THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ACID LACTIC TỪ

Lactobacillus acidophilus VỚI CÔNG SUẤT 200 TẤN/ NĂM

Chương 1: TỔNG QUAN
1. Tổng quan về acid lactic
1.1. Cấu tao, cấu trúc, tính chất vật lí
Acid lactic (acid 2-hydroxypropionic) hay còn gọi là axit sữa là acid tồn tại rộng rãi
trong tự nhiên, được tìm thấy ở người, động vật, thực vật và vi sinh vật. Acid lactic là
một dạng hợp chất hữu cơ sinh học được sản sinh ra từ quá trình oxy hóa glucid yếm khí
hay còn gọi là quá trình đường phân (glycolysise). Quá trình này là một dạng trao đổi
năng lượng rất phổ biến có trong cơ thể sinh vật. Nó lần đầu tiên được phát hiện bởi nhà
hóa học Thụy Điển Carl Wilhelm Scheele vào năm 1780 ở trong sữa chua. Acid lactic
được chấp nhận là một sản phẩm của quá trình lên men vào năm 184. Có công thức hóa
học là CH3CHOHCOOH, là một acid hữu cơ có 3 cacbon: trong đó, một nguyên tử
cacbon nằm trong nhóm cacboxyl, một nguyên tử nằm trong nhóm methyl CH3 và một
nguyên tử ở giữa có chứa nhóm hydroxyl .
Acid lactic khan tinh khiết là những hạt tinh thể rắn màu trắng có nhiệt độ nóng
chảy thấp. Đối lập với các acid khác, acid lactic không bay hơi, không mùi, không màu
và có vị acid trung bình. Hàm lượng cacbon, hydrogen, và oxygen trong phân tử tương
ứng là 40%, 6.71% và 53.29%. Tên hóa học: 2-hydroxypropanoic acid
Công thức thô: C3H6O3
Công thức hóa học: CH3 -CHOH-COOH
Trọng lượng phân tử: 90.08g/mol
Điểm nóng chảy:
- L : 530C
- D : 530C
- D/L : 530C
Điểm sôi: 1220C, 12mmHg
Đơn vị tính: Hàm lượng acid lactic có trong huyết tương được tính bằng đơn vị
mg/dl (mg%; mg/100ml), mMol/lít. Để chuyển đổi mg% thành mMol/lít thì nhân với
0,11.
 Trong công thức cấu tạo phân tử của acid lactic có một cacbon bất đối nên chúng có
hai đồng phân quang học là aicd D-lactic và axit L-lactic. Hai đồng phân quang học này
có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực
ánh sáng, một sang phải và một sang trái. Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn
khác nhau

Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của hai đồng phân axit lactic: acid L(+)-lactic trái,

acid D(-)-lactic phải

Acid L(+)-lactic được chuyển hóa hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng
hợp glycogen. Acid L-lactic ở dạng tinh thể, chúng có khả năng tan trong nước, tan trong
cồn, tan trong ether, không tan trong 𝐶𝐻𝐶𝑙3 , nhiệt độ nóng chảy 28ºC. Acid D(-)-lactic
được chuyển hóa ít hơn và phần không chuyển hóa sẽ được bài tiết dưới dạng urein. Sự
hiện diện của acid không được chuyển hóa trong ống tiêu hóa sẽ gây tình trạng nhiễm
acid trong trẻ sơ sinh. Acid D- lactic ở dạng tinh thể, tan trong nước, tan trong cồn, nhiệt
độ nóng chảy 28ºC . Nếu acid D-lactic và acid L-lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ
50:50 người ta gọi là hỗn hợp raxemic. Hỗn hợp này được kí hiệu là acid D/L-lactic. Tuy
nhiên trong quá trình lên men không có hỗn hợp có tỉ lệ lý tưởng này mà ta chỉ có thể thu
được khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. Acid D/L lactic là dịch lỏng dạng tinh thể, tan trong
nước, cồn, không tan trong chloromethane𝐶𝐻3 𝐶𝑙, nhiệt độ nóng chảy 16,8ºC, nhiệt độ sôi
122ºC . Acid lactic có khối lượng phân tử là 98.08, không màu, có mùi nhẹ. Hai dạng
đồng phân quang học này có tính chất vật lý khác nhau. Các nhóm hydroxyl và carboxyl
của acid lactic cho phép acid lactic có một khoảng rộng các phản ứng hóa học. Acid
lactic có pKa khoảng 3.86 ở 25ºC. Nó là một acid trung bình có thể phản ứng với các kim
loại hoạt động để tạo khí hydro và muối kim loại. Acid lactic phản ứng với muối cyanide
tạo thành khí hydro xyanua, phản ứng với muối diazo, dithiocarbanate, isocyanate,
mercaptan, nitrit, sulfit, thiosulfate, sulfua dioxide (𝑆𝑂2 ), carbonate tạo khí độc hoặc dễ
cháy. Acid lactic có thể tạo thành dilactide qua phản ứng ester hóa với rượu và chưng cất
xúc tác, tạo ra glycol bằng phản ứng hydrogenolysis và tạo ester lactate bằng phản ứng
khử nước xúc tác . Từ những phản ứng trên, acid lactic có nhiều ứng dụng trong công
nghiệp và sản xuất. Một vài tính chất vật lý và hóa học của axit lactic được trình bày
trong bảng sau:
 Bảng 1. 2: Tính chất vật lý và hóa học của axit lactic

Tính chất D-lactic L-lactic D, L-lactic

Khối lượng phân tử 90,08 90,08 90,08

Nhiệt độ nóng chảy 52,8 53,0 16,8 [5]

(oC)
Nhiệt độ sôi (oC) 103 122

Hằng số phân ly Ka 1,90*10−4 1,38*10−4

ở 250 C
pKa ở 250 C 3,83 3,79 3,73
Quay quang học -2,5 +2,5

Ứng dụng của acid lactic

Ứng dụng của acid lactic trong công nghệ thực phẩm:
Sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa: Các sản phẩm lên men từ sữa như: sữa chua,
phomat, bơ,...Các quá trình chuyển hóa trong sản xuất đều làm cho sản phẩm thêm giàu
dinh dưỡng và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm
Lên men sữa chua: Lên men sữa chua làm tăng giá trị dinh dưỡng có tác dụng trị
bệnh đường ruột giúp ăn ngon dễ tiêu hóa bảo quản sữa tươi lâu hơn khỏi bị hư hỏng.
Nguyên tắc làm sữa chua là do sự phát triển của vi khuẩn lactic làm pH giảm mạnh,
cazein trong sữa bị đông tụ. Sữa từ dạng lỏng chuyển sang dạng keo sệt và có mùi vị
thơm ngon. Quá trình làm sữa chua người ta phải sử dụng hai chủng vi khuẩn lactic đồng
hình và dị hình. Vi khuẩn lactic đồng hình lên men nhanh làm giảm pH, vi khuẩn lactic dị
hình lên men chậm và tạo thành mùi thơm đặc trưng của sữa chua
Sản xuất phomat: để sản xuất phomat người ta dùng enzyme đông kết thu cazein
trong sữa, sau đó tiếp tục cho lên men với nồng độ muối loãng. Tuỳ loại phomat mà trong
quá trình ủ chín người ta sử dụng các loài vi sinh vật khác nhau. Các loại vi sinh vật
thường được sử dụng để làm chín phomat là: vi khuẩn propionic, nấm mốc..
 Sản xuất dưa chua: Trong rau quả vi khuẩn sẽ phát triển tạo ra acid lactic và acid
acetic cùng với một sốchất hữu cơ khác. Các acid hữu cơ này làm giảm pH của dịch
chống lại hiện tượng gây thối rau quả. Bên cạnh đó làm tăng hương vị của khối ủ chua
rau quả. Vì vậy sản xuất sữa chua cũng như muối chua rau quả là quá trình vừa mang ý
nghĩa chếbiến vừa mang ý nghĩa bảo quản.
Sản xuất tương: Trong sản xuất tương quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho
sản phẩm và tăng hương vị cho sản phẩm.
Muối chua rau quả: Muối chua rau quả nhằm hai mục đích cơ bản sau đây: bảo
quản nguyên liệu và làm tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan của rau quả. Nguyên
tắc để muối chua rau quả là tạo điều kiện để phát triển vi khuẩn lactic đồng thời hạn chế
tác dụng của vi khuẩn gây thối rữa. .
Ứng dụng trong sản xuất các loại sữa bột và bột giàu canxi:
Bổ sung Lactate calcium vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh
nướng,..
Tính năng Lĩnh Vực ứng dụng Ứng dụng cụ thể
Tác nhân acid hóa Bánh kẹo Kẹo cứng
Hương liệu Bánh Các loại bánh mì
Thức uống Thức uống có ga
Sản xuất bia Acid hóa bia/xử lý quá
trình nghiền
Thực phẩm cho bé Sữa cho bé
Sản xuất sữa Phomat
Khử trùng Các loại thịt Xúc xích,da,giăm bông
Hương liệu Trái cây đóng hộp, các loại rau, dưa muối

Ứng dụng y học hiện đại

Patterning Poly ma trận đa cấu trúc (acid l-lactic) để điều khiển phân phối và chức
năng phân tử sinh học
Thao tác chính xác của phân phối và chức năng phân tử sinh học thông qua tương
tác ma trận sinh khối là rất quan trọng và thách thức đối với kỹ thuật mô và y học tái
tạo. Là một ma trận sinh học nổi tiếng, các sợi điện âm thường thiếu độ phức tạp không
gian độc nhất so với các đối tác tự nhiên của chúng trong cơ thể và do đó không thể cung
cấp đầy đủ các tín hiệu điều hòa cho các phân tử sinh học

Các lĩnh vực khác

 Mỹ phẩm Dưỡng ẩm, kích hoạt da, điều khiển độ
pH, kháng khuẩn
Công nghiệp Hỗn hợp gia vị nguyên chất, mạ kim, xi
mạ hóa chất, nhựa tổng hợp, chất tẩy rửa,
sản xuất phiện, sử dụng trong sản xuất
vàng, tác nhân tạo bọt trong vật liệu cách
nhiệt, thuộc da, thức ăn gia súc, thuốc lá,
…
Được phẩm Bổ sung khoáng chất, Natri
Công nghiệp dẻo Chuỗi acid lactic

1.2. Nguồn sản xuất aicd lactic

Acid lactic là hợp chất hữu cơ thu được bằng phương pháp lên men do tác chất lên men
chủ yếu là vi sinh vật. Quá trình lên men acid lactic được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn
lactic.
2. Tổng quan về lên men acid lactic
2.1. Đối tượng vi sinh vật
Lên men lactic là quá trình chuyển hoá đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật, điển
hình là vi khuẩn lactic.
Các vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong nhiều loại thực phẩm cổ truyền
như sữa chua, nem chua, dưa rau quả…
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacterium. Nhóm vi khuẩn này gồm nhiều loại khác
nhau về hình dạng, sinh lí và khả năng lên men. Do các vi khuẩn khác mhau khi tham gia
cơ chế khác nhau tạo ra các sản phẩm chính, phụ khác nhau nên chúng được chia làm hai
loại: đồng hình và dị hình
Đặc điểm chung của nhóm vi khuẩn lên men lactic:
- Thuộc nhóm đơn bào, kích thước nhỏ (từ 0,3 - 1µm), hình cầu, que, bầu dục.
- Nhiệt độ từ 10- 500C
- pH từ 4,5 - 6,8
- Hoạt động phân giải protein kém
- Vi khuẩn lactic là vi sinh vật kỵ khí bắt buộc. Do đó, trong thực tế khi nồng độ
oxygen thấp thì hoạt động sống được duy trì bình thường, nhưng không bắt
buộc luôn phải như vậy
 - Vi khuẩn lactic có các nhu cầu dinh dưỡng phức tạp

Lên men lactic gồm có lên men đồng hình và lên men dị hình Lên men đồng hình:
Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị khử carbon
chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2, và acetoin. Lượng sản phẩm phụ tạo ra phụ thuộc
sự có mặt của oxy.
Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đồng hình như: Lactobacterium
casei, Lactobacterium cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium delbruckii…
Lên men đồng hình có thể được chuyển sang dạng dị hình khi điều kiện lên men
thay đổi. Lên men dị hình: Chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn có
các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm, lượng sản phẩm phụ
tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện
ngoại cảnh. Acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân huỷ, acid suecinic
20%, rượu etylic 10%, acid acetic 10% và các loại khí gần 20%.
Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men dị hình như: Bacterium coli,
Bacterium aeogenes, Bacterium pentoacetium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
brevis
Trong các chủng vi sinh vật được sử dụng lên men lactic thì chủng Lactobacillus
acidophilus được sử dụng nhiều nhất
a. Giới thiệu về chủng Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus (L.acidophilus ) là loại probiotic thông dụng nhất hay là
loại vi khuẩn có ích. Loại vi khuẩn này có lợi cư trú tại ruột, âm đạo để bải vệ chống lại
sựu xâm nhập hay gia tăng của các sinh vật “ có hại ” có thể gây bệnh. Đây là cơ chế hoạt
động hoàn hảo.
Lactobacillus acidophilus thuộc họ vi khuẩn Lactic, chi Lactobacillus, nhiều chủng
vi khuẩn thuộc họ Lactic đã được nghiên cứu và có những ứng dụng thiết thực vào cuộc
sống. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus dạng hình roi, siêu nhỏ, không có khả năng
sinh bào tử, thích hợp để sinh trưởng trong nhiệt độ 37 độ C, có khả năng chuyển hóa
đường Lactose.
Lactobacillus acidophilus có thể sống trong đường ruột sinh vật trong một thời gian
ngắn. Có thể tồn tại trong dịch vị 2 ngày, tồn tại trong dịch mật 5 ngày, và sống 8 ngày
trong dịch tràng.
L. acidophilus phát triển ở pH thấp (<3,5), điều kiện yếm khí và chỉ trải qua quá
trình lên men. L. acidophilus thiếu cytochromes, porphyrin và enzyme hô hấp và kết quả
là không thể trải qua bất kỳ quá trình phosphoryl oxy hóa hoặc hô hấp. Bởi vì chúng sử
dụng đường làm chất nền cho quá trình lên men, chúng sống trong môi trường có lượng
đường cao, chẳng hạn như đường GI ở người và động vật. Cụ thể hơn, L. acidophilus là
homofermentative, có nghĩa là sản phẩm phụ duy nhất mà nó hình thành từ quá trình lên
men là acid lactic. Đối với mỗi một phân tử glucose trải qua quá trình lên men trong L.
acidophilus , năng suất là hai ATP. Do đó, các vi khuẩn đồng nhất phải dị hóa một lượng
lớn chất nền để tạo ra đủ năng lượng cho sự tăng trưởng. Ngoài glucose, L. acidophilus
sử dụng aesculin, cellobiose, galactose, lactose, maltose, salicin, sucrose và trehalose để
lên men.
Lactobacillus acidophilus là một trong hai lợi khuẩn quan trọng nhất của đường
ruột, có thể tồn tại trong dịch vị hai ngày, tồn tại trong dịch mật 5 ngày và sống 8 ngày
trong dịch tràng. Lactobacillus acidophilus thường có mặt ở ruột non và giúp giữ cân
bằng hệ vi sinh vật đường ruột được xem như là một chất kháng sinh tự nhiên chống các
vi sinh vật có hại.
Lactobacillus acidophilus có thể kháng 40 loài kháng sinh,có thể tổng hợp các
vitamin. Đây là vai trò sinh lý rất quan trọng của sự sống. Lactobacillus acidophilus có
khả năng sản sinh ra các chất diệt khuẩn acid lactic. Tuy thuộc nhóm vi khuẩn
Lactobacillus do Lactobacillus acidophilus cũng có khả năng ức chế sinh trưởng của vi
khuẩn gây bệnh đường ruột như vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng ngăn ngừa tiêu
chảy do kháng sinh gây nên. Giúp cho việc sinh ra hay hấp thu vitamin B, giảm
cholesterol trong máu và một số độc tố.
Ví dụ, sự phân rã của thức ăn do vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sản xuất ra
acid lactic, hydrogen peroxide… tạo ra sự phản ứng của môi trường chống lại các vi sinh
vật không ưa thích. Lactobacillus acidophillus cũng sản xuất ra lactase, loại enzyme có
khả năng phân hủy đường sữa (latose) thành các loại đường đơn giản.Những người có cơ
địa không dung nạp lactose thì không thể sản xuất ra loại enzyme này.Vì lý do đó, thực
phẩm bổ sung Lactobacillus acidophilus có thể có lợi chi những đối tượng này.
Lactobacillus đã được dùng trong nhiều năm để điều trị bệnh ỉa chảy chưa có biến chứng,
đặc biệt do vi khuẩn chỉ ở ruột bị biến đổi do dùng kháng sinh.
b. Các loại thông số nuôi cấy (thông số nuôi cấy, thông số môi trường, nhiệt độ nuôi
cấy).
Để khảo sát quá trình lên men acid lactic bởi Lactobacillus acidophilus tùy thuộc
vào các loại sản phẩm của quá trình lên men thường là sinh khối của vi sinh vật, sản
phẩm trao đổi chất hoặc các loại enzyme sử dụng cho các chuyển hóa sinh hóa khác. Tùy
thuộc vào loại sản phẩm, loại sinh vật, loại cơ chất, động cơ của quá trình và các phương
pháp cũng sẽ khác nhau và cụ thể là các loại thông số sau đây
Thông số nuôi cấy:
 Nuôi cấy gián đoạn: khi vi sinh vật được nuôi cấy gián đoạn quá trình sinh trưởng
và phá triển của lactobacillus casei theo các pha.
- Pha lag: Pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy chô đến khi vi sinh vật đạt được độ
sinh trưởng cực đại. Trong pha này thì vi sinh vật chưa phân chia mạnh, nhưng
thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt
- Pha log:Vi sinh vật sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, sinh khối vi sinh vật
tăng theo hàm mũ:
𝑡
𝑁 = 𝑁0 𝛼
𝑇
 N0: mật độ vi sinh vật ban đầu.
 T: thời gian thế hệ α, hệ số (1 < α ≤ 2)
 T: thời gian nuôi cấy
- Pha ổn định: các vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh
ra bằng số tế bào chết đi, tế bào giữu vững được sự ổn định về kích thước và
khối lượng => lượng sinh khối ổn định
- Pha suy vong: lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa
Nuôi cấy liên tục: Trong quá tình lên men sẽ có hai quá trình ảnh hưởng tới lượng
sinh khối vi sinh vật có trong thiết bị lên men, quá trình tháo liệu sản phẩm và quá trình
sinh trưởng của vi sinh vật
Xét cân bằng vật chất của thiết bị lên men khi hai trạng thái này độc lập với nhau.
Vi sinh vật bị lấy ra khỏi bình nuôi cấy với vận tốc
𝑑𝑥 𝐹
𝑣 − 𝑣𝑜 = = = 𝐷𝑋
𝑑𝑡 𝑉𝑋
 X: mật độ tế bào (g/l)
 D: tốc độ pha loãng (tốc đọ cấp môi trường lên thể tích bình nuôi)
Tuy nhiên cả hai quá trình diễn ra đông thời nên ta có sự biến thiên sinh khối tảo
Vận tốc biến thiên sinh khối

𝑑𝑥
𝑉= = (µ − 𝐷 )
𝑑𝑡
Thông số của canh trường thường cài đặt là: mật độ tế bào (xác định bằng cách đo
độ dục của canh trường nuôi cấy), nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm. Nếu các thông số
hoạt động có quan hệ phụ thuộc chặt chẽ với nhau thì cả hệ thống hoạt động độc lập với
thời gian
 Nhiệt độ nuôi cấy: môi trường nuôi cấy giống đem vào tủ ủ ở nhiệt độ 37oC trong
24h nhằm tăng sinh khối.
2.2. Cơ chế lên men
Phương trường tóm tắt của quá trình lên men acid lactic :
C6H12O6 2 C3H6O3 + 136Kj(32,4 lkcal)
Quá trình lên men axit lactic là quá trình trao đổi chất nhờ đó glucose và các loại
đường 6-carbon khác (cũng như disaccharides của các loại đường 6-carbon, ví
dụ: sucrose hoặc lactose) được chuyển thành năng lượng tế bào và chất chuyển hóa
lactate, là axit lactic trong dung dịch. Nó là một phản ứng lên men kỵ khí xảy ra ở một số
vi khuẩn và tế bào động vật, chẳng hạn như các tế bào cơ.
Nếu oxy có trong tế bào, nhiều sinh vật sẽ bỏ qua quá trình lên men và trải qua quá
trình hô hấp tế bào; tuy nhiên, các vi sinh vật kỵ khí có cấu trúc sẽ lên men và trải qua sự
hô hấp khi có oxy. Đôi khi ngay cả khi oxy có mặt và chuyển hóa hiếu khí đang xảy ra
trong ti thể, nếu pyruvate đang xây dựng nhanh hơn nó có thể được chuyển hóa, thì quá
trình lên men sẽ xảy ra.
Lactate dehydrogenase xúc tác sự biến đổi của pyruvate và lactate với sự tương tác
đồng thời của NADH và NAD+. Trong quá trình lên men homolactic, một phân tử
glucose cuối cùng được chuyển thành hai phân tử axit lactic. Ngược lại, quá trình lên
men dị thể tạo ra carbon dioxide và ethanol ngoài axit lactic, trong quá trình gọi là đường
phosphoketolase.