DNA ‫זיהוי מוטציות ב‬

DNA is the hereditary material •

passed on from generation to
generation.
‫
שימוש באנזימי‬
DNA is made up of four • ‫רסטריקציה‬
nucleotides: A, C, G, and T.
A always pairs with T. • PCR ‫
שימוש ב‬
C always pairs with G. •
The two strands of DNA are in an •
‫
שימוש בסמנים‬
antiparallel configuration. ‫פולימורפיים‬
Two complementary DNA strands •
will separate when heated, and ‫
ריצוף‬
will spontaneously pair together
again (hybridize) when cooled.
 Electrophoresis Equipment

‫ספק כוח‬,

‫המיכל‬ ‫מכסה‬

Electrical leads


‫
המגש‬
‫
המסרקים‬
‫המגש והמסרקים‬
‫הכנת המערכת‬
‫הכנת ה ג'ל‬
Buffer

‫הרתחה‬

Agarose
Agarose Buffer Solution
 ‫‪ DNA‬הינו מולקולה טעונה שלילית‬
‫כשנשים ‪ DNA‬בשדה חשמלי הוא ינוע לכיוון הקוטב החיובי )האנודה(‬

‫תפקידו של האגרוז הוא לאפשר את התנועה המדורגת של ה ‪ DNA‬כשהמהירות היא תלויה‬

‫בגודלו‬
‫‪H‬‬ ‫‪O2‬‬
‫‬ ‫‬

‫
‪DNA‬‬

‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬

‫‪Power‬‬
 ‫גורמים הקובעים את קצב הנדידה של ה ‪DNA‬‬

‫עוצמת השדה‪ ,‬טיב ה ‪ ,buffer‬צפיפות האגרוז‪,‬‬

‫גודל ה ‪DNA‬‬

‫‪DNA‬‬

‫‪small‬‬
‫‪large‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪+‬‬

‫‪Power‬‬
 DNA Ladder Standard
-

12,000 bp

5,000

DNA
migration
2,000

1,650

1,000

850

650

500

400

300

200
+
100

Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel

makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs.
 DNA ‫זיהוי מוטציות ב‬

DNA is the hereditary material •

passed on from generation to
generation.
‫
שימוש באנזימי‬
DNA is made up of four • ‫רסטריקציה‬
nucleotides: A, C, G, and T.
A always pairs with T. • PCR ‫
שימוש ב‬
C always pairs with G. •
The two strands of DNA are in an •
‫
שימוש בסמנים‬
antiparallel configuration. ‫פולימורפיים‬
Two complementary DNA strands •
will separate when heated, and ‫
ריצוף‬
will spontaneously pair together
again (hybridize) when cooled.
 ‫אנזימי רסטריקציה‬
‫• חיידקים רכשו כלי להגן על עצמם מהתקפה של ‪ DNA‬זר‬
‫באמצעות אנזימי רסטריקציה שתפקידם לחתוך ‪" DNA‬זר"‬
‫הפולש לתא‬
‫• ידועים סוגים שונים של אנזימים הממוינים על פי טיב ה ‪DNA‬‬
‫שהם מזהים‬
‫• בדרך כלל מזהים רצפים פלינדרומיים‬

‫‪EcoRI:‬‬
‫‪SmaI:‬‬
‫´‪5´ GAATTC 3‬‬
‫´‪5´ CCCGGG 3‬‬ ‫´‪3´ CTTAAG 5‬‬
‫´‪3´ GGGCCC 5‬‬
Restriction Endonucleases Cleave DNA
at specific DNA sequences
 DNA Diagnosis of HbS

MstII MstII MstII

1.15 kb Hb bA
Glu

1.35 kb Hb bS
Val
… CCT GAG GAG … (Hb bA)
… CCT GTG GAG … (Hb bS)
CCT NAG G (MstII)
… CCT AAG GAG … (Hb C)
 DNA Diagnosis of HbS
By Southern

MstII MstII MstII

1.15 kb Hb bA
Glu

1.35 kb Hb bS
Val
probe

Wild type: 1.15kb

Mutant: 1.35kb
1.35 kb
1.15 kb
A/A A/S S/S
‫זיהוי מוטציות ב ‪DNA‬‬

‫
שימוש באנזימי‬
‫רסטריקציה‬
‫
שימוש ב ‪PCR‬‬
‫
שימוש בסמנים‬
‫פולימורפיים‬
 ‫מהו ה ‪?PCR‬‬

‫סינתזה של ‪ DNA‬ספציפי במבחנה‬

‫באופן אקספוננציאלי‬

‫‪Dr. Kary Mullis, 1983‬‬

‫קיבל נובל ב ‪1993‬‬
 What is PCR? :
Why “Polymerase”?

It is called “polymerase” because the

only enzyme used in this reaction is
DNA polymerase.
 What is PCR? :
Why “Chain”?

It is called “chain” because the

products of the first reaction become
substrates of the following one, and
so on.
 What is PCR? :
The “Reaction” Components

1) Target DNA - contains the sequence to be amplified.

2) Pair of Primers - oligonucleotides that define the sequence

to be amplified.
3) dNTPs - deoxynucleotidetriphosphates: DNA building blocks.

4) Thermostable DNA Polymerase - enzyme that

catalyzes the reaction
5) Mg++ ions - cofactor of the enzyme

6) Buffer solution – maintains pH and ionic

strength of the reaction solution suitable for the
activity of the enzyme
 The Reaction

PCR tube THERMOCYCLER

 Denature (heat to
95oC)

Lower temperature to 56oC

Anneal with primers

Increase temperature to
72oC DNA polymerase +
dNTPs
Polymerase Chain Reaction (PCR)
 DNA ‫זיהוי מוטציות ב‬

DNA is the hereditary material •

passed on from generation to
generation.
‫
שימוש באנזימי‬
DNA is made up of four • ‫רסטריקציה‬
nucleotides: A, C, G, and T.
A always pairs with T. • PCR ‫
שימוש ב‬
C always pairs with G. •
The two strands of DNA are in an •
‫
שימוש בסמנים‬
antiparallel configuration. ‫פולימורפיים‬
Two complementary DNA strands •
will separate when heated, and ‫
ריצוף‬
will spontaneously pair together
again (hybridize) when cooled.
‫סמנים בגנום המייחדים בני אדם שונים‬

‫‪CA Repeats VNTRs SNPs‬‬

 ‫סמני ‪DNA‬‬
‫וריאציות ברצף ה ‪DNA‬‬
‫)פולימורפיזם(‬
‫שקיימת באוכלוסייה ‪,‬‬
‫לרוב לא ברצף המקודד‬
‫לחלבון‬
‫וחסר חשיבות קלינית‬
‫‪RFLPs / SNPs‬‬ ‫‪VNTRs CA Repeats‬‬
‫סמנים ב ‪ DNA‬מאפשרים‬
‫זיהוי של אנשים שונים‬
‫אתרים פולימורפיים‬
‫שימוש בסמנים לביצוע‬
‫תאחיזה‪LINKAGE -‬‬
‫מחלה אוטוזומלית רצסיבית‬

‫משפחה שאינה אינפורמטיבית‬

‫מחלה אוטוזומלית רצסיבית‬

‫משפחה חצי אינפורמטיבית‬

‫מחלה אוטוזומלית רצסיבית‬

‫אינפורמטיביות חלקית‬
‫מחלה אוטוזומלית רצסיבית‬

‫אין ‪ DNA‬מהתינוק שנפטר‬

‫מה נוכל להגיד?‬
 ‫מחלה אוטוזומלית רצסיבית‬

‫?‬
 ‫מחלה אוטוזומלית רצסיבית‬

‫?‬
 DNA ‫זיהוי מוטציות ב‬

DNA is the hereditary material •

passed on from generation to
generation.
‫
שימוש באנזימי‬
DNA is made up of four • ‫רסטריקציה‬
nucleotides: A, C, G, and T.
A always pairs with T. • PCR ‫
שימוש ב‬
C always pairs with G. •
The two strands of DNA are in an •
‫
שימוש בסמנים‬
antiparallel configuration. ‫פולימורפיים‬
Two complementary DNA strands •
will separate when heated, and ‫
ריצוף‬
will spontaneously pair together
again (hybridize) when cooled.
‫ריצוף ‪DNA‬‬