LAPORAN PRAKTIKUM

FUNDAMENTAL OF MOLECULAR

ELEKTROFORESIS

Disusun oleh:
Eza Media Arlan
472017409

PROGRAM STUDI GIZI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA
SALATIGA
2018
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara - negara berkermbang
akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang
teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekuler. Bidang
ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode
elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang
Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). DNA merupakan persenyawaan
kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel
khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya.
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam bidang biologi molekular. Prinsip
dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau Protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.

Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/spesies/ion atau partikel koloid

berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa larutan bufer,
sebagai respon adanya suatu medan listrik. Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang
diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC
(Direct Current). Umumnya teknik dari cikal- bakal elektroforesis digunakan untuk menentukan
muatan dari suatu koloid. Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya
muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan
ionik. Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi
diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik (Yuwono. 2009).

Dengan melakukan praktikum elektroforesis ini secara mendasar kita dapat mengetahui
teknik elektroforesis dengan tahapan – tahapan yang telah ditentukan dengan baik dan benar,
serta kita dapat mengidentifikasi keberadaan DNA berdasarkan pita pada gel agarose. Secara
elektroforesis akan memperlihatkan pola protein yang berbeda pulapada hewan lainnya. Faktor
tersebutlah yang menyebabkan pola protein dapat digunakan untuk membedakan spesies hewan.
Perbedaan pola protein inilah yang seringkali digunakan sebab untuk membedakan populasi
secara tepat kadangkala tidak dapat dilakukan apabila hanya menggunakan pengamatan melalui
morfologis saja. Fenomena ini pula yang menyebabkan metode elektroforesis banyak dilakukan
untuk pengamatan taksonomi, sistematik dan genetik serta untuk mengindentifikasi spesies
hewan maupun tumbuhan (bio-sistematik).

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum ini yaitu agar mahasiswa mampu menjalankan tahapan – tahapan
elektroforesi dengan baik dan mahasiswa mampu membaca serta mengidentifikasi keberadaan
DNA berdasarkan pita – pita pada gel agarose.
 BAB II
METODOLOGI
2.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah alat elektroforesis (tray/cetakan gel,
sisir, tangki, power suplly), gelas beker, gelas ukur, hotplate, mikropipet, tip, tabung eppendorf,
dan gel doc (UV transiluminator). Sedangkan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah
sampel DNA, DNA maker, agarose, larutan buffer TAE 1x, aquades, loading dye, dan larutan
ETBR.
2.2 Prosedur Kerja
2.2.1 Pembuatan Larutan Buffer TAE 1x

Pertama – tama buat 500 ml larutan TAE 1x menggunakan stok larutan TAE 50x,
kemudian ambil buffer TAE 50x sebanyak 10 ml dan diencerkan dengan aquades sampai
volume 500 ml. Buffer TAE ini dipakai sebagai perendam agarose gel dan juga sebagai
penghantar arus listrik saat running elektroforesis.

2.2.2 Buat agarose gel

Dibuat agarose gel dengan konsentrasi 0,8% dengan pelarut menggunakan Buffer
TAE 1x di atas dengan volume total 80 ml, ditimbang agarose sebanyak 1gr dalam
beaker gelas 100 ml. Setelah itu ditambahkan larutan TAE 1x sampai volume 50 ml.
Larutan agarose dipanaskan menggunakan hotplate dengan magnetic stirrer sampai
larutan berubah menjadi bening (jernih). Disiapkan wadah pencetak gel agarose,
dipastikan bagian tutup samping dan sisiran pencetak sumur telah terpasang dengan
benar. Tuang larutan agarose ke wadah pencetak gel, ditunggu sampai gel mengeras.
Tutup samping dan sisir dilepaskan secara perlahan dan hati - hati jangan sampai
merusak gel dan sumurnya.
2.2.3 Setting alat dan persiapan sampel
Wadah dan agarose gel diletakkan secara perlahan dan hati - hati didalam
chamber alat elektroforesis. larutan TAE 1x dituang ke dalam chamber secara perlahan
sampai menutupi permukaan gel agarose, kurang lebih 2 - 3 ml di atas permukaan
agarose gel atau sesuai garis petunjuk pada chamber. sampel DNA dari hasil isolasi dan
loading dye disiapkan dalam box ice, termasuk DNA marker yang akan digunakan.
Dicatat informasi DNA marker yang digunakan utnuk kebutuhan identifikasi. Siapkan 10
µl sampel yang merupakan campuran sampel DNA dan loading dye dengan perbandingan
DNA : loading dye = 4 : 1. Ambil loading dye 2 µl lalu ditempatkan pada kertas
parafilm, kemudian ambil 8 µl sampel DNA dan dicampurkan dengan loading dye
sampai tercampur merata. Setelah itu sampel dimasukkan ke dalam sumuran pada
agarose gel dengan hati - hati jangan sampai ujung tip merusak sumur atau sampel tidak
masuk ke dalam sumur. Lakukan untuk semua sampel DNA dan DNA marker, untuk
DNA marker cukup gunakan 5 µl.
2.2.4 Running
Semua sampel DNA dan DNA marker dipastikan telah siap di dalam sumuran dan
kode sampel dan nomor sumuran telah tercatat. Pasang penutup alat electroforesis dan
kabel power dari power supllya pada electroda masing - masing. Hidupkan power suplya
dan atur tegangan lebih kurang 40 – 50 volt dan arus listrik lebih kurang 90 – 100 mA.
Setelah semua siap, dirunning selama lebih kurang 2 jam.
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil

Keterangan :1 : DNA marker

: 2,3,4,5,6,7,8,9 : Sampel DNA
3.2 Pembahasan

Pada praktikum yang telah dilakukan di laboratorium biokimia, telah dilakukannya

prinsip kerja elektroforesis dengan sampel DNA yang telah ditentukan dengan meletakkan di gel
agarose, gel agarose dibuat dengan cara mencampurkan bubuk agarose dengan larutan buffer,
kemudian dipanaskan dan tunggu sampai mengeras. Gel agarose juga bersifat non-toxic. Dengan
beberapa tahapan yang telah dilalui dengan ketentuan yang telah ditetapkan dengan benar maka
proses elektroforesis telah selesai dilakukan. Menurut (Magdelin, 2012) Elektroforesis adalah
teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya
protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang
paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler.

Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin
digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis
(serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona.
Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam
dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada
muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein. Prinsip kerja elektroforesis gel
dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga
listrik. Molekul - molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif
berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul - molekul yang bermuatan negatif
(anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul - molekul yang
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda). (Jean and Francois G.
2010). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan
muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk
digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari
protein atau asam nukleat setiap individu

Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar
(lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp).
Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi
matriks agarose. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik
untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara
ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat
mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi
pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil. Namun, fragmen yang lebih besar dapat
bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang
ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga
ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel.
Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan
migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5
sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb
dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur pada gel
yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang
terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul - molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam
matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,
arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada
rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-
benar hanya berdasarkan ukuran. Penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan
ukuran berbeda - beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel
dengan meng-elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita -
pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan
ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

Pada tabel hasil diatas menunjukkan hasil sampel elektroforesis DNA darah. Pada
gambar kolom pertama menunjukkan DNA marker, DNA marker digunakan untuk penanda
posisi pasang basa yang terdapat pada molekul DNA yang ber migrasi. Pada tabel diatas
menunjukkan DNA pada kolom 2, dan kolom ke 3, memiliki kualitas yang baik dikarenakan
gambar pada hasil menggumpal, sedangkan pada kolom ke 4 dan 5 memiliki gambar yang
memiliki smear dan ketipisan gambar pita DNA yang berarti kualitas DNA nya kurang baik.
Pada kolom ke 6 dan 7 memiliki gambar pita yang memiliki smear dan pita yang tipis yang
berarti kualitas DNA nya kurang baik. Pada kolom 8 terlihat pita DNA yang sangat tidak jelas
yang berarti kualitas DNA nya kurang baik, dan kolom 9 terlihat pita DNA yang sangat jelas dan
menggumpal yang artinya memiliki kualitas DNA yang baik.

Irmawati (2003) mengatakan bahwa pita DNA yang tebal dan menggumpal menunjukkan
bahwa konsentrasi yang tinggi dan DNA total yang diekstrak dalam kondisi utuh. Sedangkan pita
DNA yang terlihat menyebar menunjukkan adanya ikatan molekul DNA yang terputus pada saat
proses ekstraksi berlangsung, sehingga genom DNA terpotong menjadi bagian – bagian yang
lebih kecil. Terputusnya ikatan molekul tersebut dapat disebabkan oleh adanya gerakan fisik
yang berlebihan yang dapat terjadi dalam proses pemipetan, pada saat dibolak – balik dalam
eppendorf, disentrifius, atau bahkan karena temperature yang terlalu tinggi dan aktivitas bahab –
bahan kimia tertentu.

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan
dari molekul DNA, yaitu :
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan
yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk
dilewati molekul - molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan
pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan
pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan
dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas
muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang
rendah.
5. Pori - pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA

Dari beberapa faktor diatas dapat dinilai bahwa faktor kegagalan dari elektroforesis
berasal dari faktor diatas. Tetapi jika dilihat lebih jauh ke belakang kegagalan elektroforesis
sebagian besar berada pada kegagalan pada isolasi DNA dari DNA tersebut, kemungkinan
dikarenakan suhu yang tidak stabil, dan larutan buffer yang kurang konsentrasinya.
Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor - faktor tertentu, terutama pada
konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer,
dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori - pori kecil
yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak
lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih
rendah saat bergerak menuju elektroda positif.
 BAB IV
KESIMPULAN
Kesimpulan dari praktikum kali ini mahasiswa mampu menjalankan tahapan – tahapan
elektroforesis dengan baik sesuai dengan ketentuan yang ditetapkan, serta mahaswa mampu
membaca dan mengidentifikasi keberadaan DNA berdasarkan pita – pita pada gel agarose. Pada
tahapan – tahapan elektroforesis harus dilakukan dengan konsentrasi dan ketelitian yang baik
agar tidak menyebabkan kegagalan pada hasil elektroforesis.
 DAFTAR PUSTAKA

Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry.
Journal of Medical Biochemistry 2010. 29 (1).

Lee. S.V. Bahaman. A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in
agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher. Rijeka,
Croatia.

Yuwono T. 2009. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta

Irmawati. 2003. Perubahan Keragaman Genetik Ikan Kerapu Tikus Generasi Pertama Pada
Stok Hatchery. Thesis. IPB. Bogor.