PHÒNG THÍ NGHIỆM TRỌNG ĐIỂM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ DẦU KHÍ (CEPP)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

---------------o0o---------------

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI

TRÍCH LY POLYSACCHARIDE VÀ TRITERPENOID

TỪ NẤM LINH CHI BẰNG KỸ THUẬT LƯU CHẤT
SIÊU TỚI HẠN VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT

GVHD: TS. Hoàng Minh Nam

TS. Nguyễn Hữu Hiếu
Nhóm TH: Nhóm hợp chất tự nhiên

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2019

 Danh sách nhân sự thực hiện nghiên cứu

Phân
STT Họ tên Email SĐT
nhóm
danglamtuancuong@gmail.
1 Đặng Lâm Tuấn Cường 0792159952
com
Nhóm
15139017@st.hcmuaf.edu.
2 giám sát Trần Đỗ Đạt 0388772893
vn
3 Phan Lê Thảo My thaomyhcmup@gmail.com 0969754326
4 Đặng Hoàng Bảo Ngọc 1612239@hcmut.edu.vn 0382475502
5 Lạc Dân Hy Hy.lac2710@hcmut.edu.vn 0703311222
Nguyễn Lê Nguyên Phuong.nguyen3011@hcm
6 0966921651
Phương ut.edu.vn
Nhóm
Polysacch- Vothanhdat539@gmail.co
7 Võ Thành Đạt 0975096057
aride m
Nguyễn Hoàng Phương Nghi.nguyen_3110.21@hc
8 0903146952
Nghi mut.edu.vn
Van.nguyenbk910@gmail.
9 Nguyễn Thị Thảo Vân 0964157358
com
10 Nguyễn Đức Việt 1652700@hcmut.edu.vn 0918769812
Trịnh Nguyễn Thùy Duong.trinhdcd371999@h
11 0971892022
Dương cmut.edu.vn
Nhóm Tu.huynh1999@hcmut.edu
12 Triterpen- Huỳnh Thị Thanh Tú 0935342107
.vn
oid
Nhu.nguyen.108@hcmut.e
13 Nguyễn Liên Như 0899151008
du.vn
Ngan.le1999@hcmut.edu.v
14 Lê Đào Phương Ngân 0838977063
n
15 Vương Hoài Thanh 1613134@hcmut.edu.vn 0899078363
Mục tiêu và đối tượng
nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

Thời gian và địa điểm

thực hiện

Tổng quan nghiên cứu

Thành phần hóa học

nấm linh chi

Các phương pháp trích ly

Phương pháp trích ly bằng

lưu chất siêu tới hạn

Phương pháp trích soxhlet

Phương pháp siêu âm

Phương pháp enzyme

Phương pháp phân tích

hàm lượng hoạt chất

Quang phổ tử ngoại

khả kiến (UV-Vis)

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

Phương pháp thử nghiệm

hoạt tính sinh học

Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính Chống oxy hóa

Hoạt tính kháng tiểu đường

Hoạt tính kháng ung thư

Thực nghiệm

Quy trình trích ly bằng

lưu chất siêu tới hạn

Khảo sát ảnh hưởng

đơn yếu tố

Áp suất

Thời gian

Lưu lượng tổng

(CO2 + ethanol)

Nhiệt độ

Nhiệt độ

Thí nghiệm sàng lọc

Khảo sát ảnh hưởng đồng thời

của các yếu tố và tối ưu hóa

Định lượng polysaccharide và

triterpenoid tổng trong cao trích

Xác định hàm lượng polysaccharide

và triterpenoid trong nguyên liệu

Phân tích cấu trúc nguyên Phân tích đặc tính hóa lý
liệu trích ly của cao trích

Đối chứng với các

phương pháp trích ly khác

Thử nghiệm hoạt tính sinh

học của cao trích

Kết quả dự kiến

Sản phẩm mềm

Sản phẩm cứng

A. Mục tiêu nghiên cứu
- Trích ly thành công polysaccharide và triterpenoid từ nấm linh chi bằng kỹ thuật lưu chất
siêu tới hạn với đầy đủ các thông số của quy trình.
- Khẳng định hoạt tính sinh học của cao trích thông qua các chỉ tiêu đánh giá: kháng khuẩn,
chống oxy hóa, kháng tiểu đường, và kháng ung thư.
B. Nội dung nghiên cứu
 Nội dung 1: Trích ly polysaccharide và triterpenoid từ nấm linh chi bằng kỹ thuật lưu chất siêu
tới hạn; đồng thời khảo sát ảnh hưởng của các thông số vận hành hệ thống đến hàm lượng
polysaccharide và triterpenoid thu được. Tiến hành định lượng polysaccharide và triterpenoid
tổng bằng UV-Vis để so sánh với hàm lượng của những hoạt chất này trong nguyên liệu bằng
phương pháp ngấm kiệt sử dụng soxhlet. Phân tích cấu trúc nguyên liệu trước và sau trích ly,
phân tích đặc tính hóa lý của cao trích.
 Nội dung 2: Trích ly hoạt chất polysaccharide và triterpenoid từ nấm linh chi bằng phương
pháp trích soxhlet, siêu âm và emzyme. Tiến hành định lượng polysaccharide và triterpenoid
tổng bằng UV-Vis để đối chứng với hàm lượng hoạt chất thu được bằng phương pháp CO 2 siêu
tới hạn.
 Nội dung 3: Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích thông qua đánh giá khả năng: kháng
khuẩn, chống oxy hóa, kháng tiểu đường, và kháng ung thư.
C. Thời gian và địa điểm thực hiện
- Thời gian dự kiến: 12 tháng.
- Địa điểm thực hiện:
 Phòng thí nghiệm Trọng Điểm – Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia
TP.HCM,
 Trường Đại học Quốc tế - Đại học Quốc gia TP.HCM.
D. Tổng quan nghiên cứu
1. Thành phần hóa học nấm linh chi
1.1. Polysaccharide

Các polysaccharide của nấm linh chi có tác dụng sinh học như kháng viêm, hạ đường huyết,
chống loét, chống lại sự hình thành khối u, và tăng cường khả năng miễn dịch, kháng oxy hóa [7,
8]. Có trên 200 loại polysaccharide được phân lập từ nấm linh chi, trong đó chủ yếu gồm 2 loại
chính là: galactanvà glucan. Đặc biệt, glucan có liên kết β (β-glucan) là hoạt chất sinh học có nhiều
công dụng quý, có lợi cho con người [9, 10]. β-glucan là một chuỗi các phân tử D-glucose liên kết
bởi liên kết (1,3)-β hay (1,6)-β. Các sản phẩm tự nhiên có chứa β-glucan đã được sử dụng rất lâu,
nhưng β-glucan chỉ mới được nghiên cứu trong những năm gần đây. Các nghiên cứu cho thấy các
tác động kích thích miễn dịch và được sử dụng để điều trị một số bệnh bao gồm ung thư, bệnh
truyền nhiễm, bệnh tiểu đường, và các bệnh tim mạch [11, 12]. Cấu trúc hóa học của hoạt chất β-
glucan được trình bày như ở hình 2. Dựa trên cơ sở về β-glucan đã có, trong đề tài này, nhóm tiếp
tục nghiên cứu quy trình phân tích β-glucan từ cao trích nấm linh chi bằng phương pháp sắc kí lỏng
hiệu năng cao.

Hình 1. Cấu trúc β-glucan phân lập từ nấm linh chi

1.2. Triterpenoid

Triterpenoid chủ yếu được phân lập từ các bào tử của nấm. Hàm lượng triterpenoid thay đổi tùy
theo loại linh chi, môi trường nuôi trồng, và giai đoạn phát triển dẫn đến độ đắng bị ảnh hưởng.
Hàm lượng triterpenoid càng cao, vị đắng càng mạnh.

Cấu trúc hóa học của triterpenoid trong nấm linh chi dựa trên khung sườn lanostane. Hiện nay, trên
140 triterpenoid được phân lập từ nấm linh chi, trong đó có hợp chất axit ganoderic DM (GA-DM).
Đây là hợp chất có tác dụng chống dị ứng, hạ huyết áp, chống ung thư (công thức hóa học được thể
hiện ở hình 3). Ngoài ra, còn có các axit ganodermic có tác dụng ức chế tổng hợp cholesterol,
ganodosteron kích thích hoạt động, và bảo vệ gan [13, 14].

Hình 2. Cấu trúc hóa học của GA-DM

2. Các phương pháp trích ly

2.1. Trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn
 Nguyên tắc: trích ly bằng dung môi siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction– SFE) là một quá
trình tách một hay nhiều chất từ một hỗn hợp sử dụng lưu chất siêu tới hạn như dung môi trích ly.
Hỗn hợp ban đầu thường ở dạng rắn, nhưng cũng có khi ở dạng lỏng.
Ưu điểm:
- Hoạt chất thu được tinh khiết;
- Hiệu suất trích và độ chọn lọc cao;
- Dung môi sử dụng thân thiện với môi trường, dễ dàng thu hồi dung môi;
- Hoạt tính sinh học của các chất trích được bảo toàn.
Nhược điểm:
- Chi phí cao hơn với các phương pháp trên;
- Điểm tới hạn tùy vào từng loại lưu chất.
Dựa trên những ưu, nhược điểm của từng phương pháp ở trên, phương pháp trích ly bằng dung
môi CO 2 siêu tới hạn có những ưu điểm quan trọng, được nghiên cứu, và được đề nghị sử dụng
trong nhiều lĩnh vực [20, 21].
2.1.1. Trạng thái siêu tới hạn của lưu chất
Là trạng thái lưu chất ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn (Tc) và áp suất tới
hạn (Pc ), các giá trị này của một số dung môi được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Trạng thái tới hạn của số của một số lưu chất

Khối Lượng Áp Suất Khối lượng

Nhiệt Độ
Dung Môi Phân Tử Tới Hạn Pc riêng tới hạn
Tới Hạn Tc (K)
(g/mol) (MPa (atm)) Dc(g/cm3 )

Carbon dioxide (CO 2 ) 44,01 304,1 7,38 (72,8) 0,469

Nước (H2 O) 18,015 647,1 22,06 (217,76) 0,322

Methane (CH4 ) 16,04 190,4 4,60 (45,4) 0,162

Ethane (C2 H6 ) 30,07 305,3 4,87 (48,1) 0,203

Propane (C3 H8 ) 44,09 369,8 4,25 (41,9) 0,217

Ethylene (C2 H4 ) 28,05 282,4 5,04 (49,7) 0,215

Propylene (C3 H6 ) 42,08 364,9 4,60 (45,4) 0,232

Methanol (CH3 OH) 32,04 512,6 8,09 (79,8) 0,272

Ethanol (C2 H5 OH) 46,07 513,9 6,14 (60,6) 0,276

Acetone (C3 H6 O) 58,08 508,1 4,70 (46,4) 0,278

2.1.2. Tính chất của lưu chất siêu tới hạn
Dung môi ở trạng thái siêu tới hạn có tính chất của lỏng và khí. Tại trạng thái siêu tới hạn không
có sự phân chia pha lỏng/khí, lưu chất có khả năng khuếch tán của chất khí, và hòa tan của chất
lỏng.
Sự thay đổi khối lượng riêng theo áp suất: dưới điểm tới hạn, khi áp suất tăng, khí bị nén lại,
ngưng tụ thành lỏng. Hệ thống tồn tại hai pha cân bằng, pha lỏng ngưng tụ và pha khí khối lượng
riêng thấp. Càng tới điểm tới hạn, khối lượng riêng của khí trở nên lớn hơn, nhưng vẫn thấp hơn so
với khối lượng riêng của trạng thái lỏng. Tại điểm tới hạn, không có sự khác nhau giữa pha lỏng và
khí. Ở trên điểm tới hạn, chỉ một sự thay đổi nhỏ về áp suất dẫn tới sự thay đổi lớn về khối lượng
riêng.
Khối lượng riêng và độ nhớt của dung môi siêu tới hạn thấp hơn so với trạng thái lỏng, nhưng độ
khuếch tán lại cao hơn [15]. Số liệu được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. So sánh khối lượng riêng, độ nhớt, độ phân tán giữa chất khí, dung môi siêu tới hạn
và chất lỏng

Khối lượng riêng Độ phân tán

Trạng thái Độ nhớt (μPa.s)
(kg/m3 ) (mm2 /s)

Khí 1 10 1 - 10

Dung môi siêu tới hạn 100 – 1000 50 – 100 0,01 - 0,1

Lỏng 1000 500 – 1000 0,001

2.1.3. Trích ly dùng CO 2 siêu tới hạn

CO2 đạt trạng thái siêu tới hạn khi được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ và áp suất tới
hạn. Điểm tới hạn của CO 2 là Tc= 31 o C, Pc = 73,8 bar.
Trong tất cả các chất khí và chất lỏng được nghiên cứu, dung môi CO 2 được ứng dụng rộng rãi
nhất trong trích ly siêu tới hạn bởi giá trị tới hạn thấp, không độc hại, không bắt lửa, dễ tìm, và giá
thành thấp. CO 2 siêu tới hạn còn thích hợp trong trích ly các thành phần không phân cực như
hydrocacbon, trong khi moment lưỡng cực của nó có thể hòa tan một số thành phần phân cực trung
bình như rượu, este, andehit và ceton [22].
Hình 8 trình bày giản đồ pha của CO 2 siêu tới hạn theo áp suất và nhiệt độ. Ở vị trí (1) bắt đầu
hình thành quá trình phân chia hai pha lỏng và khí và kết thúc là điểm tới hạn (2). Qua điểm tới hạn,
pha lỏng và khí biến mất chỉ còn một pha duy nhất gọi là pha siêu tới hạn.
 Hình 3. Giản đồ pha của CO 2
Hình 4 cho thấy được sự phân cách hai pha rất rõ ràng của CO 2 , pha khí nằm cân bằng với pha
lỏng (1). Khi tăng nhiệt độ, bề mặt đường phân chia mờ dần (2). Tăng nhiệt độ cao hơn nữa sẽ làm
cho tỉ trọng của chất khí và chất lỏng gần nhau hơn, đường phân cách pha vẫn tồn tại nhưng khó
quan sát (3). Khi đã đạt đến nhiệt độ và áp suất tới hạn thì không còn phân biệt được hai pha, đường
phân cách không còn, và tạo thành một pha đồng nhất gọi là pha siêu tới hạn (4).

Hình 4. Sự chuyển pha siêu tới hạn của CO 2

2.1.4. Hệ thống trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn
Sơ đồ hệ thống trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn được mô tả như hình 10.
 .
Hình 5. Sơ đồ nguyên lý hệ thống CO 2 siêu tới hạn
1. Bình cấp CO 2 6. Bình chứa đồng dung môi
2. Phin lọc 7. Thiết bị gia nhiệt
3. Thiết bị làm lạnh 8. Bình trích
4. Bơm CO 2 9. Thiết bị giữ áp
5. Bơm đồng dung môi 10. Bình thu mẫu
Nguyên tắc: khí CO 2 được làm lạnh chuyển sang trạng thái lỏng, lỏng CO 2 qua bơm cao áp nén
lên áp suất cao, qua thiết bị gia nhiệt để đạt trạng thái siêu tới hạn, sau đó đi qua bình trích ly.
Tại bình trích ly, CO 2 siêu tới hạn là dung môi trích ly, hỗn hợp trích ly và CO 2 siêu tới hạn ra khỏi
bình trích qua thiết bị tách làm áp suất giảm, CO 2 thoát ra trạng thái khí, sản phẩm còn lại được thu
vào bình chứa [23].
Ưu điểm:
- CO 2 không độc, không cháy, rẻ tiền, dễ dàng xử lý dịch sau trích ly;
- Có điểm tới hạn khá thấp, đặc biệt quan trọng trong lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm là
những ngành có các sản phẩm dễ bị biến tính vì nhiệt;
- Thêm vào đó, sử dụng CO 2 thân thiện với môi trường và an toàn. Giảm thời gian vận hành,
tăng hiệu suất của quá trình trích ly. Tuy nhiên, CO 2 siêu tới hạn chỉ hòa tan các hợp chất
không phân cực, nếu muốn sử dụng CO 2 siêu tới hạn để trích ly hợp chất phân cực thì thêm
vào một lượng dung môi hữu cơ phân cực (đồng dung môi) để làm tăng khả năng hòa tan
các chất cần trích ly [24].
Nhược điểm:
- Chi phí đầu tư ban đầu cho hệ thống thiết bị lớn;
- Chi phí vận hành cao và hệ thống vận hành phức tạp [25].
 Ứng dụng: Dung môi siêu tới hạn được ứng dụng trong công nghệ chế biến thực phẩm như quá
trình loại chất béo, làm giàu lượng vitamin E từ các nguồn thực phẩm tự nhiên, quá trình loại cồn từ
rượu vang và bia. Các nghiên cứu trước đây cũng cho thấy dung môi siêu tới hạn được ứng dụng
trong an toàn vệ sinh thực phẩm như: phân tích nhanh hàm lượng chất béo, hỗ trợ trong phân tích
nhanh hàm lượng thuốc trừ sâu. Gần đây dung môi siêu tới hạn còn được ứng dụng trong trong các
lĩnh vực: kết tinh và tạo hạt; quá trình phủ, trích ly, sấy protein và peptit, hóa dược, sắc kí [21].
2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật CO 2 siêu tới hạn trong nước
Công nghệ trích ly sử dụng CO 2 siêu tới hạn đã được các công ty Việt Nam ứng dụng trích ly
tinh dầu tràm; trích ly tinh dầu gấc, thu hồi dầu gấc có hàm lượng các chất vi lượng cao hơn gấp
nhiều lần so với phương pháp truyền thống, hiệu quả trích ly dầu lên đến 91,5% [26]; trích ly hợp
chất polyphenol từ lá cây lược vàng [27]. Đối với ứng dụng công nghệ trong trích ly hoạt chất
chống ung thư polysaccharide và triterpenoid từ nấm linh chi vẫn chưa có công trình khoa học nào
được công bố trong nước.
2.1.6. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật CO 2 siêu tới hạn ngoài nước
Trên thế giới đã có một số bài báo nghiên cứu hoạt tính chống ung thư của hai nhóm hoạt chất
chính polysaccharide và triterpenoid từ nấm linh chi bằng nhiều phương pháp trong đó có phương
pháp CO 2 siêu tới hạn.
Công nghệ trích ly CO 2 siêu tới hạn đã được ứng dụng ở nhiều quốc gia. Tại Ấn Độ, công nghệ
này dùng để trích ly tinh chất trong gia vị và thảo dược. Tại New Zealand, Ba Lan ứng dụng trên
hoa bia và thảo dược. Tại Tây Ban Nha ứng dụng để xử lý nút bần rượu vang nhằm tạo ra sản phẩm
không mùi, không ảnh hưởng đến rượu. Tại Đức, Ý ứng dụng để loại caffein trong trà, cà phê. Tại
Đài Loan dùng để xử lý thuốc trừ sâu trong gạo cho sản phẩm gạo “sạch”; Tại Hàn Quốc ứng dụng
để sản xuất dầu mè… [25].
Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng và hoạt tính của các nhóm hoạt chất chính của linh chi được
trích ly cao hơn với kỹ thuật CO 2 siêu tới hạn. Hiệu suất trích ly triterpenoid có thể đạt tới 13,8% ở
điều kiện 40 o C, lưu lượng CO 2 là 0,84 g/mL và đồng dung môi etanol 10% [13, 20, 28].
Một số nghiên cứu gần đây ứng dụng kỹ thuật CO 2 siêu tới hạn để trích ly nhóm hoạt tính từ
nấm linh chi như trích ly axit ganoderic ức chế ung thư đường mật từ nấm linh chi bằng CO 2 siêu
tới hạn, và ly trích  -Glucan từ nấm linh chi đỏ bằng kỹ thuật trích ly siêu tới hạn [29].
Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu tiếp tục ứng dụng kỹ thuật trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn có
kết hợp dung môi etanol để trích ly polysaccharide và triterpenoid từ nấm linh chi. Cao trích sẽ
được định lượng các hoạt chất bằng cách phương pháp phân tích hiện đại như phương pháp quang
phổ tử ngoại khả kiến và sắc kí lỏng hiệu năng cao.
2.2. Phương pháp trích Soxhlet

Hệ thống trích Soxhlet được chế tạo một cách thủ công, bao gồm 3 bộ phận là bình cầu đặt trong
bếp đun, ống chứa bột cây có 2 nhánh để dẫn dung môi và dẫn dịch trích, ống hoàn lưu.
Cả 3 bộ phận này tháo ráp được tại vị trí nút mài. Sơ đồ nguyên lý và hệ thống trích Soxhlet được
thể hiện ở hình 4.

(a) (b)

Hình 6. (a) Sơ đồ nguyên lý, (b) Hệ thống trích Soxhlet

Nguyên tắc: Bột cây xay thô chứa trong túi xiphong được đặt trực tiếp trong ống chứa mẫu,
dung môi được chứa trong bình cầu ở bên dưới. Điều chỉnh bếp đun để dung môi sôi nhẹ đều, bốc
hơi lên cao theo nhánh lớn thấm ướt mẫu, và dịch trích sinh ra sẽ theo nhánh nhỏ hơn chảy vào lại
bình cầu. Bếp vẫn tiếp tục đun, dung môi tinh khiết lại được bốc hơi, và tách các hợp chất hữu cơ ra
khỏi mẫu. Quá trình này diễn ra tuần hoàn cho đến khi bột cây được trích kiệt.

Ưu điểm:

- Trích được hoạt chất tối đa tương ứng với nhiệt độ xác định;
- Hạn chế được thể tích dung môi tối đa (thuận lợi cho quá trình xử lý tiếp theo);
- Dễ dàng xác định tín hiệu dừng;
Nhược điểm:

- Lượng mẫu nhỏ (khoảng vài gam đến vài chục gam);
- Nhiệt độ tại bình trích cao (bằng nhiệt độ đun), thời gian trích dài, hoạt chất có khả năng bị
phân hủy;
- Vì sử dụng dung môi hữu cơ gây độc hại đối với con người và không thân thiện với
môi trường [15].
2.3. Phương pháp siêu âm

Nguyên tắc: sử dụng sóng siêu âm truyền trong dung dịch chất lỏng, theo trình tự với tốc độ
rung cao làm cho dung môi tại các hốc nhỏ dược liệu có hiện tượng sủi bọt. Khi những bọt
bong bóng này vỡ ở những nơi gần thành tế bào, thì sóng sung kích sẽ làm vỡ thành tế bào, và
khuếch tán các thành phần hoạt chất vào dung môi [16]. Hình 5 mô tả sự khuếch tán hoạt chất vào
dung môi và bể siêu âm tại PTN Trọng điểm ĐHQG-HCM Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP).

(a) (b)

Hình 7. (a) Khuếch tán hoạt chất vào dung môi trích ly, (b) Bể siêu âm

Ưu điểm:

- Hiệu suất ly trích cao hơn phương pháp thông thường, nên sản phẩm trích ly tốt hơn;
- Tiết kiệm thời gian và dung môi cho quá trình trích ly, giảm tiêu hao năng lượng cho quá
trình trích;
- Thiết bị an toàn, dễ sử dụng.
Nhược điểm:

- Quy mô nhỏ;
- Nhiệt độ sôi của các dung môi hữu cơ (nếu sử dụng) đạt được rất nhanh nên có thể gây nổ
[6, 17].

2.4. Phương pháp enzyme

Nguyên tắc: dùng các enzyme như cellulose, α-amilase, pectinase, chitinase hoặc hỗn hợp các
enzyme phá vỡ thành tế bào để tiền xử lý nguyên liệu trước khi trích ly. Sự phá vỡ thành tế bào để
các hoạt chất khuếch tán vào dung môi trích ly và một số loại enzyme thương phẩm được
thể hiện ở hình 7.
 (a) (b)

Hình 8. (a) Sự phá vỡ thành tế bào của enzyme, (b) Enzyme thương phẩm

Ưu điểm:

- Tiết kiệm thời gian trích ly;

- Hiệu suất trích cao.
Nhược điểm:

- Tốn kém;
- Các enzyme có thể tham gia thủy phân một số nhóm hoạt chất như polysaccharide,… [18,
19].
3. Các phương pháp phân tích hàm lượng hoạt chất trong cao trích

Về xác định hàm lượng các hoạt chất, nhiều phương pháp phân tích từ cổ điển đến hiện đại; có thể
kể đến như chuẩn độ cổ điển, quang phổ tử ngoại khả kiến, sắc kí bản mỏng, sắc kí lỏng hiệu năng
cao, sắc kí khí,... Trong nghiên cứu này, tổng hàm lượng polysaccharide và triterpenoid được xác
định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến, hàm lượng β-glucan và GA-DM được xác
định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao.

3.1. Quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis)

Phương pháp dựa trên định luật Lambert-Beer. Mỗi chất đều có một bước sóng hấp thu cực đại
đặc trưng. Khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc với bước sóng xác định đi qua dung dịch thì cường
độ của tia sáng ban đầu Io sẽ bị giảm đi chỉ còn là I. Sơ đồ nguyên lý về hấp thu tia sáng được thể
hiện ở hình 11 và sơ đồ nguyên lý máy UV-Vis được thể hiện ở hình 12. Độ hấp thu tia sáng phụ
thuộc vào nồng độ của chất nghiên cứu trong dung dịch. Từ đó, có thể xác định được nồng độ chất
trong dung dịch [30, 31].
 Hình 9. Sơ đồ nguyên lý hấp thu tia sáng

Hình 10. Sơ đồ nguyên lý máy UV-VIS

Định luật Lambert-Beer (1):

(1)

trong đó: là hệ số hấp thu phân tử, là nồng độ dung dịch (mol/L), là độ dày truyền ánh sáng
(cm), là độ hấp thu quang [32].

Đây là phương pháp phân tích hiện đại có độ nhạy cao, phát hiện lượng vết µg/mL (ppm), ng/mL
(ppb) nên áp dụng cho phương pháp phân tích tổng polysaccharide và triterpenoid là
phù hợp.

3.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography – HPLC) là
một phương pháp hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực
khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn vào nhau: pha tĩnh và pha
động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột bằng
hệ thống bơm để tạo áp suất cao, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào
bản chất của pha tĩnh trong cột và chất cần phân tích. Khi thay đổi thành phần pha động và bơm vào
cột sắc kí, do ái lực tương tác giữa chất cần phân tích với pha động, pha tĩnh khác nhau nên khi pha
động di chuyển, các chất cũng bị đẩy đi dẫn đến sự phân tách [33, 34].

HPLC là một phương pháp phân tích công cụ hiện đại được ứng dụng phổ biến trong nhiều lĩnh
vực như dược phẩm, thực phẩm, và môi trường vì phương pháp có độ nhạy cao, phát hiện hàm
lượng vết ở mức ppm, ppb,… Vì vậy, việc dùng HPLC để phân tích hàm lượng β-glucan và
GA-DM trong cao trích là phù hợp.

Thiết bị HPLC gồm các bình chứa dung môi, bơm cao áp, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc kí, đầu dò,
bộ phận ghi nhận tín hiệu, và bình thải được mô tả trong hình 13.

Hình 11. Mô hình hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Các hoạt chất chứa trong nấm linh chi được nghiên cứu có hoạt tính tốt. Đồng thời, ngày nay,
tình trạng kháng kháng sinh, lão hóa sớm ở độ tuổi 30-40, tiểu đường, và ung thư đang là những
bệnh phổ biến. Vì vậy, sau khi đánh giá hàm lượng các hoạt chất bằng các phương pháp phân tích
hiện đại, cao trích tiếp tục được thử nghiệm hoạt tính sinh học.

4. Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

Trong đề tài này, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, tiểu đường, và ung thư được chọn để thử nghiệm
hoạt tính sinh học của cao trích polysaccharide và triterpenoid.

4.1. Hoạt tính kháng khuẩn

4.1.1. Các loại vi khuẩn được chọn để thử nghiệm

4.1.1.1. Staphylococcus aureus

 Staphylococcus aureus (S. aureus) còn gọi là tụ cầu vàng, là những cầu khuẩn Gram dương có
đường kính từ 0,8-1,0 µm, không có lông và nha bào, thường không có vỏ như thể hiện ở hình 14.

Hình 12. Vi khuẩn S. aureus

Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10-45 °C và nồng độ muối cao tới
10%. Thích hợp được ở điều kiện hiếu và kỵ khí. Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo
thành khuẩn lạc đường kính 1-2 mm, nhẵn. Sau 24 giờ ở 37 °C, khuẩn lạc thường có màu vàng
chanh.

Khi ăn uống phải độc tố của khuẩn tụ cầu vàng hoặc số lượng khuẩn tụ cầu vàng trong ruột tăng
lên đáng kể về số lượng có thể gây ra ngộ độc cấp tính. Sau khi ăn phải thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu
từ 2-8 giờ, bệnh nhân nôn và tiêu chảy nặng, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu
là nước [35].

4.1.1.2. Helicobacter pylori

Helicobacter pylori (H.p) là một trực khuẩn Gram âm, hình cong hoặc hình chữ S, đường kính
từ 0,3-1 µm, dài 1,5-5 µm với 4-6 lông mảnh ở mỗi đầu, chính nhờ các lông này cùng với hình
thể của mình mà H.p có thể chuyển động trong môi trường nhớt. Hình 15 mô tả về hình dạng loại
vi khuẩn này.

Hình 13. Vi khuẩn H.p

 H.p thường cư trú ở trong lớp nhầy tập trung chủ yếu ở hang vị, thân vị và ở những vùng có dị
sản dạ dày ở tá tràng. H.p gắn chọn lọc vào một vị trí đặc hiệu của chất nhày và một vị trí
glycerolipidic của màng. H.p sản sinh ra một lượng lớn ure, lớn hơn nhiều so với bất kỳ loại vi
khuẩn nào khác, vì thế ở dạ dày sự hiện diện của ure gần như đồng nghĩa với sự có mặt của H.p.

H.p tăng trưởng ở nhiệt độ 30-40 o C, chịu được môi trường pH từ 5,0- 8,5 và sống ở phần sâu
của lớp nhầy bao phủ niêm mạc dạ dày, giữa lớp nhầy với bề mặt của lớp tế bào biểu mô, và ở các
vùng nối giữa các tế bào này.

H.p có thể được lây truyền qua nhiều đường như: miệng-miệng, phân-miệng, dạ dày-miệng, và
dạ dày-dạ dày. Ở những nơi có điều kiện vệ sinh kém, nước và thức ăn bị nhiễm là nguồn lây lan
quan trọng ban đầu [36].

Ngày nay, thức ăn bị nhiễm khuẩn gây ngộ độc thực phẩm cấp tính và thường được chữa bằng
các loại kháng sinh. Tuy nhiên, việc dùng kháng sinh như vậy sẽ làm chết các loại vi khuẩn có lợi
cho đường ruột, cũng như hiện tượng kháng kháng sinh. Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu trích ly
hoạt chất polysaccharide và triterpenoid từ nấm linh chi để thử nghiệm khả năng kháng các loại vi
khuẩn trên của cao trích, góp phần tìm ra các hoạt chất có khả năng kháng các loại vi khuẩn gây hại
đến sức khỏe con người cũng như tiêu diệt chúng thay vì dùng kháng sinh trong điều trị ngộ độc
thực phẩm.

Giữa hai loại khuẩn Gram âm và Gram dương chịu ảnh hưởng khác nhau bởi hoạt chất
polysaccharide và triterpenoid trong cao trích do sự khác nhau về cấu tạo và tính chất của màng tế
bào. Do đó, trong đề tài này hai loại vi khuẩn Gram dương (S. aureus) và Gram âm (H.p) được
chọn để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích.

4.1.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn được thử nghiệm dựa trên hệ nồng độ của cao trích trong môi trường
lỏng. Có thể xác định khả năng kháng khuẩn của cao trích bằng phương pháp đo độ đục thông qua
các giá trị:

- IC50 (inhibitor concentration) là nồng độ mà tại đó ức chế 50% vi khuẩn.

- MIC (minimum inhibitor concentration) là nồng độ thấp nhất có khả năng ức chế sự phát
triển của vi khuẩn sau khoảng 24 giờ nuôi cấy.
- MBC (minimum bactericidal concentration) là nồng độ thấp nhất có khả năng tiêu diệt
99,9% lượng vi khuẩn.
Phương pháp đo độ đục:
 Mật độ vi sinh vật có thể xác định gián tiếp thông qua đo độ đục (optical density – OD) hay độ
hấp thu (absorbance – Abs). Tế bào vi sinh vật có thể tạo hệ huyền phù trong nước tạo độ đục cho
môi trường. Trong giới hạn nhất định, giá trị OD của dung dịch và mật độ của tế bào có mối quan
hệ tuyến tính với nhau. Vì vậy, có thể xác định mật độ tế bào vi sinh một cách gián tiếp thông qua
đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 550-610 nm. Ngoài ra, phương pháp đo OD còn được
dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của vi sinh vật. Đây là phương pháp cho kết quả nhanh chóng,
thường dùng để theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của vi sinh vật. Vì vậy, trong đề tài
này, nhóm nghiên cứu chọn phương pháp đo độ đục để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao
trích và sử dụng đối chứng dương là amoxicillin.

4.2. Hoạt tính kháng oxy hóa

4.2.1. Gốc tự do và chất kháng oxy hóa

Gốc tự do là những phân tử có chứa các electron ở trạng thái độc thân ở lớp vỏ ngoài cùng, luôn
có xu hướng chiếm các electron của phân tử ở trạng thái ổn định xung quanh nó. Vì vậy, gốc tự do
có khả năng oxy rất cao và có thể phản ứng với các protein, chất béo, cacbohydrat, và ADN. Khi
phân tử bị tấn công và mất electron, các gốc này sẽ trở thành gốc tự do mới, bắt đầu một phản ứng
dây chuyền.

Trong hoạt động chuyển hóa năng lượng của tế bào sống, luôn sinh ra các sản phẩm phụ là các
gốc tự do, đặc biệt khi căng thẳng, mệt mỏi kéo dài. Gốc tự do cũng có thể đến từ nguồn ngoại sinh
như ô nhiễm môi trường, bức xạ có hại, thuốc lá, chất màu tổng hợp trong thực phẩm. Bản chất gốc
tự do là nhóm nguyên tử mang electron độc thân như superoxide (O 2 •), hydroxyl (HO•),
hydroperoxyl (HOO•), peroxyl (ROO•), alkoxyl (RO•)… Các gốc tự do này kém bền, hoạt động
hóa học cực mạnh theo phản ứng dây chuyền, khi phân tử nào bị lấy electron phân tử đó sẽ trở
thành gốc tự do mới. Các gốc tự do có những lợi ích nhất định đối với cơ thể, là vũ khí tấn công tác
nhân lạ xâm nhập cơ thể, truyền thông tin giữa các tế bào. Tuy nhiên, khi cơ thể bị mất cân bằng
giữa hoạt động sản sinh gốc tự do và kháng gốc tự do, các gốc tự do dư thừa sẽ tấn công các đại
phân tử quan trọng của cơ thể: protein, lipit, axit nucleic, và gây ra hàng loạt rối loạn ở mức độ nhẹ
là sự lão hóa da, nám sạm, tàn nhang, hoặc nặng hơn là suy giảm miễn dịch, tiểu đường, các bệnh
về thần kinh Alzeimer, Pakision hay các bệnh lí về tim mạch như xơ vữa động mạch, và thậm chí là
ung thư [37].

Chất kháng oxy hóa hay còn gọi là chất bắt gốc tự do giúp ngăn chặn quá trình oxy hóa
diễn ra bằng cách trung hòa các gốc tự do. Chất kháng oxy hóa được chia thành 2 loại: chất kháng
oxy hóa nội sinh (có bản chất enzyme) và chất kháng oxy hóa ngoại sinh (không có bản chất
enzyme). Trong cơ thể sống luôn có một hệ thống các enzyme nội bào có thể phân cắt các gốc tự do
trở thành các phân tử ít nguy hại: superoxide dismuatase (SOD), catalase (CAT), glutathione
peroxidase (GPx), ... với sự kết hợp với các nguyên tố kim loại vi lượng như Se, Mn, Cu, Fe, Zn.
Khi cơ thể mất cân bằng, quá trình oxy hóa diễn ra mạnh hơn quá trình kháng oxy hóa.

Chất kháng oxy hóa đa số có tính khử, đóng vai trò như những tác nhân thu bắt gốc tự do từ đó
làm chậm tiến trình oxy hóa gây hại. Những hoạt chất như tocopherol (vitamin E), axit ascorbic
(vitamin C), epigallocatechin-3-gallate (EGCG), axit gallic, tannin, catechin, caroten,
glutathione… từ lâu đã được chứng minh có khả năng thu bắt ROS mạnh nên những chất này
thường được sử dụng làm đối chứng khi khảo sát tính kháng oxy hóa của dược liệu, cũng như cần
bổ sung các chất này khi cơ thể con người bị stress [38].

Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của cao trích
polysaccharide và triterpenoid nấm linh chi và chọn vitamin C làm chất đối chứng dương.

4.2.2. Cơ chế kháng oxy hóa của hoạt chất

4.2.2.1. Đối với polysaccharide

Trong một số nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide trích ly từ nấm linh
chi cho thấy homoglucan và heteroglucan được phân lập từ loài này có khả năng kháng oxy hóa
thông qua các xét nghiệm trong môi trường ống nghiệm như việc bắt các gốc tự do hydroxyl,
ABTS, hydroperoxyl, khả năng khử, khả năng chelating.

Homopolysacharide tạo thành bởi mannose cũng có hoạt tính kháng oxy hoá, thể hiện khả
năng bắt các gốc tự do (O 2 -, OH-, DPPH) và có thể làm tăng hoạt tính của enzyme kháng oxy hóa,
SOD (từ 67,4 đến 115,4 U/mL và 140 đến 230 U/mL), CAT (từ 7,82 đến 13,91 U/mL và 13,0 đến
22,0 U/mL), GPx (từ 10,42 đến 26,39 U/mL và 16,0 đến 36,0 U/mL. Heteroglucan với liên kết
chính -(1–3), (1–4) và (1–6) cũng được phân lập từ nấm linh chi đã cho thấy khả năng kháng oxy
hóa khi giảm tổn thương trên ty thể gây ra bởi quá trình oxy hóa bằng chiếu xạ , dẫn đến sự suy
giảm lipit hydroperoxit (1,09 xuống 0,04 nmol/mg protein), sự hình thành protein carbonyl (0,84
xuống 0,22 nmol/mg protein), trong khi sự hình thành protein thyol tăng (9,28 lên 13,42 nmol/mg
protein). Heteroglucan cũng làm tăng hoạt tính kháng oxy hóa của SOD (3,07 lên 6,11 U/mg
protein), CAT (3,25 lên 7,08 U/mg protein), GPx (2,66 lên 4,77 U/mg protein). Trong nghiên cứu
khác, homoglucan và heteroglucan đã được cô lập, cả hai đều là polysaccharide có khối lượng phân
tử thấp, và hoạt tính kháng oxy hóa của homoglucan cao hơn do có khối lượng phân tử thấp hơn
[39, 40].

4.2.2.2. Đối với triterpenoid

 Đến nay, cơ chế về khả năng kháng oxy hóa của triterpenoid cũng như GA-DM chưa được
nghiên cứu sâu rộng và cụ thể. Một nghiên cứu cho thấy các axit ganoderic A, B, C và D, lucidenic
axit B và ganodermanontriol có thể ngăn chặn các quá trình oxy hóa diễn ra trong cơ thể (Darija
Cör, Željko Knez, & Maša Knez Hrnčič , 2018).

4.2.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa

Có nhiều phương pháp thử nghiệm hoạt tính này như: TEAC (Trolox equivalent antioxidant
capacity – hoạt tính kháng oxy hóa được so sánh với khả năng kháng oxy hóa Trolox), DPPH
(Scavenging ability towards DPPH radicals – khả năng khử gốc tự do DPPH), ORAC (Oxygen
radical absorbance capacity – khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động), TRAP (Total
radical-trapping antioxidant potential – khả năng bẫy các gốc tự do), FRAP (ferric reducing-
antioxidant power – lực kháng oxy hóa bằng cách khử sắt). Trong đề tài này, phương pháp DPPH
được sử dụng để thủ nghiệm khả năng kháng oxy hóa của cao trích nấm linh chi.

Nguyên tắc: DPPH (α,α-dipheny-β-picrylhydrazyl) là một gốc tự do nhân tạo, nên bền vững và
ổn định, có thể tham gia phản ứng với những hợp chất có khả năng cho nguyên tử H tạo DPPH-H
(α,α-dipheny-β-picrylhydrazine), làm nhạt màu tím của dung dịch và dần chuyển sang màu vàng
(phương trình phản ứng như hình 16). Từ đó đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua việc đo
độ hấp thu của dung dịch màu ở bước sóng 517 nm.

α,α-dipheny-β-picrylhydrazyl α,α-dipheny-β-picrylhydrazyine

Hình 14. Phản ứng thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa

4.3. Hoạt tính kháng tiểu đường

4.3.1. Bệnh tiểu đường

 Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO), tiểu đường là một hội chứng
có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin
hoặc do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin [42].

Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ đã đưa ra một định nghĩa khác về tiểu đường: “Tiểu đường là
một hội chứng rối loạn mãn tính, có những thuộc tính như sau: tăng glucose máu, kết hợp với
những bất thường về chuyển hóa carbohydrate, lipit và protein; bệnh luôn gắn liền với xu hướng
phát triển bệnh lý về thận, mắt, thần kinh và các bệnh tim mạch khác” [43].

Theo Hiệp hội liên đoàn đái tháo đường thế giới (International Diabetes Federation – IDF),
insulin có nhiệm vụ vận chuyển glucose từ trong máu vào các tế bào của cơ thể, nơi nó được
sử dụng làm năng lượng. Sự thiếu hụt, hoặc không hiệu quả của insulin ở người bị đái tháo đường
có nghĩa là glucose vẫn lưu thông trong máu. Theo thời gian, hàm lượng glucose trong máu cao
(được gọi là tăng đường huyết) gây tổn thương nhiều mô trong cơ thể, dẫn đến sự phát triển của các
biến chứng khác [44].

Về phân loại, tiểu đường được chia thành 3 nhóm chính: tiểu đường type 1, type 2, và tiểu đường
thai kì.

Nguyên nhân gây bệnh là do khiếm khuyết gen liên quan đến hoạt tính của insulin; các bệnh tụy
ngoại tiết như viêm tụy, chấn thương, carcinoma tụy; các bệnh nội tiết như Hội chứng Cushing,
cường năng tuyến giáp; do stress oxy hóa; do thuốc hoặc hóa chất như các thuốc điều trị HIV như
pentamidine, thuốc kháng viêm nhóm corticoid, thyroid hormone... [45].

Hiện nay, số người mắc bệnh tiểu đường đang tăng lên với tốc độ báo động không những ở các
quốc gia phát triển mà cả các quốc gia đang phát triển. Đây là mối đe dọa tiềm ẩn của các bệnh rối
loạn trao đổi chất và tim mạch trong tương lai. Theo IDF, hiện nay trên thế giới có khoảng 415 triệu
người mắc bệnh tiểu đường và con số này có thể tăng đến 642 triệu người vào năm 2040. Như vậy
có nghĩa là vào năm 2015, cứ trong 11 người lớn sẽ có 1 người mắc bệnh và năm 2040 tỉ lệ mắc
bệnh là 1/10. Cũng theo tổ chức này thì tỉ lệ mắc bệnh tiểu đường ở các nước Châu Thái Bình
Dương là cao nhất so với các khu vực khác, một nửa trong số những người mắc bệnh đã không
được chẩn đoán [46].

Ở Việt Nam, số lượng người mắc bệnh tiểu đường đang có chiều hướng gia tăng với mức độ
đáng báo động. Theo thống kê vào năm 2017, hơn 3,5 triệu người mắc bệnh tiểu đường ở Việt
Nam, cao nhất Đông Nam ; và dự đoán con số này sẽ tăng lên 6,1 triệu người vào năm 2040 [47].
Trong 10 năm qua, tỉ lệ gia tăng bệnh lên đến 211%, trong khi trên toàn thế giới chỉ tăng khoảng
70%. Trong đó, gần 70% số người mắc bệnh tiểu đường không được chẩn đoán [48]. Việt Nam nằm
trong số các quốc gia thu nhập thấp và trung bình, chịu nhiều tác động xấu từ bệnh tiểu đường,
nhiều bệnh nhân đang phải chịu những gánh nặng về kinh tế do chi phí rất lớn để điều trị bệnh [46].

Chính vì những lí do nêu trên nên việc tìm ra các phương thuốc điều trị tiểu đường đang được
quan tâm. Việc thử nghiệm in vitro được thực hiện khá nhiều thông qua hình thức ức chế enzyme α-
glucosidase.

4.3.2. Cơ chế kháng tiểu đường của hoạt chất

4.3.2.1. Đối với polysaccharide

Polysaccharide có tác dụng làm tăng hoạt động của các enzyme hepatic glucokinase,
phosphofructokinase và glucose-6-phosphate dehydrogenase, ức chế quá trình tổng hợp glycogen,
làm giảm sự tạo thành glucose trong gan, giúp hạn chế sự tăng đường huyết. Một nghiên cứu khác
trên chuột bị tiểu đường type 2 do tiêm Streptozotocine, polysaccharide có tác dụng ngăn chặn sự
phá hủy tế bào β tuyến tụy, tăng cường tái tạo tế bào. Ngoài ra, các thử nghiệm còn cho thấy rằng
việc sử dụng nấm linh chi cũng mang lại những lợi ích cho việc điều trị tiểu đường type 2 bằng
cách hạ mức đường huyết có trong huyết thanh thông qua sự ức chế biểu hiện của gen PEPCK
(Phosphoenolpyruvate carboxykinase) trong gan [49].

4.3.2.2. Đối với triterpenoid

Các triterpenoid từ nấm linh chi có chứa các axit ganoderic A, C2, Df, có khả năng ức chế
enzyme aldose reductase. Enzyme này có tác dụng ức chế sự chuyển hóa glucose thành sorbitol,
ngăn chặn quá trình tích tụ sorbitol có thể gây ra các biến chứng của tiểu đường như các bệnh về
thần kinh, đục thủy tinh thể, và các bệnh về võng mạc [49].

Bên cạnh đó, triterpenoid còn có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase. Quá trình thủy phân
polysacchride trong cơ thể sẽ diễn ra 2 giai đoạn: đầu tiên enzyme α-amylase sẽ thủy phân các phân
tử polysaccharide thành các oligosaccharide, sau đó enzyme α-glucosidase tại ruột non tiếp tục thủy
phân các oligosaccharide thành các phân tử monosaccharide. Các monosaccharide này sẽ được hấp
thụ ở ruột non, sau đó thẩm thấu vào máu. Chức năng chính của các enzyme α glucosidase trong
quá trình thủy phân là xúc tác cho việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucoside của cơ chất để giải phóng
ra α-D-glucose. Bằng cách kiềm chế hoạt động của enzyme α-glucosidase thông qua chất ức chế
enzyme có thể làm giảm sự thủy phân của cacbohydrat và làm chậm sự hấp thu glucose vào mạch
máu [50]. Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu chọn enzyme α-glucosidase để thử nghiệm khả năng
kháng tiểu đường của cao trích.

4.3.3. Phương pháp thử nghiệm khả năng kháng tiểu đường
 Tại Việt Nam cũng như trên thế giới thường áp dụng các thử nghiệm có dùng enzyme để đánh
giá khả năng ức chế enzyme α-glucosidase hoặc enzyme α-amylase của cao trích, thuốc nghiên cứu,
và không dùng enzyme [51].

Nguyên tắc: Phản ứng thủy phân chất nền para-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (p-NPG) khi
có mặt enzyme α-glucosidase sẽ tạo ra sản phẩm para-nitrophenol (p-NP) và α-D-glucose như hình
17. Khi có mặt chất ức chế, enzyme α-glucosidase sẽ giảm một phần hoạt tính nên lượng
p-nitrophenol sinh ra ít hơn dẫn đến việc làm giảm độ hấp thu tại bước sóng 405 nm. Thông qua
việc so sánh độ hấp thu của mẫu cao với chứng âm, có thể xác định được lượng enzyme đã bị ức
chế [52].

α-glucosidase
+ H2 O pH = 6,8; 37oC +

p-NPG α-D-glucose p-NP

Hình 15. Phản ứng thủy phân của p-NPG

IC50 là nồng độ mẫu cho kết quả ức chế enzyme α-glucosidase được 50%. Giá trị này càng nhỏ
thể hiện mẫu có hoạt tính ức chế càng cao.

Trong đề tài này, phép thử khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được thực hiện để nghiên cứu
khả năng kháng tiểu đường của cao trích nấm linh chi.

4. Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

4.4. Hoạt tính kháng ung thư

4.4.1. Tình hình mắc bệnh ung thư hiện nay

Ung thư là tên gọi của một nhóm các bệnh có liên quan đến sự phân chia tế bào một cách vô tổ
chức, không kiểm soát được và các tế bào này xâm lấn các tế bào, mô bình thường khác xung quanh
và di căn đến các mô khác qua hệ thống bạch huyết hoặc mạch máu.

Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Theo cơ quan
nghiên cứu ung thư quốc tế ước tính đã phát hiện có khoảng 14,1 triệu ca mắc mới và 8,2 triệu ca tử
vong vào năm 2012, với 27 loại ung thư khác nhau. Các con số này sẽ tăng lên 23 và 10 triệu ca
mắc mới và tử vong vào năm 2020. Khoảng 70% các ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có
thu nhập trung bình và thấp, trong đó có Việt Nam [53, 54].

Theo thống kê của Viện nghiên cứu phòng chống ung thư, ước tính Việt Nam có khoảng 94.000
người chết vì ung thư/năm, tỷ lệ tử vong do ung thư đứng thứ 78/172 quốc gia được điều tra, xếp
vào top 2 trên bản đồ ung thư thế giới như thể hiện ở hình 18. Bên cạnh đó vấn đề đáng lo ngại là số
người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam đang có xu hướng ngày một tăng nhanh, từ 68.000 ca năm
2000 lên 126.000 ca năm 2010 và dự kiến sẽ vượt 190.000 ca vào năm 2020 [55].

Hình 16. Bản đồ ung thư thế giới

4.4.2. Cơ chế kháng ung thư của hoạt chất

Trong quá trình tìm kiếm những phương pháp điều trị và những tác nhân hoá trị mới cho bệnh
ung thư, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài thực vật, trong đó có cả nấm linh chi.
Polysaccharide và triterpenoid là hai nhóm hoạt chất kháng oxy hóa chính có tác dụng tăng cường
hệ miễn dịch, ngăn ngừa ung thư, quá trình hình thành khối u, và hỗ trợ điều trị cho các căn bệnh
liên quan mãn tính khác. Những thí nghiệm trên động vật đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc
ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung thư. Tuy nhiên, việc tiến hành những thí nghiệm
này trên cơ thể người vẫn còn hạn chế [2, 6].

4.4.2.1. Đối với polysaccharide

Polysaccharide kích thích hoạt động chống lại sự phát triển của tế bào ung thư gián tiếp thông
qua hệ thống miễn dịch của người, hoặc gây độc trực tiếp lên chúng [56, 57].

Cơ chế gián tiếp: polysaccharide hỗ trợ các phản ứng sinh học bất lợi trong cơ thể và tăng
cường miễn dịch, chống lại sự phát triển của tế bào ung thư. Polysaccaride kích hoạt các tế bào đặc
hiệu như đại thực bào, tế bào lympho T, lympho T gây độc tế bào, lympho B, tế bào tiêu diệt tự
nhiên– NK cells (Natural killer cells) – biểu lộ các cytokine (Tumor Necrosis Factor-α – TNF-α,
Interferon c – IFN-c, Interleukin 1β – IL-1β). Các cytokine có tác dụng chống phân hủy, sự rụng
chết tế bào, và sự sai khác cấu trúc tế bào.

Cơ chế trực tiếp: một vài nghiên cứu cho thấy, khi có sự hiện diện của polysaccaride, các tế
bào ung thư thay đổi sự biểu hiện tín hiệu của chúng, điều này làm cản trở chu kì tế bào, từ đó gây
chết tế bào [58].

Về mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính kháng ung thư, liên kết (1,3)-β trong mạch chính của
glucan có hoạt tính cao hơn so với glucan chứa chủ yếu liên kết (1,6)-β [59]. Ngoài ra, các cấu trúc
khác như hetero-β-glucan, heteroglycan, phức hợp β-glucan-protein... Các polyme có khối lượng
phân tử càng lớn thì hoạt tính càng mạnh [60, 61]. Do đó, β-glucan là chất được nghiên cứu trong
đề tài này.

4.4.2.2. Đối với triterpenoid

Tác dụng chống tăng sinh của triterpenoid đã được chứng minh trong các tế bào ung thư khác
nhau của con người bằng cách gây độc tế bào. Ngoài ra, triterpenoid còn thể hiện tác dụng chống lại
sự phát triển của mạch máu, hạn chế sự di căn của tế bào ung thư [62].

GA-DM có tác dụng chống tăng sinh và di căn đối với các tế bào ung thư khác nhau ở người.
GA-DM có cấu trúc hóa học tương tự như androgen hoặc estrogen nên có thể điều chỉnh thụ thể
estrogen (ER) hoặc androgen (AR) để chống lại tăng sinh và di căn của tế bào ung thư [63, 64]. Vì
vậy, GA-DM là triterpenoid được nghiên cứu trong đề tài này.

4.4.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư

Hiện nay có rất nhiều phương pháp để đánh giá hoạt tính kháng ung thư như phương pháp
tetrazolium (MTT), phương pháp Monks,…

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến.
Nguyên tắc của phương pháp là muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó
đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Vòng tetrazolium bám chặt vào
ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi
thành màu tím formazan, đo bước sóng hấp thu của dung dịch ở bước sóng 540 nm [65, 66].

Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp MTT để thử nghiệm hoạt tính kháng ung
thư, nhằm đánh giá khách quan và đa dạng các dòng tế bào.

E. Thực nghiệm
 1. Quy trình trích ly Polysaccharide và Triterpenoid từ nấm linh chi đỏ bằng CO2 siêu tới
hạn:

Nấm linh chi

Xử lý sơ bộ

Trích ly bằng
SC-CO2

Lọc chân không

Cô quay

Làm lạnh

Thêm ethanol

Thu dịch lọc,

Rửa tủa với ethanol Ly tâm
đuổi ethanol

Sấy khô
Cô quay

Polysaccharide Triterpenoid
thô

Thuyết minh quy trình: Nấm linh chi đỏ được xử lý sơ bộ bao gồm quá trình nghiền và rây để thu
được đường kính hạt d ≤ 0.5 mm, sau đó sấy ở 50 o C đến khối lượng không đổi. Sau quá trình xử lý
sơ bộ, mẫu được lưu trử trong túi nhựa, hút chân không và lưu trong ngăn lạnh nhiệt độ bé hơn 4
o
C. 20 g mẫu được cho vào bình trích ly 100 mL và cài đặt các thông số vận hành đến khi nhiệt độ
và áp suất ổn định, bắt đầu tính thời gian trích ly. Sau quá trình trích ly, thiết bị lọc chân không
được sử dụng để thu dịch lọc và loại bã. Dịch lọc được cô quay chân không để loại bỏ dung môi,
đến khi còn 1/3 dung dịch, được làm lạnh trước khi cho thêm ethanol để làm kết tủa polysaccharide
và thu được dịnh lọc chứa triterpenoids. Kết tủa được rửa lại 30 lần với ethanol 80% và đem sây
khô thu được PS thô. Đồng thời, dịch lọc được cô quay chân không để thu được cao trích
triterpenoids.
2. Khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố đến quá trình trích ly hoạt chất

Bố trí thí nghiệm khảo sát áp suất trích ly

Áp suất (Bar) 100 150 200 250 300

Thời gian (giờ) 4

Lưu lượng tổng

6
(L/phút)

Nhiệt độ (℃) 45

Tỷ lệ ethanol (%) 15

Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian trích ly

Thời gian (giờ) 1 2 3 4 5

p suất (Bar) Xác định được tại mục 1

Lưu lượng tổng (L/phút) 6

Nhiệt độ (℃) 45

Tỷ lệ ethanol (%) 15

Bố trí thí nghiệm khảo sát lưu lượng tổng

Lưu lượng tổng (L/phút) 2 4 6 8 10

 p suất (bar) Xác định được tại mục 1

Thời gian (h) Xác định được tại mục 2

Nhiệt độ (℃) 45

Tỷ lệ ethanol (%) 15

Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ

Nhiệt độ (℃) 35 40 45 50 55

p suất (bar) Xác định được tại mục 1

Thời gian (min) Xác định được tại mục 2

Lưu lượng tổng (g/min) Xác định được tại mục 3

Tỷ lệ ethanol (%) 15

Bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ ethanol

Tỷ lệ ethanol (%) 0 5 10 15 20 25

p suất (bar) Xác định được tại mục 1

Thời gian (min) Xác định được tại mục 2

Lưu lượng tổng (g/min) Xác định được tại mục 3

 Nhiệt độ Xác định được tại mục 4

3. Thí nghiệm sàng lọc

- Từ thí nghiệm khảo sát đơn yếu tố, sẽ chọn được giá trị tại tâm và thu hẹp 2 giá trị
biên.
- Bố trí thí nghiệm sàng lọc theo mô hình Plackett-Burman với 12 thí nghiệm, mỗi thí
nghiệm được lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình và phân tích phương sai
(ANOVA).
- Loại bỏ các yếu tố ít tác động đến hàm lượng Polysaccharide và Triterpenoids dựa
vào giá trị P-value. Nghĩa là, nếu giá trị P-value > 0.05, thì yếu tố khảo sát không có
ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên, nếu tất cả các giá trị P-value < 0.05, thì sẽ loại
yếu tố có giá trị P-value lớn nhất.

4. Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố

Sau khi phân tích và lựa chọn được khoảng biến thiên của bốn yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến
hiệu suất trích ly.
 Hàm mục tiêu : Y = Y (X1 , X2 , X3 , X4 )
 Phương án quy hoạch : chọn phương án trực giao cấp 2 theo hàm đáp ứng bề mặt với 4 yếu tố
độc lập ảnh hưởng
 Phương trình hồi quy (4):

∑ ∑ ∑∑

trong đó: Y là biến đáp ứng, β0 là hằng số mô hình, βi là hệ số tuyến tính, βii là hệ số bậc 2 và βij là
hệ số tương tác.
 Số thí nghiệm trong phương án là: N = 2 k + 2k + no = 24 + 2.4 + 6= 30, được thể hiện ở
bảng 5.
Trong đó số thí nghiệm tại tâm là: no = 6 và cánh tay đòn là α.
Bảng 2. Thiết kế thí nghiệm

Vị trí
TN X1 X2 X3 X4 Y
TN

1 - - - - Y1
 2 + - - - Y2

3 - + - - Y3
Nhân
4 + + - - Y4

5 - - + - Y5

6 + - + - Y6

7 - + + - Y7

8 + + + - Y8

9 - - - + Y9

10 + - - + Y10

11 - + - + Y11

12 + + - + Y12

13 - - + + Y13

14 + - + + Y14

15 - + + + Y15

16 + + + + Y16

17 -α 0 0 0 Y17

18 α 0 0 0 Y18

19 0 -α 0 0 Y19

20 0 α 0 0 Y20
Điểm
21 0 0 -α 0 Y21

22 0 0 α 0 Y22

23 0 0 0 -α Y23

24 0 0 0 α Y24

25 0 0 0 0 Y25
Tâm
26 0 0 0 0 Y26
 27 0 0 0 0 Y27

28 0 0 0 0 Y28

29 0 0 0 0 Y29

30 0 0 0 0 Y30

- Sử dụng chương trình Design expert 11 (hình 27) để thực hiện quy hoạch thực nghiệm, giao
diện của chương trình như thể hiện ở hình 28.

Hình 17. Chương trình Design expert 11

Hình 18. Giao diện Design expert 11

- Tiến hành thực nghiệm để xác định các giá trị Yj rồi lập bảng trên vào trong chương trình, chạy
chương trình để xác định các giá trị bij;

 Từ đó rút ra phương trình thực nghiệm.

5. Định lượng polysaccharide và triterpenoid tổng trong cao trích

5.1. Xác định hàm lượng polysaccharide

Hàm lượng PS được xác định bằng phương pháp phenol-axit sunfuric như sau:
Bước 1: Dựng đường chuẩn D-glucose.
Pha dung dịch D-Glucose chuẩn: Cân 100 mg D-glucose cho vào 100 mL nước cất thu được dung
dịch D-glucose 1000 µg/mL, pha loãng 10 lần thu được dung dịch D-glucose 100 µg/mL. Dựng
đường chuẩn như bảng sau:
Bảng 3: Khảo sát dựng đường chuẩn D-glucose

STT D-glucose (mL) Nước cất (mL) Phenol 5% Axit sulfuric (mL)

1 0,0 1,0 1,0 5,0

2 0,2 0,8 1,0 5,0

3 0,4 0,6 1,0 5,0

4 0,6 0,4 1,0 5,0

5 0,8 0,2 1,0 5,0

6 1,0 0,0 1,0 5,0

Sau khi trộn các thành phần vào lắc trong 10 phút, ủ ở 25-30 o C trong 20 phút. Đo mật độ quang của
dung dịch ở bước sóng 490 nm, dựng đường chuẩn:

Bước 2: Chuẩn bị mẫu cần đo, thay dung dịch D-glucose bằng dung dịch cao trích polysaccharide thu
được khi hòa tan kết tủa với 100 mL nước.
Bước 3: Dựa vào phương trình đường chuẩn để tính hàm lượng hoạt chất trong mẫu. Với là lượng
polysaccharide trong mẫu (mg/mL), là giá trị mật độ quang tại bước sóng 490 nm.
Bước 4: Đánh giá hàm lượng PS trích được thông qua phương pháp khối lượng, tính toán theo công
thức dưới đây:

X=

trong đó: X (mg/g) là hàm lượng PS,

C (μg/mL) là nồng độ của PS trong mẫu phân tích,
V (mL) là thể tích cao trích PS,
n là hệ số pha loãng,
mo (g) là khối lượng nguyên liệu nấm linh chi ban đầu sử dụng.
5.2. Xác định hàm lượng triterpenoid
Bước 1: Dựng đường chuẩn triterpenoid
Cân chính xác 1,2 mg acid ursolic, hòa tan trong 10 mL etyl acetate để xây dựng đường chuẩn với
các nồng độ acid ursolic là 0; 0,20; 0,30; 0,40; 0,50; và 0,60 mg/mL dung dịch được làm khô ở 100
o
C.
Sau đó, thêm 0,40 mL dung dịch acid axetic và vanillin 5 %, 1 mL acid pecloric, ở
60 o C, 15 phút sau đó di chuyển nó vào bồn nước đá, thêm 5 mL acid axetic, đặt nó ở nhiệt độ
phòng trong 15 phút.
Xác định độ hấp thụ của nó trong 548 nm. Dựng đường chuẩn:
Bước 2: Chuẩn bị mẫu cần đo, thay axit ursolic bằng dung dịch cao trích triterpenoid.
Bước 3: Dựa vào phương trình đường chuẩn để tính hàm lượng hoạt chất trong mẫu. Với là lượng
triterpenoid trong mẫu (mg/mL), là giá trị mật độ quang tại bước sóng 548 nm.
Bước 4: Đánh giá hàm lượng triterpenoid trích được thông qua phương pháp khối lượng, tính toán
theo công thức dưới đây:

X=

trong đó: X (mg/g) là hàm lượng triterpenoid,

C (μg/mL) là nồng độ của triterpenoid trong mẫu phân tích,
V (mL) là thể tích cao trích triterpenoid,
n là hệ số pha loãng,
mo (g) là khối lượng nguyên liệu nấm linh chi ban đầu sử dụng.
6. Xác định hàm lượng polysaccharide và triterpenoid trong nguyên liệu
Hàm lượng hoạt chất trong nguyên liệu ban đầu được tiến hành ngấm kiệt trong dung môi ethanol
trong thời gian một tuần. Dung môi được thay mới sau mỗi 24 giờ.

Hình 19. Phương pháp ngấm kiệt nguyên liệu

7. Phân tích cấu trúc nguyên liệu và đặc tính hóa lý của cao trích
SEM: mẫu nguyên liệu trước và sau khi trích ly được chụp tại Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công
Nghệ Việt Nam, hãng JEOL-Nhật. Mẫu được cắt lát để chụp cấu trúc lỗ xốp bên trong.

FTIR: Mẫu được đo bằng máy Frontier, PerkinElmer (Mỹ), ở Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng
TP.HCM. Mẫu được sấy khô sau đó ép viên với KBr. Dải phổ từ 340 – 8000 cm-1 với bộ tách tia
chuẩn, dải rộng từ 350 – 11000 cm-1 .

GPC: Mẫu được xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp GPC tại phòng phân tích trung
tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP.HCM. Mẫu được đo trên máy HPLC 1100
Agilent, cột Ultrahydrogen 250, đầu do khúc xạ (RID).

8. Đối chứng với các phương pháp trích ly khác

Bột nấm linh chi được tiến hành trích ly bằng phương pháp trích soxhlet, siêu âm và
enzyme với các thông số vận hành được xác định dựa vào các nguyên cứu trước để so sánh
hiệu quả trích ly và tính chọn lọc hoạt chất cần trích ly với phương pháp trích ly bằng CO2
siêu tới hạn.

9. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích

9.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Các chủng vi khuẩn được cung cấp theo chuẩn ATCC gồm:

- Staphylococcus aureus

- H.p

Địa điểm gửi mẫu: Phòng Sinh học ứng dụng – Viện Hóa học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ,
Phòng 601, 18A, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

Quy trình thực hiện

- Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO 5% và nước cất vô trùng thành một dãy các nồng độ khác
nhau (128, 32, 8, 2, 0,5 µg/mL).

- Chuẩn bị dung dịch vikhuẩn với nồng độ 5×105 CFU/mL khi tiến hành thử.

- Sau 24 giờ, đọc giá trị MIC bằng mắt. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ mẫu thử thấp
nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn.

- Giá trị IC50 được tính toán theo công thức (6) dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ
TECAN như hình 29 bước sóng λ= 492 nm và phần mềm Raw data.
trong đó: là nồng độ ức chế 50%, là độ hấp thu của mẫu chứa vật liệu cần thử nghiệm, là
độ hấp thu của mẫu chứa chất kháng khuẩn biết trước nồng độ ức chế tối thiểu, là
độ hấp thu của mẫu không chứa chất kháng khuẩn.

- được xác định tại giếng có nồng độ thấp nhất có khả năng làm giảm 99,9% lượng vi khuẩn bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc.

Mẫu đối chứng dương: kháng sinh Ampicilin 10 mg/mL trong nước cho vi khuẩn Gram (+) và
Cefotaxim 10mg/mL trong nước cho vi khuẩn Gram (-).

Mẫu đối chứng âm: DMSO 5%.

Hình 20. Máy TECAN

9.2. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa

Địa điểm gửi mẫu: Phòng Sinh học ứng dụng – Viện Hóa học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ,
Phòng 601, 18A, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

Chuẩn bị mẫu thử: 1 mL cao trích có các nồng độ khác nhau (128, 32, 8, 2, 0,5 µg/mL) trong
DMSO5% cho vào mỗi ống nghiệm có chứa sẵn 4 mL dung dịch DPPH 1 µM trong MeOH, lắc đều.
Giữ yên dung dịch trong tối 30 phút ở 37 o C. Xác định độ hấp thu quang của dung dịch trên ở bước
sóng 517 nm.

% ức chế ( ) được tính theo công thức (7):

trong đó: là mật độ quang của mẫu không có chất có tính kháng oxy hóa, là mật độ quang của
cao trích.
Mẫu đối chứng dương: vitamin C 50 µg/mL trong MeOH.
Mẫu đối chứng âm: dung dịch DMSO 5%
9.3. Thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường

Địa điểm gửi mẫu: Phòng Sinh học ứng dụng – Viện Hóa học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ,
Phòng 601, 18A, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

Chuẩn bị mẫu thử: 1 mL cao trích đã được hòa tan trong đệm phosphat 0,01 M ở pH 7 với các nồng độ
khác nhau (100, 50, 25, 10 µg/ mL), thêm 100 µL enzym α-glucosidase 0,2 U/mL, lắc đều, ủ ở
37 C trong 5 phút. Sau đó, thêm 100 µL dung dịch nền (Saccharomyces cerevisae, p-nitrophenyl-α-D-
glucopyranoside (PNP-G 3 mM), lắc đều, tiếp tục ủ ở 37 C trong 15 phút, rồi thêm 1,5 mL dung dịch
Na2 CO 3 0,1 M. Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch tại bước sóng 401 nm.

% ức chế ( ) được tính theo công thức (8):

trong đó: là mật độ quang của mẫu không có chất ức chế, là mật độ quang của cao trích.

Mẫu đối chứng dương: axit tannic 10 mg/mL.

Mẫu đối chứng âm: đệm phosphat 0,01 M ở pH 7.

9.4. Thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:

- KB (Human epidermic carcinoma) – ung thư biểu mô;

- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) – ung thư gan;

- Lu-1 (Human lung carcinoma) – ung thư phổi;

- MCF-7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú.

Phương pháp thử gây độc tế bào được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) chứng nhận là phép thử
nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều
kiện in vitro.

Địa điểm gửi mẫu: Phòng Sinh học ứng dụng – Viện Hóa học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ,
Phòng 601, 18A, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy môi trường phù hợp, có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò
(FBS), và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO 2 , 37 C, độ ẩm 98%, vô trùng
tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác
nhau.

Phương pháp MTT

Chuẩn bị mẫu: Cao trích được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/mL; 32µg/mL; 8µg/mL; 2µg/mL;
0,5µg/mL. Bổ sung 200µL dung dịch tế bào ở nồng độ 3×104 tếbào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng)
trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho
Lu-1.

- Giếng điều khiển có 200 µL dung dịch tế bào 3×104 tế bào/mL.

- Ủ đĩa 96 giếng ở 37 C, 5% CO 2 trong 72 giờ.

Đọc kết quả: Sau 72 giờ, thêm 50 µL MTT (1mg/mL pha trong môi trường nuôi cấy không huyết
thanh) và ủ tiếp ở 37 o C trong 4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 µL DMSO lắc đều. Đo mật độ quang
của dung dịch ở bước sóng 540 nm trên máy TECAN.

% ức chế ( ) được tính theo công thức (9):

trong đó: là mật độ quang của mẫu điều khiển, là mật độ quang của cao trích.

F. Kết quả dự kiến

1. Các sản phẩm mềm

TT Tên sản phẩm Chỉ tiêu đánh giá (định lượng)

Quy trình tổng hợp polysaccharide và
Chi tiết từng công đoạn của quy trình để có
1 triterpenoidbằng kỹ thuật lưu chất siêu
thể đánh giá.
tới hạn.

Tối ưu hóa các thông số của kỹ thuật

Các thông số khảo sát ảnh hưởng đến hàm
tích ly siêu tới hạn để thu được hiệu
2 lượng và độ tinh khiết của các hoạt chất thu
suất và độ tinh khiết của sản phẩm tốt
được.
nhất.

Quy trình phân tích định lượng các hoạt

chất polysaccharide và triterpenoid

3 tổng thu được bằng UV-Vis và định Hàm lượng các hoạt chất đạt tối ưu
lượng  -glucan và GA-DM bằng
HPLC.

Đưa ra đánh giá, báo cáo về hàm lượng Đánh giá thông qua hàm lượng các hoạt chất
4
thu được polysaccharide và triterpenoid polysaccharide và triterpenoid đã tổng hợp
 giữa phương pháp đối chứng và kỹ được từ các quá trình mà nhóm đã thực hiện.
thuật trích ly siêu tới hạn.

Đưa ra số liệu cụ thể về hoạt tính kháng Số liệu IC50 , MIC, MBC về khả năng kháng
5
khuẩn khuẩn

Đưa ra số liệu cụ thể về hoạt tính kháng

6 Số liệu IC50 về khả năng kháng oxy hóa
oxy hóa

Đưa ra số liệu cụ thể về hoạt tính kháng

7 Số liệu IC50 về khả năng kháng tiểu đường
tiểu đường

Đưa ra số liệu cụ thể về hoạt tính kháng

8 Số liệu phần trăm khả năng ức chế (%I)
ung thư

2. Các sản phẩm cứng

Mức chất lượng Dự kiến số
Tên sản phẩm cụ thể và Chỉ tiêu Mẫu tương tự lượng/
TT chỉ tiêu chất lượng chủ đánh quy mô sản
yếu của sản phẩm (theo các tiêu chuẩn mới nhất) phẩm
giá(định
lượng) Trong nước Thế giới tạo ra

1 Polysaccharide Hàm lượng x x 20 mg

(%)

2 Triterpenoid Hàm lượng x x 20 mg

(%)

Tài liệu tham khảo

[1] Khánh N. D, “Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi nấm Ganoderma lucidum,” Trường
cao đẳng kinh tế - công nghệ - Bộ môn Công nghệ sinh học, Luận văn đại học, 2009.
[2] Yuen, J. W. & Gohel, M. D. I., “Anticancer effects of Ganoderma lucidum: a review of
scientific evidence,” Nutrition and cancer, 53 (1), 11-17, 2005.
[3] Ngô Vân Thu và Trần Hùng, Dược liệu học - tập 1, NXB Y học, 2011.
[4] Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 2006.
[5] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, 1999.
[6] Nguyễn Thị Chính, Vũ Thành Công, Lý Lan Phương, Đinh Hồng Duyên, Phạm Thùy Linh,
Đặng Xuyến Như và Dương Hồng Dinh, “Nghiên cứu một số thành phần và hoạt chất sinh học
của nấm Linh chi Garnoderma Lucidum muôi trồng ở Việt Nam,” Hội nghị khoa học nữ lần
thứ 9, Hà Nội, 2004.
[7] Toledo R. C. C., Carvalho, M. A., Lima, L. C. O., de Barros Vilas-Boas, E. V., & Dias, E. S
 “Measurement of β-glucan and other nutritional characteristics in distinct strains of Agaricus
subrufescens mushrooms.,” African Journal of Biotechnology, 12 (43), 6203-6209, 2013.
[8] Cör. D., “Two-stage extraction of antitumor, antioxidant and antiacetylcholinesterase
compounds from Ganoderma lucidum fruiting body,” The Journal of Supercritical Fluids, 91,
53-60, 2014.
[9] Hung, W. T., Wang, S. H., Chen, C. H., & Yang, W. B. “Structure determination of β-glucans
from Ganoderma lucidum with matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass
spectrometry”, 13(8), 1538-1550, 2008.
[10] Cheng, P.G., “Polysaccharides-rich extract of Ganoderma lucidum (MA Curtis: Fr.) P. Karst
accelerates wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats.,” Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine, 2013.
[11] Jiezhong Chen & Kenneth Raymond, “Beta-glucans in the treatment of diabetes and associated
cardiovascular risks,” Vascular Health and Risk Management, 4(6), 1265–1272, 2008.
[12] Chen J & Seviour R., “Medicinal importance of fungal beta-(1–3), (1–6)-glucans.,” Mycol Res,
111, 635–652, 2007.
[13] Lin, M., Yu, Z., Wang, B., Wang, C. H. C. H., Weng, Y., & Koo, M. A. L. C. O. L. M. “
Bioactive constituent characterization and antioxidant activity of ganoderma lucidum extract
fractionated by supercritical carbon dioxide,” Sains Malaysiana, 44(12), 1685-1691, 2015.
[14] Wu, G. S., Guo, J. J., Bao, J. L., Li, X. W., Chen, X. P., Lu, J. J., & Wang, Y. T. “ Anti-cancer
properties of triterpenoids isolated from Ganoderma lucidum,” Expert opinion on
investigational drugs, 22(8), 981-992, 2013.
[15] Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ, NXB ĐHQG TP. HCM,
2007.
[16] Vương Ngọc Chính, Hương liệu mỹ phẩm, NXB ĐHQG TP. HCM, 2012.
[17] Alzorqi, I., Singh, A., Manickam, S., & Al-Qrimli, H. F. “Optimization of ultrasound assisted
extraction (UAE) of β-d-glucan polysaccharides from Ganoderma lucidum for prospective
scale-up.,” Resource-Efficient Technologies, 3(1), 46-54, 2017.
[18] Dam Sao Mai, T.T.T. Anh, Tu Thai Binh & Nguyen Dac Anh, “Comparison of the effect of
using cellulase, microwave and ultra-sonication on crude polysaccharides extraction from
Vietnamese Lingzhi (Ganoderma lucidum),” Journal of Food and Nutrition Sciences, 3(1), 49-
53, 2015.
[19] Nguyễn Đức Lượng và Huỳnh Ngọc Oanh, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia Tp.
HCM, 2004.
[20] Abbas K.A, Abdulamir A.S. “A review on supercritical fluid extraction as new nalytical
method,” American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 4(4), 345-353, 2008.
[21] Sapkale, “Supercritical fluid extraction,” Int. J. Chem. Sci, 8(2), 729-743, 2010.
[22] Mukhopadhyay, M., “Natural extracts using supercritical carbon dioxide.”, CRC press., 2000.
[23] Mi H., “Công nghệ trích ly sử dụng CO2 siêu tới hạn nâng giá trị quả gấc,” 2014.
[24] Sánchez-Vicente, Y., Cabañas, A., Renuncio, J. A., & Pando, C., “Supercritical fluid
extraction of peach (Prunus persica) seed oil using carbon dioxide and ethanol. The Journal of
Supercritical Fluids,” The Journal of Supercritical Fluids, 49(2), 167-173, 2009.
[25] Azmir, J., Zaidul, I. S. M., Rahman “Techniques for extraction of bioactive compounds from
 plant materials: a review,” Journal of Food Engineering, 117(4), 426-436, 2013.
[26] Phan Tại Huân, Phạm Đức Toàn, Kha Chấn Tuyền, “Gấc và công nghệ sản xuất tiềm năng,”
Sở khoa học và công nghệ TP. HCM , 2014.
[27] Nguyễn Kim Thiên Phúc, “Trích ly CO 2 siêu tới hạn các hợp chất polyphenol từ lá cây lược
vàng”, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa, TP. HCM, 2015.
[28] Askin, R., Sasaki, M., & Goto, M. “Supercritical Fluid Extraction of Bioactive Compounds
from Ganoderma lucidum,” Proceedings of International Symposium on Eco Topia Sci,
ISETS07, 2007.
[29] Li, L., Guo, H. J., Zhu, L. Y., Zheng, L., & Liu, X., “A supercritical-CO2 extract of
Ganoderma lucidum spores inhibits cholangiocarcinoma cell migration by reversing the
epithelial–mesenchymal transition,” Phytomedicine, 23(5), 491-497, 2016.
[30] Trần Tứ Hiếu, Phân tích trắc quang Phổ hấp thụ UV-Vis, ĐH QG Hà Nội, 2003.
[31] Phạm Luận, Phương pháp phân tích quang phổ phân tử, NXB. Khoa học Hà Nội, 2014.
[32] Từ Vọng Nghi và Trần Tứ Hiếu, Cơ sở lý thuyết Hóa phân tích, NXB. Khoa học kỹ thuật Hà
Nội, 1998.
[33] Phạm Luận, Phương pháp phân tích sắc kí và Tách chiết, NXB. Bách khoa Hà Nội, 2014.
[34] Bùi Xuân Vững, Cơ sở phân tích sắc kí, NXB. Sư phạm Đà Nẵng, 2012.
[35] Nguyễn Thị Liên Hạnh và Huỳnh Hồng Quang, Interviewees, Tiêu chảy nhiễm khuẩn do vi
khuẩn đường ruột.
[36] Barret EL & Clark MA,, “The phs gene and hydrogen sulfide production by Salmonella
typhimurium,” J Bacteriology, 169(6), 2391–2397, 1987.
[37] Tracey A. Taylor & Chandrashekhar G. Unakal, Staphylococcus Aureus, 2017.
[38] Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm,
NXB. Giáo dục, 2007.
[39] Vũ Minh Hoàn, “Nghiên cứu tác dụng của cao lỏng vị quản khang trên bệnh nhân viêm dạ dày
mạn tính Helicobacter Pylori dương tính,” ĐH Y Hà Nội, 2014.
[40] Krishnaiah , “A review of the antioxidant potential of medicinal plant species,” Food and
Bioproducts Processing, 89, 217 – 233, 2011.
[41] Singh, “In vitro methods of assay of antioxidant”, Food Reviews International, 24(4), 392 –
415, 2008.
[42] YouGuo, C., ZongJi, S., & XiaoPing, C., “Modulatory effect of Ganoderma lucidum
polysaccharides on serum antioxidant enzymes activities in ovarian cancer rats”, Carbohydrate
Polymers, 78(2), 258-262, 2009.
[43] Kao, P. F., Wang, S. H., Hung, W. T., Liao, Y. H., Lin, C. M., & Yang, W. B.,“Structural
Characterization and Antioxidative Activity of Low-Molecular-Weights Beta-1,3-Glucan from
the Residue of Extracted Ganoderma lucidum Fruiting Bodies”, Journal of Biomedicine and
Biotechnology, 2011, 1-8, 2012.
[44] Darija Cör, Željko Knez và Maša Knez Hrnčič , “Antitumour, Antimicrobial, Antioxidant and
Antiacetylcholinesterase Effect of Ganoderma Lucidum Terpenoids and Polysaccharides: A
review”, Molecules, 23(3), 2-21, 2018.
[45] Poretsky, L., “Principles of Diabetes Mellitus”, Springer, 2010.
[46] “Association, American Diabete, American Diabetes Association Complete Guide To
 Diabetes”, 2005.
[47] “International Diabetes Federation. Diabetes and cardiovascular disease. Brussels, Belgium:
International Diabetes Federation”, 2016.
[48] National Diabetes Data Group, “Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other
categories of glucose intolerance”, Diabetes Care, 28(12), 1039-1057, 1979.
[49] IDF Diabetes Atlas, “International Diabetes Federation”, vol. 7th , 2015.
[50] Lương Ngọc Khê, Báo động: 70% người mắc tiểu đường ở Việt Nam chưa được phát hiện
bệnh, 2017.
[51] S.L. and P.J. Bingley Thrower, "What is type 1 diabetes?", Medicine, vol. 42, no. 12, pp. 682-
686, 2014.
[52] Ma, H. T., Hsieh, J. F., & Chen, S. T., “Anti-diabetic effects of Ganoderma lucidum”,
Phytochemistry, 2015.
[53] N. Haque, U. Salma, T.R. Nurunnabi, M.J. Uddin, M.F.K. Jahangir, S.M.Z. Islam & M.
Kamruzzaman, “Management of Type 2 Diabetes Mellitus by Lifestyle, Diet and Medicinal
Plants”, Functional Foods in Health and Disease, 2011.
[54] Megha G. Chaudhari, Bhoomi B. Joshi & Kinnari N. Mistry, “In vitro anti-diabetic and anti-
inflammatory activity of Stem Bark of Bauhina Purpurea”, Bulletin of Pharmaceutical and
Medical Sciences (BOPAMS), 1(2), 139-150, 2013.
[55] Ramachandran, S., Rajasekaran, A., & Adhirajan, N., “In Vivo and In Vitro Antidiabetic
Activity of Terminalia paniculata Bark: An Evaluation of Possible Phytoconstituents and
Mechanisms for Blood Glucose Control in Diabetes”, ISRN Pharmacol, 2013, 1-10, 2013.
[56] Ferlay J1, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM, Forman D &
Bray F, “Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in
GLOBOCAN 2012.”, Int J Cancer, 136(5), 2014.
[57] Nguyễn Chấn Hùng, Lê Hoàng Minh, Đặng Huy Quốc Thịnh và Phạm Xuân Dũng, “Giải
quyết gánh nặng ung thư cho TP. HCM”, Nghiên cứu Y học, 12(4), i-vii, 2008.
[58] D.Ngân, “94.000 người chết vì ung thư mỗi năm,” Báo mới, Tp.Hồ Chí Minh, 26/05/2017.
[59] Ibrahim Alzorqi, Ajit Singh, Sivakumar Manickam and Haidar F. Al-Qrimli , “Optimization of
ultrasound assisted extraction (UAE) of β-D-glucan polysaccharides from Ganoderma lucidum
for prospective scale-up”, Resource-Efficient Technologies , vol. 3, pp. 46-54, 2017.
[60] R. Byerrum & D. Clarke, Antibiotics & chmotherapy, 1957 .
[61] Xin Meng, Hebin Liang & Lixin Luo, Antitumor polysaccharides from mushrooms: A review
on the structural characteristics, antitumor mechanisms and immunomodulating activities,
2016, pp. 1-30.
[62] M.Zhang, S.W. Cui, P.C.K Cheung và Q.Wang, “Antitumor polysaaccarides from mushrooms:
a review on their isolation process, structural characteritics and antitumor activity”, Trends in
Food Science & technology , tập 18, pp. 4-19, 2007.
[63] Mizuno T., Saito H. và Nishitoba T., “Antitumor-active substances from mushrooms”, Food
Research International , tập 11, pp. 23-61, 1995.
[64] Kawagishi H., Kanao T. và Inagaki R, “Formulation of a potent antitumor (1-6)-beta-D-
glucan-protein complex from Agaricus blazei fruiting bodies and antitumor activity of the
resulting products”, Cacbohydrate polymer , tập 12, pp. 393-404, 1990.
[65] Wu, G. S., Guo, J. J., Bao, J. L., Li, X. W., Chen, X. P., Lu, J. J., & Wang, Y. T., “Anti-cancer
properties oftriterpenoids isolated from Ganoderma lucidum -- a review”, Expert Opin.
Investig. Drugs, tập 22, số 8, pp. 981-992, 2013.
[66] Wu, G. S., Lu, J. J., Guo, J. J., Li, Y. B., Tan, W., Dang, Y. Y., ... & Wang, Y. T., “Ganoderic
acid DM, a natural triterpenoid, induces DNA damage, G1 cell cycle arrest and apoptosis in
human breast cancer cells”, Fitoterapia, tập 83, pp. 408-422, 2012.
[67] Johnson, B. M., Doonan, B. P., Radwan, F. F., & Haque, A., “Ganoderic Acid DM: An
Alternative Agent for the Treatment of Advanced Prostate Cancer”, Open Prost Cancer J, tập
3, pp. 78-85, 2010 .
[68] Lê Thị Tú Anh, “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài mít lá đen
Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu”, Đại học KHTN Hà Nội, 2012.
[69] ATCC, “MTT cell proliferation assay”, ATCC*30-1010K.
[70] Voigt, W., “Sulforhodamine B Assay and Chemosensitivity”, Methods Mol Med., tập 110, pp.
39-48, 2005.
[71] Nguyễn Hữu Hiếu, Huỳnh Kỳ Phương Hạ, Trịnh Thị Cát Hà và Nguyễn Trọng Huy, “Ứng
dụng kĩ thuật lưu chất siêu tới hạn để trích ly dầu mù u”, Tạp chí khoa học và công nghệ, tập
52, số 5B, pp. 441-447, 2014.
[72] Nguyễn Hữu Hiếu, Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long, Võ Viết Thắng, Nguyễn Di Sơn và
Nguyễn Thị Thanh Hương, “Ứng dụng kĩ thuật lưu chất siêu tới hạn để trích ly dầu hạt neem”,
Tạp chí Hóa học, tập 53, số 6c1,2, pp. 295-299, 2015.