama u liu biljaka kao to su spana zelje i dr. U njima se nalazi kao kristal Ca-oksalat, koji se moe vidjeti pod mikroskopom. Poznato je da se jestive biljke bogate oksalatima spremaju sa mlijekom koje je bogato kalcijem, ime se spreava endogeno vezivanje oksalne kiseline sa Ca iz drugih izvora. fitinska kiselina Dosta je rasprostranjena u itu, leguminozama, orasima itd. Pored uticaja na smanjenu iskoristljivost minerala, posebno Ca, Zn, i Fe, smatra se da fitinska kiselina u ishrani ima i pozitivna dejstva: fitinska kiselina vezuje toksine elemente i eliminie ih iz organizma sniava nivo seruma holesterola i triglicerida usporava digestiju ugljenih hidrata to je povoljno za dijabetiare

suzbija oksidacione procese u kojima je Fe katalizator i smanjuje rizik od nastanka kancera debelog crijeva (kao prirodni oksidans). Hormonski aktivne supstance Sadre neke namirnice, ali u malim koliinama, te se smatra da nisu u stanju da izazovu fizioloke efekte kod ovjeka. Uglavnom se radi o supstancama sa estrogenim djelovanjem i one su pronaene u mrkvi, soji, krompiru, trenjama i u nekim biljnim uljima (pamukovom, kokosovom itd), te u kravljem mlijeku, naroito kolostrumu. Uglavnom se radi o tzv. "slabim" estrogenima, ali predstavljaju potencijalnu opasnost sinergizma djelovanja sa reziduama hormona koji se eventualno mogu nai u namirnicama ivotinjskog porijekla, to moe dovesti do dizbalansa hormona u organizmu. U fitoestrogene supstance ubrajamo: izoflavonoidi (izoflavon, prunetin, genistein, daidzein) anetol zearalenon lignani kumestani Izoflavonoidi se u prirodi nalaze u obliku heterozida. eerna komponenta je vezana za hidroksilnu grupu izoflavona Opta formula izaflavona
I ol v n z fa o Pu ei r nt n Gnsen eit i Di z i aden R O H O H O H R1 O H O H H R2 OH C O H O H
3

Fitoestrogeni genistein je zastupljen u visokoj koncentraciji u soji. Tako npr. zrno soje sadri 578 3812 mg/kg ukupnih izoflavonoida. Kod ivotinja koje sa hranom unesu vee koliine genisteina dolazi do pada reproduktivnosti i prekida normalnog estrusa. Kod ena je zapaeno da je ishrana koja je dnevno sadravala 45 mg izoflavonoida produila menstrualni ciklus, smanjila stimulaciju folikula i nivo hormona utog tijela. Anetol je izolovan iz estarskog ulja anisa i on pokazuje estrogeni efekat. Zearalenon je toksin koji proizvode brojne vrste plijesni iz roda Fusarium. Kod ivotinja hranjenih hranom koja sadei ovaj toksin ispoljava se snana estrogena aktivnost. Lignanin nalazi se u mnogim biljkama kao to su ita, bobiasto i jezgriasto voe i sjemenke. Smatra se da kod ovjeka ove supstance se ne mogu resorbovat kao takve iz digestivnog trakta, ve da u debelom crijevu podlijeu metabolizmu pod dejstvom mikroorganizama. Novonastali metaboliti resorbuju se i ispoljavaju estrogeni efekat na humani organizam. Koliina lignana u pojedinim namirnicama je veoma razliita. Najbogatiji izvor lignana je sjeme lana, koje se rijetko koristi u ishrani (527 mg/kg), zrno soje (8,6 mg/kg). Kumestani se mogu nai u mnogim vrstama povra, soji i nekim leguminozama.

Kumestrol je najbolje prouen, ispoljava svoju estrogenu aktivnost interakcijom sa estrogenim receptorima, a takoe ima uticaj na metabolizam lipida i kalcijuma.

7.Kontrola sadraja rezidua veterinarskih lijekova

Radi obezbjeenja dobrog zdravstvenog stanja ivotinja i brzog napredovanja koristi se veliki broj raznovrsnih veterinarskih lijekova kao to su: savremani nain uzgoja i tovljenja velikog broja domaih ivotinja na farmama na relativno malom prostoru, pored znaajnih ekonomskih prednosti, predstavlja i rizik njihovog masovnog obolijevanja. antimikrobni lijekovi koriste se u terapiji brojnih oboljenja: respiratornih infekcija gastrointestinalnih poremeaja lijeenje mastitisa itd. radi obezbjeenja dobrog zdr.stanja ivotinja koristi se veliki br. lijek.

antimikrobni agensi (antibiotici i sulfonamidi) stimulatori rasta (hormoni i anabolici) tireostatici, antiparazitici itd. broj i vrsta lijekova regulie se na osnovu Zakona o proizvodnji i prometu lijekova.

Antimikrobni lijekovi se koriste radi boljeg iskorienja hrane i veeg prirasta pri uzgoju ivotinja. Pored upotrebe lijekova u lijeenju oni se koriste i u profilaktike svrhe radi zatite ivotinja od pojave irenja bolesti kao to su: kolibaciloze

streptokokoze Salmoneloze

Antibiotici se u te svrhe dodaju u koliini ad 5 do 50 g/t hrane, u zavisnosti od vrste antibiotika i vrste ivotinje.U pozitivne efekte antibiotika kao aditiva ubrajaju se: poveanje resorpcionog kapaciteta crijeva

smanjenje gubitka nutrimenata fecesom poveanje retencije energije i azota poveana resorpcija vitamina poveana sinteza proteina u jetri smanjena proizvodnja amonijaka i biogenih amina.

Praktino nema uspjenog uzgoja ivotinja, a da one sa hranom ne prime "zatitnu" dozu nekog antibiotika. U stoarskoj proizvodnji se kao anabolici najvie koriste hormonski preparati koji stimuliu organizam na potpuniju iskoristljivost hrane, retenciju azota i njegovu ugradnju u proteine miia Tireostatici inhibiraju funkcije tiroidne lijezde i sintezu tiroidnih hormona, ime se smanjuje bazalni metabolizam, a poveava se retencija vode u ekstracelularnom prostoru. Njihova primjena dovodi do poveanja mase, te je kvalitet ovako dobijenih mesnih proizvoda lo. Veterinarski lijekovi se koriste i kao trankilizeri radi smanjenja agresivnosti ivotinja pri dijagnostikim pregledima. Pri stresnim okolnostima pogorava se kvalitet mesa te se ilegalno koriste fenotijazini i butirofenoni, i to neposredno prije klanja tako da se rezidui i ovih lijekova mogu nai u mesu. Ulazak lijekova u lanac ishrane Masovna upotreba lijekova u poljoprivredi i veterini omoguava da njihovi rezidui ili bioloki aktivni metaboliti raznim putevima dospiju do humanog organizma. Kao izvor veterinarskih lijekova najvei znaaj za ovjeka imaju namirnice ivotinjskog porijekla (mlijeko, meso, jaja, neke vrste vjetaki uzgajanih riba) ali su zabiljeeni i sluajevi namjernog dodavanja lijekova u lahko pokvarljive namirnice (sladoled) radi spreavanja mikrobioloke kontaminacije. Izlueni lijekovi preko urina i fecesa tretiranih ivotinja zagauju zemljite i podzemne vode. Utvreno je da i do 25% uzoraka izvorskih voda iz regiona intezivne poljoprivrede sadri ostatke antimikrobnih supstanci. Prisustvo rezidua lijekova otkriveno je ne samo u tkivima ivotinja ve i u prehrambenim proizvodima dobijenih od ivotinja tretiranih lijekovima. Prema podacima iz raznih zemalja, rezidui antibiotika i drugih lijekova mogu da budu prisutni u razliitim vrstama mesa i proizvodima od mesa. Poslednjih godina broj uzoraka namirnica ivotinjskog porijekla koji sadri rezidue veterinarskih lijekova je sve manji zahvaljujui jasnim propisima i sve otrijoj kontroli nivoa rezidua i primjene savremene instrumentalne analitike. Upotrebom veine postupaka prerade mesa postie se samo vea ili manja inaktivacija antimikrobne aktivnosti prisutnih rezidua, ali u proizvodu ostaju i dalje prisutni izmijenjeni oblici lijekova koji mogu da budu tetni po zdravlje ljudi. Uticaj rezidua lijekova na zdravlje ovjeka Kontrola prisustva i sadraja rezidua veterinarskih lijekova u namirnicama je neophodna radi spreavanja ilegalne upotrebe nedozvoljenih farmakoloki aktivnih supstanci, i radi utvrivanja dali sadraj rezidua prelazi propisane maksimalne granice za pojedine vrste namirnica ivotinjskog porijekla. Rezidui lijekova i anabolika iz namirnica mogu djelovati negativno na zdravlje ljudi usljed: stvaranja rezistentnih sojeva bakterija,

izazivanja alergija poremeaj mikroorganizama u crijevima promjena hormonalne ravnotee u organizmu kancerogene i

mutagene promjene Pri procjeni potencijalne opasnosti treba imati u vidu vie faktora:

koliina unesenog lijeka njegova resorpcija metabolizam nain izluivanja raspodjela po tkivima ivotijna

Ozbiljan problem vezan za prisustvo rezidua antimikrobnih lijekova u namirnicama predstavlja indukcija rezistencije mikroorganizama prema tim lijekovima, ime se smanjuje njihiva efikasnost u humanoj terapiji. Posebno je znaajan prenos rezistencije transverom gena sa otpornih na do tada osjetljive vrste bakterija. Rezistencija moe da se prenese sa saprofitnih vrsta (E. coli) na patogene bakterije (Salmonella, Shigella). Smatra se da je velika upotreba antibiotika rezultat nastanka sve vee rezistencije. Put prenoenja moe da bude: sa ivotinje na ovjeka

preko hrane ili sa ovjeka na ovjeka (ako su ljudi u kontaktu sa istim antibiotikom).

U zemljama Evropske unije ustanovljena je lista antibiotika koji se mogu koristiti kao aditivi u stonoj hrani, a koji se praktino ne koriste u humanoj terapiji. Rezidui veterinarskih lijekova i alergijske reakcije Postoje dvije mogunosti:

Pojava senzibilizacije Alergijske reakcije (usljed prisustva rezidua antibiotika u namirnicama)

Potrebno je naglasiti da ozbiljnu alergijsku reakciju, kao to je anafilaktiki ok, kod preosjetljivih osoba moe izazvati izuzetno mala koliina penicilina. Nosilac antigenosti alergijskih osobina, kod penicilinskih antibiotika je penicilinska kiselina, koja nastaje kao proizvod djelimine razgradnje penicilina, i koja se oslobaa termikim tretmanom namirnica. Rezidui lijekova i disbakterioze Pored tetnog uticaja na ljude, oni mogu tetno uticati i na biotehnoloke procese, kao to je proizvodnja fermentiranih mlijenih proizvodnja. Utiu na enzimsku aktivnost bakterijskih kultura... Mutageni, kancerogeni, teratogeni efekti nekih lijekova Smatra se da su mogui navedeni efekti antimikrobnih lijekova rezultat njihovog antibakterijskog ometanja sinteze proteina, to se odnosi i na humane organizme, npr. hloramfenikol iz hrane moe dovesti do oteenja kotane sri i poremeaja krvne slike. tetno djelovanje rezidua stimulatora rasta

Polni hormoni, kako androgeni tako i estrogeni, dodati u hranu ivotinja, ubrzavaju njihov rast i poveavaju efikasnost konverzije hrane u meso.Rezidui prirodnih hormona u namirnicama ivotinjskog porijekla mogu da remete hormonalnu ravnoteu u organizmu ljudi. Na unos rezidua hormona posebno su osjetljiva djeca kod koih moe da se javi prerani pubertet. Poseban problem predstavljaju mutageni i kancerogeni efekti pojedinih hormona. Dokazano je da prijenatalna primjena sintetskih hormona izaziva vei broj poremeaja na reproduktivnim organima oba pola. Sanitarni inenjeri (analitiari) rezidua veterinarskih lijekova moraju voditi rauna o moguem prisustvu zabranjenih anabolika, kao i nelegalnom uputrebljavanih novih nepoznatih supstanci u veterinarskoj praksi. Kontrola sadraja rezidua veterinarskih lijekova Odobreni veterinarski lijekovi se moraju primjenjivati i racijonalno koristiti za lijeenje i prevenciju bolesti domaih ivotinja, vodei rauna o karenci odobrenih grupa lijekova. Karenca je perijod izmeu primjene lijeka i njegovog izluivanja iz organizma tretiranih ivotinja. Karenca zavisi od: vrste lijeka

naina primjene i vrste namirnice (tab. 1.)

Tab.1. karenca nekih lijekova

Poto veterinarski lijekovi nisu prirodni sastojci ivotnih namirnica, smatraju se kontaminantima. Njihovo prisustvo u namirnicama je jedan od kriterijuma za procjenu zdravstvene ispravnosti ivotnih namirnica.

Jedan od lanova pravilnika npr. glasi: mlijeko i proizvodi od mlijeka, meso i proizvodi od mesa, jaja , slatkovodne ribe, med i ostale namirnice animalnog porijekla, ako ne sadre antibiotike u koliinama koje se mogu dokazati propisanim i priznatim metodama, dozvoljavaju se pustiti u promet. Kontrola prisustva rezidua u principu bi trebala da pone jo prije klanja, pregledom urina ili krvi tretiranih ivotinja, a zatim "screening" testiranjem veeg broja uzoraka jednostavnim kvalitativnim metodama u prateim laboratorijama, i na kraju, izvriti identifikaciju i odreivanje detektovanih rezidua lijekova sloenijim postupcima u specijalizovanim dobro opremljenim laboratorijama. Laboratorije koje se bave analitikom kontaminanata moraju da ispotuju stroge uslove u pogledu visoko strunih, specijalizovanih kadrova, da raspolau savremenim instrumentima (HPLC, GC, GC-MS i dr.). Pored toga sanitarni inenjer (analitiar) mora biti stalno u toku sa najnovijim analitikim metodama, procjenama rezultata, sistemima kontrole rezidua lijekova, propisima iz ove oblasti, zatim mora biti detaljno upoznat o tetnosti pojedinih supstanci, njihovom nainu izluivanja i rasporedu u pojedinim tkivima i tkivnim tenostima i ekskretima ivotinja, ilegalno uvoenje novih nepoznatih anabolika analitiarima oteava njihovo identifikovanje i odreivanje

8.PREHRAMBENI ADITIVI I NJIHOVO DOKAZIVANJE

Da bi se hrana uinila ukusnijom, i da bi se sauvala to due vrijeme, jo u davna vremena koristila se so za soljenje, dim za konzerviranje mesa i fermenti za proizvodnju hljeba, vina, piva, sireva itd. Kod starih Egipana pronaeni su recepti iz kojih se vidi da su oni koristili vei broj zaina. Polovinom 19 vijeka poela je upotreba aditiva u proizvodnji gotovih prehrambenih proizvoda.

Njihovom upotrebom sukobila su se dva cilja: Upotreba hemikalija radi stvarnih potreba u proizvodnji hrane.

I njihova zloupotreba radi falcifikovanja hrane.

Danas se strogo vodi rauna o upotrebi aditiva u proizvodnji hrane, i dozvoljava se samo ona upotreba materija koje se nalaze na tzv. pozitivnoj listi aditiva. Postoji mnogo definicija prehrambenih aditiva, ali najee u upotrebi je ona po Codex Alimentarius: Aditivi su supstance koje se, bez obzira na njihovu hranljivu vrijednost, ne koriste kao namirnice niti predstavljaju karakteristine sastojke namirnica, ali se iz tehnolokih razloga namjerno dodaju prehrambenim proizvodima u toku proizvodnje, prerade, pripreme, obrade, pakovanja, transporta ili uvanja, pri emu same, direktno ili indirektno, postaju sastojci prehrambenih proizvoda ili na drugi nain utiu na osobine tih proizvoda. Na osnovu ove definicije u prehrambene aditive ne spadaju kontaminanti, niti supstance koje se dodaju radi poboljanja nutritivne vrijednosti prehrambenih proizvoda. Opravdanost upotrebe aditiva Aditivi se koriste u prehrambenoj industriji iz:

Tehnolkih razloga (boje, emulzije, suspenzije, zaslaivai) i, Ekonomskih razloga?

Naalost aditivi se esto neopravdano koriste kako u pogledu vrste i koliine, tako i tamo gdje njihovo dodavanje nije neophodno. Na to utiu i sami proizvoai aditiva-finansijska dobit. Danas postoji oko 2.000 supstanci koje se koriste kao aditivi, a u SAD je u upotrebi preko 2.800 supstanci. Toksikoloka ispitivanja aditiva Primjeni nekog aditiva prethodi veliki broj ispitivanja na eksperimentalnim ivotinjama pod tano definisanim uslovima (vrsta ivotinje, nain ishrane, istoa aditiva) da bi se utvrdio njihov uticaj na zdravlje i potomstvo. Utvruje se: Akutna i hronina toksinost

Mutagenost Kancerogenost Reprodukcija Embriotoksinost Teratogenost Alergenost Stepen kumulacije Metabolizam aditiva Djelovanje na crijevne mikroorganizme Djelovanje na pojedine enzime itd.

Mnoga djelovanja se ne mogu odmah ustanoviti, ve se to vri naknadno, nakon dueg vremena njihove upotrebe. Zbog toga postoji komitet na nivou SZO koji regulie ova pitanja daje sugestije i preporuke o uvoenju novih aditiva. Prema Codex Alimentariusu aditivi su svrstani u nekoliko grupa: Grupa A1 provjereni aditivi

Grupa A2 dugo se koriste u tehnolokoj praksi

Grupa B1 upotrebljavaju se u pojedinim zemljama ali nisu vrednovani od strane komisije WHO/FAO Grupa B2 potencijalno mogu da se koriste Grupa C1 da nisu bezopasni Grupa C2 toksini, treba ih zabraniti za upotrebu.

Pravilnikom o kvalitetu aditiva za prehrambene proizvode utvruju se njihove funkcionalne osobine, fiziko-hemijske karakteristike, kvalitet u pogledu sadraja aktivne komponente, kao i

vrsta i koliina prateih supstanci i neistoa koje aditiv smije maksimalno da sadri. Za svaki aditiv pojedinano odreena je jedna ili vie moguih primjena. Pored toga, Pravilnikom su potvreni opti uslovi za njihovu proizvodnju i promet i hemijsku kontrolu njihovog kvaliteta. Da bi se mogao koristiti prehrambeni aditiv mora da: bude ukljuen u pozitivnu listu Pravilnika,

odgovara kvalitetom i zahtjevima koje Pravilnik propisuje,

da se dodaje u proizvod u koliinama koje ne prelaze koliine dozvoljene propisima, o kvalitetu tih proizvoda, ili u manjoj koliini koja je tehnoloki opravdana, ako odgovarajuim propisima nije drugaije odreeno. Oznaavanje aditiva se u nacionalnim pozitivnim listama najee vri prema oznakama prihvaenim od strane EU. To su tzv. E oznaka koje se meusobno razlikuju po broju iza slova E. Ne samo da svaki aditiv ima svoj zasebni E broj (npr. tartazin E 102, borna kiselina E 284, glicerol E 422), grupe aditiva se, uz manje izuzetke, meusobom razlikuju po brojevima, to je prikazano u tabeli 2.

Sredstva za spreavanje kvarenja namirnica

Antioksidansi i sinergisti Antioksidansi su jedinjenja koja su u stanju da sprijee ili uspore proces autooksidacije masti i ulja i time produavaju njihovu trajnost, kao i trajnost prehrambenih proizvoda koji u svom sastavu sadre masti i ulja. Pod dejstvom svjetlosti, poviene temperature, vode, tragova tekih metala odvijaju se oksidativne promjene nezasienih masnih kiselina u mastima i uljima ili u namirnicama koje sade masti, pri emu nastaju slobodni radikali. U daljem toku reakcije dolazi do stabilizacije nastalih slobodnih radikala izdvajanjem protona iz lanca novih, neoteenih masnih kiselina, pri emu ponovo nastaju novi slobodni radikali masnih kiselina i tako nizom lananih reakija, dolazi do potpune oksidacije masti. Radi spreavanja ove neeljene lanane reakcije koriste se pravi oksidansi koji svojim protonomstabilizuju slobodne radikale i na taj nain zaustavljaju lananu reakciju autooksidacije: Antioksidansi su najee difenoli, odnosno njihovi derivati. U ovu grupu spadaju antioksidansi koji reaguju sa slobodnim radikalima (tokoferoli). Drugu grupu antioksidanasa ine redukujui agensi koji imaju nii redoks potencijal od komponente koju tite i zato se lake i bre oksiduju. Tu spadaju askorbinska kiselina i sulfiti. Treu grupu uslovnihantioksidanasa ine sinergisti, koji obino sami nemaju antioksidativno djelovanje, ali pojaavaju djelovanje antioksidanasa prve grupe. Dobri antioksidansi moraju da ispunjavaju odreene uslove: Da djeluju u malim koliinama

Da ne mijenjaju ukus i miris masti Da su stabilni na temperaturi dodavanja i obrade namirnica Da su rastvorljivi u mastima odnosno uljuma Da nisu toksini

Da ne sadre neistoe tetne po zdravlje

Izbor antioksidansa zavisi od hemijskih i fizikih osobina, sastava proizvoda, naina pakovanja, uvanja, naina primjene (oralni za hranu i pie, dermalni za kozmetike proizvode). Antioksidansi se mogu podijeliti na: orirodne u koje ubrajamo tokoferol (vitamin E), askorbinska kiselina(vitamin C) i izoaskorbinska kiselina sintetske u koje spadaju galati, BHA, BHT, i

tercijerni (butilhidrohinon).

Neki prirodni antioksidansi se ne ekstrahuju, ve se ulja i masti koja ih sadre u veim koliinama dodaju proizvodima kojima je potrebna zatita od oksidacije. Od prirodnih antioksidanata najee se koristi askorbinska kiselina i njena kalijumova i kalcijumova so, kao i estri askorbinske kiseline. Tokoferoli, Vitamini grupe E su najznaajniji prirodni antioksidansi. Dobijaju se iz sojinog i kukuruznog ulja.

Radi se o bistroj uljanoj, viskoznoj tenosti, svijetloute boje, gotovo bez mirisa, koja mora da sadri 96% -tokoferola ili 97% drugih tokoferola, kao i da odgovara ostalim zahtjevima za testove identifikacije i istoe.

Askorbinska kiselina (vitamin C) i njene kalcijumove i natrijumove soli su bijeli kristalni prah sa najmanjim sadrajem aktivne komponente 99%, odnosno 98% za kalcijum-askorbat. Rastvorljivi su u vodi. Pripadaju A1 grupi aditiva i upotreba im je jako velika u prehrambenoj industriji (pekarstvu, pivarstvu, i proizvodnji konzervisanog voa itd.). Antioksidaciona sposobnost askorbinske kiseline i njenih soli objanjava se sposobnou otputanja dva vodika koji dalje mogu da stabilizuju slobodne radikale. Askorbinska kiselina, izoaskorbinska kiselina i njihove soli u vonim sokovima spreavaju djelovanje enzima koji dovode do tamnjenja proizvoda. Dodavanjem askorbinske kiseline postie se i stabilizacija boje piva, vina, kao i odravanje boje mesnih proizvoda, bombona i poboljanje peenja hljeba i drugog peciva. Butil-hidroksianizol BHA (E 302) predstavlja smjesu dva izomera. Supstanca je bijele ili svijetlo-ute boje slina vosku, prijatnog karakteristinog mirisa, rastvara se u alkoholu i mastima. Stabilan je na temperaturi obrade namirnica i obino se koristi u koncentraciji od 0,02% do 0,2%. Ima antimikrobna svojstva. Pripada A2 grupi aditiva. PDU je 0,5mg/kg TM.

Butil-hidroksitoluol, BHT (E 321) je supstanca bijelih listastih kristala, esto bez mirisa, rastvara se u alkoholu i mastima.BHT pripada A2 grupi aditiva. PDU iznosi 0,3 mg/kg TM. Sinergisti nisu antioksidansi, ali pomau njihovo djelovanje. Sinergistiko djelovanje zasniva se na njihovoj osobini vezivanja metala i na taj nain eliminie jedan od faktora koji ubrzava autooksidaciju masti. Kao sinergisti mogu se koristiti kalcijumova ili natrijumova so, limunska kiselina i njezina natrijumova so, natrijum i kalcijum laktat, vinska kiselina. Navedeni sinergisti pripadaju A1 grupi aditiva. Sinergistiko djelovanje imaju i lecitini, kefalini, fosforna kiselina i druge supstance. Bezbjednost upotrebe aditiva u hrani Sve ira primjena aditiva u proizvodnji hrane otvorila je mnoga pitanja kojima su zaokupljeni istraivai iz raznih oblasti irom svijeta, kao i specijalne organizacije UN. Aditivi u hrani su na najniem mjestu prema stepenu opasnosti kojima su ljudi izloeni preko hrane i naina ishrane, ako se koriste u skladu sa vaeim propisima i uz stalnu kontrolu njihovog sadraja, istoe i kvaliteta od strane ovlatenih laboratorija. Problem identifikovanja i odreivanja aditiva Neophodno je propisati jedinstvene standardne analitike metode za utvrivanje stepena istoe aditiva i njihovog kvaliteta, kao i za odreivanje sadraja aditiva u prehrambenim proizvodima. Najznaajniji i najee koriteni standardi su ameriki Fooud Chemicals Codex. istoa aditiva koja se koristi u praksi preporuka za upotrebu nekog aditiva zasniva se na eksperimentalnim podacima o njegovim fiziolokim osobinama koje se dobiju u eksperimentima na ivotinjama upotrebom potpuno istog aditiva. U promet se mogu staviti aditivi koji odgovaraju Pravilniku o kvalitetu prehrambenih aditiva. Problemi dozvoljenih koliina za pojedine aditive u prehrambenim proizvodima i kontrola njihovog sadraja Izvjestan broj aditiva se dodaje pri proizvodnji namirnica prema principima dobre proizvoake prakse, dok je za odreen broj aditiva utvren MDK. Neophodno je stalno revidirati pozitivnu listu aditiva. Podjednako je vana kontrola sadraja aditiva u namirnicama. Problem dnevnog unosa aditiva Dnevni unos za pojedine aditive izraen u mg/kg TM je definisan. Potrebno je znati koliko i kojih aditiva unose pojedine populacione grupe. Opte je pravilo da nivo aditiva bude to manji u najfrekfentnije upotrebljavanim namirnicama, npr. djeca unose(bombone) skoro svakodnevno,dok npr. kavijar (prosjean graanin kavijar uopte ne koristi). Poznavanje karakteristika aditiva neophodno je da proizvoai hrane pored poznavanja tehnolokih karakteristika aditiva, bude dobro upoznat i sa moguim rizicima njihove upotrebe po zdravlje ljudi. S druge strane zdravstveni radnici moraju da budu bolje obavijeteni o nunosti upotrebe pojedinih aditiva u savremenoj

proizvodnji hrane. Sredstva javnog informisanja bi trebalo da obavjetavaju javnost tano i objektivno o problemima aditiva u hrani.

9.KONZERVANSI
Ili antiseptici su supstance definisanog hemijskog sastava, koje pod odreenim uslovima spreavaju ili usporavaju razmnoavanje mikroorganizama u prehrambenim proizvodima i time produavaju njihovu trajnost. Oni kao i drugi aditivi, moraju da ispunjavaju opte uslove u pogledu:

cjelishodnosti upotrebe toksinosti stabilnosti djelovanja na namirnice itd.

Takoe treba da imaju: nisku cijenu da se lahko uvaju i transportuju.

Prema vrsti mikroorganizma konzervansi se dijele na: fungistatike mikrobiostatike

Konzervansi djeluju na vie vitalnih funkcija mikroorganizama kao to su: naruavanje strukture elija mikroorganizama naruavaju funkcije ishrane mikroorganizama ometaju aktivnosti enzima (metabolizam mikroorganizama)

Efekti konzervansa zavise od:

Vrste i broja mikroorganizama Stadija njihovog razvoja pH vrijednosti sredine kao i koncentracije upotrijebljenog sredstva i duine njegovog djelovanja.

Dobar konzervans mora da ispunjava odreene uslove: da je efikasan u to manjim koncentracijama da djeluje na vei broj razliitih mikrooganizama

da nije tetan po ljudsko zdravlje da ne pogorava organoleptike i nutritivne osobine proizvoda da se moe lahko identifikovati i odrediti.

Zakonom je propisano da se na proizvodu deklarie vrsta i koliina upotrijebljenog konzervansa. Od konzervansa koji se najee koriste su:

sorbinska kiselina i njene soli benzojeva kiselina i njene soli estri mravlja kiselina i njene soli propionska kiselina i njene soli siretna kiselina mlijena kiselina itd.

Ove supstance spadaju u lipofilne konzervanse. Nain njihovog djelvanja se zasniva na inhibiciji preuzimanja hranljivih sastojaka supstrata. Lipofilni konzervansi se koriste za kontrolu rasta i razvoja kvasaca i plijesni u namirnicama.U tzv. hidrofilne konzervanse spadaju.

nitrati i nitriti sumporasta kiselina i njene soli

borna kiselina i njene soli, (a ire gledano tu spadaju eer i kuhinjska so, koji meutim ne spadaju u konzervanse). Mehanizmi njihovog djelovanja su meusobno razliiti, ali djeluju na bakterije, plijesni i kvasce. Potrebno je istai grupu konzervansa koji se zovu nizini a koriste se u mlijenim proizvodima.

Sorbinska kiselina i njene soli Sorbinska kiselina (E 200) i njena kalijumova (E 202) i kalcijumova so (E 2003) su konzervansi koji se najvie koriste. Ova kiselina je izolovana iz oskorue Sorbus aucuparia,L. Posjeduje fungistiko djelovanje. Sintetski se dobija od acetaldehida preko krotonaldehida i aldehida sorbinske kiseline. Prvenstveno se koristi zbog antimikotinih i antibakterijskih svojstava. Kao konzervansi se koriste kalijum, kalcijum i natrijum-sorbati i svi pripadaju A1 grupi aditiva. Benzoeva kiselina i njene soli

(E 210) je bijela kristalna supstanca, karakteristinog mirisa, slabo je rastvorljiva u vodi, a lahko rastvorljiva u etanolu i masnim uljima. Takoe se koriste soli ove kiseline natrijum-benzoat (E 211) kalijum benzoat (E 212) i kalcijum benzoat (E 213).Benzoeva kiselina utie na kvasnice i plijesni pri pH pdruju 3,5-4. Tehniki se dobija oksidacijom trihlorbenzola ili dekarboksilacijom ftalne kiseline. Maksimalno dozvoljena koncentracija benzojeve kiseline u gotovom proizvodu kree se od 0,15 do 0,25%. Natrijum-benzoat poznat pod imenom "konzervans"ima antimikrobno djelovanje. Propionska kiselina i njene soli To je uljasta tenost, neznatno otrog mirisa, koristi se protiv pljesnivosti hljeba. Takoe spreava stvaranje pauine na hljebu i spreava razvoj Bacillusa mesentericusa. Smatra se da djeluje antimikrobno tako to blokira ferment katalazu time remeti metabolizam mikroorganizama. Potreban dnevni unos(PDU) procjenjuje se na 10 mg/kg TM. Mravlja kiselina (E 236) je bistra bezbojna tenost, jako korozivna, karakteristinog otrog mirisa. U prirodi se nalazi u koprivi i etinarima. Pripada A1 grupi aditiva. Koristi se za konzerviranje vonih poluproizvoda. Koristi se za suzbijanje bakterija iz coli grupe i kvasaca. PDU za mravlju kiselinu iznosi 3 mg/kg TM. Mlijena kiselina (E 270) spada u multifunkcionalne aditive. Pored konzervirajueg djelovanja moe se u namirnicama koristiti i kao podeiva pH i za postizanje prijatne arome. Ona je bezbojna ili ukasta sirupasta tenost, skoro bez mirisa, kiselog ukusa. Soli mlijene kiseline natrijum, kalijum i kalcijum-laktat ne spadaju u konzervanse, ali se koriste kao aditivi u prehrambenim proizvodima ito kao:

sinergisti antioksidansi emulgatori i regulatori kiselosti.

Hidrofilni konzervansi

Nitrati i nitriti Se koriste kao konzervansi u mesnim proizvodima, i to u smjesama aditiva poznate koncentracije: so za salamurenje nitritna so za salamurenje nitratna so za salamurenje

S obzirom na toksinost nitrata posebna panja se poklanja proizvodnji, prometu i kontroli ovih aditiva. Deklaracija za NaNO3, KNO2 nitritnu so za salamurenje, nitritnu so za salamurenje sa 1% alitre i druge mjeavine aditiva koje sadre nitrite mora da sadri oznaku "otrov". Dnevni unos nitrata je znatno manji i iznosi u prosjeku 2 mg.

SREDSTVA ZA DOTJERIVANJE IZGLEDA NAMIRNICA (Prehrambene boje)

U ovu grupu aditiva spadaju boje za bojenje prehrambenih proizvoda. Njihova upotreba se tumai tehnolokim i psiholokim razlozima...(zamislite bombone koje nisu obojene?). Odreena vrste namirnice ili proizvoda vezana je esto za odreenu boju (psiholoki karakter), npr. narande sa Floride imaju zelenu boju zbog klimatskih uslova i veoma su ukusne, ali neprivlane za potroaa, koji oekuje kvalitet narande oran boje.Tokom prerade esto se gubi prirodna boja pa je potrebno nadoknaditi, prirodnim ili vjetakim bojama. Boje predstavljaju iste supstance i koncentrate dobijene ekstrakcijom iz jestivih sirovina, kao i sintetska hemijska jedinjenja. Boje dozvoljene za bojenje prehrambenih proizvoda koriste se i za bojenje nekih farmaceutskih oblika (sirupi, draeje, kapsule, tablete itd). Boje mogu biti organskog i neorganskog porijekla, a dozvoljena je upotreba nekoliko neorganskih pigmenata. Vjetake boje se dijele na:

boje rastvorljive u vodi i boje rastvorljive u mastima boje namijenjene za spoljanje bojenje namirnica.

Vjetake boje su stabilnije od prirodnih te se zbog toga vie koriste za bojenje namirnica i farmaceutskih proizvoda. Boje dozvoljene za prhrambenu i farmaceutsku industriju imaju svoje hemijsko ime, komercijalni naziv, E broj, svoj Color Index pod odreenim brojevima, uz opis njihovih znaajnih osobina. Koliine boje koje se dodaju namirnicama su bile odreene dobrom proizvoakom praksom, meutim noviji zakonski propisi reguliu MDK vrijednost.

Tartazin

Postoje razni podaci o reakcijama na tartazin koje ukljuuju: angioderme asmatine napade urtikariju trombocitopeniju

purpuru i anafilaktiki ok

Tartazin se koristi za bojenje bombonskih proizvoda, pudinga u prahu, sladoleda, pjenuavih napitaka, ali i za bojenje kozmetikih preparata i lijekova. PDU za ovu boju iznosi 7,5 mg/kg TM. Hinolin uta je uti prah rastvorljiv u vodi. Koristi se za bojenje namirnica , lijekova i kozmetikih preparata. Sunset uta Prakasta supstanca rastvorljiva u vodi. Najee se koristi za bojenje napitaka, konzervisanih vonih proizvoda, slatkia i bombona. Postoje podaci o reakcijama preosjetljivosti na ovu boju. PDU za ovu boju iznosi 5 mg/kg TM. Azorubin Prakasta supstanca crvene boje, rastvorljiva u vodi. Koristi se za bojenje slatkia, sladoleda, pudinga i konzervisanog voa. Privremeni PDU iznosi 1,25g/kg TM Amarant Sme do crveno sme prah rastvorljiv u vodi. Koristi se za bojenje namirnica, marmelade, slatkia konzervisanog voa. PDU iznosi 80 g/kg TM. Primjena Upotreba vjetakih boja za bojenje prehrambenih proizvoda zahtijeva posebnu panju zbog njihove osjetljivosti na visoke temperature (proizvodi u pekarstvu i konditorski proizvodi) i svjetlost kod (bezalkoholni napici).

16. Odreivanje ukupmog broja mikroorganizama u namirnicama direktnim postupkom

Za odreivanje broja i vrste mikroorganizama te njihovih produkata u namirnicama primjenjuju se razliite tehnike (metode). One ukljuuju odreivanje broja ivih i mrtvih elija i to:

mikroskopiranjem (direktna metoda) brojanje poraslih kolonija mikroorganizama (indirektna metoda) imunoloki testovi na enzime i druge mikrobne produkt Metoda membranske filtracije

Namirnice nisu samo izvor nutrijenata za ljude i ivotinje, nego su takoe i supstrat za rast mikroorganizama. Nekontrolisan rast mikroorganizama u hrani uzrokuje njeno kvarenje, a onda itav niz problema? Briga o kontroli hrane bitan je inilac u spreavanju poetka bolesti, koja nastaje upoutrebom kontaminirane hrane. Kvarenje hrane se definie kao svaka promjena u hrani koja je pretvara u nepogodnu ili u opasnu za potronju.

Nekontrolisan rast mikroba u hrani dovodi do:

Smanjivanje sadraja nutrijenata Promjenu okusa Mirisa Boje i kakvoe (nepogodna je za ljudsku upotrebu) U odnosu na osjetljivost prema mikrobnim kvarenjima hrana je klasificirana kao: trajna (nepokvarljiva) polutrajna (polupokvarljiva) i kratkotrajna (pokvarljiva).

Kratkotrajnu hranu ine razne vrste mesa, mlijko, jaja, veina plodova biljaka itd.- brzo podlijeu mikrobnom kvarenju, osim ako se mikrobi iz nje ne uklone sterilizacijom ili spreavanjem rasta mikroorganizama. Polutrajne namirnice kao to su krompir , jabuke openito se ne kvare tako brzo ako se s njima postupa pravilno. Trajne namirnice, kao to su eer, brano i veliki broj dehidriranih proizvoda, u normalnim okolnostima se ne kvare. Izvor mikroorganizama u namirnicama mogu biti:

zrak praina zemlja voda posue rukovanje namirnicama

te probavni sistem ljudi i ivotinja. Razliiti faktori utiu na broj i vrstu mikroorganizama u vou i povru ili gotovim prehrambenim proizvodima. Faktorima koji utiu na kvarenje namirnica pripadaju: temperatura uskladitenja relativna vlanost zraka koncentracija kisika Od unutranjih faktora valja spomenuti: sadraj vode pH vrijednost te fiziku i hemijsku prirodu namirnice i kontrolu broja i vrste mikroorganizama koji su ukljueni u proces kvarenja. Prekomjerno visok broj mikroorganizama razliitih vrsta moe uzrokovati kvarenje namirnic ivotne namirnice sadre odreen broj mikroorganizama, koj skrauju njihovu odrivost.

S druge strane u odreenim uslovima mogu uzrokovat i razliita oboljenja ljudi. Ta se oboljenja rjee manifestuju u vidu infekcija, odnosno intoksikacija, uzrokovanim specifinim patogenim mikroorganizmima, jer su ti mikroorganizmi zahvaljujui preventivnim sanitarnim mjerama rijetko prisutni u namirnicama. To su razliite vrste mikroorganizama, meu kojima su enterotoksine stafilokoke, mikroorganizmi iz grupe enterobaktrija E. Coli, Proteus sp. fekalni streptokoki Sc. Faecalis i proteolitikih klosridija Cl. Perfringens. Dijagnostika uzronika specifinih oboljenja zasniva se na kvalitativnom dokazu odeenih patogenih mikroba. Potekoe zadaju nespecifine bakterije, kako u dijagnostici, tako i uvezi sa interpretacijom nalaza tih bakterija u namirnici, s obzirom na vrstu, broj i uinak. Za ocjenu higijenkog kvaliteta namirnica znaajan je ne samo kvantitativni dokaz pojedinih vrsta i grupa nespecifinih bakterija, nego i broj tih bakterija u namirnici. Utvrivanje ukupnog broja bakterija direktnim postupkom odreuje se dirktnim brojanjem bakterija u razmazu (npr. mlijeka) pod mikroskopom. Postupak je sljedei:

uzorak mlijeka se dobro protrese i od njega se pipetom uzme 0,01 ml.

mlijeko iz pipete se ispusti u srdinu kvadrata povrine od 1 cm2 koji je ucrtan na predmetnom staklu, zatim se mlijeko razmae pomou sterilne eze po itavoj povrini kvadrata. razmaz mlijeka se sui 5 minuta na vazduhu ili laganim zagrijavanjem na tempraturi od zatim se razmaz oboji metilenskim plavim 2 minuta. razmaz se ispere vodom osui na vazduhu i mikroskopira. 450C

pod mikroskopom se broje bakterije u to je mogue veem broju vidnih polja sve dobijene vrijednosti se saberu i podijele brojem vidnih polja u kojima je vreno brojanje bakterija. Tako se dobije srednja vrijednost bakterija u 0,01 ml. Kada se taj broj pomnoi sa 100 dobije se ukupan broj bakterija i 1 ml ispitivanog mlijeka. Prednosti direktnog postupka jeste u tome, to se ovim postupkom moe za kratko vrijeme 10-15 min.dobiti podatak ne samo o broju ve i ovrsti(morfoloki) bakterija u mlijeku. Najee greke su: netano pipetiranje pogreno pripremanje i bojenje razmaza neosjetljivost bakterija prema boji premala koliina mlijeka na osnovu koje se zakljuuje o broju bakterija. nepravilno brojanje i proraunavanje zamorenost pregledaa itd. Ovim postupkom moe se odrediti broj bakterija i u pasterizovanom i mlijeku u prahu. Poveani ukupan broj bakterija utvren direktnim postupkom ukazuje na veliki broj bakterija u sirovom mlijeku, zatim nepravilnu obradu mlijeka, preduga upotreba filtera, neredovno ienje pasterizatora itd. Povean broj bakterija u pasterizovanom mlijeku ukazuje na nepravilnu pasterizaciju, preivljavanje termorezistentnih vrsta i njihovo razmnoavanje, rekontaminacija poslije pasterizacija, razmnoavanje psihrofilnih vrsta bakterija itd.

17. Odreivanje ukupnog broja mikroorganizama u namirnicama indirektnim postupkom

Kvantitativno odreivanje mikroorganizama u namirnicama vri se zasijavanjem na hranljive podloge, tako da se ovaj metod smatra jednim od najtanijih i koristi se za provjeravanje drugih metoda. Meutim, ni ovaj metod nije bez nedostataka. Mikroorganizmi se u namirnicama esto nalaze u skupinama koje sadre vei broj elija koje na hranljivim podlogama daju jednu koloniju. Mikroorganizmi u namirnicama imaju razliite optimalne uslove za rast, pa tako utiu na rezultat: sastav hranljive podloge pH sredine redoks potencijal temperatura i duina inkubacije Namirnica npr. moe da sadri veliki broj mikroorganizama pa kod direktnog zasijavanja na podlogu, izraste veliki broj kolonija koje se nemogu izbrojati. Stoga se uvijek prave razblaenja namirnice sa sterilnom vodom ili fiziolokim rastvorom i sl. u odnosu 1:10, 1:100, 1:1000 itd. iz kojih se u hranljivu podlogu zasijava po 1ml. Visina razblaenja se pravi prema broju mikroorganizama koji se oekuju u pojedinim uzorcima. Na taj nain se dobija razbalenje namirnice iz kojeg na zasijanoj podlozi izraste mali broj kolonija, koje mogu lahko da se izbroje. Odreivanje broja mikroorganizama na hranljivim podlogama mora da se vri sterilnim priborom pod strogo aseptinim uslovima. Stoga se ovaj rad moe uspjeno da izvodi samo u laboratorijama opremljenim za mikrobioloka ispitivanja. S obzirom na to da se u praksi primjanjuje vei broj metoda za ispitivanje broja mikroorganizama u namirnicama pojedine zemlje propisuju obavezne metode. Ovdje emo opisati metodu koja je propisana Pravilnikom o metodama vrenja mikrobiolokih analiza i superanaliza ivotnih namirnica (Sl. RBiH 2/92). Pribor: Pipeta od 1 i 20 mL Erlenmajer boca od 250 mL (sa staklenim zrncima) Petrijeve olje Epruvete Termostat na 30 320 C

Reagensi fizioloki rastvor hranljiva podloga ekstrakt kvasca 2,5 gr tripton 5gr glukoza 1 gr agar 12 18 gr

destilovana voda 1000 mL pH 6,5 7,0

Nain rada: Od dobro promijeanog uzorka namirnice sa pipetom prenese se 20 mL u Erlenmajerovu posudu sa staklenim zrncima i doda 180 mL fiziolokog rastvora, a zatim homogenizuje mukanjem. Na taj se nain dobije osnovno razreenje 1 : 10. Svaki mL osnovnog razreenja sadri po 0,1 mL namirnice. Za dalja razreenja se uzima 1 mL osnovnog razreenja i prenosi u epruvetu sa 9 mL fiziolokog rastvora gdje se pusti da lagano iskaplje ne dotiui nivo fiziolokog rastvora. Sadraj iz te epruvete se zatim usisava do oznake 1 mL i pusti da iskaplje. Ovo se ponovi 10 puta pa sa novom sterilnom pipetom prenese 1 mL u sledeih 9 mL fiziolokog rastvora da bi se pripremilo razreenje 1 : 1000. Dalji postupak je isti kao pri pravljenju prethodnih razblaenja. Zasijavanje se izvodi prenoenjem 1 mL iz svakog razreenja u Petrijevu olju pri emu se vrh pipete spusti, pipeta se jo dri 3 sekunde da se slije zaostali sadraj. Zasijavanje pojedinanih razblaenja vri se posebnim sterilnim pipetama. Odmjerena koliina razreenja se prelije sa oko 15 ml istopljenog i na 450 C ohlaenog hranljivog agara. Neposredno poslije izlivanja podloge , sadraj u petrijevoj olji se izmijea okretanjem olje 5 puta u pravoj ravni, zatim 5 puta krunim pokretima u pravcu kazaljke na satu i 5 puta krunim pokretima suprotno od kazaljke na satu. Zasijavanje se izvodi na isti nain u dva ili tri niza petrijevki. Zasijane podloge se inkubiraju 72 sata na 300 C, a za brojanje se odaberu ploe na kojima je izraslo 30 do 300 kolonija. Kolonije se broje slobodnim okom, lupom ili brojaem. Pri upotrebi komore (brojaa) kolonije se izbroje u najmnje 20 kvadrata, od kojih svaki ima povrinu 1 cm2. Takvo brojanje omoguava ucrtana mrea na postolju gdje se stavlja Petrijeva ploa. Kolonije se prebroje u raznim kvadratima poev od jednog kraja petrijevke. Na osnovu ukupnog broja dobijenih kolonija izrauna se srednja vrijednost po 1 kvadratu. Taj broj se mnoi sa ukupnim brojem kvadrata koji za Petrijevu olju sa vanjskim prenikom od 10 cm iznosi 65 jer je unutranja povrina 65 cm2. Dobijeni broj kolonija na pojedinim Petrijevkama treba pomnoiti sa razblaenjem iz kojeg je izvreno zasijavanje, kako bi se dobio broj bakterija u 1mL/gr ispitivane namirnice. Ako je zadnja cifra odreenog broja kolonija 5 ili manja od 5 izvri se korekcija broja kolonija na niu, a ako je 6 i vie od 6 na viu deseticu. Primjer: ako je izbrojano 104 kolonije broj se korigira na 100, a ako je izbrojano 107 kolonija broj se korigira na 110. Izuzetno ako su u uzorku utvruje broj mikroorganizama manji od 100/g ili mL, kolonije se broje i na ploama na kojima je izraslo manje od 30 kolonija.

Ako je broj kolonija od 10 do 29 vri se korekcija druge cifre na naprijed opisan nain, a ako je broj kolonija manji od 10 korekcija se ne izvodi nego se iskazuje stvarno utvren broj.

Za orjentaciju o broju i vrstama mikroorganizama koji su kontaminirali neku ivotnu namirnicu preporuuje se sljedei postupak: uzimanje uzorka organoleptika ocjena uzorka mikroskopski nalaz kulturelna pretraga za utvrivanje broja mikroorganizama u namirnici a)priprema razreenja b)zasijavanje podloga c) brojanje izraslih kolonija interpretacija rezultata. Odreivanje najvjerovatnijeg broja (MPN)- vrijednosti u namirnicama Cilj ovog pretraivanja je da se utvrdi dali namirnica predstavlja, odnosno dali moe predstavljati opasnost od zaraznih bolesti ili nekih epidemija. To se postie utvrivanjem prisustva mikrobiolokih indikatora ukupnog broja raznih mikroorganizama u namirnicama. Osnovni preduslov za dobijanje pouzdanih rezultata o kvalitativnom mikrobiolokom stanju namirnica jeste da se ispitivani uzorak uzima i alje na pregled tako da se pri tome ne kontaminira i da se onemogui razmnoavanje onih mikroorganizama koji u njemu ve postoje, ali da oni u njemu ostanu ivi i sposobni za razmnoavanje. Zbog toga je neophodno da se uzimanju i slanju uzoraka namirnica na mikrobioloki pregled posveti veoma velika panja. Rezultati novijih istraivanja pokazuju vezu izmeu mikroorganizama porijeklom iz namirnica, kao uzronicima infekcija kod osoba sa smanjenom otpornou. Jedna od metoda za dokazivanje najvjerovatnijeg broja (MPN) vrijednosti u namirnicama jeste kolimetrija i provodi se u tri faze koje se nazivaju: Prethodni Potvrdni i Zavrni test Prethodnim testom dokazuje se imali u istraivanom uzorku bakterija koje razgrauju laktozu uz oslobaanje CO2. Postupak: U seriju epruveta sa briljant-zelenim laktozo-unim bujonom inokulie se 1mL ili 10mL istraivane namirnice. U epruvetama se nalaze Durhamove cjevice u koje se izdvaja osloboeni CO2. Epruvete se stave u termostat na 370C, a rezultat se oitava nakon 24, odnosno 48 sati. Test je pozitivan ako se u bilo kojoj Durhamovoj cjevici pojavi mjehuri gasa. Nakon oitavanja rezultata valja zapisati broj pozitivnih epruveta jer se na osnovu toga broja odreuje koliko je koliformnih bakterija bilo u 1mL uzorka namirnice. Potvrdni test

Iz jedne pozitivne epruvete sa laktoza-bujonom prenese se ezom dio uzorka na vrstu podlogu EMB (eozinmetilenblau) ili na ljubiasto-crveni uni agar. Test je pozitivan ako nakon inkubacije pri 370C/48 sati na vrstoj podlozi porastu ljubiaste kolonije metalnog sjaja, veliine 1-2 mm (kolonije koliformnih bakterija).

Zavrni test S jedne pozitivne kolonije iz potvrdnog testa inokulira (nacijepi) se dio uzorka ezom ponovo u jednu epruvetu sa laktoza-bujonom i Durhamovom cjevicom i uporedo se nacijepi na kosihranljivi agar. Test je pozitivan ako nakon inkubacije pri 370C u Durhamovoj cjevici se pojavi gas, a na kosom agaru porastu kolonije bakterija. Da bi se dokazala prisutnost koliformnih bakterija valja napraviti preparat iz podloge nakon zavrenog testa i obojiti ga po Gram-u. Ako se dokau gram-negativne tapiaste bakterije, kaemo da je u istraivanom uzorku namirnice prisutna skupina koliformnih bakterija. O kojem se rodu, odnosno vrsti koliformnih bakterija radi (da li npr. o Escherichia coli ili Enterobacter aerogenes) dokazuje se biohemijskim testom (IMV i C-testom). Inkubiranjem kultura pri 44,50C tokom 24, odnosno 48 sati mogu se razlikovati koliformne bakterije porijeklom iz crijevnog trakta, od bakterija koje su normalno prisutne u zemljitu i vodi. Pri toj temperaturi naime rastu samo fekalne koliformne bakterije. Odreivanje broja koliformnih bakterija (MPN.vrijednost) najvjerovatniji broj Odreivanje najvjerovatnijeg broja koliformnih bakterija (Most Probable Number ili MPN) statistika je metoda koja se zasniva na teoriji vjerovatnoe. Odreivanje se provodi u nekoliko serija razreenja. Jedan od naina odreivanja MPN vrijednosti je upotreba 15 epruveta sa briljantzelenim laktoza-unim bujonom u kojima se nalaze durhamove cjevice. Pet od njih inokulira se sa po 10 mL uorka istraivane namirnice, drugih 5 sa po 1 mL i treih 5 sa 0.1 mL (razreenja 100, 10-1 i 10-2). Nakon inkubacije pri 370 tokom 48 sati izbroje se epruvete sa pozitivnom reakcijom (pojava gasa u Durhamovim cjevicama), dobijeni rezultati uporeuju se sa statistikim tabelama (tabele po Sverupu) iz kojih se iitava broj koliformnih bakterija. Predpostavlja se da je uzorak koji sadri 2,2 koliformne bakterije u 100 mL ili vie kontaminiran.

slika

U primjeru koji je prikazan na slici bile su pozitivne sve epruvete u seriji razreenja 100, etiri od pet epruveta bile su pozitivne u seriji razreenja 10-1, a dvije su epruvete bile pozitivne u seriji 10-2. Na osnovu vrijednosti prikazanih u tabeli najvjerovatniji je broj koliformnih bakterija 220/100 mL.

Determinacija koliformnih bakterija esto je neophodno da se odredi vrsta koliformnih bakterija u namirnicama. U tu svrhu najmanje 5 kolonija se prenese u bujon, inkubira 24 sahata na 370C, a zatim mikroskopski ispita preparat napravljen iz te bujonske kulture. U daljem postupku se koristi nekoliko karakteristinih osobina koliformnih bakterija koje su tipine za pojedine vrste i stoga slue za njihovu identifikaciju. Dokazivanje indola Indol je jedan od produkata u metabolizmu aminokiseline triptofan. Test na indol zasniva se na stvaranju crveno obojenog kompleksa kada indol reaguje sa aldehidnom grupom pdimetilaminobenzaldehid. U ovom dokazivanju obavezno je upotrijebiti podlogu bogatu triptofanom. Postupak: Triptofan-bujon, nacijepi se test-mikroorganizmom i inkubira pri 350C/18-24 sata. Nakon isteka tog vremena doda se 5 kapi reagensa u dubinu uz zid epruvete.Test je pozitivan ako se na povrini bujona pojavi crveni prsten. Interpretacija Svaka nova serija podloga ili reagenasa mora biti testirana radi dokazivanja pozitivne ili negativne reakcije na indol. Kao kontrola upotrebljavaju se ovi mikroorganizmi: Pozitivna kontrola E. Coli, negativna kontrola Klebsiella pneumoniae Test metilnim crvenilom Metilno crvenilo je indikator pH vrijednosti u rasponu izmeu 6,0 (uto) i 4,4 (crveno). Vrijednost pH pri kojoj metilno crvenilo odreuje kiselinu prilino je mala s obzirom na pH vrijednost ostalih indikatora koji se upotrebljavaju u bakteriolokim podlogama. Stoga se postizanje promjene boje mikroorganizam mora proizvesti veliku koliinu kiseline iz podloge sa ugljikohidratima. Nain dokazivanja Test metilnim crvenilom kao kvantitativan test, za proizvodnju kiseline, zahtijeva pozitivan mikroorganizam koji od glukoze stvara jake kiseline. Postupak: MC/VP bujon nacijepi se istom kulturom test-mikroorganizmima. Podloge se inkubiraju pri 350C/24-72 sahata (ne manje od 48 sahata). Nakon toga direktno se u podlogu doda 5 kapi metilnog crvenila. Interpretacija:

Nastanak nepromijenjene crvene boje u podlozi rezultat je pozitivne reakcije.

Kao kontrolni mikroorganizmi preporuuju se: Pozitivna kontrola E. Coli Negativna kontrola Enterobacter aerogenes

Voges-Proskauerov test Test se zasniva na pretvaranju acetilmetilkarbinola (aceton u diacetil) tokom reakcije sa KOH i atmosferskim kisikom. Diacetil se pretvara u crveni kompleks uz katalitiko djelovanje -naftola i kreatina. Postupak: Epruvete sa MC/VP bujonom inokuliraju se istom kulturom test-mikroorganizmima i inkubiraju pri 350C/24-48 sahata. Nakon toga uzimaju se 1 mL i prenese u istu epruvetu, doda se 0,6 mL 5% -naftola, a zatim 0,2 mL 40% KOH. Vano je reagense ovim redom dodavati. Epruveta se lagano protrese i ostavi izloena atmosferskom kisiku 10-15 minuta. Interpretacija: Pozitivan je test pojava crvene boje u podlozi nakon 15 minuta od dodavanja reagensa, to pokazuje prisutnost diacetila kao produkta oksidacije acetona. Test nije valjan ako se oitanje obavi nakon vie od 1 sahata. Citrat test Neki mikroorganizmi iz grupe koliformnih bakterija mogu da koriste citrat kao izvor ugljika. Odreivanje tih osobina vano je u identifikaciji mnogih predstavnika iz porodice Enterobacteriaceae. Podloge koje se koriste za to odreivanje ne smiju sadravati proteine i ugljikohidrate kao izvar ugljika. Naelo dokazivanja Iskoritavanje citrata zasniva se na sposobnosti mikroorganizama da upotrijebe natrijum-citrat kao jedini izvor ugljika. Podloga za testiranje sadri natrijum-citrat kao jedini izvor ugljika, i amonijum-fosfat, kao jedini izvor azota. Bakterije koje iskoritavaju citrate mogu takoe ekstrahovat azot iz amonijevih soli i stvarati NH4OH. Ta reakcija, zajedno sa hidrolizom natrijumcitrata, uzrokuje poveanje bazinosti supstrata, jer nastaju amonijeva i natrijeva baza. Kao indikator upotrebljava se bromtimol-plavo koje u podruju ispod pH = 6,0 ute boje, a plave je boje u pH = 7,6. Postupak: Istraivane kolonije bakterije, porasle na podlozi za primarnu izolaciju, precijepi se uzorak ezom na kosu povrinu citratnog agara u epruveti. Ovako pripremljen uzorak inkubira se pri 350C/24-48 sahata. Interpretacija Stvaranje plave boje u podlozi nakon inkubacije pri 350C/24-48 sahata dokazuju prisutnost bazinih produkata. Pozitivan test takoe moe biti oitan ako plava boja izostane, ali je vidljiv porast kolonija uzdu inokulacijske linije. To je razumljivo ako se ima na umu da je za vidljiv rast mikroorganizama nuno postizanje log-faze rasta, to je mogue samo ako taj mikroorganizam metabolizira ugljik i azot koji su sadrani u podlozi. Pozitivna interpretacija oitane inokulacijske

linije moe se potvrditi inkubacijom podloge produenjem dodatna 24 sahata, kada se u pravilu pojavljuje plava boja.

Produkcija i odreivanje H2S u podlozi Sposobnost nekih vrsta bakterija da oslobaaju sumpor u obliku plina iz aminokiselina i ostalih jedinjenja vana je injenica prilikom njihove identifikacije?

19.DOKAZIVANJE LIPOLITIKIH BAKTERIJA U NAMIRNICAMA

Lipolitiki mikroorganizmi stvaraju enzim lipazu, koja katalizira hidrolizu mlijene masti na masne kiseline i glicerol. Tipini predstavnici lipolitikih bakterija su vrste iz rodova: Pseudomonas Aeromonas Flavobacterium Micrococcus Corynebacterium Escherichia Klebsiella i Bacillus Veina lipolitikih mikroorganizama moe da se razmnoava pri niskim temperaturama, zbog ega se hlaenjem proces razlaganja masti u kontaminiranoj namirnici (mlijeko i mlijeni proizvodi) ne moe da sprijei. Lipoliti su neotporni na temperaturu pasterizacije, ali su njihovi enzimi termostabilni.Za dokazivanje lipolitikih bakterija u ivotnim namirnicama, koristi se osobina ovih mikroorganizama da razlau masti i pri tome stvaraju masne kiseline. S obzirom na to da mnogi mikroorganizmi razlau tributirin, preporuuju ga za dokazivanje lipolitikih bakterija. Lipolitike bakterije se dokazuju na hranljivoj podlozi sljedeeg sastava: Hranljivi agar..............20,0 g Pepton......................... 5,0 g Ekstrakt kvasca...........10,0 g Voda ........................1.000 mL Ova podloga se naziva tributirin agar po Andersonu Navedeni sastojci podloge se rastvore zagrijevanjem na 1000 C pa se tome doda 10 mL tributirina, i emulguje u elektrinom emulgatoru pri temperaturi od 45 500 C. Emulzija ne smije da pokae kuglice masti vidljive golim okom i mora biti stabilna. pH se podesi na 7,5 i razlije se u epruvete po 10 mL, zatim se sterilie u Kohovom loncu 30 minuta pri 1000 C. Rast lipolitikih bakterija odlikuje se prosvijetljenom zonom irine oko 1 mm oko kolonija.

Pribor: Pipeta od 1 mm Epruveta sa po 9 mL fiziolokog rastvora Stakleni tapi za razmazivanje materijala na podlogi Petrijeve ploe Termostat na 30 320 C. Nain rada: Namirnica se pripremi kao za odreivanje ukupnog broja bakterija. Na povrinu podloge razlivene u Petrijeve ploe stavlja se po 0,1 mL namirnice ili razblaenja iste u koliko se oekuje vei broj lipolitikih bakterija. Zatim se tako stavljeni materijal staklenim tapiem ravnomjerno razmae po povrini podloge,. Zasijane Petrijeve ploe se dre 48 72 sata na 300 C i naknadno jo dva dana na sobnoj temperaturi. Karakteristine kolonije se izbroje pa se dobijeni broj prerauna na 1 mL namirnice. Druga metoda: Viktorija plavo metoda po Rathu Sastav i priprema: Ova vieslojna podloga sastoji se iz ovih slojeva: a) nosei sloj slui da se postigne potpuno ravna povrina podloge i titi sloj b) od isuivanja. Nosei sloj sastoji se od 1,5% vodenog agara koji se razlije u epruvete po 10 mL i ostavi u friider. b) hranljivi supstrat: pepton..................8,0 g ekstrakt kvasca....2,0 g NaCl....................5,0 g Agar..................15,0 g Destilovana voda....... do 1.000 mL. Ova podloga zadovoljava sve bakterije sa konstitutivnim enzimom lipazom. Ako se ele obuhvatiti i bakterijske vrste sa adaptivnom lipazom ovom substratu treba jo dodati 20 g ispitujue namirnice npr. masno tkivo, maslac, margarin, mast i sl. i dispergovati se u supstratu. Razlije se u epruvete po 2 mL i pohrani u friideru. Podloga za sloj a) i b) steriliu se u Kohovom loncu 3 puta u 3 dana. c) Viktorija- plavo baza U trgovini je samo Viktorija- plavo, a baza se sprema na ovaj nain: Nekoliko grama Viktorija-plavog se kuha sa 100 puta tolikom koliinom vodovodne vode do pojave disperzije.

Disperzija je obojena tamno plavo. Tada se prekine kuhanje i dodaje 10%-tna NaOH dok plava boja ne stvori smei talog. Tada se odlije tenost iznad taloga, ispere vie puta talog vodom, filtrira i osui pri temperaturi 300 C. Suenje traje 2-3 dana. Nakon toga se stvorena zrna pohrane na suhom Tako dobijena Viktorija-plavo baza je stabilna.

d) supstrat za diferenciranje: Uzima se posve svjei margarin ili maslac i kuha 1/2 sata sa istom koliinom vodovodne vode ime se odstrane u vodi topive slobodne masne kiseline Zatim se uz stalno mukanje dodaje Viktorija-plavo baza dok se mast ne oboji, tamno crveno. Pri tome se obaraju visokomolekularne slobodne masne kiseline kao plavi sapuni ili soli i mogu se zajedno sa nemasnim sastojcima margarina, koji se takoe plavo boje, odfiltrirati. Nakon toga se mast jo 1/2 sata kuha. Tada se sa pipetom usisa najvei dio masti, a ostatak se oslobodi vode filtriranjem kroz prethodno ovlaeni filter pazei da u masti ne ostane ni jedna kap vode. Cjelokupna koliina na taj nain dobijenog obojenog margarina (iz pipete i iz filter ostatka sterilie se pri 1210 C i moe se pohraniti kod + 60 C nekoliko mjeseci. Nakon hlaenja ispod 100 C mast se oboji plavo-ljubiasto. A nakon ponovog otapanja postaje ponovo crvena. Postupak: Sto za rad mora biti besprijekorno ravan, a isto tako i ploe koje se zasijavaju sa vie tankih slojeva supstrata (gore navedenih). Voda za hlaenje ploa mora imati temperaturu izmeu +1 i +10. Ploe moraju biti besprijkorno oprane i bez tragova sredstava za pranje ili vodikovih jona. U petrijeve ploe se najprije razlije po 10 mL podloge a) pazei da se na poklopcu izdvoji to manje kondenzovane vode. Zbog toga supstrst a) ohladiti prije razlijevanja na 450 C. U hranljivi supstrat podloga b) zasije se 0,1 mL razreenje 10 puta nie od potrebnog t.j. umjesto 10-4 10-3 ispitujue namirnice i razlije preko skrutnute podloge a) pravei krune pokrete(da se ravnomjerno razlije). Kada se ovaj sloj skrutne inkubiraju se ploe (sa poklopcem prema dole zbog kondeza na ploama) 72 sata na 300 C. Sloj hranljivog supstrata b) iznad osnovnog noseeg sloja a) debljine je od 0,4 0,6 mm, to omoguuje da lipolitike bakterije stvore u blizini povrine bogatu zonu lipolize, koja onda razlae substrat ze diferenciranje d) koja se razlijeva po povrini sloja b). Supstrat za dokazivanje d) razlijeva se u tek nakon inkubiranja ploa kroz 3 dana u otopljenom stanju pomou pipete u koliini od 3 mL. Ploe se pri tom kruno okreu da se supstrat ravnomjerno razlije po povrini, a zatim se ploe odmah stave na hladnu plou da se supstrat to prije skrutne. Nakon toga se ploe inkubiraju na 250 C (aktivitet lipaza najbolji na toj temperaturi). Ploe se ovaj put dre u termostatu sa poklopcem prema gore) jer nesmeta kondez.

Nakon 3 dana reaguje oko 80 90 % lipolitikih kolonija pozitivno, a nakon 6 dana 100%. Iznad lipolitikih kolonija nastaje tamno-plava mrlja ili taka, po ijem vanjskom izgledu se moe donekle zakljuivati o pripadnosti. Kolonije pak zadravaju svoju prirodnu boju odnosno zbog presijavanja plave mrlje izgledaju plaviaste, zelenkaste ili ljubiaste. Kod slabo lipolitikih bakterija kolonije plave mrlje ili take su manje od kolonija. Diferenciranje je stroga, metoda izvanredno osjetljiva. I najmanje kolonije pokazuju lipolizu. Utvreno je da je ova metoda bolja od tributirin agara (podloge broj 1). Rath je dokazao da hlaenje mlijeka vodom u sabiralitima ne zaustavlja u dovoljnoj mjeri umnoavanje lipolitikih bakterija.

20.DOKAZIVANJE PROTEOLITIKIH BAKTERIJA U NAMIRNICAMA

Higijenska ispravnost i odrivost namirnica zavisi u velikoj mjeri od prisustva proteolitikih bakterija u njima. Proteoliza je proces razgradnje bjelanevina u jednostavnije spojeve topljive u vodi. Razgradnja tee do razliitog stepena a ukjuuje: Peptone Amino kiseline Amonijak I sve do slobodnog azota Proteolizu vre brojni mikroorganizmi. Neki od njih su sposobni proizvoditi enzime koji su u stanju uzrokovati tzv. slatko "gruanje".Prilikom proteolize se u namirnicama javlja gorak okus, koji uzrokuju neki poizvodi razgradnje bjelanevina (peptoni). U razgradnji bjelanevina u namirnicama uestvuje veliki broj proteolitikih bakterija koje se mogu podijeliti u 2 grupe: proteolitike bakterije koje ne stvaraju spore i proteolitike bakterije koje stvaraju spore: aerobne i anaerobne Proteolitike bakterije (asporogene) ine kratki ravni tapii koji uzrokuju uglavnom umjerenu proteolizu do peptona (peptonizacija), te proizvode i neke kiseline. Rastu pri optimalnom pH 7,0 7,2, uz iroki raspon temperature 5 450 C. Razgradnja bjelanevina pomou proteolitikih enzima: renina tripsina erepsina itd. rasprostranjene su svuda u prirodi i to:

na materijama koje truhnu u vodi zemlji gnoju rana otpadnoj vodi morskoj vodi i dr.

A) Ovoj grupi pripada Rod Proteus sa vrstom Proteus vulgaris. Produkuje indol i H2S. esto se nalazi u vodi, praini i gnoju. Pasterizacija ga unitava. Namirnice oneiene ovim bakterijama sadre toksine. B) Rod Pseudomonas obuhvata pojedinane ili savijene tapie. Mnoge vrste ovoga roda produkuju fluoroscentne pigmente: ute Plavkaste Ljubiaste Nalaze se u vodi i u zemlji. Aerobni su. Optimum razvoja im je na temperaturi 20 250 C, ali se mogu razvijati i na 50 C te ih nalazimo u svjeem hlaenom mlijeku. Razgrauju bjelanevine. Izmeu ostalih najpoznatije su vrste: Pseudomonas aeruginosa (priozvodi plavi pigment piocinin) P. synxsanta (proizvodi uto-narandasti pigment) P.fluorescens Aeroban je. (proizvodi fluoroscentni, uti pigment) C) Rod Serratia sa vrstom Serratia marcescens, razgrauje bjelanevine. Optimum razvoja ima kod 25 300 C. Aeroban je i fakultativno anaeroban. Ne proizvodi indol. Proizvodi acetil metil karbinol i trimetil amin (miris). Karakteristian je po stvaranju razliitih crvenih kolonija na namirnicama. D) Rod Alcaligenes to su tapiaste, ili bakterije u obliku koka. Pokretne su, gram negativne i proizvode alkalije. Nalaze se u crijevnom traktu kimenjaka i mlijenim proizvodima.Vrsta Alcaligenes viscolactis. Aeroban je. Optimum razvoja ima izmeu 20 370 C, a moe se razvijati i kod 10 200 C. Daju namirnicama gorak , truho okus. E) Rod Brevibacterium to su kratki i dugi tapii. Stvaraju ute crvene i smee pigmente a nalaze se u zemlji ivodi. Vrsta Brevibacterium linens razgrauje bjelanevine te proizvodi crveno do narandasto obojenje. Optimalan razvoj mu je od 21 do 300 C, raste jo i kod 8 370 C. Neke vrste podnose i do 15% soli (halofilne vrste). Aeroban je. Zajedno sa ostalim srodnim vrstama u tzv. "crvenom mazu" uestvuje u zrenju limburkog tipa sireva. Vrsta Brevibacterium erythrogenes razlae bjelanevine, pri emu stvara crveni i uti pigment, rasprostranjen je u prirodi. Proteolitike bakterije koje stvaraju spore (sporogene) Ovu grupu ine bakterije koje stvaraju sporu, otporne prema visokoj temperaturi te mogu preivjeti pasterizaciju. Zato se mogu nai u pasterizovanim namirnicama. Meu njima razlikujemo aerobne i anaerobne vrste. U aerobne spadaju mnoge vrste iz roda Bacillus, a u anaerobne takoe mnoge vrste iz roda Clostridium. Aerobne sporogene proteolitike bakterije:

A) Rod Bacillus su kratki tapii, veinom pokretni rasporeeni pojedinano ili u lancima, stvaraju endo spore. Intezivno razgrauju proteine uz stvaranje amonijaka. Uglavnom su saprofiti i iroko su rasprostranjeni u prirodi. Znaajne vrste su: Bacillus cereus stvara kolonije sline vosku, spore su mu elipsoidne. Optimum razvoja mu je kod 300 C, maksimum kod 480 C. Peptonizira namirnice. Rasprostranjen je u zemlji, vodi i na biljkama. Bacilus subtilis neki sojevi proizvode antibiotike (suptilin, bacilin, bacilomycin). Optimalna temperatura razvoja mu je izmeu 25 i 450 C. Aeroban je. Rasprostranjen je u zemlji , praini na travi koja truhne. Bacillus megatherium ima izgled velikih, irokih pokretljivih tapia. Optimum razvoja mu je kod 28 350 C, maksimum 40 450 C. Peptonizira namirnice. Rasprostranjen je u zemlji ivodi. Bacillus stearothermophilus spada u termofilne vrste. Optimum razvoja ima kod 50 650 C, a podnosi temperaturu do 700 C. Rasprostranjen je u zemlji i pokvarenoj hrani. Spore su mu vrlo otporne. Anaerobne sporogene proteolitike bakterije: B) Rod Clostridium su tapiasti bacili sa oblim krajevima. Pojavljuju se pojedinano, u parovima i dugim lancima. Proizvode spore karakteristinog oblika kruke otuda naziv klostridije. Neke vrste mogu razlagati i bjelanevine. Posebnu tetu prave u sirarstvu jer uzrokuju tzv. "kasno nadimanje" sira. Pasterizacija nije djelotvorna jer spore preive. Najznaajnije vrste iz ovoga roda su. Clostridium botulinum ima vie sojeva koji proizvode toksine. Optimum razvoja mu je izmeu 20 300 C. Strogo je anaeroban. Spore su mu vrlo otpone pa se moe odrati u konzervama i topljenom siru. Nalazi se u zemlji i crijevima oboljelih ivotinja. Clostridium perfringens optimalan razvoj ima na temperaturi 450 C, a raste izmeu 20 500C. Brzo fermentira mlijeko uz produkciju kiseline i gasa. Clostridium lentoputrescens optimalan razvij mu je kod 370 C. Nalazi se u crijevnom traktu kod ivotinja i u zemlji. Anaeroban je. Razgrauje bjelanevine uz stvaranje jako neugodnog mirisa. Stvara truhla mjesta u siru. Podloge za dokazivanje: Agar sa kalcijumom, kazeinom i peptonom po Schonbergu i Krausu. Rastvor 1. 3,5 g kazeina stavi se u 50 mL destilovane vode. Poslije 15 minuta dodaje se 100 mL zasiene krene vode (1 dio kalcijumhidroksida i 104 dijela destilovane vode). Poslije zasienja filtrira se 2 puta kroz isti filter papir i mijea dok se kazein ne rastvori. Rastvor se stavlja u Kohov lonac 30 minuta i pslije hlaenja na 500 C mijea u jednakom odnosu sa rastvorom 2 koji se takoe zagrije na 500 C Rastvor 2. 20 mL bujona (na 1000 mL destilovane vode stavlja se 3 gr mesnog ekstrakta, 5 gr peptona, 10 mL 0,15% rastvora hlorkalcijuma, 10 mL rastvora fosfata), 460 mL destilovane vode i 4,5% agar-agara. Sve rastvoriti u Kohovom loncu, a zatim se podesi pH na 7,6 i sterilie u autoklavu 10 minuta na 1200 C. Rastvor 1 i 2 se uvaju u Erlen majerovim posudama razliveni po 150 mL, jer se poslije sastavljanja nesmiju zagrijavati. Prije upotrebe se napravi svje 10% rastvor kazein-peptona i

sterilie u Kohovom loncu 30 minuta, pslije ega se na 30 mL dodaje 150 mL rastvora 1. Cjelokupna smjea se dobro iznijea i razlijeva u Petri ploe. Pribor: Pipeta od 1 mL Epruveta sa 9 mL sterilnog fiziolokog rastvora Stakleni tapi za razmazivanje Petrijeva ploe Termostat na 370 C. Nain rada: Uzorak namirnice se priprema na uobiajen nain kao i pri odreivanju ukupnog broja bakterija. Ako se oekuje mali broj proteolitikih bakterija na povrinu podloge razlivene u Petri ploe stavi se 0,1 mL namirnice i staklenim tapiem ravnomjerno razmae. Ako pak oekujemo vei broj. Onda se srazmjerno tome uzima po 0,1 mL iz veeg razreenja namirnice i dalje postupi kao u prethodnom sluaju. Inkubiranje zasijanih podloga mora da bude najmanje 48 sati, poslije ega se proteolitiki mikroorganizmi lahko uoavaju na osnovu jasnog prosvjetljenja podloge oko izraslih kolonija. Ostali mikroorganizmi ne mijenjaju izgled podloge.Determinacija proteolitikih bakterija izraslih na opisanoj podlozi radi se prema poznatim principima u bakteriologiji. Pri tome posebni znaaj ima utvrivanje sporogenih aerobnih bacila, jer preivljavaju termiku obradu namirnica. Anaerobne sporogene bakterije se na podlozi sa kazeinom ne mogu da dokau. Za njihovu izolaciju moraju da se primijene metode koje omoguavaju anaerobni rast mikroorganizama. Preporuuje se metoda po Weizirlu, zbog jednostavnosti i vrlo lahke interpretacije. Na ovakvu primarnu izolaciju anaerobnih sporogenih bakterija se nastavlja determinacija poznatim tehnikama u mikrobiologiji.

21.DOKAZIVANJE SALMONELA VRSTA U NAMIRNICAMA

Klasifikacija Enterobacteriacea zasniva se na odreivanju prisustva ili odsustva razliitih enzima kodiranih u genetikoj materiji bakterijskih hromozoma. To su enzimi iz direktnog metabolizma bakterija, koji se mogu dokazati pomou posebnih hranljivih podloga za kultivisanje postupcima "in vitro". Materije sa kojima ti enzimi mogu reagovati, sastavni su dio hranljive podloge zajedno sa prisustvom indikatora, kojim se moe odrediti ili razgradnja supstrata ili prisustvo specifinih produkata metabolizma. Budui da najvei broj uzoraka to dolazi u laboratorij sadri mnotvo razliitih vrsta bakterija, esto pomijeanih sa ostalim mikroorganizmima, moraju se koristiti salektivne podloge za ponovno dokazivanje pojedinih vrsta bakterija Strunjak iz tog podruja rada zbog praktinosti mora znati sastav svake pojedinane podloge i svrhu svakog hemijskog spoja koji se dodaje podlozi. Npr. nije dovoljno znati da su une soli u sastavu brojnih selektivnih podloga radi inhibicije rasta gram-pozitivnih i nekih osjetljivih gram-negativnih vrsta bakterija. Naime, potrebno je znati da koncentracija unih soli odreuje koje e bakterije biti inhibirane i koliko je selektivna ta podloga. Izbor selektivnih podloga zavisi o vrsti mikroorganizama koje valja izolovati a i o linoj sklonosti analitiara. Inae se selektivne podloge koriste za dokazivanje vrsta iz rodova Salmonella i Shigella iz uzoraka namirnica i vode za koje se sumnja da bi mogli biti oneieni fekalijama.

Salmonelle su gram-negativni tapii, koji ne fermentiraju laktozu, ne razgrauju ureu i pokretne su, izuzev Salmonella pullorum i Salmonella gallinarum . Neke vrste su patogene za ovjeka (S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B.) a neke za ivotinje (S. typhimurium, S. enteritidis, S. dublin, S.cholerae suis i druge). Putem endotoksina uzrokuju alimentarna trovanja. Trovanja uzrokuju namirnice u kojima se salmonele mogu umnoavati, jer je za nastanak trovanja potrebno prisustvo veeg broja tih bakterija u namirnicama. Za dokazivanje salmonela u namirnicama potrebno je da se izvri obogaenje u tenoj podlozi, a zatim izolacija na vrstoj podlozi. Za obogaenje se koristi tena podloga selenit bujon. Sve komponente se rastvore u prethodno prokuhanoj destilovanoj vodi, u sterilnoj posudi. Podloga se koristi odmah poslije pripremanja, odnosno za svako ispitivanje priprema se svjea podloga. Gotova podloga treba da ima pH 7,0. Mogu se koristiti gotove dehidrirane podloge prema upustvu proizvoaa. Za izolovanje salmonela koristi se SS-agar, Bizmut sulfit agar, Ksilozolizin-dezoksiholat-agar. une soli mogu se zamijeniti sa 100 mL svjee govee ui. Sve komponente se stave u 1000 mL hladne destilovane vode dobro se promijeaju i ostave da stoje 15 minuta. Poslije toga se zagrijavanjem sve komponente potpuno otope i podesi se pH na 7,4. ohlade se do 600C, dobro se promijea i razljeva u Petri ploe. Podloga se ne sterilie. Sve hemijske materije se rastvore u sterilnoj destilovanoj vodi i ostave 15 minuta. Uz paljivo zagrijavanje, podloga se otopi, ohladi na oko 500C, dobro promijea da se precipitat ujednai i odmah razljeva u Petrijeve ploe. Podloga se ne sterilie, a pH treba da je 7,7. Prije upitrebe razlivenu podlogu u Petrijevim ploama treba drati 4 dana na +400C. Nain rada: Uzorak namirnice se odmjeri u koliini od 25 mL/g i prenese u 225 mL/g selenit bujona. Zasijana podloga se inkubira na 370 C. 18-24 sata. Po zavrenoj inkubaciji podloge jedna oma se zasijava na povrinu SS-agara ili Bizmut sulfitnog-agara. Zasijane podloge se inkubiu 24-48 sati na 370 C. Karakteristine kolonije se presijavaju na Kliglerov dvostruki eer. Salmonele ne razlau laktozu pa je kosi dio dvostrukog eera crven, a dekstrozu razlau, pa je stub u dubini ut ili crn usljed stvaranja H2S. Za dalju identifikaciju Salmonella ispituje se sposobnost razgradnje ureaze, rast u prisustvu KCN i sposobnost stvaranja indola.Sposobnost stvaranja ureaze se ispituje na kosom agaru sa ureom po Christensenu sljedeeg sastava: Pepton...........................................0,1% Dekstroza......................................0,1% Natrijum-hlorid NaCl)..................0,5% Mono-kalijum-fosfat(KH2PO4)....0,2% Urea .............................................0,2% Fenol-crveno..........................0,0012% 1,5g agara u prahu rastvori se u 90 mL destilovane vode i sterilie se u autoklavu 15 minuta na 1200C. Neposredno prije upotrebe agar se otopi i ohladi na oko 500C. Tada mu se doda 10 mL rastvora koji sadri navedene komponente u propisanim postocima. Sve se te komponente rastvore u sterilnoj destilovanoj vodi i odmah koriste. Po 4 mL podloge razlije se u epruvete 12x120 mm i u kosom poloaju ohladi. pH podloge treba da bude 6,9. Ispitivane kulture sumnjive na Salmonelle ili

Proteus zasijavaju se ezom po kosini i ubodom u podlogu. Ureaza pozitivna reakcija oitava se pojavom crvene boje podloge. Rast u prisustvu KCN se ispituje na tenoj podlozi sljedeega sastava: Proteaza pepton....................................0,3% Dinatrijum-fosfat(Na2HPO4)............0,564% Monokalijum-fosfat (KH2PO4)......0,0225% Natrijumhlorid (NaCl)..........................0,5% Sve komponente se rastvore u destilovanoj vodi, pH podloge podesi na 7,6, razlije se u boce po 100 mL i sterilie u autoklavu 15 minuta na 1200C. Ohladi se na oko 200C i na 100 mL doda 1,5 mL 0,5% rastvora kalijumcijanida (KCN). Rastvor kalijumcijanida priprema se tako to se 0,5 mL kalijumcijanida stavi trbuastom pipetom u 100 mL destilovane vode. Po 2 mL podloge razlije se u sterilne epruvete 12x120mm, koje se zatim zatvore epom. Kulture, sa 24 sata starog bujona, zasiju se ezom. Ako mikroorganizam raste u prisustvu KCN podloga se zamuti. Za ispitivanje stvaranja indola koristi se peptonska voda sljedeeg sastava: Pepton (koji sadri triptofan)...........1,0% Natrijumhlorid (NaCl).....................0,5% Pepton i natrijum hlorid rastvore se zagrijavanjem u destilovanoj vodi, po 10 mL podloge razlije se u epruvete 16x160 mm i sterilie se 15 minuta na 1200C. pH gotove podloge treba da je 7,5. Podloga se zasijava istom kulturom i inkubira 24 sata na 370C. Reakcija je specifina za mikroorganizme koji razlau triptofan (aminokiselinu sa indolovim prstenom), pa je zbog toga obavezno da se on nalazi u podlozi. Podloga ne smije sadravati eer, jer eer ometa reakciju stvaranja indola. Stvoreni indol, u podlozi zasijanoj ispitivanom kulturom dokazuje se pojavom crvenog prstena. Kultura koja daje sve biohemijske reakcije za salmonele dalje se identifikuje reakcijama aglutinacije polivalentnim i monovalentnim sarumima. Pri identifikaciji soja aglutinacijom, treba provjeriti soj i aglutinirajui serum na pojavu spontane aglutinacije. Na odgovarajue staklo stavi se kap grupnog O (polivalentnog) aglutinirajueg seruma za salmonele i dio kolonije sa agara pa se izmijea.Pozitivna reakcija aglutinacije izraena je pojavom sitno zrnastih pahuljica u bistroj tenosti seruma.

22.DOKAZIVANJE KOAGULAZA-POZITIVNIH STAFILOKOKA U NAMIRNICAMA

Stafilokoke u namirnucama se prvenstveno dokazuju zbog vanosti enterotoksinih sojeva, koji kod ljudi, poslije konzumiranja kontaminirane hrane, mogu da izazovu trovanje. Diferenciranje enterotoksinih sojeva od ostalih stafilokoka mogue je jedino na osnovu dokaza enterotoksina u kulturi izolovanih stafilokoka, ili u namirnici koja je izazvala trovanje. Sve poznate metode za dokazivanje enterotoksina su sloene, dugotrajne i skupe, pa su zbog toga nepodesne za rutinski rad. Zato je uobiajeno da se u namirnicama, dokazuju stafilokoke sa osobinama patogenih vrsta, jer u veini sluajeva enterotoksigeni sojevi imaju sline osobine. Prirodno je da se na osnovu toga ne moe sigurno tvrditi da li se radi o enterotoksinom soju, jer ima stafilokoka koje stvaraju enterotoksin, a ne pokazuju karakteristine osobine patogenih

stafilokoka, kao to ima stafolokoka koje ne stvaraju enterotoksin, a imaju osobine patogenih vrsta. Dokazivanje stafilokoka u namirnicama predstavlja poseban problem u sanitarnoj kontroli, jer su u veini sluajeva prisutne druge bakterije, koje ometaju izolaciju i identifikaciju stafilokoka. Krvni agar na kome stafilokoke vrlo dobro rastu, moe da se koristi za dokazivanje stafilokoka u namirnicama samo ako je zagaenje iz vanjske sredine svedeno na najmanju mjeru. Stoga se za dokazivanje stafilokoka u namirnicama koriste selektivne podloge na kojima stafilokoke, a naroito patogene, karakteristino rastu, dok su ostale prisutne vrste potpuno sprijeene u rastu. Prema mnogim autorima, za izolovanje patogenih stafilokoka iz namirnica pogodne su sljedee podloge:

Agar po Baird-Parkeru Agar sa dodatkom 7,5%-nog natrijumhlorida Slani agar po Chapmanu

Agar po Baird-Parkeru: Sastav osnovne podloge u 1000 mL destilovane vode uz zagrijavanje rastvori se: tripton....................10g mesni ekstrakt..........5g ekstrakt kvasca.........1g natrijumhlorid...........5g

agar.......................20g. Podesi se pH na 7,2 i razlije u boice po 83 mL, a zatim sterilie u autoklavu 15 minuta na 1200C. Posebno se pripremi 20%-ni rastvor glikokola, 1%-ni rastvor kalijumtelurita i 20%-ni rastvor natrijumpiruvata. Sterilie se proputajui kroz Seitzov filter. Osnovnoj podlozi (83 mL) ohlaenoj na 450C dodaje se po 6,3 mL rastvora glukoze, 1mL rastvora kalijumtelurita i 5 mL rastvora piruvata, prethodno takoe zagrijanih na 450C. Najzad se dodaje 5 mL umanceta i ako je potrebno zapremina dopuni do 100 mL sterilnom destilovanom vodom.Gotova podloga se razljeva u Petrijeve ploe koje prije zasijavanja treba ostaviti da se prosue. Preporuuje se upotreba svjee pripremljene podloge.Glavna osobina ove podloge je u tome da kod koagulaza-pozitivnih sojeva nastaje svijetla zona oko kolonija. Ova zona je poslije inkubacije od 24 sata na 370C iroka 2 do 5 mm, a poslije inkubacije u sljedeih 24 sata esto nastaje zamuenje. Natrijumpiruvat stimulie rastenje stafilokoka, a kalijumtelurit i glikol je ine visoko selektivnom. Nalaz sjajnih crnih kolonija sa sivkastim rubom i svijetlom zonom smatra se tipinim za koagulaza-pozitivne stafilokoke. Agar sa dodatkom 7,5%-nog natrijumhlorida: Selektivnost ove podloge je zasnovana na visokoj koncentraciji NaCl, a krv u podlozi omoguava bolju identifikaciju stafilokoka, jer se na osnovu hemolize mogu da diferenciraju hemolitike od nehemolitikih vrsta. Bolji rezultati se dobijaju ako se eritrociti prije upotrebe isperu fiziolokim rastvorom. Slani agar po Chapmanu:

Njegova se selektivnost zasniva na visokoj koncentraciji NaCl. Chapman je svojoj podlozi dodao eer manit jer je smatrao da samo patogene stafilokoke razlau manit. Poslije 24 do 48 sati na 370 C stafilokoke izrastaju u vidu utih kolonija, jer usljed razlaganja manita nastaje promjena boje indikatora. Sastav podloge: pepton............................2g ekstrakt mesa..................1g pepton proteaza...............9g natrijumhlorid.................75g manit.............................10g agar...............................15g fenolcrveno................0,025g destilovana voda........1000mL pH sa dotjera na 7,4-7,5. Sterilizacija 15 minuta na 1200C u autoklavu. Prije zasijavanja namirnica se dobro izmijea, a zatim se pipetom stavi 0,1 mL na podlogu razlivenu u Petrijevu plou. Ako se oekuje veliki broj stafilokoka treba napraviti decimalna razblaenja namirnice kao pri odreivanju ukupnog broja bakterija pa iz njih zasijati po 0,1mL. Sterilnim staklenim tapiem namirnica se razmae po cijeloj povrini podloge. Tako zasijane Petrijeve ploe dre se u termostatu 24 sata na 370 C ili due. Na opisanim selektivnim podlogama, patogene stafilokoke, imaju tipian rast, to je esto dovoljno za njihovo razlikovanje od ostalih bakterija koje na ovim podlogama nekada ipak izrastu. Meutim, u cilju identifikacije patogenih stafilokoka moe se izvriti dokazivanje razlaganja manita, stvaranje koagulaze, fosfataze, hijaluronidaze i primijeniti druge metode koje se u bakteriologiji koriste za identifikaciju patogenih stafilokoka. Dokazivanje hemolizina: Za ispitivanje hemolizina kod stafilokoka koristi se 5% krvni agar. Pojava nepotpune hemolize poslije 18-20 sati inkubacije na 370 C je dokaz beta hemolizina, a potpuna je ustvari dokaz alfa hemolizina. Razlikovanje alfa i delta hemolize se posmatra u beta zoni stafilokoka. Stvorena beta zona koi alfa hemolizin, a pojaava delta hemolizin, tako da u beta zoni nastaje prosvjetljenje u vidu lijevka. Dokazivanje koagulaze: Koagulaza se dokazuje sa krvnom plazmom kunia koja se dobije dodavanjem 1mL 10%-nog natrijumcitrata na 10 mL krvi. Poslije centrifugiranja odvoji se bistar sloj iznad nataloenih eritrocita, koji predstavljaju plazmu. Za dokazivanje koagulaze plazma se razblai fiziolokim rastvorom u odnosu 1:5. Od toga se uzima 0,5 mL i sipa u epruvetu, a zatim se ezom doda djeli kolonija koje se ispituju, poslije ega se epruveta stavi u termostat na 370 C, poslije 2 sata kontrolie se dali je dolo do koagulacije plazme. U sluaju da nije, produi se inkubiranje i reakcija oitava poslije 4, 6 i 24 sata. Za kontrolu se uzima 0,5 mL plazme koja ne smije da koagulie poslije odreenog vremena i jedna epruveta u kojoj se ispita koagulaza sa ranije provjerenim pozitivnim sojem. Aglutinacija plazme kunia moe da se dokazuje brzim testom na predmetnoj ploici mikroskopa. Kap plazme kunia izmijea se sa malo materijala uzetog ezom od kolonija koje se ispituju. Pojava

pahuljiastog taloga poslije 1-2 minuta oznaava pozitivnu reakciju dok kod negativne reakcije tenost ostaje homogeno zamuena. Dokazivanje fosfataze: Fosfataza moe da se dokazuje na vie naina. Schonherr preporuuje bujon koji sadri 0,01% kolamin fenolftalein fosfata. Zasijana podloga se inkubie 24 sata na 370C, poslije ega se dodaje kap mol/L NaOH. U pozitivnoj fosfatazi slobodan fenolftalein se u bazinoj sredini oboji crveno. Slina ovom postupku je i metoda koju predlae Kaffka. Na agar koji sadri 0,01% fenolftaleindifosfata zasije se ispitivani soj i inkubira 18 sati na 370C. Izrasle kolonije se izloe pari amonijumhidroksida koja ih oboji crveno, ako je dejstvom fosfataze osloboen fenolftalein.

Dokazivanje hijaluronidaze: Opisaemo nain za dokazivanje hijaluronidaze metodom dekapsulacije po Murrayu i Piercyu. Mehanizam reakcije kod metode dekapsulacije sastoji se u tome to se pod dejstvom hijaluronidaze razlae mucin (mukopolisaharid) iz kapsule mukoznog soja Staphylococcus equi, usljed ega soj koji inae raste u vidu krupnih sluzavih kolonija gubi osobinu ovakvog rasta i izraste u vidu sitnih kolonija bez sluzi. Soj Staphylococcus equi zasijava se tako da se omom povlai prava linija preko 1,5% krvnog agara razlivenog u Petrijeve ploe. Upravo Staphylococcus equi takoe u pravoj liniji zasijava se ispitivani soj stafilokoka, pa ukoliko stafilokoke stvaraju hijaluronidazu Staphylococcus equi ne raste sluzavo na mjestu gdje se ukrtaju oba soja. Zasijane podloge se inkubiraju 18 sati na 370 C u vlanoj komori, za ta moe da se koristi i staklena tegla na ije dno se stavi nakvaena vata. Tegla se sa zasijanim Petrijevim ploama poklopi staklenim poklopcem i stavi u termostat. Oksidaciono fermentacijski test Izvodi se u agaru sa glukozom i agaru sa manitom. Ispitujue stafilokoke se zasijavaju u po dvije epruvete agara sa manitom i agara sa glukozom. Po jedna epruveta agara sa manitom i agara sa glukozom se preliju sterilnim parafinom. Sastav agara sa glukozom:

tripton............................2g kvaev ekstrakt..............2g glukoza.........................10g NaCl...............................5g K2HPO4....................... 0,3g agar...............................3g

bromtimolplavo............0,3g

Podloga se sterilie 20 minuta na 1200 C Sastav agara sa manitom: tripton........................10g kvaev ekstrakt...........5g manit.........................10g bromkrezolpurpur....0,015g agar..............................5g

pH 6,9. Podloga se sterilie 20 minuta na 1200 C. Zasijane podloge se inkubiraju 24 sata na 370 C. Promjena boje podloge u epruveti sa parafinom do 2 cm ispod parafina oznaava oksidaciju, a u dubini epruvete fermentaciju.

Rast na podlozi sa kristalvioletom: Za razlikovanje humanih od bovinih sojeva koristi se podloga sa kristalvioletom. Sastoji se:

1% rastvor kristal violeta 1:100.000 hranljivi agar pH= 7,6 podloga se zasijava u makrokolonijama prenika 6 mm. Rast utih kolonija je karakteristian za stafilokoke koje razlau kristalviolet. Violet ili plavoviolet kolonije daju stafilokoke koje razlau kristalviolet.

Dokazivanje lizocima: Zasniva se na sposobnosti stafilokoka da razlau membrane elija Micrococcus lisodeiticus suspendovanih u agaru u koncentraciji 106/mL podloge. Pojava svijetle zone oko kolonija poslije inkubacije 24 sata na 370 C oznaava prisustvo lizocima.

23.DOKAZIVANJE PROTEUS VRSTA U NAMIRNICAMA

Mikroorganizmi iz roda Proteus (P. Vulgaris, P.mirabilis, P.morgani i P. Rettgeri) su veoma rasprostranjene u prirodi. Najee se nalaze na mjestima aerobnog raspadanja materije. Dobro se razmnoavaju u namirnicama bogatim bjelanevinama koje su podlone kvarenju. Temperaturne granice u kojima se Proteusi razmnoavaju kreu se od 10 do 400 C. Proteus vrste su termolabilne i unitavaju se na temperaturama pasterizacije. Kvarenje namirnica uglavnom izazivaju u zajednici sa drugim mikroorganizmima. U mlijeko i proizvode od mlijeka Proteus vrste

dospijevaju pri naruavanju higijensko-sanitarnih reima. Tako npr. u sirovom mlijeku Proteus vrste se ne razmnoavaju zbog prisustva bakterija mlijene kiseline, dok se u sterilnom mlijeku veoma brzo razmnoavaju. Nalaz Proteus vrste u namirnicama ne pokazuje samo fekalnu kontaminaciju ve govori i o zagaenosti hrane proizvodima u kojima se raspadaju bjelanevine. Za izolovanje Proteus vrste iz namirnica koriste se tene i vrste podloge. Ako se Proteus vrste trae u jednom gramu ili u jednom mililitru uzorka, onda se ta koliina uzorka zasijava u hranljivi bujon. Sastav podloge hranljivog bujona: Pepton.......................................15g Ekstrakt mesa.............................3g NaCl............................................5g K3PO4 ......................................0,3g Destilovana voda...............1000 mL Sve komponente se rastvore i podloga sterilie u autoklavu 15 minuta na 1200 C. Zasijane podloge se inkubiraju 24 sata na 370C. Ako se Proteus vrste trae u 0,1 mL tekue namirnice ili u 0,01g vrste namirnice, tada se 0,1mL tene namirnice ili osnovnog razreenja vrste namirnice zasijava na brilijant-zeleni laktoza-uni agar iji sastav izgleda ovako: Ekstrakt kvasca.......................................3g Pepton ..................................................10g NaCl........................................................5g Laktoza ................................................10g Saharoza .............................................10g Fenolcrveno .....................................0,08g Brilijantzeleno.................................0,025g Agar ....................................................20g Sve komponente se rastvaraju laganim zagrijevanjem dok ne doe do kljuanja u destilovanoj vodi. Podlozi se dodaje 1,25 mL 0,1% vodenog rastvora brilijantzelenog. Podesi se pH na 6,9 do 7,2 razlije u manje boce i sterilie 15 minuta na 1200 C. Kolonije bakterija koje ne razlau laktozu ne mijenjaju boju podloge, imaju svijetloruiasto opalescentnu boju i malog su promjera (Salmonelle), a mogu se spajati i initi tanak sloj (Proteus). Bakterije koje razlau laktozu mijenjaju pH podloge i stvaraju uto zelene kolonije (Koliformne). Zasijane podloge se inkubiraju 24-48 sati na 370 C. Izrasle laktoza negativne kolonije, gram negativnih tapia karakteristinih za Proteus vrste se presijavaju na dvostruki eer po Kligleru. Zasijana podloga se inkubira 24-48 sati na 370 C. Proteus vrste su laktoza negativne pa je kosi dio podloge crven, a dekstroza poitivne ine stubi podloge ut ili crn usljed stvaranja sumporvodika. Dalja identifikacija mikroorganizama koji su na dvostrukom eeru rasli karakteristino za Proteus vrste se izvodi prema tabeli 1.

24.DOKAZIVANJE SULFITOREDUCIRAJUIH KLOSTRIDIJA U NAMIRNICAMA

Rod Clostridium obuhvata saprofitske bakterije koje se normalno nalaze u zemljitu, otpadnim vodama, i u materijalima biljnog i ivotinjskog porijekla. Mali broj vrsta ovoga roda su uzronici oboljenja, i to samo kada se nalaze van svog prirodnog prebivalita. Neke vrste uzrokuju kvarenje ivotnih namirnica i u njih produkuju toksine koji dovode do veoma tekih trovanja. Nain dokazivanja: 1 mL odgovarajueg osnovnog razreenja uzorka ispitivane namirnice stavi se u epruvetu 16 x 160 mm. Epruveta se potopi u vodu koja je zagrijana u vodenom kupatilu na 800C i ostavi 10 minuta. Nakon toga u epruvetu se nalije pripremljeni i otopljeni sulfitni agar tako da udaljenost agara od epa nesmije biti vea od 1cm. Zasijana podloga inkubira se 3-5 dna na 370 C. Rast karakteristinih crnih kolonija u dubini podloge ili difuzno crnjenje cijele podloge, uz oslobaanje gasa i cijepanje podloge ili bez stvaranja gasa, oznaava se kao pozitivni prethodni ogled, odnosno kao znak vjerovatne prisutnosti sulfitoreducirajuih klostridija u uzorku. Dokazivanje se dalje izvodi tako da se od karakteristinih crnih kolonija napravi razmaz i oboji po Gramu. Istovremeno se kultura ezom prenese na krvni agar koji se inkubira aerobno 48 sati na 370C. Nalaz Gram pozitivnih tapia, sa sporama ili bez spora, u mikroskopskom preparatu i izostanak rasta na krvnom agaru smatra se pozitivnim prethodnim ogledom, odnosno dokazom prisutnosti sulfitoreducirajuih klostridija u ispitivanom uzorku namirnice. Postupak izolacije sulfitoreducirajuih klostridija iz namirnica za koje se sumnja da su izazvale trovanje, a kod kojih postoje uslovi za razmnoavanje klostridija, dopunjuje se istovremeno uporednom obradom uzorka koji se prije zasijavanja termiki ne obrauje na gore navedeni nain. Pri tom se uvijek zasijava serija od najmanje 4 epruvete sa razreenjima 10-1, 10-2, 10-3 10-4. Pozitivnim nalazom smatra se utvreni rast sulfitoreducirajuih klostridija u termiki obraenom uzorku ili utvren rast u najmanje dva razreenja kod termiki neobraenog uzorka.

25.DOKAZIVANJE VRSTA CAMPILOBACTER JEJUNI, LISTERIA MONOCYTOGENES, YERSINIA ENTEROCILYTICA I NJIMA SLINE VRSTE IZ NAMIRNICA
Kampilobakterioze su jedne od eih akutnih infekcija crijevnog trakta izazvanih vrstom Campilobacter jejuni. Iako je ve dugo poznata u veterinarskoj medicini, tek od 1972 godine postaje znaajnija u humanoj medicini, zahvaljujui otkriu selektivnih podloga za njihovu izolaciju iz namirnica.Bolest se najee javlja u djeijoj dobi. Izvor infekcije: Kako se bakterija kampilobakter nalazi u crijevnom traktu gotovo svih ivotinjskih vrsta, glavni je izvor infekcije za ovjeka hrana ivotinjskog porijekla. Najee su to perad, te rjee goveda, ovce i kuni ljubimci psi i make. Izvor zaraze moe biti i ovjek koji je zdrav (kliconoa) ili bolesnik.

Nain prenoenja: Primarni znaaj u prenoenju kampilobaktera na ovjeka ima hrana ivotinjskog porijekla i njihove preraevine, posebno perad koja se tokom klanja i obrade kontaminira bakterijom iz crijeva ivotinje. Osnovni uslov za nastanak infekcije je nedovoljna termika obrada hrane. esta je infekcija mlijekom, posebno nekuhanim i nepasterizovanim. Savremeni nain masovne industrijske prerade mesa i upotreba konzerviranih namirnica ivotinjskog porijekla predstavlja znaajan uslov za pojavu kampilobakterioza u zemljama visokog higijenskog standarda. Stoga je bolest jednako uestala i u razvijenim zemljama i u zemljama u razvoju.

Preventivne mjere: o U cilju postizanja kvalitetnih preventivnih mjra znaajna je saradnja veterinarske i medicinske slube: o Veterinarski pregled ivotinja prije klanja i nadzor nad mesom o Adekvatni higijenski uslovi u klaonicama i prostorijama za uvanje mesa o Posebna higijena ljudi koji rade sa namirnicama o Provoenje mjera deratizacije i dezinsekcije, te uvanje namirnica od pristupa mieva , muha i ohara o Obavezno dranje hrane u friiderima na (+40C) o Termika obrada namirnica o Upotreba prokuhanog ili pasterizovanog mlijeka o Otkrivanje kliconoa. Dokazivanje: Uzeti materijal namirnice treba odmah zasijati, najkasnije 12 sati nakon uzimanja. Jedan uzorak se inkubie 24-48 sati na 250C, a drugi na 430C. porasle kolonije se ispituju na njihove morfoloke (ute kolonije) i druge osobine na osnovu kojih se vri identifikacija. Listerija monocytogenes: to je kratki tapi sa zaobljenim krajevima, asporogen, bez kapsule, imju flagele, gram-pozitivne su. Uzeta namirnica se zasijava na krvni agar ili teluritni agar, inkubacija traje 14 dana, a porast se kontrolie svakog drugog dana i na osnovu gore navedenih osobina vri se dokazivanje vrste. Yersinia enterocolitica: Ona je jajolika ili kratka tapiasta bakterija, asporogena, gram-negativna. Uzorak namirnice se zasijava na SS-agar, DCA ili na Mac-Conkijevu podlogu. Zasijane podloge se inkubiu na temperaturi od 220C. Poslije 24, 48 i 72 sata inkubacije zasijane podloge se pregledaju. Porasle kolonije se koriste za biohemijska i seroloka ispitivanja i dokazivanja.