Analiza namirnica 49

HROMATOGRAFSKE METODE

Princip hromatografije

Sve hromatografske metode se svode na raspodeljivanje smeše komponenata

između dve različite fizičke faze. Pod fizičkom fazom podrazumevamo deo prostora
jasno omeđen međufaznom granicom od ostalog prostora. Zamislimo da se u čaši
nalaze voda i hloroform – dve tečnosti koje se ne mešaju. Hloroform će, kao gušći,
obrazovati sloj na dnu čaše, a iznad njega će biti sloj vode. Između dva sloja postoji
jasna međufazna granica. Dve faze na isti način predstavljaju led i voda ili voda i
vazduh.

Ako, na primer, u čašu stavimo jednake zapremine vode i hloroforma i u nju

unesemo neku supstancu, ona će se između ove dve faze raspodeliti shodno
rastvorljivosti u svakoj od njih. Tu pojavu opisuje Nernstov zakon raspodele:
Cvoda
=K
C hloroform
Ako sada pažljivo pipetom odvojimo sloj vode i unesemo ga u drugu čašu u kojoj se
nalazi jednaka količina čistog hloroforma, supstanca će, sledeći Nernstov zakon, iz
vodenog sloja delimično preći u njega dok se ponovo ne zadovolji odnos
koncentracija. Isto tako, ako u prvu čašu na postojeći sloj hloroforma dodamo istu
količinu čiste vode, supstanca će iz hloroforma delimično preći u nju, opet dok se ne
zadovolji gornji odnos koncentracija.

Proširimo opisani eksperiment i zamislimo da preko kadice napunjene hloroformom

ravnomerno struji tok vode. Ako se na početku neka supstanca koja se inače
rastvara i u vodi i u hloroformu, nalazila samo u hloroformu, lako se može razumeti
da će zbog istovremene rastvorljivosti u ova dva rastvarača, ona vremenom biti
potpuno odnesena vodom. Nastavimo u istom duhu i zamislimo da su se u
hloroformu na početku nalazile dve supstance A i B, koje se obe rastvaraju i u vodi i
u hloroformu, ali se u vodi A rastvara mnogo bolje nego B. Može se pogoditi da će pri
strujanju vode iznad hloroforma u kadici, komponenta A biti iz njega mnogo pre
isprana vodom nego komponenta B.

Ovaj jednostavan zamišljeni eksperiment ukazuje na dva ključna aspekta

hromatografskih metoda:

- Svaki hromatografski sistem sadrži dve faze – jednu stacionarnu

(nepokretnu) i drugu mobilnu (pokretnu).
- Pri proticanju mobilne faze preko stacionarne, u hromatografskom sistemu
se duže zadržavaju supstance koje imaju veći afinitet prema stacionarnoj fazi.

Shodno ovome, kada s mobilnom fazom u hromatografski sistem istovremeno

unesemo više komponenata u obliku smeše (uzorak), one će iz njega izlaziti posle
različitog vremena, u zavisnosti od svojih relativnih afiniteta prema stacionarnoj,
odnosno mobilnoj fazi. To je ilustrovano sledećim šemama:
 Analiza namirnica 50

Dve faze miruju jedna iznad druge.

Komponente A, B i C se različito rastvaraju u
svakoj od njih.

Faza I i Faza II na prvoj slici se međusobno ne mešaju. Supstance A, B i C se u

različitom stepenu rastvaraju u dve faze, tako da njihovi koeficijenti raspodele između
faza I i II [Ki=(Ci)I/(Ci)II] stoje u sledećem odnosu:
KA>KB>KC
Od tri komponente, u Fazi I je najrastvorljivija komponta A, a u Fazi II komponenta C.
Komponenta B se u obe faze rastvara približno jednako.

Faza I (mobilna) teče u smeru strelice preko faze

II (stacionarne). Komponente A, B i C se pri tome
razdvajaju.

Na drugoj slici je Faza II nepomična (stacionarna), dok se Faza I (mobilna) kreće

preko nje u smeru strelice. Može se zamisliti da se komponente A, B i C kreću s
Fazom I (slikovito: kotrljaju) brzinom koja je proporcionalna njihovoj rastvorljivosti u
toj fazi. Najbrže se kreće komponenta A, a najsporije komponenta C – ona je najviše
"zaglibljena" u nepomičnu Fazu II. Zbog toga komponente u smeru sleva udesno
putuju različitim brzinama – razdvajaju se, i na kraju stacionarne faze izlaze
pojedinačno. Ovo je princip svih hromatografskih metoda razdvajanja, a razlike u
tehnikama postoje zbog različitih sila kojima dve faze (stacionarna i mobilna)
"privlače" komponente.

Klasifikacija hromatografskih metoda

Shodno agregatnom stanju primenjenih faza, sve hromatografske tehnike se mogu

podeliti u četiri grupe. Tako imamo:
 Analiza namirnica 51

1. Čvrsto-gasnu hromatografiju
2. Čvrsto-tečnu hromatografiju
3. Gasno-tečnu hromatografiju
4. Tečno-tečnu hromatografiju

Povod za neke drugačije klasifikacije mogu biti i sami mehanizmi na osnovu kojih se
komponente smeše iz uzorka raspodeljuju između dve faze u kontaktu:

- Adsorpcija. Pojam podrazumeva koncentrisanje supstanci na graničnoj površini

dveju faza. Najčešće je jedna faza čvrsta, pa se pod adsorpcijom uobičajeno
podrazumeva koncentrisanje komponenata iz rastvora (tečne faze) ili iz smeše
gasova (gasne faze) na čvrstoj površini. Stoga se čvrsto-tečna i čvrsto-gasna
hromatografija nazivaju i adsorpcionom hromatografijom. Pri adsorpciji postoji
konstantan odnos između koncentracije supstance u gasnoj ili tečnoj fazi i na površini
adsorbenta, određen adsorpcionom izotermom.

- Rastvorljivost. Raspodela komponenata uzorka između dve tečne faze se vrši

prema njihovoj rastvorljivosti u tim fazama. Odnos koncentracija komponente u dve
faze određen je Nernstovim zakonom raspodele. Fenomen se tiče uglavnom tečno-
tečne hromatografije.

- Isparljivost. Raspodela komponenata izmeću tečne i gasovite faze određena je, s

jedne strane, rastvorljivošću u tečnoj fazi, a s druge, njihovom isparljivošću.
Isparljivost komponenata zavisi od njihovog napona pare i aktivnosti. Pojava je
karakteristična za gasno-tečnu hromatografiju.

- Jonska izmena. Između jona u rastvoru i jonogenih grupa na površini čvrste faze
uspostavlja se jonska ravnoteža prema zakonu o dejstvu masa. Fenomen se
iskorišćava kod jonoizmenjivačke hromatografije koja spada u klasu tečno-čvrstih
hromatografskih metoda.

- Gel-filtracija. Raspodela komponenata smeše između tečne i čvrste faze ne vrši se

prema afinitetu, već prema veličini molekula komponenata. Čvrsta faza predstavlja
granulisan porozan materijal čije pore imaju širinu blisku veličini molekula
komponenata. Većim molekulima pore će biti manje dostupne, a manji će u njih lako
ulaziti, pa će se shodno tome molekuli različitih veličina zadržavati različito vreme u
sistemu. Pojava strogo ne spada u hromatografiju (nema raspodele između dve
faze), već se koristi efekat različite veličine "mrtve zapremine" sistema za molekule
različite veličine, zbog čega im se vremena zadržavanja razlikuju. Ipak, gel-filtracija
se uvek razmatra uporedo s hromatografskim metodama jer se tehnički izvode na
sličan način.

Hromatografske metode mogu se realizovati na različite tehničke načine i obratno –

slična tehnika može se koristiti za izvođenje različitih hromatografskih metoda. Stoga
se u praksi često vrši klasifikacija prema tehnikama. Najpoznatije tehnike
hromatografije su:

1. Hromatografija na papiru (engl. PC - paper chromatography)

Raspodela obuhvata adsorpciju komponenata iz rastvora na površini listova

celuloznog papira.
 Analiza namirnica 52

2. Tankoslojna hromatografija (engl. TLC - thin layer chromatography)

Čvrsta faza je praškasti adsorbent, imobilizovan na ravnoj ploči od inertnog

materijala. Raspodela komponenata vrši se adsorpcionim mehanizmom između
rastvora i adsorbenta.

3. Hromatografija na stubu (engl. CC - column chromatography)

Čvrsti, praškasti adsorbent spakovan je u vertikalnu kolonu kroz koju se propušta

tečna, mobilna faza. Na isti način se izvode i jonoizmenjivačka, odnosno gel-
hromatografija.

4. Hromatografija na invertovanoj fazi (engl. IPC - inverted phase chromatography)

Izvedba je kao kod TLC i CC, osim što je na adsorbent nanesena tečna stacionarna
faza, tako da se raspodela vrši između nje i mobilne faze. Naneta tečna faza menja
(invertuje) polarnost adsorbenta.

5. Tečna hromatografija (engl. LC - liquid chromatography)

Pojam uključuje sve tečno-tečne i tečno-čvrste hromatografske metode, koje se

izvode na koloni. Takođe i jonoizmenjivačku i gel-hromatografiju.

6. Tečna hromatografija visoke moći razlaganja (engl. HPLC - high performance

liquid chromatography) ili tečna hromatografija pod visokim pritiskom (engl. HPLC -
high pressure liquid chromatography).

Pojam obuhvata tehnike tečne hromatografije u posebnom aparativnom izvođenju

koje omogućuje izuzetnu kontrolu procesa i razdvajanje komponenata.

7. Gasna ili gasno-tečna hromatografija (engl. GC - gas chromatography ili GLC -

gas-liquid chromatography)

Kontaktiranje gasne i tečne ili čvrste faze ostvaruje se u specijalnim dugačkim

kolonama, ispunjenim stacionarnom fazom u praškastom obliku, sa ili bez nanete
tečne faze, u posebnim uređajima.

8. Kapilarna gasna hromatografija (engl. Capillary GC)

Stacionarna tečna faza nije naneta na čvrsti adsorbent, već na unutarnji zid uske,
veoma duge kapilare, kroz koju protiče gasna faza. Koristi se u uređajima za GLC.
 Analiza namirnica 53

ADSORPCIONA HROMATOGRAFIJA

U ovaj odeljak spadaju tehnike hromatografije na papiru, tankom sloju i stubu

adsorbenta, pa ih je, zbog sličnosti mehanizma separacije, pogodno razmatrati
zajedno.

Istorijski posmatrano, hromatografija je kao metoda separacije i uvedena baš kao

adsorpciona hromatografija. Davne 1903. g., ruski naučnik M.S. Cvet uspeo je da
razdvoji smešu biljnih pigmenata na stubu adsorbenta spirajući ih rastvaračem, pri
čemu su se pojedinačni pigmenti raspodeljivali duž stuba adsorbenta u obliku
obojenih prstenova. Takav preparat Cvet je nazvao "hromatogramom", a metodu
"hromatografijom" (pisanje bojom).

Za sve adsorpcione tehnike zajedničko je postojanje čvrste stacionarne faze –

adsorbenta, od čijih osobina zavisi mogućnost i kvalitet razdvajanja komponenata.

Adsorpcione sile

Kod neutralnih atoma se centar pozitivnog i centar negativnog naelektrisanja

poklapaju, pa se atom u odnosu na okolinu ponaša kao nenaelektrisana čestica. Kad
se atom, međutim, unese u električno polje, pomenuti centri naelektrisanja se
razdvajaju i atom se polarizuje postajući električni dipol. Pri tome, stvaranje i
orijentisanje dipola slabi spoljno električno polje – što je atom polarizabilniji, slabljenje
je veće. Sposobnost većeg ili manjeg polarizovanja atoma (stvaranja dipola) u
spoljnom električnom polju iskazuje se dielektričnom konstantnom materijala.

Ulogu spoljnog električnog polja koje izaziva polarizaciju atoma često vrše susedni
atomi unutar hemijskih jedinjenja. Jedan od dva učesnika u tzv. kovalentnoj vezi
obično jače privlači zajednički elektronski par, tako da je sama veza polarizovana –
predstavlja električni dipol. U graničnom slučaju veoma jake polarizacije veze,
elektronski par u potpunosti prelazi na jedan od dva atoma i kovalentna veza
degradira u jonsku. Molekul može sadržati više polarizovanih i nepolarizovanih veza
čiji se električni dipoli (ako postoje) vektorski sabiraju. Ako je zbir različit od nule, tada
i molekul u celini poseduje stalni električni dipol. Na primer, polarizovane su veze
H→O i C→Cl jer atomi kiseonika, odnosno hlora, koji su elektronegativniji od
vodonika, odnosno ugljenika, jače privlače elektronski par. Sa slike 2 vidi se da će
molekul vode zbog toga imati stalan dipol, ali molekul ugljentetrahlorida neće.

Slika 2
 Analiza namirnica 54

Na sličan način se razmatra polarnost i pojedinih funkcionalnih grupa od kojih su

izgrađeni molekuli, što u velikoj meri može da pomogne pri razmatranju mogućnosti
razdvajanja pojedinih komponenata složene smeše. Na slici 3 prikazan je redosled
polarnosti nekih funkcionalnih grupa.

-OCH3 < -NO2 < -N(CH3)2 < -COCH3 < -NH2 < -OH < -CONH2 < -COOH
Slika 3. Polarnost funkcionalnih grupa raste s leva u desno

Treba naglasiti da su redosledi polarnosti funkcionalnih grupa koji se često citiraju u

literaturi samo približni jer i ostatak molekula može imati znatnog uticaja na polarnost.
Tako, na primer, u homologom nizu alifatičnih alkohola ili kiselina polarnost molekula
opada sa dužinom ugljovodoničnog lanca.

Zbog opšte težnje sistema ka elektroneutralnosti, između polarnih molekula deluju

relativno jake privlačne sile – molekuli se tako orijentišu da im se električni dipoli
poništavaju. Tečnosti s polarnim molekulima obično su u znatnoj meri asosovane –
njihovi molekuli čine veće ili manje grupacije uzajamno orijentisanih dipola, pa su
tačke ključanja takvih tečnosti obično visoke.

Kada se polarni molekul nađe u blizini nepolarnog, on svojim električnim dipolom

može da u nepolarnom molekulu indukuje privremeni električni dipol. Zbog toga će se
između njih javiti privlačne sile koje su ipak znatno slabije od sila između dva
molekula sa stalnim dipolima.

Slabe privlačne sile će se javiti čak i između dva bliska nepolarna molekula, usled
privremenog uspostavljanja dipola. Pojava se objašnjava činjenicom da elektroni pri
svom kruženju oko jezgra nisu u svakom trenutku simetrično raspoređeni, pa je
ukupna nepolarnost atoma samo statistički prosek. Dakle, iako molekul nema stalan
dipol, poremećaji njegovog električnog polja mogu indukovati iste takve poremećaje
polja u susednom molekulu, tako da se uspostavlja slabo privlačenje između dva
privremena dipola.

Kada se razmatraju sile, pomoću kojih se molekuli neke supstance vezuju za

površinu čvrste stacionarne faze, svi pomenuti fenomeni su zastupljeni, pa ipak,
obično ne svi istovremeno.

Redosled jačine ovih sila je sledeći:

- Vandervalsovske sile (Londonove disperzione sile). Njima se ostvaruje upravo

opisana interakcija između nepolarnih molekula adsorbata i nepolarne površine
adsorbenta. Energija veze je mala, pa se veze lako raskidaju. Takva, fizička
adsorpcija poželjna je u hromatografiji, jer se komponente lako razdvajaju, a
koncentracione zone su dobro definisane.

- Indukcione sile. Molekuli adsorbata su polarni i indukuju električne dipole u

molekulima površine adsorbenta. Energija adsorpcije je viša nego u prethodnom
slučaju.

- Vodonične veze. Kada se u molekulima adsorbenta i adsorbata nalaze grupe koje

mogu da izmenjuju proton, na primer, hidroksilne, karboksilne ili amino-grupe, tada
 Analiza namirnica 55

se između njih uspostavljaju vodonični mostovi koji pojačavaju efekat ostalih sila.
Znatan broj adsorbenata ima hidroksilne grupe na površini, tako da je ovakva veza
često zastupljena.

- Kovalentne veze. Ukoliko su molekuli i adsorbata i adsorbenta veoma polarni, što

znači da su sastavljeni od atoma čija je razlika u elektronegativnosti velika, može
doći do obrazovanja prave kovalentne veze na površini adsorbenta. Energija
adsorpcije je visoka i odgovara energiji uspostavljanja kovalentne hemijske veze. U
hromatografiji je ova pojava, osim u specifičnim slučajevima, nepoželjna, jer se
supstance često adsorbuju nepovratno. U blažim slučajevima, one se mogu eluirati -
sprati sa adsorbenta polarnim mobilnim fazama, pri čemu se obrazuju veoma
razvučene, asimetrične koncentracione zone s dugim "repovima", nepogodne za
kvantitativan rad.

Adsorbenti

Budući da se kod adsorpcione hromatografije raspodela komponenata uzorka vrši

između mobilne faze i površine adsorbenta, ova kontaktna površina mora biti
dovoljno velika da bi sistem bio efikasan. Stoga se za adsorbente koriste porozan
čvrsti materijali u obliku sitnih granula ili praha, čija specifična površina obično
prevazilazi 50 m2/g, a ponekad i 1000 m2/g. Ovako velika površina kontakta ostvaruje
se veoma razuđenim sistemom pora unutar pojedinih čestica adsorbenta. Da bi ona
bila dostupna mobilnoj fazi, prečnik čestica adsorbenta treba da je što manji i na ovo
rešenje se ide u tehnici tankoslojne hromatografije. Međutim, kod hromatografije na
stubu čestice ne smeju da budu previše sitne jer takav sloj pruža visok otpor
proticanju mobilne faze. Tipične vrednosti veličine čestica za stubnu hromatografiju
kreću se u intervalu od 50 do 200 μm.

Adsorpcija komponenata smeše se ne vrši na celoj površini adsorbenta, već na

pojedinim njenim mestima - aktivnim centrima, čija priroda zavisi od para adsorbent -
adsorbat. Na primer, supstance sa slobodnom karboksilnom grupom vezivaće se za
bazne centre. Stoga podatak o specifičnoj površini mora biti dopunjen i podatkom o
aktivnosti – broju aktivnih centara po jedinici površine. Tipične vrednosti aktivnosti
iznose od 4 do 6 centara po 1 nm2. U Tabeli 1 prikazano je nekoliko adsorbenata,
redosledom rastuće aktivnosti.

Tabela 1. Redosled aktivnosti pojedinih

adsorbenata
Adsorbent Priroda aktivnih
centara
Saharoza neutralna
Skrob neutralna
Dijatomit neutralna
Silicijumdioksid kisela
Magnezijumsilikat kisela
Aluminijumoksid kisela i bazna
Magnezijumoksid bazna
Aktivni ugalj neutralna i kisela
Jonoizmenjivačke smole kisela i bazna
 Analiza namirnica 56

Aktivnost adsorbenta može se uglavnom regulisati količinom vode, koju on sadrži.

Pokažimo ovo na primeru silikagela – tipičnog adsorbenta.

Površina silikagela koji je vazdušno osušen (amorfnog silicijumdioksida), prekrivena

je fizički adsorbovanom vodom. Pri postepenom zagrevanju do 150-2000 C deo te
vode se udaljava, ostavljajući za sobom hidroksilne grupe kao kisele centre (slika 4).

Slika 4

Hidroksilne grupe su polarne, a istovremeno su i donori protona, tako da se na

površini prvenstveno adsorbuju polarna i bazna jedinjenja.

Tokom daljeg zagrevanju silikagela u temperaturnom intervalu od 200 do 4000 C, sve

više susednih hidroksilnih grupa međusobno reaguju (slika 5) obrazujući siloksanske
grupe, zbog čega površina gubi aktivnost.

Slika 5

Razmišljanje ove vrste može se primeniti na većinu adsorbenata, koji imaju

mogućnost ostvarivanja vodoničnih veza.

Pri izboru adsorbenta za određeni sistem, neophodno je voditi računa o prirodi

aktivnih centara. Naime, adsobenti s veoma jakim kiselim ili baznim centrima mogu
hemijski reagovati s komponentama smeše ili ispoljiti prema njima katalitičko dejstvo,
što dovodi do hidrolize, izomerizacije, kondenzacije i drugih neželjenih pratećih
reakcija u sistemu. Takvo dejstvo adsorbenta se takođe može regulisati količinom
prisutne vode ili i drugih supstanci koje prvenstveno blokiraju najaktivnije centre.

Osobina adsorbenta koja u praksi ima najveći značaj jeste njegova selektivnost pri
adsorbovanju različitih jedinjenja jer je to i osnov za hromatografsko razdvajanje. Pri
tome, danas još uvek ne postoji jedinstveno teorijsko znanje na osnovu koga bi se u
svakom pojedinačnom slučaju, prema hemijskoj strukturi jedinjenja mogao odabrati
optimalan adsorbent, ali postoji izuzetno obiman eksperimentalni materijal koji
praktično omogućava svaki izbor.

Osnovno pravilo u izboru adsorbenta proizilazi iz razmatranja prirode

međumolekulskih sila koje učestvuju u adsorpciji: polarne supstance će se dobro
razdvajati na polarnim adsorbentima, a nepolarne na nepolarnim. Ako neku
supstancu mnogo jače privlači mobilna faza nego adsorbent, ona se uopšte neće
 Analiza namirnica 57

adsorbovati. U obrnutom slučaju, ona će se za adsorbent vezati hemijski. Za

postizanje hromatografskog razdvajanja nije dobro ni jedno ni drugo – potrebno je
pronaći neku sredinu izmeću ova dva granična slučaja.

Tako, na primer, za smeše polarnih jedinjenja: alkohola, estara itd., koristićemo

polarni adsorbent: silikagel ili alumijumoksid, a za razdvajanje nepolarnih alifatičnih
ugljovodonika, aktivni ugalj. Pri tome treba imati u vidu mogućnost nepovratne
hemisorpcije jakih kiselina na baznim adsorbentima i obratno, jakih baza na kiselim
adsorbentima. Stoga ćemo smešu kiselina razdvajati na kiselom adsorbentu –
silikagelu, a smešu baza na onom koji poseduje bazne centre, možda na
aluminijumoksidu. Treba naglasiti da su polarni adsorbenti primenljivi i za razdvajanje
jedinjenja s dvostrukim i trostrukim vezama, budući da se π-veza lako polarizuje.

Za specifične potrebe površina adsorbenta se može modifikovati različitim dodacima.

Na primer, nezasićeni ugljovodonici se mogu razdvojiti od odgovarajućih zasićenih
uglovodonika eluiranjem sa silikagela, impregniranog srebro-nitratom. Srebro-nitrat
gradi komplekse s dvostrukom i trostrukom vezom nezasićenih jedinjenja i na taj
način povećava njihovo vreme zadržavanja u sistemu. U Tabeli 2 navedeno je
nekoliko takvih modifikatora.

Tabela 2. Neki načini modifikovanja adsorbenata

Modifikator Jedinjenja koja se selektivno adsorbuju

0,1-0,5 n kiselina ili baza jedinjenja, osetljiva na promenu pH

srebro-nitrat olefini i acetileni
borna kiselina, natrijum-borat polihidroksilna jedinjenja
pikrinska kiselina policiklični aromatski ugljovodonici
natrijum-bisulfit aldehidi
bakar-sulfat amini

Osim pobrojanih osobina, komercijalni adsorbenti za primenu u adsorpcionoj

hromatografiji moraju posedovati standardizovana svojstva da bi se rezultati
pojedinih eksperimenata i laboratorija mogli porediti. S obzirom na više osetljivih,
nedovoljno poznatih osobina adsorbenta koje u proizvodnji treba nepogrešivo
reprodukovati, to nije lako izvesti, ali u današnje vreme, mnoge poznate svetske
firme bave se ovim problemom, tako da analitičar uglavnom može računati na
gotove, standardne adsorbente.

Pregled važnijih adsorbenata

Silikagel

Adsorbenti opšte formule SiO2.xH2O nazivaju se: silikagel, silicijumdioksid,

silicijumova kiselina, kizelgur. Silikagel nastaje taloženjem iz rastvora alkalnih silikata
ili hidrolizom silicijumovih jedinjenja. Dobija se u obliku gela koji sušenjem daje
amorfan, porozan, delimično hidratisan materijal. Promenom uslova obrazovanja gela
(na primer, promenom pH pri taloženju), dobijaju se čestice različite strukture,
specifične površine od 200 do 800 m2/g, i prečnika pora od 10-25 nm.
 Analiza namirnica 58

Zbog mogućnosti regulacije aktivnosti preko sadržaja vode i lake dostupnosti,

silikagel je veoma zastupljen u hromatografskoj praksi. Polarnost, kiselost (pH
površine 3-5) i prisustvo hidroksilnih grupa na površini omogućuju mu široku primenu
za razdvajanje nezasićenih, aromatičnih i uopšte, polarnih jedinjenja. Zbog prisustva
kiselih centara, bazne supstance se na njemu snažno adsorbuju, ponekad
nepovratno. Budući da je polarnog karaktera, pokazuje slabu adsorpciju i selektivnost
prema nepolarnim supstancama. S njega se one prve eluiraju.

Posebnu klasu silicijumdioksidnih adsorbenata čini dijatomit ili infuzorijska zemlja –

mineral, nastao od fosilnih skeleta jednoćelijskih praživotinja – infuzorija, dijatomea.
Adsorpciona sposobnost dijatomita je niska i on se uglavnom ne koristi kao
adsorbent, već kao pomoćno filtraciono sredstvo. Ponekada se koristi kao nosač
stacionarne tečne faze u tečno-tečnoj ili gasno-tečnoj hromatografiji.

Aluminijumoksid

Ovaj adsorbent se pored silikagela najčešće koristi u adsorpcionoj hromatografiji. I

on je polarne prirode, a red eluiranja supstanci s njega isti je kao kod silikagela.
Aktivira se zagrevanjem do 4000 C. Tipična specifična površina mu je 100-200 m2/g,
a tipična veličina pora 3 nm.
U odnosu na silikagel, aluminijumoksid pokazuje i važne razlike:

- Jedinjenja sa nezasićenim vezama na aluminijumoksidu se adsorbuju nešto

jače, pa se i bolje razdvajaju. Stoga je ovo preporučeni adsorbent za aromatične
ugljovodonike.
- Zbog prisustva kiselih, ali i jako baznih centara, jake kiseline se na njemu ne
mogu razdvajati jer se hemisorbuju. Slabe kiseline se mogu razdvajati, naročito ako
je mobilna faza bazna.

Primena aktiviranog aluminijumoksida za mnoge svrhe je isključena, zbog

katalitičkog podsticanja različitih neželjenih reakcija.

Osim silikagela i aluminijumoksida, kao adsorbenti se koriste i: magnezijumsilikat

(najpoznatiji komercijalni preparat je Florisil), kod koga se broj kiselih centara na
površini lako može regulisati dodatkom vode, zatim bazni i polarni magnezijumoksid,
slabi adsorbenti – šećeri, skrob i celuloza, nepolarni adsorbenti – aktivni ugljevi,
kisele i bazne jonoizmenjivačke smole.

Mobilna faza

Pri razmatranju selektivnosti adsorbenata ne treba zaboraviti ni prirodu mobilne faze

jer ona je drugi učesnik u međufaznoj separaciji i treba da zadovolji neke osnovne
kriterijume. Ona treba da dobro rastvara sve komponente uzorka, da se sama
minimalno adsorbuje na stacionarnoj fazi i ne sme da reaguje hemijski ni sa
stacionarnom fazom, ni s komponentama uzorka. Pored toga, pogodno je da ima
nizak viskozitet pod primenjenim uslovima kako bi uz što manji otpor prolazila kroz
sloj adsorbenta, čime se vreme analize značajno skraćuje.
Uslov rastvorljivosti komponenata uzorka treba razmatrati u smislu starog
alhemijskog pravila "slično se u sličnom rastvara". Kako treba razumeti "sličnost"?
Ako se pri mešanju dve komponente ostvaruju veze slične jačine ili čak jače
međumolekulske veze od veza koje su vladale unutar svake od dve čiste
 Analiza namirnica 59

komponente, one će se međusobno dobro rastvarati. Primer je sistem voda

(polarna)–etanol (polaran). Ako bi se, s druge strane, pri mešanju dve komponente
između njihovih molekula ostvarivale slabije veze, nego u čistim komponentama,
tada bi do takvog mešanja moglo doći tek uz dovođenje dodatne energije.
Komponente se spontano ne mešaju, na primer: pentan (nepolaran)–voda (polarna).
Konačno, dva nepolarna jedinjenja: pentan i ugljentetrahlorid, lako se mešaju jer se
obrazuju relativno slabe nove veze na račun raskidanja takođe relativno slabih veza.
Odavde sledi jednostavno pravilo: dobro se međusobno rastvaraju smeše polarnih
supstanci i smeše nepolarnih supstanci. Smeše polarnih i nepolarnih supstanci se
međusobno samo ograničeno rastvaraju.

U hromatografiji se često primenjuje eluiranje (spiranje) uzorka s kolone uzastopnim

nizom rastvarača sve veće desorpcione moći (sve veće polarnosti), pri čemu se
jedna po jedna komponenta desorbuje, redosledom rastuće jačine adsorpcije. U vezi
s tim, veoma je ilustrativan tzv. eluotropni niz rastvarača (Tabela 3), niz u kome su
rastvarači uređeni po opadajućoj sposobnosti desorpcije komponenata s polarnog
adsorbenta. Ovo je približno i redosled kojim se smanjuje polarnost rastvarača, o
čemu svedoči i gotovo identično opadanje njihove dielektrične konstante, kao i
podatak o rastvorljivosti u vodi. Za nepolarne adsorbente, eluotropni niz je obrnut.

Tabela 3. Elutropni niz rastvarača

Rastvarač Dielektrična Rastvorljivost u

konstanta vodi (g/100 g)

Voda 81,0 ∞
Metanol 31,2 ∞
Etanol 25,8 ∞
n-Propanol 22,8 ∞
Aceton 21,5 ∞
Dihloretan 10,4 0,7-0,9
Etilacetat 6,1 8,5
Amilacetat - slabo rastvoran
Dietiletar 4,4 7,5
Dioksan - ∞
Hloroform 5,2 0,82
Metilenhlorid - 2
Benzol 2,3 0,082
Toluol 2,3 0,05
Trihloretilen 3,4 0,1
Ugljentetrahlorid 2,2 0,097
Cikloheksan 2,0 nerastvoran
Petroletar 1,9 nerastvoran

Pri izboru mobilne faze, njena polarnost se podešava prema polarnosti i adsorbenta i
adsorbujućih supstanci. Da bi se komponente uzorka uopšte našle u mobilnoj fazi,
ona mora da ih rastvara, a da bi se s njom kroz sistem i kretale, njena polarnost mora
biti konkurentna polarnosti adsorbenta. Na primer, smeša organskih kiselina neće se
 Analiza namirnica 60

uopšte eluirati sa silikagela nepolarnim heksanom. S druge strane, veoma polarna

mobilna faza - dietiletar, eluiraće sve komponente praktično istom brzinom -
neselektivno. Potrebno je, dakle, naći takvu smešu heksana i dietiletra da polarnost
mobilne faze približno odgovara polarnosti silikagela. Polarnost mobilne faze se, baš
kao u ovom primeru, reguliše mešanjem rastvarača različite polarnosti, pri čemu broj
komponenata može biti i 4-5. Pri tome, međutim, treba paziti da ne dođe do
raslojavanja unutar mobilne faze.
 Analiza namirnica 61

HROMATOGRAFIJA NA STUBU (KOLONI)

Tradicionalne tehnike

Kolona (slika 1) predstavlja vertikalnu staklenu ili plastičnu cev koja na donjem kraju
može da ima slavinu. Pri dnu je disk od poroznog stakla ili čep od staklene vune, čija
je svrha da nosi sloj adsorbenta. Kolona može imati dvostruki zid kroz koji protiče
voda određene konstantne temperature.

Slika 1 Kolona za klasičnu

stubnu hromatografiju

Kolona se puni određenom količinom stacionarne faze, na nju se nanosi uzorak i

tada kontrolisanim protokom dodaje mobilna faza koja se niz stub adsorbenta kreće
pod dejstvom gravitacije. Efluent iz kolone se prikuplja u posebne sudove.

Kolona za stubnu hromatografiju obično je prečnika 2-70 mm, a dužine 15-150 cm.
Pošto mobilna faza kroz kolonu teče pod dejstvom gravitacije, razdvajanje traje dugo,
što je i glavna mana ovakvog tipa hromatografije na stubu. S druge strane,
skraćivanje stuba ubrzava proces, ali snižava kvalitet separacije – komponente iz
kolone izlaze nedovoljno razdvojene.

Moderne tehnike (HPLC - hromatografija visoke moći razlaganja)

Sistem HPLC u načelu se sastoji od pumpe visokog pritiska (i do 350 bara), koja
obezbeđuje stabilan, visok protok mobilne faze, zatim kolone, injektora ili ventila za
unos uzorka u kolonu i detektora (slika 2) sa uređajem za registrovanje rezultata.
 Analiza namirnica 62

Slika 2 Šematski prikaz HPLC sistema

Dodatnu opremu može činiti filter za rastvarač, stabilizator pulsacija pumpe, monitor
pritiska, alarm previsokog pritiska, predkolona za zaštitu analitičke kolone od
zagađenja nečistim uzorcima i kolektor frakcija. Da bi se skratilo vreme zadržavanja
uzorka, odnosno njegovih komponenata u sistemu i time predupredilo difuziono
širenje koncentracionih zona, ceo uređaj je izveden od uskih, kapilarnih vodova, tako
da je mrtva zapremina sistema svedena na minimum. Uređaj je automatizovan, a
temperatura, sastav mobilne faze, njen protok i drugi parametri strogo se kontrolišu.
Efluent iz kolone se analizira kontinuirano. Često uređaju pripada sopstveni računar
za programiranje procesa i obradu podataka.

Aparatura za izvođenje HPLC je skupa, ali omogućuje veoma preciznu kontrolu

radnih uslova.

Zbog upotrebe visokog pritiska i shodno tome viših protoka mobilne faze, mogu se
koristiti odnosi dužine i prečnika kolone od 100:1 do 1000:1, pri čemu je prečnik
obično 2-3 mm, uz dužine od 50-100 cm. Ovde se, takođe, može koristiti adsorbent
znatno manje veličine čestica: 5-15 μm, u odnosu na raspon od 50-250 μm kod
klasičnih tehnika. Stoga je efikasnost razdvajanja ovakvih sistema veoma visoka.

Detekcija komponenata

Kod klasičnih tehnika, eluent se sakuplja u porcijama u kojima se naknadno

analiziraju pojedine komponente specifičnim ili nespecifičnim metodama.

Kod HPLC se koncentracija komponenata prati kontinualno u struji mobilne faze, uz

korišćenje mnogih poznatih instrumentalnih, kao i nekih specifičnih metoda.

1. Detektor indeksa refrakcije

Ovo je diferencijalni detektor, jer prati razliku indeksa refrakcije mobilne faze pre
ulaska i posle izlaska is kolone. Spada u univerzalne detektore. Osetljivost mu je oko
10 μg komponente po ml efluenta.

2. UV-apsorpcioni detektori

Ovi detektori mogu raditi pri različitim talasnim dužinama, ali se najviše koristi talasna
dužina od 254 nm, koju emituje živina lampa niskog pritiska. Detektor je selektivan, tj.
 Analiza namirnica 63

ograničen na detekciju onih supstanci koje apsorbuju ili fluoresciraju u ovoj oblasti
spektra. Može se detektovati do 1 ng supstance.

Oba opisana detektora značajna su za praćenje neobojenih supstanci.

3. Kolorimetrijski detektori

Prati se apsorpcija vidljivog zračenja, bilo u originalnim, bilo u derivatiziranim

komponentama uzorka. U drugom slučaju, u struju efluenta se kontinualno dozira
reagens za obrazovanje boje, pri čemu se mora dopustiti da supstance tokom
određenog vremena izreaguju, što produžava vreme analize i doprinosi širenju
koncentracionih zona.

4. Konduktometrijski detektor

Funkcioniše na principu praćenja električne provodljivosti efluenta. Primenjuje se,

uglavnom, kod mobilnih faza, koje sadrže vodu. Granica detekcije je oko 10 μg.

5. Plameno-jonizacioni detektor s pokretnom žicom

Kroz efluent na izlazu iz kolone stalno se provlači beskonačna žica koja se zatim suši
od rastvarača i unosi u plameno-jonizacioni detektor, gde sagorevaju komponente
koje su na njoj zaostale. (Plameno-jonizacioni detektor će biti detaljnije opisan kod
gasne hromatografije). Osetljivost mu je 1 - 4 μg/ml, uz kvantitativan, linearan
odgovor.

6. Detektor radioaktivnosti

Metoda se primenjuje u slučajevima razdvajanja prirodnih ili veštačkih radioaktivnih

supstanci.

Primer klasičnog razdvajanja

Prema originalnom članku: Johnston, J.J., Ghanbari, H.A., Wheeler, W.B.,

Kirk, J.R. 1983. Characterization of Shrimp Lipids. J. Food Sci., 48, 33.

Razdvajanje lipida na klase neutralnih, gliko- i fosfolipida

20 g Silikagela 60 (70-230 meša) suspenduje se u hloroformu i

izruči u staklenu kolonu (1,5 x 20 cm). Na gornji sloj pakovanog
silikagela postavi se sloj od 1 cm anhidrovanog natrijumsulfata.
Na kolonu se nanosi do 1 g lipida, kao rastvor u 1 ml
hloroforma. Lipidi se eluiraju sukcesivno sa po 400 ml
hloroforma (neutralni lipidi), acetona (glikolipidi) i metanola
(fosfolipidi). Svaka od tri eluirane frakcije upari se pod sniženim
pritiskom, pri 300 C, do zapremine od oko 10 ml, zatim prebaci
u tariranu posudu i ostatak rastvarača otpari u struji suvog
azota, pri 350 C. Konačno se frakcije osuše do konstantne
mase u eksikatoru nad CaSO4.
 Analiza namirnica 64

Napomena: Neutralnim lipidima bi pre odgovarao naziv "umereno polarni lipidi", za

razliku od veoma polarnih gliko- i fosfolipida, koji sadrže polarne šećere i fosfatne
grupe. U neutralne lipide spadaju: ugljovodonici, holesterol i holesterilestri, mono-, di-
i trigliceridi i slobodne masne kiseline.

Razdvajanje frakcije neutralnih lipida na pojedine klase

Oko 300 mg neutralnih lipida, rastvorenih u 1 ml heksana,

nanosi se na kolonu (1,5 x 30 cm), pakovanu sa 25 g Florisila
(100-200 meša), pre upotrebe aktiviranog pri 2600 C, tokom 8
sati i tada hidratisanog sa 7% vode (w/w). Neutralni lipidi se
frakcionišu eluiranjem rastvaračima, uzastopno rastuće
polarnosti (Tabela 1), pri čemu se prikupljaju frakcije po 7 ml.
Lipidni sadržaj svake frakcije određuje se gravimetrijski, po
uparavanju rastvarača i sušenju. Čistoća i identitet svake
frakcije proveravaju se tankoslojnom hromatografijom, uz
standarde.

Tabela 1 (uz Primer)

Frakcija Zapremina Eluent

eluenta (ml)

Ugljovodonici 60 heksan
Holesterilestri 80 5% etra u heksanu
Trigliceridi 120 15% etra u heksanu
Holesterol 100 25% etra u heksanu
Digliceridi 100 50% etra u heksanu
Monogliceridi 100 2% metanola u etru
Slobodne masne kiseline 150 4% sirćetne kiseline u etru

Razdvajanje frakcije fosfolipida na pojedine klase

Kolona (2 x 40 cm) spakuje se hloroformskom suspenzijom

Silikagela 60 (70-230 meša), aktiviranog i hidratisanog sa 7%
vode. Kolona se prvo ispere sa 200 ml metanola, a potom sa
200 ml hloroforma. Na vrh kolone uspe se sloj od 1 cm
anhidrovanog natrijumsulfata, a potom unese uzorak od oko
500 mg fosfolipida u 1 ml hloroforma. Eluiranje se vrši sa: 400
ml 15% metanola u hloroformu (v/v), pri čemu se skupljaju
frakcije po 15 ml u tarirane posude, a zatim, jedno za drugim,
sa 400 ml 35% metanola u hloroformu i 400 ml metanola. Ove
dve frakcije od po 400 ml upare se na oko 10 ml metanola i
kvantitativno prenesu u tarirane posude. Po uparavanju i
sušenju, sadržaj lipida se određuje gravimetrijski. Identitet se
potvrđuje tankoslojnom hromatografijom, uz standarde.

Opisanom procedurom, autori su u lipidima škampa našli sledeće fosfolipide:

sfingomijelin, fosfatidilserin, fosfatidilholin i fosfatidiletanolamin.
 Analiza namirnica 65

HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU (TLC)

Jedna od adsorpcionih hromatografskih tehnika – hromatografija na listovima

celuloznog papira je zahvaljujući svojoj jednostavnosti našla veoma široku primenu u
istraživačkom radu, pa ipak, upotreba isključivo celuloze kao stacionarne faze
neizbežno je ograničila mogućnosti ove metode. Stoga su činjeni mnogi pokušaji da
se ovo prevaziđe. Sadašnji sistem hromatografije na tankom sloju postavio je
Kirchner sa saradnicima 1951. godine, a metoda je postala popularna tek pošto je
Stahl objavio obimnu knjigu iz ove oblasti (1962.) u kojoj je opisao komercijalni uređaj
za nanošenje tankog sloja i odgovarajuće adsorbente.

Najčešće se adsorbent u suspenziji na pogodan način razvlači po površini ploče od

stakla ili drugog materijala i suspenzija suši dajući sloj tipične debljine 0,25 mm.
Takva ploča se dalje koristi kao i list papira – tehnika rada je veoma slična.

Tehnika razdvajanja na tankom sloju

Hromatografija na tankom sloju adsorbenta se izvodi tako što se blizu ivice ploče na
koju je nanesen adsorbent specijalnom kapilarom nanese rastvor uzorka u vidu kapi
ili linije koju čini više kapi, rastvarač otpari na vazduhu, a zatim taj kraj ploče
vertikalno uroni svojom ivicom u mobilnu fazu. Mobilna faza se kapilarnim silama
penje uz sloj adsorbenta, na svom putu nailazi na mrlje uzorka, delimično iz njih
rastvara komponente i nosi ih različitim brzinama sa sobom. Kada front mobilne faze
dostigne dovoljnu visinu, ploča se vadi i suši, a potom se zone pojedinih
komponenata upoređuju.

Izgled razvijene ploče s tankim slojem adsorbenta na koju su naneti

nepoznati uzorak i poznati standard

Već je naglašeno da je vreme zadržavanja karakteristika svake komponente uzorka

u datom hromatografskom sistemu. Kod hromatografije na tankom sloju nije pogodno
meriti vreme izlaska komponenata iz sistema jer se to pri uobičajenim uslovima rada
 Analiza namirnica 66

ne događa, već se tokom određenog trajanja eksperimenta registruje relativno

zaostajanje komponenata za frontom mobilne faze, pri čemu se rastojanja obično
mere od linije nanošenja uzorka do centra koncentracionih zona (mrlja)
komponenata. Karakteristično zaostajanje komponente naziva se Rf-vrednost
komponente (gornja slika):

put komponente a
Rf = × 100 = × 100
put mobilne faze b

Na taj način, Rf-vrednost je veličina, obrnuto proporcionalna vremenu zadržavanja

komponente u sistemu.

Kod hromatografije na tankom sloju uslovi pojedinačnog eksperimenta teško se

mogu ponoviti, tako da poređenje Rf-vrednosti nije pouzdano. Stoga se u uzorak
unosi unutrašnji standard (x), i sve Rf-vrednosti porede s njim:

put komponente a
Rx = × 100 = × 100
put standarda c

Ovakav postupak kompenzuje nehomogenost tankog sloja adsorbenta, temperaturne

fluktuacije i mnoge neregularnosti drugih uslova eksperimenta.

Kada je reč o reproduktivnosti Rf i Rx-vrednosti, treba odmah reći da ove

karakteristike nisu dovoljne za sigurnu identifikaciju supstanci zbog mnogih
eksperimentalnih faktora koje ne možemo kontrolisati.

Koncentracione zone komponenata u idealnom slučaju predstavljaju kružnu ili ovalnu

mrlju koja postepeno uvećava dimenzije (difuzno širenje) tokom putovanja s
mobilnom fazom. U mnogim slučajevima oblik zona je deformisan – javljaju se mrlje s
jednim ili dva repa, preklapanje mrlja dve komponente ili jedinstvena supstanca daje
dve ili više mrlja. Uzroci ovakvih anomalija nisu u potpunosti poznati, no
hromatografski sistem se može iskoristiti i u ovakvim slučajevima, ukoliko omogućuje
reproduktivnu separaciju komponenata.

Stacionarna faza

Adsorbenti korišćeni za stacionarnu fazu odgovaraju materijalima koji se

upotrebljavaju kod hromatografije na koloni, osim što su čestice znatno manjih
dimenzija. Adsorbenti obično sadrže i vezivo da bi se pojačala adhezija između sloja i
ploče, a kod nekih se dodaje i inertni fluorescentni indikator (na primer, cink-silikat)
koji pomaže pri detekciji koncentracionih zona pod ultraljubičastom svetlošću. Takva
posebna obrada adsorbenta posebno se i označava, pri čemu su oznake gotovo
standardizovane. U Tabeli 1 dati su neki primeri za silikagel, možda najčešće
korišćeni adsorbent u hromatografiji na tankom sloju.

Prisustvo dodataka može da izmeni osobine adsorbenta ili da onemogući primenu

nekih mobilnih faza, odnosno sredstava za vizuelizaciju koncentracionih zona.
 Analiza namirnica 67

Tabela 1. Oznake komercijalnih silikagelova za TLC

Silkagel H bez dodataka

Silikagel G uz dodatak gipsa kao veziva
Silikagel S uz dodatak skroba kao veziva
uz dodatak fluorescentnog indikatora za
Silikagel F-254
područje talasne dužine od 254 nm
uz dodatak gipsa kao veziva i
Silikgel GF-254+366 fluorescentnog indikatora za područje
254 i 366 nm
za preparativnu hromatografiju, uz
Silikagel PF
dodatak fluorescentnog indikatora

Tanki sloj se može modifikovati na različite načine u cilju zadovoljenja specifičnih

potreba. Na primer, za sloj se može upotrebiti adsorbent sastavljen od više
komponenata ili se na istoj ploči mogu obrazovati dva susedna sloja od različitih
adsorbenata. Sloj se može impregnirati puferima, agensima za precipitaciju (na
primer, sulfidom za razdvajanje metalnih jona), agensima za kompleksiranje (na
primer, boratima za šećere), agensima za helatiziranje (za neorganske jone), srebro-
nitratom (za nezasićena jedinjenja), hidrofobnim materijalima (za postizanje inverzije
faza) itd.

Priprema sloja adsorbenta

Slika 1 Komercijalni uređaj za nanošenje tankog sloja

Za nanošenje sloja postoji niz komercijalnih aparata, od kojih je jedan prikazan na

Slici 1. On se sastoji od plastične podloge, na koju se ređaju staklene ploče
(20x20 cm ili 20x10 cm), i aplikatora s podesivim razrezom, koji se puni suspenzijom
adsorbenta, postavlja na kraj niza ploča, i prevlači preko njega, pri čemu iza sebe
ostavlja tanak, ravnomeran sloj suspenzije. Razrez se može podešavati u intervalu
od 0-2000 μm (0-2 mm). Rezervoar aplikatora može se podeliti na dva dela i u njih
usuti suspenzije dva različita adsorbenta za obrazovanje dva različita susedna sloja
na pločama.

Suspenzija adsorbenta pravi se u određenoj količini vode, organskog rastvarača ili

smeše vode i organskog rastvarača, pri čemu se treba strogo pridržavati uputstva
proizvođača. Obično se primenjuje suspendovanje tokom 30-60 sekundi u
električnom mikseru. Ako adsorbent sadrži vezivo, mora se odmah po
suspendovanju naneti na ploče da se ne bi stegao i postao neupotrebljiv. Brzina
 Analiza namirnica 68

vezivanja gipsa, čestog vezivnog materijala, može se smanjiti ako se umesto čiste
vode za suspenziju upotrebi smeša vode i metanola.

Prevučene ploče se ostave da se osuše na vazduhu, a zatim se aktiviraju prema

uputstvu, odnosno potrebi, najčešće (SiO2, Al2O3) pri 100-1200 C. Slojevi celuloze,
jonoizmenjivačkih smola, poliamida samo se suše na vazduhu, a gel Sephadexa
koristi se odmah po nanošenju, dok je još u nabubrelom stanju.

Ako je potrebno, ploče se impregniraju tako što se prskaju ili potapaju u rastvor
impregnacionog sredstva ili se jednostavno urone donjim krajem u rastvor i pusti da
se on kapilarnim silama upije do vrha ploče, posle čega se suše i kondicioniraju.

Na tržištu ima više proizvođača koji isporučuju gotove ploče za tankoslojnu

hromatografiju, kako na staklu, tako i na fleksibilnoj aluminijumskoj foliji ili filmu.
Garantovanog su sastava i uniformnosti, a fleksibilne ploče imaju prednost što se
mogu seći.

Tehnika tankoslojne hromatografije

Nanošenje uzorka

Nanosi se 0,1-1% rastvor u količini od 1-25 μl. Zone uzorka na početnoj liniji treba da
su prečnika od 1-3 mm, međusobno udaljene 1-2 cm, na 1,5-2 cm od ivice ploče. Za
analitički rad, uzorak se nanosi u količini od 1 μg do 1 ng.

Postoje komercijalni uređaji za automatsko, reproduktivno nanošenje.

Izbor sistema: mobilna faza/adsorbent

U Tabeli 2 dat je prikaz nekih često korišćenih sistema za različite klase jedinjenja.

Tabela 2. Neki često korišćeni sistemi za tankoslojnu hromatografiju

različitih klasa jedinjenja

1. 2,4-dinitrofenilhidrazoni aldehida ili ketona

a. Heksan/etilacetat (4:1 ili 3:2) - silikagel
b. Benzen ili hloroform ili etar ili benzen/heksan (1:1) - aluminijumoksid
c. Smeše petroletra/benzena s malo piridina - cinkkarbonat

2. Amini
a. Etanol(95%)/amonijak(25%) (4:1) - silikagel
b. Aceton/heptan (1:1) - aluminijumoksid
c. Aceton/voda (99:1) - kizelgur G

3. Karboksilne kiseline
a. Bezen/metanol/sirćetna kiselina (45:8:8) - silikagel
b. Metanol ili etanol ili etar - poliamid
 Analiza namirnica 69

Tabela 2. Neki često korišćeni sistemi za tankoslojnu hromatografiju

različitih klasa jedinjenja (nastavak)
4. Sulfonamidi
a. Hloroform/etanol/heptan (1:1:1) - silikagel G

5. Insekticidi
a. Cikloheksan/heksan (1:1) ili ugljentetrahlorid/etilacetat (8:2) - silikagel G
b. Heksan - aluminijumoksid
c. Heptan, zasićen sirćetnom kiselinom - silikagel S
d. Hloroform - silikagel G, impregniran oksalnom kiselinom

6. Lipidi
a. Petroletar/dietiletar/sirćetna kiselina (90:10:1) do (70:20:4) - silikagel G
b. Petroletar/dietiletar (95:5) - aluminijumoksid
c. Hloroform/metanol/voda (80:25:3) - silicijumova kiselina

7. Glikolipidi
a. Propanol/amonijak(12%) (4:1) - silikagel G

8. Fosfolipidi
a. Hloroform/metanol/voda (60:35:8 ili 65:25:4) - silikagel

9. Aminokiseline
a. Butanol/sirćetna kiselina/voda (3 ili 4:1;1) - silikagel

10. Steroidi i steroli

a. Benzen ili benzen/etilacetat (9:1 ili 2:1) - silikagel G
b. Sirćetna kiselina/voda (92:8 ili 90:10) - kizelgur G, impregniran
undekanom

11. Vitamini
a. Metanol, ugljentetrahlorid, ksilol, hloroform ili petroletar - aluminijumoksid
b. Metanol, propanol ili hloroform - silikagel G
c. Aceton/parafin (zasićeno vodom) (9:1) - silikagel, impregniran parafinom

12. Šećeri
a. Benzen/sirćetna kiselina/metanol (1:1:3) - silikagel, impregniran bornom
kiselinom

Detekcija i identifikacija komponenata

Hromatogram se po sušenju obrađuje reagensima za bojenje koji su poznati iz

hromatografije na papiru, pri čemu je na tankom sloju silikagela moguće upotrebiti i
brojne korodivne, destruktivne supstance. U nastavku je opisano nekoliko
univerzalnih metoda.
 Analiza namirnica 70

1. Jodna para. Ploča se unosi u komoru na čijem dnu se nalazi nekoliko kristala joda
ili se prska rastvorom joda u ugljentetrahloridu. Većina organskih supstanci pojavljuje
se u vidu žutih mrlja, pri čemu se nezasićena jedinjenja boje intenzivnije. Ukoliko se
želi da se komponente očuvaju za dalju analizu ili eluiraju s ploče, izlaganje jodnoj
pari treba da traje kratko, često samo desetak sekundi. Adsorbovani jod se s ploče
može ukloniti strujom vazduha. Ovaj reagens, naravno, nije moguće primeniti na
adsorbentima kod kojih je vezivo skrob.

2. Prskanje vodom. Ploča se prska vodom dok ne postane transparentna i posmatra

u propuštenoj svetlosti. Koncentracione zone organskih jedinjenja pojavljuju se kao
neprovidne ("masne") bele mrlje. Reagens je očigledno nedestruktivan.

3. pH-indikatori. Pri prskanju rastvorom indikatora, kisele, odnosno bazne

komponente boje se odgovarajućom bojom.

4. Smeše sumporne kiseline. Ovo je opšti reagens za nespecifičnu lokalizaciju zona

svih organskih jedinjenja. Postoji niz ovakvih smeša s vodom ili i drugim oksidacionim
reagensima (hromsumporna kiselina), kojima se ploča prska i zagreva tokom
određenog vremena pri određenoj temperaturi. Komponente se pojavljuju u obliku
tamnih ugljenisanih mrlja, pri čemu često tokom zagrevanja određena jedinjenja
menjaju boju na specifičan način koji se može iskoristiti za njihovu priližnu
identifikaciju. Reagens se ne može primeniti na ploče sa skrobom.

5. Metod vruće žice. Komponente se mogu ugljenisati i tako što se iznad ploče, na
kratkom odstojanju (1 mm), prevlači elektrootporna usijana žica (cekas ili nihrom).
Metoda je neprimenljiva za ploče vezane skrobom.

6. UV-svetlost. Jedinjenja koja ne fluoresciraju pojavlju se kao tamne mrlje na svetloj

pozadini, ako je u sloj dodat fluorescentni indikator. Obratno, na sloju bez indikatora,
vidljive su svetle mrlje fluorescirajućih jedinjenja na tamnoj pozadini. Metoda je
nedestruktivna. Za specifičnu, bližu identifikaciju jedinjenja, mogu se koristiti sve
metode iz oblasti hromatografije na papiru.

Kvantitativna analiza

Za kvantitativno određivanje mrlja direktno na sloju se koriste fotodenzitometri –

uređaji koji na osnovu intenziteta reflektovane svetlosti izračunavaju količinu
materijala u mrlji.

Kod hromatografije na tankom sloju široko se koristi metoda skidanja mrlja i njihovog
daljeg analiziranja drugim metodama. Područje sloja pod mrljom izgrebe se iglom i uz
pomoć vakuuma usisa neposredno u minijaturnu kolonu, odakle se eluira polarnim
rastvaračem. Ovde mogu nastati teškoće kod spektrofotometrijske analize jer se pri
spiranju ne može izbeći prelaz najfinijih čestica adsorbenta u eluat, naročito ako se
eluiranje vrši vrlo polarnim rastvaračima. Sitne čestice rasipaju svetlost i snižavaju
tačnost određivanja.
 Analiza namirnica 71

GASNA (GASNO-TEČNA) HROMATOGRAFIJA (GC, GLC)

Kod ove metode mobilna faza je gasna, dok stacionarna faza može biti čvrsta (gasna
hromatografija - GC) ili tečna, naneta na čvrst nosač, odnosno unutarnji zid kapilarne
kolone (gasno-tečna hromatografija - GLC). Ovaj drugi slučaj je mnogo važniji i češći
u praksi.

Kod gasno-tečne hromatografije, mobilna faza je uvek neselektivna, tj. predstavlja

inertnu, pokretnu atmosferu, u koju komponente uzorka prelaze isključivo zbog
sopstvene isparljivosti. S druge strane, afinitet komponenata ka stacionarnoj fazi se
ne ostvaruje uvek mehanizmom rastvorljivosti, već često značajnu ulogu igra i
adsorpcija na površini, kako tečnog sloja, tako i na površini nosača stacionarne faze.
Ovde je značajan faktor i temperatura koja izuzetno utiče na rezoluciju komponenata.

Aparatura

Na slici 2 je šematski prikazan sistem za gasno-tečnu hromatografiju.

Slika 2 Šema sistema za gasno-tečnu hromatografiju

Noseći gas (mobilna faza) mora odgovarati primenjenom detektoru, biti inertan, čist,
suv i jeftin. Tipičan protok nosećeg gasa u analitičkom radu kreće se između 25 i 125
ml/min.

Uzorak se u gasnu struju unosi kroz injektor, putem mikrošprica ili specijalnih ventila
za uzorkovanje. Tipična količina rastvora ubrizganog uzorka u analitičkom radu iznosi
od 0,1 do 50 μl, a ako su u pitanju gasoviti uzorci, onda između 0,1 i 50 ml. Injektor
mora biti zagrejan do temperature dovoljne za potpuno isparavanje uzorka.

Kolone su obično od stakla, nerđajućeg čelika ili bakra – prave, savijene ili u obliku
navoja. Ispunjene su praškastim nosačem, impregniranim stacionarnom fazom.
Pakovanje adsorbenta je sabijeno između dva čepa od staklene vune na krajevima
kolone. Prečnik analitičkih kolona kreće se od 2 do 6 mm, a dužina od 2 do 30 m.
Ako je kolona kapilarna, dakle bez adsorbenta, tada joj se prečnik može kretati od
0,25 do 0,75 mm, a dužina od 30 do 300 m. Budući da je temperatura eksperimenta
značajna karakteristika, kolone se smeštaju u poseban termostat.
 Analiza namirnica 72

Detektor ima ulogu da otkrije prisustvo i odredi koncentraciju komponente u izlaznoj

struji nosećeg gasa. Dobar detektor treba da ima visoku osetljivost, da daje linearan
odgovor u širokom rasponu koncentracija i da njegov rad ne podleže varijacijama
protoka i temperature. Detektor se termostatira barem na temperaturu kolone da u
njemu ne bi došlo do kondenzovanja komponenata uzorka.

Signal iz detektora se preko odgovarajućeg pojačivača šalje pisaču i beleži u funkciji

vremena.

Komponente koje izlaze iz kolone mogu se skupljati u hlađene kapilarne cevi ili u
odgovarajuće posude.

Stacionarna faza

Kod gasno-tečne hromatografije čvrsta faza ima pretežno ulogu nosača tečne
stacionarne faze i stoga treba da je inertna, fizički postojana i dovoljne specifične
površine. Za nosače se koriste razni oblici deaktiviranog silicijumdioksida (dijatomit,
kizelgur) čija se površina dodatno obrađuje da bi postala inertnija. Najefikasnije je da
se površina silanizira (slika 3), pri čemu se blokiraju zaostale hidroksilne grupe. Kod
kapilarnih staklenih kolona unutarnji zid se takođe podvrgava istoj obradi.

Slika 3 Postupak blokiranja hidroksilnih grupa na površini silikagela

Kolona ima najveću efikasnost kada je veličina čestica nosača u uskom rasponu,
naprimer 60-80 meša (0,25-0,18 mm), 80-100 meša (0,18-0,15 mm), ili 100-125
meša (0,15-0,13 mm).

Tečna stacionarna faza u radnim uslovima treba da ima nizak viskozitet i da pokazuje
visoku selektivnost rastvaranja različitih komponenata uzorka. Ona ne sme da
reaguje sa čvrstim nosačem (osim ako se na taj način imobilizuje na njemu), niti da
isparava u značajnijoj meri. Zbog toga se za svaku stacionarnu fazu preporučuju
donja i gornja temperaturna granica primene. Tečna stacionarna faza se nanosi na
čvrsti nosač u količini od 2-20%, pri čemu manja količina omogućava brže
razdvajanje, pri nižoj temperaturi, ali istovremeno smanjuje kapacitet kolone.

Tečne stacionarne faze mogu se klasifikovati prema polarnosti. Najpolarnije tečnosti

vezuju komponente uzorka jakim vodoničnim vezama, dok kod onih najmanje
polarnih između molekula stacionarne faze i molekula komponenata deluju samo
slabe vandervalsovske sile. Izbor stacionarne faze vrši se tako da njena polarnost
približno odgovara polarnosti komponenata (prema navedenom alhemijskom pravilu:
 Analiza namirnica 73

"slično se u sličnom rastvara"). U Tabeli 3 su navedene neke tipične stacionarne faze

prema redosledu rastuće polarnosti uporedo s maksimalnim temperaturama njihove
primene.

Tabela 3. Neke stacionarne faze za GLC, u nizu rastuće polarnosti

Stacionarna faza Maksimalna

temperatura
korišćenja (0 C)

Squalan (C30H62, razgranat) 150

Apiezon-L mast (A.E.I., England) 250-300
Didecilftalat 165-170
Di-(2-etilheksil)sebacinat 150
Metilsilikonsko ulje, niskog viskoziteta (DC-200, 200
Dow Corning)
Fenilsilikonsko ulje (DC-550, Dow Corning) 180-220
Metilsilikonska guma (SE-30, General Electric) 300-350
Polietilenglikol (Carbowax 1540, Union Carbide) 150
Polialkilenglikol (Ucon Oil LB-550-X, Union Carbide) 180-200
Polialkilenglikol (Ucon Oil 50-HB-2000, Union 180-200
Carbide)
Polifeniletar (OS-138) 200-225
Poliestar butandiolsukcinat "BDS" 200-205
Poliestar dietilenglikolsukcinat "DEGS" 205-210

Noseći gas

Noseći gas, osim što treba da je inertan, treba da ima i što veću molekulsku masu jer
se na taj način smanjuje difuzioni koeficijent komponenata uzorka u njemu i shodno
tome, difuziono širenje koncentracionih zona. Zbog toga se obično za noseći gas
koristi azot (M=28) ili argon (M=40). Za specifične svrhe, npr. pri upotrebi
termokonduktometrijskog detektora (o kome će kasnije biti reči), koriste se, s druge
strane, gasovi najniže moguće molekulske mase: vodonik i helijum, upravo zato što
im se koeficijent termičke provodljivosti veoma razlikuje od svih drugih supstanci, pa
se prisustvo komponenata u njima može lako pratiti. Osim toga, pomenuti gasovi su
niske gustine, što omogućuje primenu visokih protoka i ostvarivanje kraćeg vremena
razdvajanja.

Temperatura kolone

Budući da se kod gasno-tečne hromatografije raspodela komponenata između

nosećeg gasa i stacionarne faze vrši na osnovu razlika između njihove isparljivosti i
rastvorljivosti, radna temperatura sistema ima izuzetan značaj. Povišenje
temperature izaziva povećanje isparljivosti i smanjenje rastvorljivosti komponenata,
zbog čega se komponente kraće zadržavaju u koloni, koncentracione zone su jasnije
 Analiza namirnica 74

izražene, ali je razdvajanje komponenata lošije. S druge strane, sa sniženjem

temperature raste rastvorljivost komponenata, što omogućuje njihovu potpuniju
interakciju s polarnom stacionarnom fazom i vodi boljoj rezoluciji, ali i produženom
vremenu analize. Više temperature po pravilu poboljšavaju razdvajanje komponenata
prema isparljivosti, a niže prema polarnosti.

Na osnovu prethodnog razmatranja proizlazi da za svako konkretno razdvajanje

postoji neka kompromisna temperatura, s tim što treba voditi računa i o maksimalnoj
temperaturi korišćenja stacionarne faze, kao i o riziku da komponente uzorka pri
višim temperaturama reaguju s njom ili nezavisno od nje, pretrpe strukturne i
hemijske promene.

Kod gasno-tečne hromatografije učestvuje i pojava koja se ne sreće kod drugih vrsta
hromatografije: razdvajanje se postiže ne samo prema afinitetu, već i prema
isparljivosti. Tako će, na primer, homologi niz alifatičnih ugljovodonika (dakle
jedinjenja jednake polarnosti) izlaziti iz kolone redosledom rastućih molekulskih
masa, što se slaže s redosledom njihove opadajuće isparljivosti. Pri tome će se pri
izotermskom radu zapaziti sukcesivno opadanje visine i širenje koncentracionih zona
s vremenom zadržavanja pojedinih komponenata, što se u potpunosti može
kompenzovati primenom programiranog rasta temperature kolone tokom analize.

Sličan princip temperaturnog programiranja kolone može se primeniti na smešu

komponenata kod kojih se (zbog njihove veoma različite polarnosti) retenciona
vremena veoma razlikuju.

Detektori

1. Termokonduktometrijski detektor (katarometar)

Slika 4 Šema termokonduktometrijsklog detektora

Ovaj detektor radi na principu električno zagrevane žice oko koje struji noseći gas.
Kada su jačina struje i protok konstantni, između žice i gasa uspostavlja se termička
ravnoteža: proizvedena toplota jednaka je toploti koju odvodi noseći gas i
temperatura žice zadržava konstantnu vrednost koja, između ostalog, zavisi i od
termičke provodljivosti gasa. Ako se zbog pristustva strane komponente promeni
termička provodljivost nosećeg gasa, uspostaviće se novo ravnotežno stanje i
drugačija temperatura žice.
 Analiza namirnica 75

U svojoj praktičnoj realizaciji katarometar (slika 4) predstavlja masivni metalni blok s

dve protočne ćelije u kojima su smeštena dva identična metalna filamenta ili dva
identična termistora – poluprovodnička otpornika s visokim termičkim koeficijentom
električnog otpora. Ti elementi čine dve grane Wheatstoneovog mosta – uređaja,
pomoću koga se mogu upoređivati njihove električne otpornosti.

Kroz jednu od ćelija (referentnu) noseći gas protiče pre ulaska u kolonu, a kroz drugu
(radnu) po izlasku iz nje. Početna identičnost uslova u obe ćelije znači i električnu
ravnotežu filamenata – detektor ne daje signal. Kada se, pak, u efluentu iz kolone
nađe komponenta, termička provodljivost nosećeg gasa se menja, što izaziva
promenu temperature elektrootpornog elementa u radnoj ćeliji i poremećaj električne
ravnoteže između filamenata, koju detektor registruje.

Konduktometrijski detektor je univerzalnog tipa. Pošto je za njegovu osetljivost

veoma značajno da se termička provodljivost nosećeg gasa što više razlikuje od
termičke provodljivosti komponenata, noseći gas je obično vodonik ili helijum. On
spada u nedestruktivne detektore, što znači da se posle izlaska iz njega komponente
mogu sakupljati i dalje analizirati drugim metodama. Odgovor katarometra
proporcionalan je koncentraciji komponente u nosećem gasu tako da se za dobijanje
podatka o apsolutnoj masenoj količini komponente mora tačno poznavati veličina
protoka nosećeg gasa.

2. Plameno-jonizacioni detektor (engl. flame ionization detector, FID)

Ovaj detektor (slika 5) sastoji se u načelu od dve elektrode, između kojih gori
kiseonično-vodonični plamen. Između elektroda priključenih na jednosmerni napon
(150-300 V) protiče slaba električna struja zbog prisustva male količine jona u
plamenu. U gorivu smešu stalno se uvodi noseći gas iz kolone. Kada u plamen s
nosećim gasom dospe neko organsko jedinjenje, ono naglo sagoreva u višku
kiseonika, pri čemu se stvori veliki broj jona i struja između elektroda naglo poraste.

Odgovor detektora proporcionalan je broju neoksidisanih ugljenikovih atoma, što

znači da se detektor može primeniti za detektovanje gotovo svih organskih jedinjenja,
pri čemu je za kvantitativan rad potrebna kalibracija uz standarde. Neorganski
gasovi, voda, ugljendisulfid i ugljenoksisulfid ne izazivaju odgovor detektora, tako da
je ugljendisulfid pogodan rastvarač za unošenje uzorka u kolonu.

Slika 5 Šema plameno-jonizacionog detektora

 Analiza namirnica 76

Za razliku od katarometra, odgovor ovog detektora nije proporcionalan koncentraciji,

već apsolutnoj masenoj količini komponente i stoga ne zavisi od protoka nosećeg
gasa. Detektor je veoma raširen u praksi. Budući da je destruktivan, ako se želi
hvatanje komponenata iza kolone, mora se primeniti cepanje toka nosećeg gasa
(obično u odnosu 1:10). Manji deo ide u detektor, a veći u kolektor frakcija.

3. Alkalni plameno-jonizacioni detektor (engl. alkali flame ionization detector, AFID)

FID se može podesiti da bude osetljiv gotovo isključivo za organofosforna i u nešto

manjoj meri za azotna jedinjenja u submikrogramskim količinama tako što se uz sam
plamen smesti mali blok kalijumhlorida, cezijumbromida ili rubidijumsulfata. Za razliku
od situacije kod plameno-jonizacionog detektora (višak kiseonika), vodonično-
kiseonični plamen se održava redukcionim (višak vodonika), tako da značajnu ulogu
u stvaranju signala ima piroliza organskih jedinjenja. Mehanizam rada AFID još nije u
potpunosti rasvetljen. Detektor je destruktivnog tipa i primenjuje se najviše za analizu
organofosfornih pesticida.

4. Detektor elektronskog zahvata (engl., electron capture, EC)

Slika 6 Detektor elektronskog zahvata

Ovaj detektor (slika 6) sadrži izvor β-zračenja na unutarnjem zidu kućišta kroz koje
se propušta noseći gas iz kolone. Zračenje jonizuje molekule komponenata, zbog
čega se između pozitivne elektrode i negativno naelektrisanog kućišta detektora
javlja električna struja. Izvor β-zračenja je obično titanijumska folija na kojoj je
adsorbovan radioaktivni tricijum 3H2 ili folija radioaktivnog izotopa 63Ni. Oba izvora su
čisti β-izračivači, što pri radu omogućuje laku zaštitu od radioaktivnosti.

Kao noseći gas za ovaj detektor koristi se azot ili argon sa 10% metana. Osetljivost
detektora na organske molekule zavisi od njihovog efektivnog preseka za jonizaciju,
pa se stoga on uglavnom koristi za detekciju halogenih jedinjenja, naročito pesticida.
Ovo je detektor nedestruktivnog tipa.

Neke uporedne osobine opisanih detektora, prikazane su u Tabeli 5.

 Analiza namirnica 77

Tabela 5. Uporedne osobine GLC detektora

Detektor Osetljivost Interval Granica

(g/s) linearnog detekcije (g)
odgovora

Katarometar 6 x 10-10 104 3 x 10-6

FID 9 x 10-13 107 2 x 10-11
AFID (fosfor) 4 x 10-14 103 2 x 10-12
AFID (azot) 7 x 10-12 103 2 x 10-10
EC-tricijum
2 x 10-14 5 x 102 10-13
(hlor)
EC-nikl (hlor) 5 x 10-14 50 4 x 10-12

Kvalitativna analiza

Kao kod drugih hromatografskih metoda, vreme zadržavanja komponente

(retenciono vreme) pod datim uslovima predstavlja njenu karakteristiku. Kod gasno-
tečne hromatografije pogodno je da se koristi korigovano vreme zadržavanja koje se
meri od trenutka izlaska iz kolone vazduha koji je unet sa uzorkom. Često se iz
praktičnih razloga vreme zadržavanja meri od trenutka izlaska iz kolone rastvarača u
kome je bio rastvoren uzorak.

U kvalitativnoj analizi veliku pomoć može da pruži činjenica da kod članova

homologog niza postoji linearna zavisnost logaritma retencionog vremena od broja
ugljenikovih atoma, pri čemu je nagib ove zavisnosti različit za različite homologe
nizove. Zakonitost se još bolje može iskoristiti ako se takve linearne zavisnosti
uporede na kolonama različite polarnosti.

Dodatne informacije mogu se dobiti ako se efluent iz kolone propušta kroz dva
različita detektora, paralelno ili sukcesivno. U drugom slučaju, prvi detektor mora biti
nedestruktivan. Na primer, kod para: FID i EC utvrđuje se koje komponente su
halogena jedinjenja.

Identifikaciji može pomoći ako se alikvoti uzoraka pre hromatografskog razdvajanja

obrade na različite načine: oksidišu, hidrogenuju i sl. Na primer, hromatogram smeše
jedinjenja različitog stepena nezasićenosti značajno se može razjasniti ako se uzorak
prethodno hidrogenuje i dvostruke i trostruke veze zasite.

I na kraju, neisparljive supstance mogu se pirolizovatii pod kontrolisanim uslovima,

produkti pirolize podvrći GLC i dobijeni hromatogram (pirogram) uporediti kao "otisak
prsta" s pirogramima poznatih supstanci obrađenih na identičan način.

Svi pobrojani načini identifikacije samo su približni, čak i kada se analiza radi uz
standarde, jer iako svakom jedinjenju pod datim uslovima odgovara karakteristično
retenciono vreme, za dva jedinjenja ono može biti jednako. Stoga je za pozitivnu
identifikaciju komponenata neophodno njihovo naknadno analiziranje pouzdanim
klasičnim ili instrumentalnim metodama. U tom cilju se gasni hromatograf često
povezuje s kolorimetrom, spektrofotometrom ili masenim spektrometrom.
 Analiza namirnica 78

Kvantitativna analiza

Izuzimajući tehnike kod kojih se pojedine komponente sakupljaju po izlasku iz kolone

i neposredno mere, kvantitativno određivanje kod gasno-tečne hromatografije svodi
se na merenje površina koncentracionih zona (pikova) na hromatogramu, što
podrazumeva linearan odgovor detektora u širokom rasponu koncentracija.

Pri tome, unutar nekog homologog niza, i uz FID, najčešće je moguće dobiti relativno
učešće komponenata u smeši kao relativno učešće površina odgovarajućih pikova u
zbirnoj površini:
AX
%X =
∑ AX
Kada odgovor detektora nije približno jednak za sve komponente, gornji izraz se
koriguje:
FX AX
%X =
∑ FX AX
gde je Fx - faktor proporcionalnosti između površine pika i mase svake komponente.
Ovaj faktor se dobija određivanjem standardne krive za svaku komponentu.

Dakle, za tačnu analizu neophodno je korišćenje standarda, najbolje direktno dodatih

u uzorak (unutrašnji standard), jer se tako eliminišu varijacije između ponovljenih
hromatografskih razdvajanja.

Sama površina pikova komponenata može se izmeriti:

- planimetrisanjem;
- triangulacijom - aproksimiranjem zvonastog oblika zona trouglom, i merenjem
njegove visine i osnove;
- isecanjem pikova s hromatograma i njihovim merenjem na analitičkoj vagi, što
podrazumeva dovoljnu homogenost papira;
- pomoću automatskog mehaničkog integratora površine;
- pomoću digitalnog (računarskog) integratora površine;

pri čemu se, istim redosledom, smanjuje greška merenja, počev od nekoliko %, pa
do 0,5%.

Primena GLC

Iako su tehnike hromatografije na papiru, tankom sloju i koloni veoma popularne, ipak
se može reći da je najveći doprinos analitici uopšte, a naročito analitici biološkog
materijala, dala gasno-tečna hromatografija, zbog svoje visoke moći razdvajanja,
fleksibilnosti radnih uslova i širokog područja primene. Na području namirnica, neke
njene uobičajene primene nalaze se u sledećim oblastima.

1) Utvrđivanje sastava pojedinih prehrambenih komponenata ili proizvoda.

2) Utvrđivanje falsifikata, odnosno identifikovanje porekla namirnica.
 Analiza namirnica 79

3) Istraživanje komponenata mirisa i ukusa – instrumentalno objektiviziranje

organoleptičkih svojstava radi praćenja promena pri preradi i skladištenju.
4) Kontrola aditiva (prezervativa, antioksidanasa, emulgatora, stabilizatora)
kako u proizvodnji, tako i u primeni.
5) Kontrola kvaliteta začina.
6) Kontrola toksičnih supstanci u hrani (ugljovodonici iz ambalaže, rastvarači,
ostaci pesticida, hormona, antibiotika, hemoterapeutika, nitrozamini,
policiklični aromati, polihlorovani bifenili itd.).

Iako iz samog principa gasno-tečne hromatografije proizilazi da se njoj mogu

podvrgavati isključivo isparljive supstance, tehnika pripreme uzoraka u toj meri je
napredovala da gotovo ne postoji područje gde se ona ne bi mogla primeniti.

Pomenuta priprema uzorka uglavnom obuhvata derivatizaciju – prevođenje

neisparljivih, često termolabilnih jedinjenja u njihove isparljivije, termostabilne
derivate, pogodne za analizu uz GLC.

Osnovni uzrok male isparljivosti i termičke labilnosti mnogih organskih jedinjenja jesu
njihove veoma polarne funkcionalne grupe. One se često intermolekulski povezuju
međusobno jakim vodoničnim vezama, čije raskidanje zahteva dodatnu energiju za
isparavanje takvih jedinjenja. Istovremeno, veoma polarne funkcionalne grupe
(hidroksilna, karboksilna, amino grupa i slične grupe) veoma su reaktivne tako da
povišenje temperature lako dovodi do destrukcije molekula, kroz reakcije s drugim
polarnim grupama.

Derivatizacijom se pomenute veoma polarne grupe blokiraju, u stvari prevode u

manje polarne grupe. U literaturi je opisan niz proverenih postupaka i reagenasa za
blokiranje pojedinih, specifičnih funkcionalnih grupa, od kojih su najpoznatiji:

- Alkilovanje hidroksilnih grupa, čime se alkoholi ili karboksilne kiseline

prevode u manje polarne etre ili estre.
- Sililovanje -OH, -SH i =NH grupa, tj., zamena aktivnog vodonika u njima,
neaktivnom trimetilsilil (TMS) grupom: -Si(CH3)3.
- Trifluoracetilovanje, za blokiranje uglavnom amino-grupe.
- Halogenesterifikovanje kiselina, alkohola, amina, u cilju uvođenja halogena u
jedinjenja, za osetljivu analizu uz pomoć EC-detektora.
- Dinitrofenilovanje amina, u cilju analize uz EC-detektor.
- Obrazovanje 2,4-dinitrofenilhidrazona karbonilnih jedinjenja.

Postupci derivatizacije omogućuju da se uz GLC analiziraju i takva osetljiva

jedinjenja, kao što su steroidi, antibiotici, vitamini, šećeri, i sl.