Određivanje bilirubina u serumu

Biohemija i fiziologija:
Bilirubin , narandžasti pigment, proizvodi se iz protoporfirina. Za svaki mol hema koji je katalizovan
dobija se jdan mol ugljenmonoksida, jedan mol bilirubina i jedan mol jona gvožđa.
Kod ljudi dnevna proizvodnja bilirubina iz svih izvora prosečno iznosi oko 250 – 300 mg, od čega se 80%
dobija iz hema hemoglobina starih, oštećenih eritrocita a ostalih 15-20% dobija se iz predhodnika eritrocita
koji iz nekog razloga bivaju uništeni u kostnoj srži, i iz katabolizma drugih proteinskih jedinjenja koja
sadrže hem kao što je mioglobin, citohromi, itd..
Nakon što je proizveden u perifernim tkivima bilirubin se transportuje do jetre vezan za albumine i to je
tzv. slobodan, nevezan, nekonjugovan ili indirektni bilirubin.
Kada uđe u jetru bilirubin se vezuje, konjuguje za glukuronsku kiselinu, gradeći bilirubin di glukuronid
koji se izlučuje putem žuči u dvanaestopalačno crevo. To je tzv. vezani, konjugovani, esterifikovani ili
direktni bilirubin.
Postoje nekoliko poremećaja u metabolizmu bilirubina a to su:
„Slobodna hiperbilirubinemija“, koja mastaje kao posledica povećanog razaranja eritrocita i to se sreće
kod novorođenčadi, takvo stanje nestaje obično do sedmog dana posle rođenja, ili se javlja kod raznih
hemolitičkih anemija gde takođe postoji povećano razaranje eritrocita.
Kod opstrukcije žučnih puteva kada žuč ne može da otiče u dvanaestopalačno crevo, javlja se „ vezana
hiperbilirubinemija“.
Kod raznih drugih oštećenja jetrinog tkiva, kada postoji poremećaj rada hepatocita, javlja se povećanje
nivoa oba bilirubina u krvi i to se zove „ukupna hiperbilirubinemija“.
1. Primcip određivanja
Koncentracija bilirubina se određuje preko azo boje, koja nastae u reakciji sa diazovanom sulfonilnom
kiselinom u prisustvu kofeina i benzoata.
2. Reagensi
1. Rastvor sulfonilne kiseline 29mmol/L. Rastvoriti 0.5g sulfonilne kiseline u 80ml destilovane vode,
zatim dodati 1,4 ml koncentrovane HCL i dopuniti do 100.
2. Rastvor Na-Nitrita 25 mmol/L ( 017g Na-Nitrita na 100 mL destilovane vode)
3. Rastvor kofeina 260 mmol/L i 520 mmol/L Na-benzoata ( na 1000mL vode rastvoriti 50g kofeina i
75g Na-benzoata.
4. Rastvor alkalnog tartarata 0.93 mol/L i 1.9 mol/L NaOH (na 1000 mL destilovane vode rastvoriti
195,5g K-Na-tartarat i 76g NaOH.
5. Rastvor NaCl „fiziološki“ 0,9% ( na 1000mL destilovane vode rastvoriti 9,0g NaCl)
6. Koncentrovani standard bilirubina 342 mmol/L ( na 100 mL destilovane vode rastvoriti 20mg
bilirubina).
7. Radni rastvor standarda bilirubina, dobija se razblaživanjem koncentrovanog rastvora u odnosu 1:10
3. Postupak određivanja
mL A analiza S standard SP slepa proba
Sulfonilna kiselina r. 1 0.20 0.20 0.20
Na-nitrit, reagens r. 2 0.05 0.05 /
Rastvor kofeina r. 3 1.0 1.0 1.0
Serum 0.20 / 0.20
Standard r. 7 / 0,20 /
Sadržaj svake epruvete dobro izmešati i nakon 10 minuta dodati u svaku epruvetu po 1.0 mL rastvora
alkalnog tartarata r.4. Izmešati epruvete i posle 5 minuta meriti apsorpciju prema slepoj probi na 578
nm.
4. Izračunavanje
Bilirubin=__A__ x 34,2
S
Referentne vrednosti: Ukupan bilirubin u krvi do 17,0