BAKALÁRSKA PRÁCA

MASARYKOVA UNIVERZITA
Přírodovědecká fakulta
Ústav antropologie

Antropologicko-genetická identifikace kosterních

pozůstatků historických osobností

Autor: Kristína Kovačovicová

Vedúca práce: doc. RNDr. Eva Drozdová, PhD.

Brno 2010
Prehlasujem, že som túto bakalársku prácu vypracovala samostatne s použitím literatúry
uvedenej v zozname použitej literatúry.

V Brne, dňa 17. 5. 2010

Kristína Kovačovicová

2
Poďakovanie :

Rada by som poďakovala vedúcej svojej bakalárskej práce doc. RNDr. Eve Drozdovej,
PhD. z Ústavu experimentálnej biológie Přírodovědecké fakulty Masarykovej univerzity za
venovaný čas pri spracovávaní problematiky.

3
Obsah

Abstrakt .......................................................................................................................... 6

Kľúčové slová ................................................................................................................. 6

1 Úvod .............................................................................................................................. 7

2 Metódy práce ............................................................................................................... 9

3 Antropologická identifikácia .................................................................................... 10

3.1 Antropologické určenie pohlavia ................................................................................. 10

3.2 Odhad veku ................................................................................................................... 11

3.3 Odhad výšky postavy .................................................................................................... 11

3.4 Určenie etnickej príslušnosti ........................................................................................ 12

3.5 Superprojekcia a rekonštrukcia podoby .................................................................... 12

3.6 Paleopatologická analýza ............................................................................................. 13

3.7 Ukážka antropologickej identifikácie ......................................................................... 14

4 Genetická identifikácia ............................................................................................. 17

4.1 Degradácia aDNA ......................................................................................................... 17

4.2 Krátke tandemové repetície ......................................................................................... 19

4.2.1 Autozomálne krátke tandemové repetície .............................................................................19
4.2.1.1 Najpoužívanejšie autozomálne STR lokusy ................................................................................. 20
4.2.2 Amplifikácia a analýza nukleárnych STR markerov .............................................................21
4.2.3 Použitie autozomálnych krátkych tandemových repetícií v identifikácii ..............................22
4.2.3.1 Cárska rodina Romanovcov .......................................................................................................... 22
4.2.3.2 Mikuláš Kopernik ......................................................................................................................... 24

4.3 Molekulárne určenie pohlavia ..................................................................................... 25

4.3.1 Amelogenin ...........................................................................................................................25
4.3.2 Krátke tandemové repetície na X a Y chromozómoch ..........................................................27
4.3.2.1 Krátke tandemové repetície na Y chromozóme ............................................................................ 28
4.3.3 Príklad určenia pohlavia ........................................................................................................29

4
 4.4 Mitochondriálna DNA .................................................................................................. 30
4.4.1 Amplifikácia a analýza mtDNA ............................................................................................31
4.4.2 Príklad využitia mitochondriálnej DNA – Jesse James .........................................................33

5 Antropologicko-genetická identifikácia .................................................................. 34

5.1 Identifikácia neznámych pohrešovaných osôb ........................................................... 35

6 Diskusia ...................................................................................................................... 39

7 Záver........................................................................................................................... 41

8 Použitá literatúra ...................................................................................................... 42

9 Slovník dôležitých pojmov........................................................................................ 50

10 Register..................................................................................................................... 56

11 Medailón autorky .................................................................................................... 58

5
Abstrakt

Identita človeka predstavuje zásadnú otázku v historickej antropológii. Dnes je k

dispozícii veľké množstvo metodík, ktoré pomáhajú určiť základné charakteristiky známych i
neznámych osôb. Celkovo ich môžeme rozdeliť na dve skupiny. Prvou sú metódy
antropologické, ktoré umožňujú určiť pohlavie neznámeho nálezu, odhadnúť vek, výšku
a etnickú príslušnosť jedinca, zhodnotiť zdravotný stav a zrekonštruovať jeho podobu. Druhú
skupinu tvoria metódy založené na súčasných poznatkoch a metódach v oblasti molekulárnej
biológie. Patrí k nim najmä analýza DNA, zostavenie profilu za použitia krátkych
tandemových repetícií alebo zaradenie jedinca do haploskupiny na základe mitochondriálnej
DNA. Optimálnym riešením by malo byť spojenie oboch prístupov, s ktorým sa však
v súčasnej dobe stretávame zriedkavo.

Kľúčové slová
amelogenin - archaická DNA - identifikácia - krátke tandemové repetície – haploskupina –
haplotyp – STR profil

6
1 Úvod

Určenie identity človeka predstavuje zásadnú otázku pri identifikácii osôb v historickej
antropológii. V dnešnej dobe máme k dispozícii veľké množstvo metodík, ktoré pomáhajú
k určeniu základných vzhľadových charakteristík známych i neznámych osôb.
Celkovo ich môžeme rozdeliť na dve veľké skupiny. Prvou sú metódy antropologické,
ktoré nám umožňujú určiť pohlavie neznámeho nálezu, odhadnúť vek, výšku a etnickú
príslušnosť jedinca, zhodnotiť zdravotný stav a zrekonštruovať jeho podobu. V rámci tejto
skupiny sa používané metódy klasicky členia na morfoskopické, pri ktorých je podstatný
rozvoj znakov, ich popis a zaradenie. A morfometrické, kedy sú jednotlivé požadované
rozmery zmerané vhodne zvolenými meradlami a následne pracujeme s nimi. Tieto
charakteristiky nám poskytujú informácie o základných výzorových charakteristikách osoby.
Pomáhajú tak zúžiť okruh potenciálnych jedincov, ktorých identita môže byť k pozostatkom
priradená.
Druhú skupinu tvoria metódy založené na súčasných poznatkoch a metódach v oblasti
molekulárnej biológie. Patrí k nim najmä analýza DNA, v tomto prípade archaickej DNA.
Vďaka jej správne zvoleným úsekom , ktoré sú odovzdávané z rodičov na potomkov, môžeme
zostaviť genetický profil jedinca. Dvomi hlavnými cestami je amplifikácia, analýza krátkych
tandemových repetícií a zostavenie profilu. A druhou je amplifikácia mitochondriálnej DNA
a zaradenie jedinca do príslušnej haploskupiny. Pri vhodnom zrovnávanom materiále, vzorke
od rodinných príslušníkov, prípadne od samotnej osoby môžeme s pomerne vysokou
pravdepodobnosťou určiť identitu.
Cieľom práce bolo popísať základné metodiky používané pri identifikácii kostrových
nálezov, so zameraním na metódy molekulárnej antropológie, na príkladoch uvedených
v literatúre.
Preto je práca rozložená do dvoch celkov, prvý reprezentuje antropologické možnosti
identifikácie a druhý metódy genetické (molekulárne-biologické). Jedná sa najmä o prípady
historických osobností, pri ktorých bola ich totožnosť už predpokladaná a následne
potvrdzovaná alebo vyvrátená.
Úlohou práce nie je popisovať známe postupy antropologickej identifikácie kostrových
pozostatkov, ktorých existuje veľké množstvo a ich základné osvojenie je úlohou povinných
predmetov bakalárskeho stupňa štúdia antropológie. Rovnako ako postupy amplifikácie,

7
elektroforézy či sekvenovania, ktoré patria medzi základné znalosti molekulárnej biológie. Ale
na konkrétnych príkladoch z literatúry ukázať použitie už získaných informácií pri
identifikácii osobností.

8
2 Metódy práce

Bakalárska práca je spracovaná formou literárnej rešerše. Informácie sú čerpané

prevažne z vedeckých článkov, dostupných v základných databázach: PubMed, Science Direct
a Web of Science. Okrem voľne dostupných článkov som použila materiály, ktoré som získala
priamo od ich autorov, pretože neboli v rámci databáz sprístupnené.
Praktické i teoretické znalosti izolácie a analýzy DNA, ako je PCR, elektroforéza,
štepenie reštrikčnými enzýmami a sekvenovanie som získala v rámci predmetov obore
Molekulární biologie a genetika na Masarykovej univerzite. Okrem povinných predmetov som
absolvovala predmet Úvod do kvantitativní RT-PCR, ktorého cieľom bolo osvojenie si
a pochopenie základných princípov tejto techniky, ktorá by mala byť dnes používaná ako
štandard v práci s archaickou DNA a slúži na zistenie počiatočného množstva vyizolovanej
DNA zo vzorky.

9
3 Antropologická identifikácia

Určenie pohlavia, veku, etnickej príslušnosti, výšky postavy, rekonštrukcia podoby

(vytvorenie modelu, kresebná rekonštrukcia alebo superprojekcia) a paleopatologický rozbor
patria k základným úlohám v oblasti historickej antropológie. Všetky tieto úlohy sú výrazne
ovplyvnené možnosťami, ktoré nám poskytuje samotný materiál. Pri veľmi fragmentárnych
pozostatkoch môžu byť analýzy často nepresné a skreslené.
Dnes existuje veľké množstvo metodík používaných na určenie základných
charakteristík. Správne zvolený postup je závislý od stavu kostrového materiálu, možnostiach
a skúsenostiach antropológa.

3.1 Antropologické určenie pohlavia

Aj keď rozoznávame len dve biologické pohlavia, prechod medzi znakmi na kostre,
ktoré umožňujú odlíšenie pozostatkov rôzneho pohlavia, nie je ostrý. Značne sa prekrývajú vo
svojom rozložení.
Existuje veľké množstvo metód, vypracovaných na určenie pohlavia na základe
kostrových pozostatkov. V zásade ich môžeme rozdeliť na dve skupiny:
1. Metódy založené na aspektívnom pozorovaní a popise morfologického tvaru.
2. Metódy založené na morfometrickom hodnotení.
Platí, že muži majú všeobecne robustnejšiu stavbu kostí a mohutnejšie svalové úpony, ale
tento jav je výrazne závislý na populačnej príslušnosti. Preto je potrebné poznať populáciu,
z ktorej daný nález pochádza.
Najčastejšie býva použitá lebka a panva, kde je rozvoj sekundárnych pohlavných
znakov najviditeľnejší. Hodnotenie však nie je obmedzené len na tieto dve časti, prakticky
možno použiť akúkoľvek časť kostry, pokiaľ je následne i vhodne zvolená metodika.
Najpresnejšie a najspoľahlivejšie výsledky poskytuje hodnotenie pohlavia na panve či
morfometricky (Novotný, 1986), alebo morfoskopicky.
Spoľahlivosť jednotlivých metód sa líši v závislosti na použitom kostrovom materiále
a autoroch. Pri použití rovnakých metodík uvádzajú rôzni autori rozdielnu úspešnosť.

10
3.2 Odhad veku

Odhad veku v čase úmrtia je založený na sledovaní zmien, ktoré sa odohrávajú na

kostrovej sústave jedinca v priebehu času. Tieto umožňujú určenie biologického veku, nie
však veku chronologického.
Okrem stavu a vývoja kostry je možné použiť i určenie veku zubného (Stloukal et al,
1999). Za hranicu dospelosti sa všeobecne považuje vymiznutie synchondrosis
sphenooccipitalis, čo je medzi 18. a 20. rokom života.
Určiť vek je pomerne jednoduché pri vyvíjajúcom sa jedincovi. V prípade staršej
osoby je možné vek len rámcovo odhadnúť a na základe znakov ho zaradiť do definovanej
vekovej triedy. Preto je vhodné používať na hodnotenie komplexnejšie metodiky, založené na
hodnotení viacerých znakov.
Nakoľko sa kostra dospelého človeka výrazne kvantitatívne nemení, sú tieto metódy
obvykle morfoskopické. Dôležité sú zmeny lebečných švov, ktoré často sa používajú pri
odhade veku (Hunger et Leopold, 1978; Linc, 1971). Ďalej zmeny na povrchu facies
symphysialis. Prípadne stav vnútornej štruktúry hlavice humeru a femuru (Knussman, 1988).
Ďalšou často využívanou možnosťou je odhad veku prostredníctvom zubnej abrázie (Lovejoy
et al., 1985), ktorá je vhodná pre jedincov bez stomatologických zásahov (napríklad
blombovanie zubov).

3.3 Odhad výšky postavy

Výšku postavy jedinca nemožno spoľahlivo určiť. Nutným predpokladom, ako je to pri
všetkých metódach používaných pre antropologický odhad je, aby boli metódy vytvorené a
používané na rovnakej populácii. Medzi najpoužívanejšie patrí Sjøvoldova metóda (1990),
ktorá je založená na dosadení rozmerov dlhých kostí (humerus, ulna, radius, femur, tibia
a fibula) do regresných rovníc. Používané sú však i metódy vypracované na iných častiach
skeletu.

11
3.4 Určenie etnickej príslušnosti

Antropológia pracuje s troma etnickými skupinami: negroidnou, mongoloidnou

a kavkazoidnou (európoidnou). Niekedy sa vyčleňuje navyše skupina natívnych Američanov.
Väčšina metód je založená len na hodnotení splanchnokrania. Používajú sa metódy
morfologické (Pickering - Bachman, 2009), založené na hodnotení tvaru vybraných znakov,
i morfometrické.

3.5 Superprojekcia a rekonštrukcia podoby

Rekonštrukcia podoby na základe lebky predpokladá vzťah medzi splanchnocraniom

a mäkkými tkanivami. Jej cieľom je na základe lebky alebo jej sadrového odliatku spätne
vytvoriť podobu daného jedinca pre účely identifikácie. Celkovo možno tieto metódy rozdeliť
na 2D (kresebná rekonštrukcia a superprojekcia) a 3D (vytvorenie modelu reálneho alebo
virtuálneho) (Taylor, 2001).
Kresebná rekonštrukcia je rýchlejšou a flexibilnejšou variantou, pretože umožňuje
vytvorenie viacerých vekových variant. Pri tejto 2D metóde je za pomoci dioptografu získaný
obrys lebky a na ňom následne zostavený obrys tváre podľa štandartnej hrúbky mäkkých
tkanív (Novotný et al., 2003). Druhou 2D metódou je superprojekcia, založená na vytvorení
takzvaného superprojekčného obrazu, kedy je obraz neznámej lebky premietnutý do portrétu,
fotografie (Obr. 2) alebo röntgenového snímku jedinca. Obraz lebky sa premieta do fotografie
tak, aby boli viditeľné obrysy lebky i fotografická snímka. Oba musia do seba zapadať, musia
mať zhodnú veľkosť i pozíciu (Glassman, 2001). Následne je určená miera korelácie
jednotlivých navzájom si odpovedajúcich prvkov kostí a mäkkého tkaniva (Aulsebrook et al.
1995).
Vytvorenie reálneho 3D modelu je v dnešnej dobe založené na jednom z troch
prístupov. Prvý prístup (podľa Gerasimova) je založený na znalosti anatómie a postupnom
nanášaní anatomických štruktúr. Druhý prístup, takzvaná americká škola vychádza zo znalosti
priemernej hrúbky mäkkých tkanív v presne definovaných dvadsať jedna antropometrických
bodoch. (Gatliff et Taylor, 2001). Posledným prístupom je takzvaná britská škola, ktorá
kombinuje obe predchádzajúce metódy (Wilkinson, 2004).

12
 Okrem vytvorenia reálneho modelu je možné počítačovou technológiou vytvoriť
i modely virtuálne. Tieto sú zostavené na základe morfometrického alebo morfoskopického
zhodnotenia, prípadne na základe prispôsobenia (lebka nachádzajúca sa v referenčnom súbore
je deformovaná na základe požiadaviek) (Quatrehomme et Subsol, 2005).

3.6 Paleopatologická analýza

Paleopatologický rozbor kostrových pozostatkov predstavuje ďalšiu významnú

možnosť identifikácie pozostatkov historických osobností. Rozsah využitia je obmedzený na
patologické zmeny a zranenia prejavujúce sa na kostrovej sústave. Najčastejšie je preto možné
určiť degeneratívne zmeny, za nimi početnosťou nasledujú traumy (zlomeniny, poranenia a
dislokácie), prerušujúce cievne zásobenie a inerváciu kosti, spôsobujúce jej následnú
deformáciu. Ďalej sú na kostrovom materiále zistiteľné niektoré infekčné ochorenia (napríklad
tuberkulóza, syfilis a iné) a nádorové ochorenia (napríklad osteochondrom, chondrosarkom,
osteom a iné). Rovnako sa možno stretnúť s prejavmi metabolických alebo výživových
porúch, najčastejšie je rozpoznateľná hypovitaminóza vitamínu D a porotická hyperostóza.
Okrem kostrových pozostatkov sú vhodným materiálom na štúdium patológie zuby. Na
nich sa najčastejšie hodnotí výskyt a početnosť zubných kazov, zubného kameňa, prípadne
dentálna hypoplázia a peridontitída.
Na základe dochovaných popisov osobností, v prípade novších nálezov na základe
zdravotných záznamov, je možné porovnať nález na kostrovom materiále s pravdepodobnou
zdravotnou diagnózou osoby a tak potvrdiť, alebo vyvrátiť predpokladanú totožnosť nálezu.
V prípade ak je identita osoby istá možno naopak na základe paleopatologického rozboru
zistiť viac o zdravotnom stave jedinca.
Na základe nálezov je v niektorých prípadoch možné určiť akú vekovú hranicu osoba
prekročila. Prakticky každý človek nad päťdesiat rokov trpí degeneratívnym ochorením,
najčastejšie sa jedná o arthrosis deformans (Pickering et Bachman, 2009).

13
3.7 Ukážka antropologickej identifikácie

V júli 1991 boli v lese, v blízkosti Jekaterinburgu exhumované kostrové pozostatky,

ktoré podľa predbežných zistení mohli patriť rodine posledného ruského cára Mikuláša II..
Pozostatky v hrobe boli značne poškodené, fragmentované a dislokované (Obr. 1).

Obrázok 1: Archeologická schéma Jekaterinburského hrobu a číselným označením jednotlivých kostrových

nálezov (Kolesnikov et al., 2001).

Najprv bolo nutné určiť počet pochovaných jedincov a priradiť konkrétne kosti ku
skeletom. V hrobe sa nachádzalo viac ako 900 kostí (vrátane izolovaných zubov a fragmentov
kostí). Celkový počet jedincov bol určený na deväť.
Ďalšou úlohou bola identifikácia pozostatkov a priradenie totožnosti jedincom. Na to
však bolo nevyhnutné poznať podobu osôb zaživa. Jediné dochované materiály, vhodné pre
osobnú identifikáciu, boli fotografie.
Neexistovali spoľahlivé stomatologické záznamy, údaje o hmotnosti, úrazoch,
ochoreniach alebo vrodených malformáciach. Existovali však základné biologické údaje, ako
je vek, pohlavie, etnická príslušnosť a výška (Tab. 2), ktoré bolo možné predikovať
a porovnať i na základe kostrových pozostatkov (Tab. 1) (Kolesnikov et al., 2001).

14
 Kostra Pohlavie Vek Výška (cm) Etnická príslušnosť
1 Žena 40-50 164-168 Európska
2 Muž 51-60+ 171-177 Európska
3 Žena 20-25 161-165 Európska
4 Muž asi 50 165-169 Európska
5 Žena asi 20 166-169 Európska
6 Žena 20-24 162-166 Európska
7 Žena 40-50 163-168 Európska
8 Muž ? 40-50 163-167 Neurčená
9 Muž 60+ 173-180 Európska
Tabuľka 1: Základná charakteristika kostrových nálezov nájdených v roku 1991 pri Jekatinburgu (Kolesnikov et
al., 2001).

Na určenie kostrových pozostatkov bola použitá osteologická klasifikácia podľa

Popova, Zviagina a Zinina (1987) a neskôr podľa Maplesa a Browninga (1994).
Všetky kostry vykazovali uzavretie rastových chrupaviek, preto by mali podľa autorov
patriť osobám starším ako sedemnásť rokov.
Klasifikačné metódy identifikácie neumožnili v tomto prípade rozlíšenie
individuálnych vzťahov medzi pozostatkami. Umožnili ich rozčlenenie do skupín.
Metódy, ktoré boli použité na určenie veku a pohlavia neboli optimálne, vzhľadom na
nedostatok vhodného materiálu. Práve kvôli neoptimálnym podmienkam oboch
osteologických štúdií (veľký počet značne fragmentovaných kostí, nedostatočné množstvo
dochovaných záznamov o zdravotnom stave a vzhľade) môžu byť výsledky brané len ako
teoretické závery (Kolesnikov et al., 2001).

Pravdepodobná Pohlavie Vek Výška(cm) Etnikum Kompatibilné Určenie

identita osoby pozostatky pozostatkov
Zviagin Maples
Mikuláš II. Muž 50 približne 170 Európske 2,4,8,9 4 4
Alexandra Romanová Žena 46 približne 170 Európske 1,7 7 7
Alexander Romanov Muž asi 14 pod 160 Európske X X
Oľga Romanová Žena asi 23 165-170 Európske 3,5,6 3 3
Tatiana Romanová Žena 21 165-170 Európske 3,5,6 6 6
Mária Romanová Žena 19 165-170 Európske 3,5,6 5/X 5
Anastázia Romanová Žena 17 160-165 Európske 3,5,6 5/X X
E. Botkin Muž 61 nad 170 Európske 2,4,8,9 2 2
A. Trupp Muž 62 bez údajov Európske 2,4,8,9 9 9
A. Demidová Žena 40 bez údajov Európske 1,7 1 1
I. Karitonov Muž 48 bez údajov Európske 2,4,8,9 8 8
Tabuľka 2: Všeobecná charakteristika osôb (známa z júla 1918). Kompatibilné pozostatky sú určené číslami
uvedenými v Tabuľke. Priradenie pozostatkov podľa Zviagina a Zinina (1987), Maplesa a Browninga v roku
1994 (Kolesnikov et al., 2001).

Podľa topografie jednotlivých skeletov (Obr.1), morfologickej charakteristiky, pohlavie

a veku bolo možné priradiť lebku k príslušnému postkraniálnemu skeletu.

15
 Preukázateľná variácia tvaru a veľkosti lebky je používaná na individualizáciu každej
osoby. Preto nasledovala superprojekcia. Príkladom takejto projekcie je Obr. 2.

Obrázok 2: Výsledok superprojekcie lebiek číslo 3, 5 a 6 s portrétom Tatiany Romanovej (Kolesnikov et al.,
2001).

Výsledky superprojekcie pre všetky nájdené lebky, spolu s pravdepodobnosťami

falošných pozitívnych výsledkov v prípade určenia pohlavia a veku sú uvedené v Tab. 3.
Kostra Pohlavie Veková trieda Pravdepodobnosť falošného výsledku
(roky) Určenie Fotografický Všetky
pohlavia a veku prekryv parametre
1 Žena 40-45 0,093 0,3 0,0279
2 Muž 50-64 0,101 0,3 0,0303
3 Žena 20-29 0,064 0,3 0,192
4 Muž 45-54 0,048 0,3 0,0144
5 Žena 15-24 0,067 0,3 0,0201
6 Žena 15-2 0,067 0,3 0,0201
7 Žena 45-54 0,054 0,3 0,0162
8 Muž 40-54 0,086 0,8 0,0688
9 Muž 60-90 0,044 0,3 0,0132
Pravdepodobnosť falošnej identifikácie všetkých 9
2,625x10-12 1,389x10-15
kostier
Tabuľka 3: Výpočet pravdepodobnosti falošne pozitívnej identifikácie (Kolesnikov et al., 2001).

Na základe zvolených metodík bola určená pravdepodobná identita všetkých skeletov

z nálezu, okrem jednej ženskej kostry, ktorá podľa Maplesa a Brovninga patrila Anastázii
a podľa Zviagina a Zinina mohla patriť buďto Anastázii alebo Márii (Kolesnikov et al., 2001).

16
4 Genetická identifikácia

Pri identifikácii jedinca sú k dispozícii najčastejšie len kostrové pozostatky, niekedy

zvyšky mäkkých tkanív, nechty, prípadne vlasy. Práve tieto slúžia ako jediný zdroj genetickej
informácie.
Na základe súčasných protokolov sme schopní izolovať a následne amplifikovať DNA,
prípadne proteíny i z niekoľko tisícročných pozostatkov (Haak et al., 2005). Táto DNA je na
rozdiel od súčasných vzoriek charakteristická vyšším stupňom fragmentácie, nazýva sa
archaická DNA (aDNA).

4.1 Degradácia aDNA

Pri analýze a DNA sa možno stretnúť s degradáciou templátu na malé úseky, obvykle
medzi 100 až 500 bp (Hofreiter et al., 2001). Táto redukcia je dôsledkom enzymatických
procesov, ktoré nastávajú krátko po smrti organizmu a neenzymatického štepenia
fosfodiesterových väzieb v cukrovo-fosfátovej kostre . Nukleotidové bázy bývajú taktiež
pozmenené pôsobením hydroxylových radikálov. Prehľad najbežnejších typov poškodení,
s ktorými sa stretávame v prípade aDNA je uvedený v Tab. 4.
Typ poškodenia Proces Vplyv na DNA Možné riešenie
Degradácia Zníženie celkového PCR krátkych
mikroorganizmami množstva DNA prekrývajúcich sa
Reťazcový zlom Pôsobenie nukleáz Redukcia veľkosti fragmentov
v bunkách posmrtne
Iné chemické pôsobenie
Poškodenie báz Fragmentácia báz PCR krátkych
Oxidatívne pôsobenie Poškodenie Fragmentácia sacharidov prekrývajúcich sa
deoxyribózových zvyškov Modifikácia nukleotidov fragmentov
Reakcia medzi Maillardove produkty PTB (N-fenylacyl
molekulami DNA, alebo thiazonium bromid)
„DNA crosslinks“
medzi DNA a inými
biomolekulami
Strata aminoskupín Zmena sekvencií Nezávislé mnohonásobné
(modifikácia): PCR
adenín na hypoxantín, Klonovanie sekvencií
Hydrolytické pôsobenie
cytozín na uracil, a sekvenovanie viacerých
5-metyl-cytozín na tymín, klonov
guanín na xantín
Tabuľka 4: Prehľad najčastejších typov poškodenia v aDNA (Pääbo et al., 2004).

17
 Najčastejšia forma poškodenia DNA vzniká oxidatívnym pôsobením. Kyslíkové
radikály sa vyskytujú v nadbytku a sú difúzne. Nie sú vytvárané len intracelulárne
v mitochondriách živého organizmu, ale sú všadeprítomné v prostredí (Pääbo, 1989). Ich
pôsobením vznikajú jednoreťazcové zlomy v DNA helixe s blokovanými 3´ koncami. Sú
výsledkom nezvratnej, difúzne kontrolovanej reakcie hydroxylových radikálov
s deoxyribózou, nasledované hydrolýzou a ďalšími preskupovaniami (Obr. 3). Produkty sa
vyznačujú extrémnou labilnosťou (Hutchinson, 1985).
DNA získaná z fosilizovaných pozostatkov býva charakteristicky štepená
endonukleázou III., ktorá je špecifická pre oxidáciu pyrimidínov.
Maillardove produkty vznikajú pri kondenzačnej reakcii medzi sacharidmi
a primárnymi aminoskupinami proteínov alebo nukleových kyselín.
Pri hydrolytickom pôsobení dochádza najčastejšie k zmenám aminoskupín adenínu,
cytozínu, 5-metylcytozínu a guanínu . Produkty, ktoré následne vznikajú pri amplifikácii takto
pozmeneného templátu, nemusia preto obsahovať rovnakú sekvenciu ako bola pôvodná
(Pääbo, 1989).

Obrázok 3: Hlavné produkty vznikajúce pôsobením hydroxylových radikálov, reakcie s 1, 2, 4 alebo 6- uhlíkom
deoxyribózového kruhu (Hutchison , 1985; upravené).

18
 Všetky zmeny v DNA komplikujú interpretáciu získaných výsledkov. Preto je dôležité
dodržanie pravidiel pre prácu s aDNA, ktoré slúžia najmä na zabránenie kontaminácii
historických vzoriek modernou DNA, ktorá by sa amplifikovala prednostne.

4.2 Krátke tandemové repetície

Krátke tandemové repetície (STR), často označované ako mikrosatelity, pozostávajú

z opakujúcich sa nukleotidových sekvencíí, pozostávajúcich z 2-7 bp. Sú užitočné pre
mapovanie a určovanie identity, pretože bola preukázaná ich vysoká variabilita medzi
jedincami (Edwards et al., 1991).
Najrozšírenejšie sú dinukleotidové STR s opakovaním [CA]n, druhé najrozšírenejšie sú
tetranukleotidové STR. Tie netvoria uniformnú skupinu, niektoré z nich sú tvorené len jednou
skupinou, napr. [AGAT]n, iné sa skladajú z viacerých skupín, napr. [AGAT]n[ACAT]m.
Okrem toho veľa tetranukleotidových repetícií poskytuje takzvané interalely, ktoré sa
neskladajú len z rovnakých opakovaní báz, napr. [AGAT]n[AT]m[AGAT]l[AGA]k (Hummel,
2003).
Najpoužívanejšími sú tetranukleotidové STR, pretože ich amplifikácia prostredníctvom
PCR vykazuje vyššiu spoľahlivosť ako dinukleotidové repetície, ktoré sú veľmi náchylné na
tvorbu alelických výpadkov (Edwards et al., 1991).

4.2.1 Autozomálne krátke tandemové repetície

Autozomálne STR sú dnes veľmi rozšírené ako markery pri identifikácii osôb. Výber
vhodných STR pre analýzu historických populácií je odvodený od ich využitia
v kriminalistickej praxi. Používané je najmä mnohonásobné STR profilovanie, ktoré umožňuje
prostredníctvom sady vhodne navrhnutých párov primerov amplifikovať počas jednej PCR
reakcie viacero STR lokusov.
Systém mnohonásobného STR profilovania bol prvýkrát použitý v roku 1993
Kimptonom et al., kedy bol použitý tzv. „quadruplex“, amplifikácia štyroch STR lokusov
v jednej reakcii. Identifikácie jedincov týmto spôsobom však neboli spoľahlivé,
pravdepodobnosť zhody bola 1:10000.

19
 Pridaním dvoch vysoko polymorfných STR (D21S11 a HUMFIBRA/FGA), v roku
1996, vzrástla pravdepodobnosť správneho určenia osoby na 1:50 miliónov. Táto druhá
generácia mnohonásobného určenia (nazývaná i SGM z anglického „second-generation
multiplex“) zahŕňala i post PCR analýzu XY-homologických úsekov amelogeninového génu,
umožňujúceho určenie pohlavia (Sparkes et al., 1996).
V roku 1999 boli medzi STR využívané pri identifikácii pridané ďalšie štyri
a multiplex bol pomenovaný SGM Plus10, alebo AmpFlST® SGM PlusTM (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA), pravdepodobnosť zámeny osôb klesla na menej ako
1:1013. Tento systém je dodnes používaný vo Veľkej Británii (Cotton et al., 2000).
V Spojených štátoch amerických využívajú systém pozostávajúci z trinástich STRs
a amelogeninového génu, pri ktorom je pravdepodobnosť zámeny ešte nižšia ako v anglickom
systéme (Moretti et al., 2001).
V rámci zvýšenia presnosti identifikácie osôb sa neustále vyvíjajú presnejšie
mechanizmy, v súčasnosti sa používa systém založený na amplifikácii 16 STRs, vrátane
amelogeninu (Krenke et al., 2002).

4.2.1.1 Najpoužívanejšie autozomálne STR lokusy

Dnes sa môžeme stretnúť s rôzne štandardizovanými sadami používanými pri určovaní

jedincov, následne i pri určovaní príbuznosti medzi jedincami.
Paralelne vedľa seba fungujú štyri základné sady, v závislosti na rozšírení v daných
krajinách (Tab. 5).
Prvým je systém americký systém - „U.S. Core Loci“ , známy i ako FBI CODIS
(Combined DNA index system), ktorý pozostáva z: CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA,
D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11
a amelogeninu.
Druhý systém používaný vo Veľkej Británii - „UK/European Core Loci“, obsahuje:
FGA, TH01, VWA, D2S1338, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11
a amelogenin (okrem vymenovaných STR lokusov obsahuje ešte odporúčané: D1S1656,
D2S441, D10S1248, D12S391, D22S1045, TPOX).

20
 Názov Chromozomálna Alelové rozpätie Repetitívna Prístup na Mutačná
markeru lokalizácia (počet repetícií) Sekvencia GenBank hodnota
(príslušná alela)
CSF1PO 5q33.1 4-18 [AGAT] (t. s.) U63963 (12) 0,16%
FGA 4q28 12-51.2 [TTTC]3TTTTTTCT[CTTT]n M64982 (21) 0,28%
CTCC [TTCC]2 (t. s.)
TH01 11p15.5 3-14 [AATG] (b. s), D00269 (9) 0,01%
[TCAT] (t. s.)
TPOX 2p25.3 4-16 [AATG] (t. s.) M68651 (11)
VWA 12p13.31 10-25 [AGAT] (b. s) M25858 (18) 0,17%
D3S1358 3p21.31 8-20 [AGAT], AC099539 (16) 0,12%
[TCTA] (b. s)
D5S818 5q23.2 6-18 [AGAT](t. s.) AC008512 (11) 0,11%
D7S820 7q21.11 5-16 [GATA] (t. s.) AC004848 (13) 0,10%
D8S1179 8q24.13 7-20 [TATC] (t. s.) AF216671 (13) 0,14%
D13S317 13q31.1 5-17 [GATA] (b. s.), AL353628.2 (11) 0,14%
[TATC] (t. s.)
D16S539 16q24.1 4-16 [GATA] (t. s.) AC024591.3 (11) 0,11%
D18S51 18q21.33 7-39.2 (40) [GAAA] (t. s.) AP001534 (18) 0,22%
D21S11 21q21.1 12-41.2 [TCTA], M84567 (26) 0,19%
[TCTG] (t. s.)
D2S1338 2q35 11-28 [TGCC]n[TTCC]n G08202 (17) 0,12%
D19S433 19q12 5.2-20 (AAGG)(AAAG)(AAGG) G08036 (15) 0,11%
(TAGG)[AAGG]n
SE33 6q14 3-39.2 [AAAG] (t. s.) V00481 (26.2) 0.64%
Tabuľka 5: Prehľad najpoužívanejších STRs, s ich chromozomálna lokalizácia, príslušná repetitívna sekvencia
a prístupové číslo do GenBank. Lokalizácia repetitívnej sekvencie na hornom vlákne DNA (t. s. z anglického top
strand) alebo na dolnom vlákne (b. s. z anglického bottom strand) (údaje z The Distribution of the Human DNA-
PCR Polymorphisms (Huckenbeck et al., 1997) a Short Tandem Repeat DNA Internet DataBase (Butler et
Reeder, 1997).

Tretím systémom je nemecký - „German Core Loci“, používajúci FGA, TH01, SE33,
VWA, D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11 a amelogenin.
Posledný set je základným setom, ktorý vyžaduje pre identifikáciu Interpol - „Interpol
Standard Set of Loci“, obsahuje FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11
a nepovinne amelogenin (Butler et Reeder, 1997).

4.2.2 Amplifikácia a analýza nukleárnych STR markerov

Väčšina DNA izolovanej a amplifikovanej z fosilizovaných alebo čiastočne

fosilizovaných pozostatkov má dĺžku medzi 100 a 500 bp (Pääbo, 1989).
Práve preto musia byť štandartne používané primery modifikované pre potreby
amplifikácie aDNA. Väčšinou musia byť navrhnuté na amplifikáciu kratších úsekov. Existuje
veľa párov primerov, i sád, ktoré túto podmienku spĺňajú a sú publikované vo vedeckých

21
článkoch zaoberajúcich sa týmto problémom (Schultes et al. 1999, Wurmb-Schwark et al.,
2009).
Súčasné protokoly forenznej analýzy DNA z ľudských pozostatkov sú založené na
veľkostnej alebo sekvenčnej analýze PCR produktov. Pri hodnotení STR sa častejšie
stretávame s veľkostnou analýzou, kedy sú príslušné alely STR lokusov určené pomocou
kapilárovej elektroforézy.
Problém analýzy historických populácií, ako i iných zdrojov fragmentárnej DNA, je
prítomnosť malého množstva templátu, vstupujúceho do PCR a jeho modifikácie zapríčinené
degradáciou počas rozkladu.
Pokiaľ je koncentrácia DNA templátu nižšia ako 100 pg (množstvo zodpovedajúce 15-
17 diploidným kópiám jadrových DNA markerov) je označovaná ako málo kópiová (LCN
z anglického „low copy number“). Tento problém sa dá niekedy vyriešiť zvýšením počtu
amplifikačných cyklov, s čím sa stretávame takmer vo všetkých štúdiách aDNA. Odporúčané
je určiť množstvo templátu, napríklad pomocou RT-PCR (Alonso et al., 2001).

4.2.3 Použitie autozomálnych krátkych tandemových repetícií v identifikácii

V prípade identifikácie jedinca musíme mať k dispozícii zrovnávaciu vzorku. Môže sa

jednať o pozostatky alebo vzorky doloženého príbuzného. Prípadne o vzorky pochádzajúce od
samotného jedinca.
Až na základe porovnania získaných profilov možno s určitou pravdepodobnosťou
určiť identitu jedinca.

4.2.3.1 Cárska rodina Romanovcov

V júli 1991 boli v lese, v blízkosti Jekaterinburgu exhumované kostrové pozostatky,

ktoré podľa predbežných zistení mohli patriť rodine posledného ruského cára Mikuláša II.
a ich služobníctvu (zastrelení 16. 7. 1918). Pozostatky v hrobe boli značne poškodené,
fragmentované (viac ako 900 úlomkov) a dislokované (Gill et al., 1994). V roku 2007 boli
nájdené kostrové pozostatky dvoch ďalších jedincov, ktorí mohli byť deťmi cárskeho páru
(Coble et al., 2009).

22
 Pri prvej analýze v roku 1994 boli určené STR profily všetkých osôb amplifikáciou
piatich lokusov, označené ako: HUMVWA/31, HUMTH10, HUMF13A1, HUMFES/FPS
a HUMACTBP2 (Gill et al., 1994).
Pri ďalšej autozomálnej STR analýze týchto pozostatkov (vybratých), spolu so
vzorkami z dvoch ďalších jedincov (objavených v roku 2007), bolo možné určiť príbuzenské
vzťahy medzi oboma nálezmi. Vtedy bolo ampifikovaných 15 autozomálnych STR lokusov
prostredníctvom AmpFlSTR Identifiler a AmpFlSTR Mini Filer kitov (Applied Biosystems)
(Coble et al., 2009). A 17 Y-STR lokusov pomocou AmpFlSTR Yfiler kitu (Applied
Biosystems)pre zistenie haplotypu cára a jeho pravdepodobného syna (Alexandra), žijúceho
príbuzného v mužskej línii.
Na analýzu získaných fragmentov bol použitý 3100 alebo 3130xl Genetic Analyzer
(Applied Biosystems), získané údaje boli vyhodnotené v GeneScan software v3.7, Genotyper
v3.7NT alebo v Genemapper® v3.2. Získané údaje sú uvedené v Tab. 6.
Marker Mikuláš II. Alexandra Oľga Tatiana Mária/ Mária/ Alexander
Anastázia Anastázia
Vzorka 4.3 Vzorka 7.4 Vzorka 3.46 Vzorka 5.21 Vzorka 6.14 Vzorka 147 Vzorka146.1
AMEL XY XX XX XX XX XX XY
D3S1358 14, 17 16, 18 17, 18 17, 18 16, 17 17, 18 14, 18
TH01 7, 9.3 8, 8 8, 9.3 7, 8 8, 9.3 7, 8 8, 9.3
D21S11 32.2, 33.2 30, 32.2 30, 33.2 32.2, 33.2 30, 33.2 30, 33.2 32.2, 33.2
D18S51 12, 17 12, 13 12, 12 12, 12 13, 17 12, 7 12, 17
D5S818 12, 12 12, 12 12, 12 12, 12 12, 12 12, 12 12,12
D13S317 11, 12 11, 11 11, 11 11, 11 11, 11 11, 11 11, 12
D7S820 12, 12 10, 12 12, 12 10, 12 12, 12 10, 12 12, 12
D16S539 11, 14 9, 11 11, 11 11, 11 11, 14 9, 11 11, 14
CSF1PO 10, 12 11, 12 11, 12 11, 12 10, 11 10, 12 10, 12
D2S1338 17, 25 19, 23 17, 19 23, 25 17, 19 17, 23 23, 25
vWA 15, 16 15, 16 15, 16 15, 16 16,16 15, 16 15, 16
D8S1179 13, 15 16, 16 13, 16 15, 16 13, 16 15, 16 15, 16
TPOX 8, 8 8, 8 8, 8 8, 8 8, 8 8, 8 8, 8
FGA 20, 22 20, 20 20, 22 20, 20 20, 22 20, 22 20, 22
D19S443 13, 13.2 13, 16.2 13.2, 16.2 13.2, 16.2 13, 16.2 13, 13 13, 13.2
Tabuľka 6: Autozomálne STR profily Romanovcov (Coble et al., 2009).

Keďže autozomálny STR profil je tvorený dvomi alelami, jednou od otca a druhou od
matky, možno na základe ich zostavenia sledovať pravdepodobný vzťah rodič- dieťa. V tomto
prípade mali pravdepodobné deti po jednej alele od každého z rodičov. Tento predpokladaný
príbuzenský vzťah by však musel byť podložený štatisticky, napríklad použitím
pravdepodobnostného pomeru (LR, z anglického likehood ratio) a potvrdený ďalšími

23
molekulárnymi analýzami, ako je analýza mitochondriálnej DNA a STR lokusov na Y
chromozóme v prípade mužských jedincov (Coble et al., 2009).
Tento výskum je ukážkou identifikácie jedinca na základe predpokladaného
príbuzenského vzťahu.

4.2.3.2 Mikuláš Kopernik

V roku 2005 boli vo Fromborkskej katedrále vyzdvihnuté pozostatky, približne 60-70

ročného muža, pravdepodobne patriace Mikulášovi Kopernikovi. Ako porovnávacia vzorka
bola použitá DNA získaná zo vzorky vlasov, nájdených v knihe Calendarium Romanum
Magnum, ktorá pôvodne patrila Kopernikovi. Autozomálny STR profil pozostatkov bol
získaný pomocou Identifiler kit (Applied Biosystems), pričom z 15 lokusov boli získané
amplikony len v šiestich prípadoch (Tab. 7).
Marker Príslušná alela
D8S1179 11, 14
D3S1358 16, 18
TH01 9.3
D19S433 13
VWA 14, 15
D5S818 12
Tabuľka 7: Autozomálny STR profil pravdepodobných pozostatkov Mikuláša Kopernika (Bogdanowicz et al.,
2009).

Získané profily sa zhodovali v úspešne amplifikovaných alelách. Preto možno

predpokladať, že sa v prípade kostrových pozostatkov jedná skutočne o známeho poľského
hvezdára, pokiaľ budeme zároveň predpokladať, že vlasy nájdené v knihe patrili jemu
(Bogdanowicz et al., 2009).
Práca je ukážkou porovnania jedinca s jeho vlastnou vzorkou, kedy nepredpokladáme
polovičnú zhodu STR profilu, na rozdiel od predchádzajúceho prezentovaného prípadu, kedy
v prípade potomka predpokladáme polovičnú zhodu (v prípade lokusov, pre ktoré rodičia
nezdieľajú navzájom rovnakú alelovú kombináciu).

24
4.3 Molekulárne určenie pohlavia

Určenie pohlavia je dôležitou premenou, ktorá umožňuje rekonštrukciu pohlavne-

špecifických údajov, ktoré umožňujú pochopenie úloh jednotlivých pohlaví v spoločnosti.
Použitie klasických antropologických metód umožňuje určenie pohlavia na základe
morfologických znakov, ktoré sú pohlavne podmienené pohlavným dimorfizmom.
Tieto postupy však nemožno spoľahlivo použiť na určenie pohlavia pri nedospelých
jedincoch, alebo pri jedincoch, u ktorých je nedostatočný rozvoj sekundárnych pohlavných
znakov na kostre, prípadne sa skelet zachoval výrazne porušený.

4.3.1 Amelogenin

Molekulárne určenie pohlavia kostrového materiálu je založené na amplifikácii

amelogeninového génu (Amel), ktorý patrí ku génom vyskytujúcich sa na pohlavných
chromozómoch.
Amelogeninový gén bol prvýkrát osekvenovaný Nakahorim et al. v roku 1991,
prístupové číslo v databáze GenBank je pre AmelX M55418 a pre AmelY M55419 (Hass-
Rochholz et Weiler, 1997).
Rozoznávane dve jeho formy. Jedna sa nachádza na Y chromozóme na pozícii 11p12.2
(ďalej len AmelY), má dĺžku 3272 bp. Jemu homologický gén na X chromozóme je
lokalizovaný na pozícii 22p31-22p1 (ďalej len AmelX) v dĺžke 2872 bp.
Hlavnou výhodou tohto génu je jeho rozdielna veľkosť foriem na oboch
chromozómoch. Okrem toho obsahuje pomerne veľkú časť, ktorá je konzervatívna, ide o 19
oblastí s rozsahom homológie od 22 do 80 bp (Faerman et al., 1995).
Obe varianty génu môžu byť amplifikované s použitím jednej sady primerov, ktoré
nasadajú na rovnakú oblasť na AmelY i AmelX géne. Táto cieľová oblasť génu začína medzi
intrónom 2-3, zahŕňa exón 3 a končí na intróne 4. Zahŕňa štrnásť vysoko konzervatívnych
pohlavne-špecifických polymorfných regiónov, okrem toho je AmelY gén o šesť báz dlhší ako
AmelX gén.

25
 SNP Zmena bázy Pozícia bp na AMELX Pozícia bp na AMELY
1 T/C 3906 4514
2 T/A 3917 4525
3 A/C 3940 4548
4 G/A 3960 4568
5 C/T 4041 4649
6 T/C 4044 4652
7 G/A 4052 4660
8 A/G 4056 4664
9 A/G 4059 4667
10 G/C 4061 4669
11 T/G 4086 4694
12 T/G 4089 4697
13 T/C 4097 4705
14 G/A 4104 4712
„Nepárový úsek“ Začiatok 4107 4715
(AmelY) Koniec 4107 4720
Tabuľka 8: Lokalizácia SNP a „nepárového úseku“ vo vnútri Amel génu spolu s uvedením čísla metódy, pri
ktorej sa používajú v poslednom stĺpci. Údaje uvedené v tabuľke boli skomprimované z informácií
zhromaždených na Ensembl Genome Borowser (Gibbon et al, 2009).

Využívané sú dva systémy identifikácie pohlavia založené na Amel géne. Prvý využíva
analýzu desiatich pohlavne špecifických jednonukleotidových polymorfizmov (SNP,
z anglického single nucleotid polymorphism) (Tab.8), na určenie prítomnosti oboch typov
pohlavných chromozómov (X a Y pri mužoch), alebo len jedného typu (X pri ženách).
Následný produkt amplifikácie je vyhodnotený v podobe elektroferogramu (poradie
nukleotidov v sekvencii) (Obr. 4).

Ženská vzorka Mužská vzorka

Obrázok 4 : Ukážka ženského a mužského elektroferogramu ukazujúci polymorfizmy 5,6 a 7, popísané v Tab. .
Pri mužoch je viditeľná prítomnosť alely na Y chromozóme (Gibbon et al, 2009).

Druhý systém je založený na rozličnej dĺžke AmelY a AmelX génov v kombinácii

s vybranými SNP použitými v prvom systéme.
V tomto prípade je okrem elektroferogramu použitá i elektroforéza, pretože dĺžka
produktov PCR je v prípade oboch génov odlišná. Pri mužoch nachádzame dva pruhy (Obr.
5), zatiaľ čo u žien len jeden (oba produkty PCR majú rovnakú dĺžku) (Obr. 5). Rovnako po

26
nafarbení eketroforetického gelu sú viditeľné dva izolované úseky, s rozličnou dĺžkou, len
u mužov (Obr. 5).
Výhodou molekulárneho určenia pohlavia je skutočnosť, že nemusím poznať etnikum,
z ktorého jedinec pochádza.
Na rozdiel od antropologického určenia je totiž možné použiť túto metódu na
akéhokoľvek jedinca (Gibbon et al, 2009).

Kľúč :
MW – molekulárna hmotnostná značka
L - definovaná referenčná veľkostná značka
AM – ázijský muž
AF – africká žena
EM – európsky muž
EF – európska žena

Obrázok 5: Príklad určenia pohlavia na základe metódy číslo 2 na Bio-Rat automatizovanej gelovej
elektroforéznej stanici. 188 bp produkt zodpovedá časti amplifikovaného AmelX a 194 bp produkt je amplikon
AmelY (Gibbon et al, 2009; upravené).

Problémom pri DNA analýze Amel génu je skutočnosť, že ak dôjde k amplifikácii len
alely X, existuje stále ešte možnosť, že jedinec bol mužského pohlavia, ale alela Y nebola
amplifikovaná. Pokiaľ sa preukáže prítomnosť alely Y, je výsledok nepopierateľný. Táto
nevýhoda môže byť zmiernená osekvenovaním amplikonu a hodnotením nielen veľkosti
produktu, ale i SNP. Ešte lepšie výsledky však vykazuje amplifikácia úsekov na Y
chromozóme, súbežne s amplifikáciou Amel génu.

4.3.2 Krátke tandemové repetície na X a Y chromozómoch

Okrem Amel génu sú pri forenznej analýze alebo aDNA často využívané i krátke
tandemové repetície na X a Y chromozóme. Tieto pomáhajú vyriešiť problém s alelickými
výpadkami, a teda i nesprávne určenie pozostatkov.
V týchto prípadoch sa používa mnohonásobná PCR, ktorá využíva ako templátové
molekuly aDNA a poskytuje amplikony s dĺžkou 91-166 bp. Pre aDNA navrhnuté napríklad
Schmidtovou et al. (2003), kedy boli amplifikované lokusy DYS391 a DYS392 na Y

27
chromozóme, DXS6789 a DXS9898 na X chromozóme, ktoré patria medzi polymorfné
markery.
V súčasnej dobe sa však obvykle používajú STR na Y chromozóme oveľa častejšie ako
v prípade STR na X chromozóme.

4.3.2.1 Krátke tandemové repetície na Y chromozóme

Metodológia amplifikácie a interpretácie STR na Y chromozóme (Y-STR) bola

vytváraná súbežne s autozomálnymi STR. Ich štruktúra sa nelíši od autozomálnych STR.
V súčasnosti je známych viac ako 220 rozdielnych STR, potencionálne použiteľných na
identifikáciu ľudského Y chromozómu (Butler et Reeder, 1997).
Pre forenznú prax sa používajú Y-STR, ktoré nie sú homologické k STR na X
chromozóme (Tab. 9). Preto tvoria haplotyp a na základe získaných alel daných lokusov sú
jedinci zaradení do haploskupiny.
Alelové
Názov rozpätie Prístup na Príslušná Mutačná
Repetitívna sekvencia
markeru (počet GenBank alela hodnota
repetícií)
DYS19 10-19 [TAGA]3tagg[TAGA]n (t. s.) AC017019 15 0,25 %
DYS385 a/b 7-28 [GAAA]n (t. s.) AC022486 11 0,21 %
DYS389 I 9-17 (TCTG) (TCTA)(TCTG) AC004617 12, 29 0,24 %
DYS389 II 24-34 (TCTA) AC004617 12,19 0,35 %
DYS390 17-28 [TCTG]n [TCTA]m[TCTG]p[TCTA]q (t. s.) AC011289 24 0,25 %
DYS391 6-14 [TCTA]n (t. s.) AC011302 11 0,28 %
DYS392 6-17 [TAT]n (t. s.) AC011745 13 0,07 %
DYS393 9-17 [AGAT]n (t. s.) AC006152 12 0,08 %
DYS437 13-17 [TCTA]n[TCTG]2[TCTA]4 (t. s.) AC002992 16 0,13 %
DYS438 6-14 [TTTTC]n (t. s.) AC002531 10 0,07 %
DYS439 9-14 [GATA]n (t. s.) AC002992 13 0,61 %
DYS448 20-26 [AGAGAT]nN42[AGAGAT]m (t. s.) AC025227 22 0,11 %
DYS456 13-18 [AGAT]n (t. s.) AC010106 15 0,53 %
DYS458 13-20 [GAAA]n (t. s.) AC010902 16 1,06 %
[TCTA]4(TGTA)2[TCTA]2(TGTA)2[TCTA]2
DYS635 17-27 AC004772 23 0,46 %
(TGTA)0,2[TCTA]n (t. s.)
8-13 [TAGA]nATGGATAGATTA[GATG]pAA
Y-GATA-H4 AC011751 12 0,43 %
(25-30) [TAGA]q (t. s.)
Tabuľka 9: Prehľad najpoužívanejších Y-STR, ich chromozomálna lokalizácia, príslušná repetitívna sekvencia
a prístupové číslo do GenBank. Lokalizácia repetitívnej sekvencie na hornom vlákne DNA (t. s. z anglického top
strand) alebo na dolnom vlákne (b. s. z anglického bottom strand) (Y chromosome haplotype reference database
(Willuweit et Roewer , 2000) a Short Tandem Repeat DNA Internet DataBase (Butler et Reeder, 1997)).

28
 Takto získané Y-STR profily sú používané najmä pri určovaní otcovskej línie. Slúžia
teda ako protiklad k mitochondriálnej DNA, ktorá slúži na určenie materskej línie. Okrem
amplifikácie STR na Y chromozóme sa niekedy v prácach môžeme stretnúť i s amplifikáciou
úseku pohlavie určujúceho génu (SRY, z anglického sex-determination gene) (Kastelic et al.,
2009). Tento však, na rozdiel od Y-STR, slúži výhradne na určenie pohlavia.

4.3.3 Príklad určenia pohlavia

Určenie pohlavia je jedným zo základných krokov pri molekulárnej analýze kostrových

pozostatkov. Týmto spôsobom bolo možné dokázať, že lebka v hrobke, ktorá mala patriť
spisovateľovi Francescovi Petrarcovi, v skutočnosti patrí neznámej žene. Zvyšné kostrové
pozostatky však patrili jedincovi mužského pohlavia. DNA bola izolovaná zo zubov (moláry)
a rebier a molekulárne určenie pohlavia bolo vykonané prostredníctvom mnohonásobnej PCR.
V jednej reakcii bola spoločne amplifikovaná oblasť prvého intrónu Amel a malá časť
(93 bp) SRY génu, v celkovom objeme reakčnej zmesi 25 μl s použitím Taq polymerázy.
Produkty reakcie boli následne podrobené elektroforéze v 5% agarózovom gele (doba
trvanie elektroforézy bola dve hodiny pri 50 V) a ofarbené ethidium bromidom.
PCR Rebro (prvá extrakcia) Rebro (druhá Zub (tretia extrakcia) Zub (štvrtá extrakcia)
extrakcia)
1 112-106-93 93 106 106
2 112-106-93 112-106-93 106 106
3 112-93 112 106 106
4 93 112-106-93 106 106
5 106-93 106-93 106 106
6 112-106-93 112-106-93 106 106
Tabuľka 10: Výsledok amplifikácie Amel a SRY (Caramelli et al., 2007).

V prípade jedinca mužského pohlavia by sa vo vzorke mali nachádzať amplifikované

tri rôzne dlhé sekvencie. 112 bp dlhý úsek, ktorý zodpovedá prvému intrónu AmelY génu, 106
bp úsek, zodpovedajúci AmelX gému a 93 bp úsek, ktorý zodpovedá úseku SRY génu (Tab.
10).
V prípade vzoriek získaných zo zubov, bol však prítomný len amplikon zodpovedajúci
AmelX génu. Tento nález sa zhodoval i s antropologickou morfologickou analýzou
a s uhlíkovým rozborom, ktorý určil, že lebka je o dvesto rokov staršia ako zbytok kostry,
a preto k nej nemôže patriť (Caramelli et al., 2007).

29
4.4 Mitochondriálna DNA

Ľudská mitochondriálna DNA (mtDNA) predstavuje kružnicovú molekulu s veľkosťou

16569 bp, ktorá sa vyskytuje v živočíšnej bunke približne v 500 kópiách.
Skutočnosť, že sa mtDNA dedí len v materskej línii, spolu s vysokým počtom mutácií,
z nej robí užitočný zdroj odpovedí na evolučné otázky, týkajúce sa vyhynutia jednotlivých
druhov alebo migrácie ľudí v minulosti (Parsons et al., 1997). Taktiež poskytuje možnosť
určenia príbuznosti v materskej línii, čo môže poslúžiť pri určení totožnosti osôb a rodinných
vzťahov medzi jednotlivcami.
Štúdie mtDNA vykazujú značnú spojitosť s geografickým regiónom. Jedinci
s rovnakou sekvenčnou variáciou tvoria haploskupinu, ktorá je definovaná mutáciami na
jednotlivých nukleotidových pozíciách (Tab. 11), takzvanými SNP (Wallace et al., 1999).
Súčasné členenie na základné haploskupiny bolo získané po priložení mtDNA sekvencií
jedincov definovaného etnika s tzv. Cambridgskou sekvenciou, ktorá predstavuje prvú
kompletne osekvenovanú molekulu mtDNA (Anderson et al., 1981). Poradie nukleotidov tejto
sekvencie bolo opakovane overené v roku 1999 (Andrews et al., 1999), od pôvodne určenej
sekvencie sa odlišuje v osemnástich nukleotidoch a v súčasnej dobe je sekvencia prístupná
v GenBank (NC_012920, GI:251831106) ako takzvaná revidovaná Cambridgská sekvencia
(rCRS) (Ruiz-Pesini et al., 2007).
Najväčší sekvenčný polymorfizmus vykazuje D-slučka kontrolného regiónu (nazvaná
podľa štruktúry viditeľnej v elektrónovom mikroskope počas mtDNA replikácie),
lokalizované v blízkosti terminologického začiatku mitochondriálneho genómu. Táto oblasť
pozostáva z približne 600 bp tvoriacich hypervariabilnú oblasť I a II (HVRI a HVRII)
(Budowle et al., 1999).
HVRI sa vyskytuje medzi nukleotidovými pozíciami 16024 až 16365. HVRII začína na
nukleotidovej pozícii 73 a končí na pozícii 340. HVR tvoria približne 3% variability medzi
jednotlivcami. Okrem HVR nie sú polymorfné miesta rozložené uniformne, ale nachádzajú sa
v blokoch nazývaných horúce body (Stoneking, 2000).
Ak je pozmenená mtDNA prenesená z matky do ďalšej generácie, vznikajú nové
subpopulácie, ktoré sú základom pre určenie identity osoby, materskej línie, prípadne odhadu
etnika, z ktorého jedinec pochádza.

30
 Nukleotidová pozícia a báza* Pôvodné
Haplo- 8272- rozšírenie
skupina 8280 13263 1719 5178 663 10398 10400r† 3594r 7028r 12406 4833 7600
del
A C A G C G A C C T G A G AS/NA
B G A G C A A C C T G A G AS/NA
C C G G C A G T C T G A G AS/NA
D C A G A A G T C T G A G AS/NA
E C A G C A G T C T G A A AS
F C A G C A A C C T A A G AS
G C A G C A G T C T G G G AS
H C A G C A A C C C G A G EU
I C A A C A G C C T G A G EU
L1/2 C A G C A G C T T G A G AF
L3 C A G C A G C C T G A G AF/E/AS
M C A G C A G T C T G A G AS/NA
N C A G C A A C C T G A G E/AS/NA
X C A A C A A C C T G A G E/AS/NA
* zvýraznené bázy sú odlišné ako revidovaná Cambridgská referenčná sekvencia (haploskupina H) a používajú sa
na rozlíšenie typu haploskupiny
Tabuľka 11: Typické SNP podmieňujúce zaradenie do haploskupiny. EU je označenie európskej haploskupiny,
AS ázijskej haploskupiny, AF africkej haploskupiny a NA je označením haploskupiny vyskytujúcej sa
u natívnych Američanov (Nelson et al., 2007).

V niektorých prípadoch sa stretávame s javom nazývaným heteroplazmia (čo sa prejaví

pri sekvenovaní PCR produktu výskytom dvoch rozdielnych nukleotidov na jednej pozícii).
Vtedy sa u jedného jedinca populácie vyskytuje zmes dvoch alebo i viacerých subpopulácií
mtDNA.

4.4.1 Amplifikácia a analýza mtDNA

Tradičné protokoly, vypracované pre analýzu mtDNA vo forenznej praxi, sú založené

na amplifikácii a následnom sekvenovaní dvoch hypervariabilných regiónov HVR-I a HVR-II
v mitochondriálnej kontrolnej oblasti. Primery používané bežne amplifikujú oblasti dlhé 300-
400 bp v každom regióne, ktoré sú väčšie, ako je odporúčaná maximálna hodnota amplikonu
aDNA, a preto môžu spôsobiť výpadok amplikonu, pokiaľ je templátom degradovaná vzorka.
Bolo teda nutné navrhnúť sady primerov, ktorými by bolo možné amplifikovať dostatočne
veľkú časť HVR a zároveň by veľkosti amplikonov nepresahovali odporúčanú hodnotu
(Gabriel et al., 2001). Úpravu primerov, ktorá je často používaná v prípade aDNA, navrhol
Gabriel et al. (Tab. 12). Veľkosť získaných amplikonov je v rozmedzí 126-170 bp. S ich
použitím stúpla úspešnosť PCR, pri ktorej bola templátom degradovaná vzorka.

31
 Rozsah
Názov mini- Veľkosť Primery –
Sekvencia primeru amplifikovanej
primer sady amplikonu lokalizácia
oblasti
F15989 5’-CCCAAAGCTAAGATTCTAAT-3’
MPS1A 170 16009-16138
R16158 5’-TACTACAGGTGGTCAAGTAT-3’
F16112 5’-CACCATGAATATTGTACGGT-3’
MPS1B 126 16132-16217
R16237 5’-TGTGTGATAGTTGAGGGTTG-3’
F16190 5’-CCC CATGCTTACAAGCAAGT-3’
MPS2A 133 16210-16302
R16322 5’-TGGCTTTATGTACTATGTAC-3’
F16268 5’-CACTAGGATACCAACAAACC-3’
MPS2B 143 16288–16390
R16410 5’-GAGGATGGTGGTCAAGGGAC-3’
F34 5’-GGGAGCTCTCCATGCATTTGGTA-3’
MPS3A 126 57–135
R159 5’-AAATAATAGGATGAGGCAGGAATC-3’
F109 5’-GCACCCTATGTCGCAGTATCTGTC-3’
MPS3B 132 133–219
R240 5’-TATTATTATGTCCTACAAGCA-3’
F151 5’-CTATTATTTATCGCACCT-3’
MPS4A 142 169–273
R292 5’-ATTTTTTGTTATGATGTCT-3’
F220 5’-TGCTTGTAGGAC ATAATAAT-3’
MPS4B 158 240–357
R377 5’-GTGTTAGGGTTCTTTGTTTT-3’
Tabuľka 12: Prehľad primerov navrhnutých na amplifikáciu HVRI a HVRII z degradovaných vzoriek (Gabriel et
al., 2001; upravené).

Ďalšiu úpravu primerov pre oblasť HVRI spravili Eichmann et Parson (2008), ktorí
navrhli dve sady primerov, umožňujúce mnohonásobnú vzájomnú amplifikáciu počas jednej
PCR, vďaka čomu je možné súbežne amplifikovať viacero úsekov mtDNA, čo je veľmi
vhodné najmä pri malom množstve templátu.
Nový spôsob získania kompletnej mtDNA sekvencie z archaickej vzorky bol navrhnutý
Rogaevom et al (2009).

Obrázok 6: Získanie kompletnej sekvencie mitochondriálneho genómu z pravdepodobných pozostatkov

Alexandra, jeho sestry a ich rodičov. Krátke amplikony sú uvedené vo vnútri mitochondriálneho genómového
kruhu (Rogaev et al., 2009).

32
 Pomocou sady navrhnutých primerov dokázali z krátkych amplikonov zrekonštruovať
kompletný mitochondriálny genóm jedinca (Obr. 6). Vďaka tomu možno porovnať nielen
štandartne používané HVR, ale celú sekvenciu genómu, vrátane jednonukleotidových
polymorfných miest, ktoré by nebolo možné zachytiť.
Mitochondriálna DNA ponúka možnosť určenia identity jedinca v materskej línii.
Neznamená to však, že títo jedinci sú blízkymi príbuznými. Amplifikácia HVR je dnes skôr
používaná na určenie etnickej príslušnosti jedinca a identifikačnú úlohu preberajú vybrané
jednonukleotidovo polymorfné miesta, nachádzajúce sa mimo kontrolný región.

4.4.2 Príklad využitia mitochondriálnej DNA – Jesse James

V júli roku 1995 boli z cintorína v Kenarney (štát Nebraska) exhumované pozostatky,
pravdepodobne patriace Jessemu Jamesovi, legendárnemu zločincovi. Okrem vzoriek kostí (z
femuru a tibie) a zubov (tri moláry a caniny), získaných z tohto miesta, boli použité vzorky
vlasov z pôvodného miesta uloženia pozostatkov, z Jamesovej farmy, odkiaľ boli
premiestnené v roku 1978. Na analýzu mitochondriálnej línie boli vybraní dvaja žijúci
potomkovia jeho sestry Susan, ktorí by mali s ním zdieľať rovnakú mtDNA sekvenciu
a poskytli krvnú vzorku (Obr. 7).

Obrázok 7: Genealógia príbuzných v materskej línii Jesseho Jamesa. RJ je pravnukom a MN prapravnukom

Jesseho sestry Susan. U oboch je predpokladaná rovnaká mtDNA sekvencia ako u Jesseho (Stone, et al., 2001).

33
 Vo všetkých prípadoch bol amplifikovaný úsek HVR1. Získané výsledky boli
reprodukovateľné v prípade vzoriek izolovaných z vlasov a z dvoch molárov. Získané
sekvencie boli porovnané s revidovanou Cambridgskou sekvenciou a so sekvenciami
potencionálnych príbuzných (Tab. 13).
Vzorka Pôvod Nukleotidová pozícia
vzorky 16129 16274 16294 16296 16304
rCS T G C C T
C Molár C A T T C
F Molár C A T T C
H-1 Vlasy C A T T C
H-2 Vlasy C A T T C
RJ Krv C A T T C
MN Krv C A T T C
Tabuľka 13 : MtDNA sekvencie získané z pozostatkov a vzoriek od príbuzných (Stone, et al., 2001).

Porovnané sekvencie získané zo všetkých vzoriek. Aby vylúčili možnosť, že

pozostatky patria osobe, ktorá nebola s Jessem Jamesom príbuzná, ale mala rovnakú sekvenciu
mtDNA, vyhľadali sekvenciu v databáze (Technical Workung Group on DNA Analysis
Methods), ktorá obsahuje 2426 sekvencií, z ktorých ani jedna nebola zhodná so získanou.
Preto nie je veľmi pravdepodobné, žeby nepríbuzná osoba zdieľala rovnakú sekvenciu DNA.
Na potvrdenie identity pozostatkov by boli potrebné ďalšie analýzy, napríklad
vypracovanie STR profilu, za predpokladu, žeby sa našla vhodná zrovnávacia vzorka (Stone,
et al., 2001).

5 Antropologicko-genetická identifikácia
Každá z doteraz prezentovaných metód poskytuje sama o sebe len určitú časť
informácií. Na získanie komplexnej identifikácie osoby je najvhodnejšie použiť čo najväčšie
množstvo metód.
Kombinácia antropologických a genetických prístupov nám poskytuje základné
vzhľadové charakteristiky spolu s genetickým profilom.

34
5.1 Identifikácia neznámych pohrešovaných osôb

Rozsiahle skúsenosti so skúmaním pozostatkov neznámych osôb, pochádzajúcich

z obdobia druhej svetovej vojny a rozpadu Juhoslávie (1992-1995) majú chorvátski vedci. Na
ukážku kombinovaného prístupu k pozostatkom boli vybrané prípady pochádzajúce z druhého
zmieneného vojnového konfliktu.
Pozostatky celkovo 674 osôb boli počas dvanástich rokov výskumu exhumované
z viacpočetných hrobov na viac ako tridsiatich lokalitách Chorvátska, následne boli presunuté
na Oddelenie patológie a forenznej medicíny v Splitskej univerzitnej nemocnici. K dispozícii
bol zoznam osôb, ktoré zostali po roku 1995 nezvestné. V približne 50% prípadov boli
k dispozícii záznamy zaobstarané ante-mortem, zahŕňajúce údaje zozbierané od príbuzných
spolu s lekárskymi a stomatologickými záznamami. Forenzná expertíza taktiež zahŕňala
preskúmanie odevu, obuvi iných nálezov objavených pri pozostatkoch. V prípade, ak
nepodľahli všetky mäkké tkanivá rozkladu, bolo možné vykonať autopsiu.
V prípade kostrových pozostatkov bolo určené pohlavie, odhadnutý vek a výška
postavy postupom popísaným v Krogmanovi a Iscanovi (1986) a v Ubelakerovi (1999).
Antropologická charakteristika kostí, patologické zmeny a traumy boli popísané. Nasledovalo
porovnanie posmrtného stavu chrupu s ante-mortem záznamami. V prípadoch s dochovanými
fotografiami nezvestných bola lebka superprojekovaná do fotografie(Andelinović, et al.,
2005).
Najpodrobnejšie antropologické publikované záznamy pochádzajú z roku 1996 od
Primoraca et al.. Tí študovali 61 pozostatkov, pochádzajúcich zo šiestich masových hrobov,
z ktorých boli všetky vo vysokom štádiu rozkladu. Päťdesiatosem malo kompletnú alebo
čiastočne vojenskú uniformu a dvaja boli oblečení ako civilisti, v jednom prípade nebol
nájdený odev. Sedem tiel bolo čiastočne alebo úplne saponifikovaných a jedno karbonizované.
Pohlavie všetkých kostier bolo určené ako mužské.
V prípade 32 pozostatkov bola výška odhadnutá na základe dlhých kostí, vo viac ako
polovici prípadov toto možné nebolo. Dentálne záznamy potvrdili identitu 15 osôb.
Špeciálne znaky ako staré jazvy a fraktúry boli použité v siedmich prípadoch. Len 19
osôb bolo identifikovaných na základe dentálnych a lekárskych záznamov.
Táto nízka úspešnosť bola spôsobená dvoma faktormi: nedostatkom predsmrtných
záznamov a veľkým počtom, extrémne poškodených lebiek bez zachovaných horných alebo

35
dolných čeľustí, prípadne oboch. Superprojekcia bola použitá na porovnanie lebiek obetí
s fotografiami.
Identita 577 telesných pozostatkov (85,6%) bola potvrdená klasickou forenznou
antropologickou analýzou. Len 14,4% nálezov sa kvôli nedostatočným záznamom a zlej
zachovalosti materiálu nepodarilo určiť.
Okrem klasickej forenznej analýzy bola na niektoré pozostatky (spolu 1150 vzoriek)
použitá i molekulárna analýza, zahŕňajúca vytvorenie DNA profilov neznámych obetí.
DNA bola izolovaná prevažne z kostí dlhého typu (Tab. 14), pričom povrch kostí bol
najprv mechanicky očistený a následne opakovane umývaný detergentami a destilovanou
vodou. Vysušené vzorky boli rozomleté na prášok. K 2 mg prášku boli následne pridané 3ml
izolačného pufru (zloženého z: 10 μmol/l Tris, 100 μl/l NaCl, 50 μmol/l EDTA, 0,5 % SDS
a 100 μl 20 mg/ml proteinázy K). Vzorky boli inkubované 48 hodín pri teplote 56 oC a DNA
bola z roztoku izolovaná fenol-chloroform-izoamylalkoholovou extrakciou.
Neskôr bol tento systém nahradený DNA IQ Isolation System (Promega). Ten je
založený na použití magnetických častíc pri príprave čistej vzorky pre STR analýzu .
Typ kosti Počet Dna izolácií ročne Počet úspešných amplifikácií DNA ročne
2000 2001 2002 2003 2004 spolu 2000 2001 2002 2003 2004 2001spolu
Femur 15 69 46 76 13 219 80 91 87 97 100 92
Zuby 6 63 6 11 0 86 67 89 100 100 / 90
Lebka 2 5 5 0 1 13 100 60 60 / 100 69
Humerus 1 6 6 0 3 16 100 67 100 / 67 81
Ulna 1 3 1 1 0 6 0 100 100 0 / 67
Radius 1 1 1 0 0 3 100 100 100 / / 100
Mandibula 0 1 0 0 0 1 / 0 / / / 0
Rebro 0 2 0 0 0 2 / 0 / / / 0
Calcaneus 0 0 1 0 0 1 / / 0 / / 0
Panva 0 0 4 0 0 4 / / 75 / / 75
Tibia 0 0 9 1 8 18 / / 89 100 100 94
Sacrum 0 0 1 0 0 1 / / 100 / / 100
Fibula 0 0 2 0 0 2 / / 100 / / 100
Neznáme 21 2 17 0 0 40 100 50 88 / / 93
Spolu 47 152 99 89 25 412 87 86 87 97 96 89
Tabuľka 14: Úspešnosť DNA amplifikácie z rozdielnych kostrových pozostatkov v rokoch 2000-2001
(Andelinović et al., 2005).

Vzorky boli amplifikované v Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 (Perkin

Elmer), s použitím AmpliType PM + DQA1 PCR Amplification and Typing
Kit, AmpliFlPD1S80 (Perkin Elmer), AmpFLSTR Profiler PCR Amplification Kit,
AmpFlSTR Profiler Plus PCR Amplification Kit, AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification

36
Kit (Applied Biosystems), GenePrint-PowerPlex 16 System (Promega) alebo s Y-Plex 6
(ReliaGene Technologies), v závislosti na období (Tab. 15).
Tieto sady sa líšia v počte s druhu amplifikovaných STR lokusov, napríklad GenePrint-
PowerPlex 16 System obsahuje primery pre lokusy: Penta E, D18S51, D21S11, TH01,
D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820,
D13S317 a D5S818 (http://www.cstl.nist.gov/strbase/images/powerplex16.pdf). AmpFlSTR
Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems) amplifikuje lokusy: CSF1P0,
D7S820, D8S1179, D21S11, D2S1338, D3S1358, D13S317, D16S539, TH01, D18S51,
D19S433, TPOX, vWA, D5S818, FGA, a amelogenin
(https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=6017
05).
Rok Analyzované vzorky Počet % Použitý DNA Počet % pozitívnej identifikácie
Štandartné DNA úspešných amplifikačný systém Štandartné DNA Kombinované
forenzné určenie DNA forenzné určenie metódy
metódy amplifikácií metódy
1993 118 / / / 77,1 / /
1994 120 11 9,1 AmpliType PM+DQA1 90,8 / 9,1
1995 44 12 8,3 86,4 / 8,3
1996 177 15 13,3 73,5 / 13,3
1998 117 15 20,0 94,9 / 20,0
1999 98 16 62,5 AmpFLSTR Profiler™ 100 / 62,5
2000 / 47 87,2 / 17,1 /
2001 / 152 86,2 AmpFLSTR Profiler™, / 16,8 /
AmpFLSTR Profiler
Plus™,
GenePrint®PowerPlex™
16, Y-Plex™6
2002 / 99 77,8 AmpFLSTR Identifiler™, / 36,0 /
AmpFLSTR Profiler™,
AmpFLSTR
Profiler Plus™,
GenePrint®PowerPlex™
16 Immobilized SSO
probe analysis
2003 / 89 96,9 AmpFLSTR / 34,9 /
Identifiler™Immobilized
SSO probe analysis,
Y-Plex™6
2004 / 25 96,0 AmpFLSTR Identifiler™, / 79,1 /
Y-Plex™6
Spolu 674 481 80,0 85,6 28,3 5,6
Tabuľka 15: Celkový prehľad identifikácií pozostatkov pochádzajúcich z masových hrobov. Počas roku 1997
boli skúmané krvné vzorky, ktoré boli následne použité pre zostavenie Chorvátskej populačnej databázy
(Andelinović et al., 2005).

37
 Okrem STR lokusov boli amplifikované i vzorky na analýzu mtDNA a Y-STR lokusy.
Pre určenie identity boli zostavené profily a tie boli následne zrovnané so vzorkami získanými
od rodinných príslušníkov (príklady popísané v kapitolách 2.2.3.1, 2.3.3 a 2.4.2). Celkovo
bolo pozitívne identifikovaných analýzou DNA 109 jedincov.
V tejto rozsiahlej niekoľkoročnej štúdii je možno sledovať kombináciu využitia
klasickej forenznej antropológie s molekulárnou biológiou (17 spoločných prípadov). Kde sa
tieto techniky navzájom dopĺňajú a dávajú tak ucelený obraz identifikácie (Andelinović et al.,
2005).

38
6 Diskusia

Pôvodne vychádzali antropologické metódy identifikácie z hodnotenia kostrových či

iných pozostatkov morfometrickými a morfoskopickými metódami. Postupne pribudli ďalšie
metódy, založené na mikroskopických a chemických technikách. Dnes je ďalšou možnosťou
použitie analýzy DNA. Najskôr mitochondriálnej, kvôli vysokému počtu molekúl v bunke,
neskôr i jadrovej.
Použitie metód klasických antropologických metód, rovnako ako metód molekulárnej
antropológie má pri identifikácii jedinca svoje klady i zápory. Klasická antropológia dokáže
poskytnúť charakteristiku nálezu. Medzi základné zisťované údaje patrí pohlavie, výška,
dožitý vek a etnická príslušnosť, ktoré sú veľmi dôležité pri eliminácii osôb. Ďalej je možné
použiť metódy rekonštrukcie podoby a zdravotného stavy na základe paleopatologickej
analýzy. Nedokážu nám však poskytnúť presné informácie o rodinnej príslušnosti či identite,
ak nie sú k dispozícii vhodné porovnávacie materiály (fotografie, röntgenové alebo zdravotné
záznamy a iné) .
Naopak molekulárne metódy, založené na vytvorení molekulárneho profilu, v prípade
použitia krátkych tandemových repetícií alebo zaradení jedinca do haploskupiny, v prípade
mitochondriálnej analýzy, nám dajú pomerne presnú informáciu o identite jedinca.
Podmienkou je však porovnávacia vzorka, buďto od samotného jedinca, prípadne od
pokrvného príbuzného. Analýza mtDNA dokáže odhadnúť etnickú príslušnosť osoby, ale na
základe DNA nie sme schopní zistiť ďalšie vzhľadové charakteristiky, i keď v niektorých
štúdiách sú snahy o určenie napríklad farby očí, na základe najčastejšie sa vyskytujúcich
jednonukleotidových polymorfizmov v géne HERC2, spojenom s rôznym zafarbením
dúhovky (Bogdanowicz, et al., 2009). Ďalšou nevýhodou týchto metód je ich finančná
náročnosť v porovnaní s klasickými antropologickými metódami.
Optimálnym riešením by malo byť spojenie oboch prístupov. V rámci literárnej rešerše
som sa však stretla s oddelením týchto dvoch metodických celkov. Pri identifikácii
recentnejších nálezov sú, na základe publikovaných článkov, oveľa častejšie využívané
metódy molekulárnej biológie, rovnako ako v prípade identifikácie významných osôb, pri
ktorých je k dispozícii porovnávacia vzorka, slúžiaca na vytvorenie profilov. Naopak pred

39
rozmachom éry molekulárnej identifikácie (v 90. rokoch dvadsiateho storočia) sa stretávame
takmer výlučne s využitím klasických forenzne-antropologických metód.
S kombináciou oboch možností sa stretávame len veľmi zriedka, v prípade
významných osobností, či rodín. Príkladom použitým v tejto práci je identifikácia pozostatkov
cárskej rodiny Mikuláša II. Alebo v prípade výskumu masových hrobov, pochádzajúcich
z nedávnych vojnových konfliktov, kedy nie je možné na všetky prípady použiť len
molekulárne biologické prístupy a zároveň je k dispozícii dostatok materiálu v dobrej kvalite
pre klasickú antropologickú analýzu.

40
7 Záver

Bakalárska práca Antropologicko-genetická identifikace kosterních pozůstatků

historických osobností je spracovaná formou literárnej rešerše.
Práca je rozdelená na tri hlavné celky: antropologická identifikácia, genetická
identifikácia a antropologicko-genetická identifikácia.
V prvej časti stručne predstavuje základné metódy používané pre odhad veku, výšky
postavy, etnickej afinity a určenie pohlavia na kostrových pozostatkoch. Ich použitie je
demonštrované na prípade nálezu pozostatkov cárskej rodiny Romanovcov v roku 1991.
Ďalšia kapitola je venovaná genetickej identifikácii pozostatkov, kde sú prezentované
postupy, ktoré nasledujú po izolácii a amplifikácii príslušných segmentov DNA. Popis týchto
techník nie je náplňou, a teda ani súčasťou práce. V práci sú rozobrané tri hlavné cesty určenia
molekulárnej identity osoby. Jedná sa o použitie krátkych tandemových repetícií na
autozómoch a následné zostavenie profilu jedinca. Ďalej použitie krátkych tandemových
repetícií na gonozómoch, so zameraním na STR vyskytujúce sa na nehomologickej časti Y
chromozómu, ktoré sú využívanie na zostavenie haplotypu mužského jedinca. Nasleduje
využitie mitochondriálnej DNA pri zaradení jedinca do haploskupiny a určenie materskej
mitochondriálnej línie. Okrem toho je v tejto časti práce zaradená podkapitola venovaná
molekulárnemu určenie pohlavia jedinca na základe amplifikácie amelogeninového génu,
ktorý sa vyskytuje na X i Y chromozóme, pričom sa odlišuje dĺžkou sekvencie na každom
z nich.
Posledná časť predstavuje príklad spojenia antropologického i genetického prístupu ku
kostrovým pozostatkom. Je demonštrovaný na rozsiahlom projekte identifikácie jedincov
z masových hrobov, ktorý zahŕňa viac ako šesťsto jedincov, nájdených na území dnešného
Chorvátska, pri ktorých boli v niektorých prípadoch použité obe metódy určovania totožnosti.

41
8 Použitá literatúra

Alonso, A. - Andelinović, S. - Martin, P. - Sutlović, D. - Erceg, I. - Huffine, E. - de Simon,

L. F. - Albarran, C. - Definis-Gojanovic, M. - Fernandez-Rodriguez, A. - Garcia, P. -
Drmic, I. - Rezić, B. - Kuret, S. - Sancho, M. - Primorac, D. (2001) DNA typing from
skeletal remains: evaluation of multiplex and megaplex STR systems on DNA isolated from
bone and teeth samples. Croatian Medical Journal, zv. 42, s. 260-266.

Andelinović, Šimun - Sutlović, Davorka - Ivkošić, Ivana Erceg - Škaro, Vedrana -

Ivkošić, Ante - Paić, Frane - Režić, Boja - Definis-Gojanović, Marija – Primorac, Dragan
(2005): Twelve-year Experience in Identification of Skeletal Remains from Mass Graves.
Croatian Medical Journal, zv. 46, č. 4, s. 530-539.

Anderson, S. - Bankier, A. T. - Barrell, B. G. - de Bruijn, M. H. L. - Coulson, A. R. –

Drouin, J. - Eperon, I. C. - Nierlich, D. P. - Roe, B. A. - Sanger, F. - Schreier, P. H. -
Smith, A. J. H. - Staden, R. - Young, I.G. (1981): Sequence and organization of the human
mitochondrial genome. Nature, zv. 290, s. 457-465.

Andrews, R. M. - Kubacka, I. - Chinnery, P. F. - Lightowlers, R. N. - Turnbull, D. M. –

Howell, N. (1999): Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human
mitochondrial DNA. Nature Genetics, zv. 23, č. 2, s. 147.

Aulsebrook, W. A. – Iscan, M. Y. – Slabbert, J. H. – Beckerd, P. (1995): Superimposition

and reconstruction in forensic facial identification: a survey. Forensic Science International,
zv. 75, s. 101-120.

Budowle, B. - Wilson, M. R. – Di Zinno, J. A. - Stauffer, C. - Fasano, M. A. - Holland, M.

H. - Monson, K. L. (1999): Mitochondrial DNA regions HVI and HVII population data.
Forensic Science International, zv. 103, s. 23-35.

Bogdanowicz, Wiesław - Allen, Marie – Branicki, Wojciech – Lembring, Maria –

Gajewska, Marta - Kupiec Tomasz (2009): Genetic identification of putative remains of the

42
famous astronomer Nicolaus Copernicus. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, zv. 106, č. 30, s. 12279-12282.

Butler, J. M. - Reeder, D. J. Short Tandem Repeat DNA Internet DataBase [online]. 1997
[cit. 2010-02-19]. Dostupné z www: <http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/index.htm.>.

Caramelli, David - Lalueza-Fox, Carles - Capelli, Cristian – Lari, Martina – Sampietro,

Marı´a Lourdes – Gigli, Elena – Milani, Lucio – Pilli, Elena – Guimaraes, Silvia –
Chiarelli, Brunetto - Marin, Vito Terribile Wien – Casoli, Antonella – Stanyon, Roscoe –
Bertranpetit, Jaume - Barbujani Guido (2007): Genetic analysis of the skeletal remains
attributed to Francesco Petrarca. Forensic Science International, zv. 173, s. 36-40.

Coble, M. D. - Loreille, O. M. - Wadhams, M. J. - Edson, S. M. - Maynard, K. - Meyer,

C. E. - Niederstätter, H. - Berger, C. - Berger, B. - Falsetti, A. B. - Gill, P. - Parson, W. et
Finelli, L. N. (2009) Mystery Solved: The Identification of the Two Missing Romanov
Children Using DNA Analysis.PloS ONE [online]. č. 4(3). Dostupné z www:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2652717/.>.

Cotton, E. A. - Allsop, R. F. - Guest, J. L. - Frazier, R. R. E. - Koumi, P. - Callow, I. P. –

Seager, A. - Sparkes, R. L. (2000): Validation of the AMPFlSTR® SGM Plus™ system for
use in forensic casework. Forensic Science International, zv. 112, č. 2-3, s. 151-161.

Edwards, A. - Civitello, A. - Hammond, H. A. - Caskey, C.T. (1991): DNA Typing and

Genetic Mapping with Trimeric and Tetrameric Tandem Repeats. American Journal of Human
Genetics, zv. 49, s. 746-756.

Eichmann, C. - Parson, W. (2008): „Mitominis‟: multiplex PCR analysis of reduced size

amplicons for compound sequence analysis of the entire mtDNA control region in highly
degraded samples. International Journal of Legal Medicine, zv. 122, s. 385–388.

43
Faerman, Maria – Filon, Dvora – Kahila, Gila – Greenblatt, Charles L. – Smith, Patricia
– Oppenheim, Ariella (1995): Sex identification of archaeological human remains based on
amplification of the X and Y amelogenin alleles. Gene, zv. 167, s. 327-332.

Gatliff, Betty P. – Taylor, Karen T. (2001): Three – Dimensional Facial Reconstruction on

the Skull. In. Karen T. Taylor ed., Forensic Art and Illustration. Boca Raton – London – New
York – Washington D. C.: CRC Press.

Gabriel, M. N. - Huffine, E. F. - Ryan, J. H. - Holland, M. M. - Parson, T. J. (2001):

Improved MtDNA sequence analysis of forensic remains using a “mini-primer set”
amplification strategy. Journal of Forensic Science, zv. 46, č. 2, s. 247–253.

Gibbon, Victoria - Paximadis, Maria – Štrkalj, Goran - Ruff, Paul - Penny, Clem (2009):
Novel metod of molecular sex identification from skeletal tissue using the amelogenin gene.
Forensic Science International –Genetics, zv. 3, s. 74-79.

Gill, P. - Ivanov, P. L. - Kimpton, C. - Piercy, R. - Benson, N. - Tully, G. - Evett, I. –

Hagelberg, E. - Sullivan, K. (1994): Identification of the remains of the Romanov family by
DNA analysis. Nature Genetics, zv. 6, s. 130-135.

Glassman, David M. (2001): Methods of Superimposition. In. Karen T. Taylor ed., Forensic
Art and Illustration. Boca Raton – London – New York – Washington D. C.: CRC Press.

Haak, Wolfgang - Forster, Peter - Bramanti, Barbara - Matsumura, Shuichi - Brandt,

Guido - Tänzer, Marc - Villems, Richard - Renfrew, Colin - Gronenborn, Detlef - Alt,
Kurt Werner - Joachim Burger (2005): Ancient DNA from the First European Farmers in
7500-Year-Old Neolithic Sites. Science, zv. 310, č. 5750, s. 1016 – 1018.

Hass-Rochholtz, H. - Weiler, G. (1997): Aditional primer sets for an amelogenin gene PCR-
based DNA-sex test. International Journal of Legal Medicine, zv. 110, s. 312-315.

44
Huckenbeck, W. - Kuntze K. - Scheil, H.G (1997): The Distribution of the Human DNA-
PCR Polymorphisms [online]. Düsseldorf: Institute of Forensic Medicine and Institute of
Human Genetics and Anthropology, [cit. 2010-02-19]. Dostupné z www: <http://www.uni-
duesseldorf.de/WWW/MedFak/Serology/dna.html.>.

Hummel Susanne (2003) Ancient DNA typing: methods, strategies, and applications.
Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. 298s.

Hunger, H. – Leopold, D. (1978): Identifikation. In: Stloukal, Milan, ed., Antropologie.

Příručka pro studium kostry. Praha: Národní muzeum, s. 275-276.

Hutchinson, Franklin (1985): Chemical Changes Induced in DNA by Ionizing Radiation. In:
Waldo E. Cohn, ed., Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Academic
Press, San Diego, s. 115-154.

Hofreiter, M. - Jeanicke, V. - Serre, D. - Haeseler, A. von - Pääbo, S. (2001): DNA

sequences from multiple reveal artifacts induces by cytosine deamination in ancient DNA.
Nucleic Acids Research, zv. 29, č. 23, s. 4793-4799.

Kastelic, Vanja – Budowle, Bruce – Drobnič, Katja (2009): Validation of SRY Marker for
Forensic Casework Analysis. Journal of Forensic Science, zv. 54, č. 3, s. 551-555.

Kimpton, C.P. - Gill, P. - Walton, A. - Urquhart, A. - Millican, E.S. - Adams, M. (1993):

Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci.
Genome Research, zv. 3, s. 13-22.

Knussman, R. (1988): Antropologie; Handbuch der Vergleichenden Biologie des Menschen.

Stloukal, Milan, ed., Antropologie. Příručka pro studium kostry. Praha: Národní muzeum, s.
170.

45
Kolesnikov, Lev L. – Pashinyan, Grgen, A. – Abramov, Sergej S. (2001): Anatomical
Appraisal of the Skulls and Teeth Associated With the Family of Tsar Nicolay Romanov. The
anatomical record, č. 265, s. 15-32.

Krenke, B. E.- Tereba, A. - Anderson, S. J. - Buel, E. - Culhane, S. - Finis, C. J - Tomsey,

Ch. S. - Zachetti, J. M. - Masibay, A. - Rabbach, D. R. - Amiott, E. A. - Sprecher, C. J.
(2002): Validation of a 16-Locus Fluorescent Multiplex System. Journal of Forensic Science,
zv. 47, č. 4, s. 773-785.

Linc, R. (1971): Kapitoly z růstové a funkční morfologie. Stloukal, Milan, ed.: Antropologie.
Příručka pro studium kostry. Praha: Národní muzeum, s. 276-278.

Lovejoy, C. O. – Meindl, R. S. – Mensforth, R. P. – Barton, T. J. (1985): Multifactorial

determination of skeletal age at death: A method and blind tests of its accurancy. In: White,
Tim D. – Folkens, Pieter Arend (2005): The Human Bone Manual. Lodon: Elsevier Inc., s.
364-367.

Malina Jaroslav, ed. (2009): Antropologický slovník aneb co by mohl o člověku vědět každý
člověk. Brno: Akademické nakladatelství CERM, 4738 s.

Moretti, T. R. - Baumstark, A. L. - Defenbaugh, D. A. - Keys, K. M. - Smerick, J. B. –

Budowle, B. (2001): Validation of short tandem repeats (STRs) for forensic usage:
performance testing of fluorescent multiplex STR systems and analysis of authentic and
simulated forensic samples. Journal of Forensic Science, zv. 46, s. 647–660.

Nelson, T. M. - Just, R. S - Loreille, O. - Schanfield, M. S. - Podini, D. (2007):

Development of a Multiplex Single Base Extension Assay for Mitochondrial DNA
Haplogroup Typing. Croatian Medical Journal, zv. 48, č. 4, s. 460-472.

Novotný, Vladimír (1986): Sex Determination of the Pelvic Bone: a System Approach.
Anthropologie, roč. 24, č. 2 – 3, s. 197 – 205.

46
Novotný, V. - Malá, P. - Králík, M. - Kotrla, J. (2003): Tváří v tvář našim předkům.
(Re)konstrukce a experiment v archeologii, roč. 4, s. 53-70.

Parsons, T. J. - Muniec, D. S. - Sullivan, K. - Allison-Greiner, R. - Wilson, M. R. - Berry,

D. L. - Holland, K. A. - Weedn, V.W. - Gill, P. - Holland, M. M. (1997): A high observed
substitution rate in the human mitochondrial DNA control region, Nature Genetics, zv. 15, s.
363–368.

Pääbo, Svante (1989): Ancient DNA: Extraction, characterization, molecular cloning, and
enzymatic amplification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, zv. 86, s. 1939-1943.

Pääbo, Svante - Poinar, Hendrik - Serre, David - Jaenicke-Després, Viviane - Hebler,

Juliane - Rohland, Nadin - Kuch, Melanie - Krause, Johannes - Vigilant, Linda –
Hofreiter, Michael (2004): Genetic Analyses from Ancient DNA. Annual Review of Genetics,
č. 38, s. 645–79.

Pickering, Robert B. – Bachman, Robert (2009): The use of forensic anthropology. CRC
Press, s. 103-111.

Primorac, Dragan – Andelinovic, Simun - Definis-Gojanovic, Marija – Drmic, Irena –

Rezic, Boja – Baden, Michael M.,- Kennedy, Mitchell A. – Schanfield, Moses S. – Skakel,
Stephen B. – Lee, Henry C. (1996): Identification of war victims from mass graves in
Croatia, Bosnia, and Herzegovina by use of standard forensic methods and DNA typing.
Journal of Forensic Science, zv.41, s. 891-894.

Quatrehomme, G. – Subsol, G. (2005): Automatic 3D facial reconstruction by featurebased

registration of a reference head, s. 79–101. Computer-Graphic Facial Reconstruction. Oxford:
Elsevier Academic Press.

Rogaev, Evgeny I. – Grigorenko, Anastasia P. – Moliaka, Yuri K. – Faskhutdinova,

Gulnaz Goltsov, Andrey – Lahti, Arlene – Hildebrandt, Curtis – Kittler, Ellen L. W. –

47
Morozova, Irina (2009): Genomic identification in the historical case of the Nicholas II royal
family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, zv.
106, č. 13, s. 5258-5263.

Rosypal, S. – Doškař, J. – Pantiček, R – Kailerova, J. – Relichova, J. – Růžičkova, V. –

Šmarda ml., J. – Šmarda, J. – Štěpan, J. (2001): Terminologie molekularni biologie. Brno:
Prof. RNDr. Stanislav Rosypal, DrSc., 300 s.

Ruiz-Pesini, E. - Lott, M.T. - Procaccio, V. - Poole, J. - Brandon, M.C. - Mishmar, D. Yi,

C. - Kreuziger, J. - Baldi, P. - Wallace, D.C. (2007): An enhanced MITOMAP with a global
mtDNA mutational phylogeny [online]. Nucleic Acids Research 35 (Database issue): D823-
D828, [cit. 2010-02-19]. Dostupné z www: <http://www.mitomap.org.>.

Schmidt, Diane - Hummel, Susanne - Herrmann, Bernd (2003): Multiplex X/Y-PCR

Improves Sex Identification in aDNA Analysis. American Journal of Physical Anthropology,
zv. 121, s. 337-341.

Schultes, T. - Hummel, Susanne - Herrmann, B. (1999): Amplification of Y-chromosomal

STRs from ancient skeletal material. Human Genetics, zv. 104, s. 164–166.

Sparkes, R. - Kimpton, C. - Watson, S. - Oldroyd, N. - Barnett, L. - Arnold, J. -

Thompson, C. - Hale, R. - Chapman, J. - Urquhart, A. - Gill, P. - Clayton, T. (1996): The
validation of a 7-locus multiplex STR test for use in forensic casework. (I) Mixtures, ageing,
degradation and species studies. International Journal of Legal Medicine, zv. 109, s. 195-
204.

Stloukal, Milan – Dobisíková, Milena – Kuželka, Vítězslav – Stránská, Petra –

Velemínský, Petr – Vyhnánek, Luboš – Zvára, Karel (1999): Antropologie. příručka pro
studium kostry. Praha: Národní muzeum. 509 s.

48
Stone, Anne C. – Starrs, James E. – Stoneking, Mark (2001): Mitochondrial DNA Analysis
of the Presumptive Remains of Jesse James. Journal of Forensic Science, zv. 46, č. 1, s. 173-
176.

Stoneking, Mark (2000): Hypervariable Sites in the mtDNA Control Region Are Mutational
Hotspots. Ameriacan Journal of Human Genetics, zv. 67, s. 1029–1032.

Sjøvold, T. (1990): Estimation of Stature from the Long Bone Utilizing the Line of Organic
Correlation. Human evolution, sv. 5, s. 431 – 447.

Taylor, Karen T. ed. (2001): Forensic Art and Illustration. Boca Raton – London – New
York – Washington D. C.: CRC Press.

Wallace, D.C - Brown, M.D - Lott, M.T. (1999): Mitochondrial DNA variation in human
evolution and disease. Gene. 238: 211–230

Wilkinson, Caroline (2004): Forensic Facial Reconstruction. Cambridge: Cambridge

University Press.

Willuweit, S. – Roewer, L. (2000): Y chromosome haplotype reference database (YHRD)

[online]. Berlin: Department of Forensic Genetics, [cit. 2010-02-12]. Dostupné z www: <
http://www.yhrd.org/.>.

Wurmb-Schwark, E. von - Preusse-Prange, A. - Heinrich, A. - Simeoni, E. - Bosch, T. –

Schwark, T. (2009): A new multiplex-PCR comprising autosomal and y-specific STRs and
mitochondrial DNA to analyze highly degraded material. Forensic Science International:
Genetics, zv. 3, s. 96-103.

Internetové zdroje
https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=6017
05 (12. 4. 2010).
http://www.cstl.nist.gov/strbase/images/powerplex16.pdf (12. 4. 2010).

49
9 Slovník dôležitých pojmov

aDNA (z anglického ancient DNA) – DNA získaná z pozostatkov už nežijúcich organizmov,

napríklad z kostného tkaniva, mumifikovaných tkanív, zubov. Oproti recentnej DNA sa
vyznačuje vysokou fragmentárnosťou (Malina et al., 2009).

Alela – konkrétna forma génu. Gén môže mať jednu alebo viac možných alternatívnych
variant, ktoré sa líšia v sekvencii DNA a ovplyvňujú funkciu daného produktu (RNA nebo
proteínu). Ak existujú v populácii viac ako dve alely daného génu, tvoria alelovú sériu (Malina
et al., 2009).

Amelogenin - gén pre amelogenin, lokalizovaný v homologickej oblasti pohlavných

chromozómov Xp22.1-p22.3, Yp11.2, kóduje proteín zubnej skloviny, využíva sa jeho
dĺžkový polymorfizmus v prvom intróne génu na determináciu pohlavia (Malina et al., 2009).

Amplifikácia - pomnoženie cieľovej sekvencie DNA, spravidla prostredníctvom

polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) (Rosypal et al., 2001).

Amplikon – produkt polymerázovej reťazovej reakcie.

Arthrosis deformans - nezápalové ochorenie kĺbov, ktoré sa spravidla vyskytuje so

zvyšujúcim sa vekom, väčšinou ako dôsledok zvýšenej aktivity pohybového systému.
Postupne je rozrušovaná hyalínna chrupavka pokrývajúca kĺbne plochy, až po kostné tkanivo
(Pickering et Bachman, 2009).

Autozóm - akýkoľvek chromozóm s výnimkou pohlavných chromozómov (Malina et al.,

2009).

Degradácia - postupný rozklad materiálu. Najmä organické materiály sa postupne rozložia na

jednoduchšie zložky. S týmto faktom je nutné počítať pri analýze organických látok z
archeologických nálezov a ich následnej interpretácii (Malina et al., 2009).

50
Dentálna hypoplázia – narušenie vrstvy zubného enamelu, prejavujúce sa horizontálnymi
ryhami alebo jamkami na prednej ploch zubov (White et Folkens, 2005).

Dioptograf – upravený pantrograf na zakreslovanie kostí (Stloukal et al., 1999).

EDTA - etyléndiamintetraoctová kyselina (Rosypal et al., 2001).

Gonozóm – pohlavný chromozóm (heterochromozóm). V prípade človeka chromozóm X

alebo Y (Malina et al., 2009).

Haploskupina - skupina haplotypov. V genetike sa skúmajú najmä haploskupiny

chromozómu Y a mitochondriálnej DNA, ktoré možno využiť na určenie populačnej afinity
(etnickej príslušnosti) (Malina et al., 2009).

Haplotyp - termín, ktorý vznikol zo slov haploidný genotyp. Označuje určitú zostavu
navzájom viazaných alel v oblasti príslušných génov (Malina et al., 2009).

Hypervariabilná oblasť (D-slučka; HVR, z anglického hypervariabile region) - miesto

začiatku replikácie molekuly mitochondriálnej DNA (mtDNA). Ide o oblasť, v ktorej sa s
matricovým reťazcom páruje krátky fragment DNA, ktorý vytláča rodičovský reťazec a v
danom mieste vzniká trojreťazcová štruktúra. Od krátkeho komplementárneho fragmentu
potom začína syntéza nového reťazca. D-slučka je súčasťou tzv. kontrolnej oblasti, s ktorou
býva niekedy zamenená. Kontrolná oblasť (z anglického: control region) je približne 1100 bp
dlhý úsek mtDNA zložený z centrálnej konzervatívnej sekvencie obklopenej dvoma
variabilnými doménami – D-slučka je približne uprostred a obsahuje konzervatívnu doménu a
časti oboch variabilných domén. Spolu s génom pre cytochróm b je D-slučka najčastejšie
sekvenovanou časťou mtDNA (Malina et al., 2009).

Identifikácia - zistenie alebo stanovenie totožnosti, zhodnosti, identifikovanie, stotožnenie

(Malina et al., 2009).

51
James, Jesse (Jesse Woodson James) – narodil sa 5. septembra 1847 v Misouri, zomrel 3.
apríla 1882. Bol americkým zločincom, vedúcim lúpežnej bandy, bankový a vlakový lupič
a vrah.

Jednonukleotidový polymorfizmus (SNP, z anglického Single Nucleotide Polymorphisms)

– výskyt odlišného nukleotidu na rovnakej pozícii v rámci rovnakej sekvencie.

Krátke tandemové repetície (STR; z anglického Short Tandem Repeats) - krátke

tandemovo sa opakujúce sekvencie DNA, spravidla s dĺžkou 2–6 bp. V typickej podobe sú
najčastejšie dinukleotidové repetície, z ktorých prevažuje typ (CA)n, medzi trinukleotidmi sú
najčastejšie CAG a AAT. Počet opakujúcich sa motívov môže dosiahnuť až niekoľko stoviek
(okolo 150 bp). Vyskytujú sa vo všetkých doteraz skúmaných prokaryotických a
eukaryotických genómoch a to ako v kódujúcich, tak i nekódujúcich oblastiach (Malina et al.,
2009).

Kopernik, Mikuláš - poľský matematik, kartograf, astronóm a lekár; hlavný autor

heliocentrickej predstavy o vesmíre. Narodil sa 19. 2. 1473 v Toruni v Poľsko, zomrel 24. 5.
1543 vo Fromborku (Malina et al., 2009).

Lokus – miesto lokalizácie génu, alebo určitej sekvencie nukleotidov na chromozóme

(Rosypal et al., 2001).

Marker – genetická alebo molekulárna značka. Genetické markery sú gény, ktorých

fenotypový prejav, je ľahko rozpoznateľný a môže slúžiť na identifikáciu jedinca, bunky alebo
na označenie jadra, chromozómu, alebo konkrétneho miesta na ňom. Molekulárne markery sú
negénové oblasti, slúžiace na označenie, oproti nim sú potom mapované gény na chromozóme
(Malina et al., 2009).

Minimálny počet jedincov - predstavuje teoreticky najmenší počet jedincov, ktorí je možné
na základe pozostatkov spočítať. Zodpovedá počtu rovnakých fragmentov kostí, ktoré nepatria
k tej istej kosti, po ich roztriedení podľa druhu a stranovej príslušnosti (White et Folkens,
2005).

52
Mikuláš II. (Nikolaj Alexandrovič Romanov, po rusky Николай II) – narodil sa 19.5.
1868, zomrel 17. júla 1918. Bol posledný ruský cár (1868 - 1918), poľský kráľ (1894 -
1915/1917) a fínsky veľkoknieža (1894 - 1917).

Mitochondriálna DNA (mtDNA) - dedičná genetická informácia uložená v mitochondriách,

typ mimojadrovej DNA, vyznačuje sa maternálnou dedičnosťou, modifikovaným
„univerzálnym“ genetickým kódom a absenciou intrónov (s výnimkou kvasiniek); ľudská je
tvorená kružnicovou molekulou s veľkosťou 16 569 bp. V mitochondrii sa väčšinou nachádza
5 až 10 kópií mtDNA (Malina et al., 2009).

Mnohonásobná PCR (z anglického Multiplex Polymerase Chain Reaction) - jedna z

modifikácií polymerázovej reťazovej reakcie, pri ktorej je do reakčnej zmesi pridaných
niekoľko párov primerov rozpoznávajúcich dve a viac cieľových sekvencií. Takýmto
spôsobom je možné detekovať súčasne niekoľko sledovaných znakov v jednej reakčnej zmesi
(Malina et al., 2009).

Mutácia – trvalá dedičná zmena genetickej informácie, najčastejšie vznikajúca pôsobením

mutagénnych činidiel (Rosypal et al., 2001).

Nehomologická oblasť chromozómu - odlišné oblasti chromozómov, napríklad u človeka na

pohlavných chromozómoch X a Y, ktoré sa nepárujú v meióze (Malina et al., 2009).

Osteochondrom – najbežnejší kostný benígny nádor, zväčša asymptomatický. Vyskytuje sa

v oblasti metafýz, na povrchu je útvar pokrytý chrupavkou, ktorá plynulo prechádza do
kostnej trámčiny (White et Folkens, 2005).

Osteom – zriedka vyskytujúci sa kostný nádor, veľmi podobný normálnej kosti. Objavuje sa
výhradne na lebke, v paranasálnych dutinách a na kostiach splanchnokrania (White et Folkens,
2005).

Peridontitída – zápal tkaniva v okolí zubov, môže zasahovať všetky mäkké tkanivá
a prechádzať na kosť (White et Folkens, 2005).

53
Polymerázová reťazová reakcia (PCR; z anglického Polymerase Chain Reaction) -
technika pre amplifikáciu (zmnoženie) danej sekvencie DNA, jedna z metód molekulárnej
biológie, ktorá umožňuje mnohonásobné pomnoženie určitého úseku DNA. DNA potom môže
byť použitá na ďalšie skúmanie. Jeden cyklus zahŕňa tri kroky: 1. denaturáciu DNA zvýšenou
teplotou (90–95 °C), tzn. dvojreťazec sa rozpadne na jednoreťazce, 2. nasadnutie primerov, to
znamená krátkych reťazcov DNA, takzvaných oligonukleotidov, komplementárnych ku
koncom amplifikovaných úsekov (annealing, schladenie, pri 40–60 °C), 3. syntézu
komplementárneho reťazca od miesta nasadnutia primeru (elongation, elongace, pri 65–72 °C)
(Malina et al., 2009).

Polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (RT-PCR, q-PCR; z anglického Real-

time Polymerase Chain Reaction ) - jedna z modifikácií polymerázovej reťazovej reakcie,
ktorá umožňuje kvantifikáciu sledovaného úseku DNA. Na rozdiel od bežnej PCR je v tomto
prípade zaznamenávaný každý cyklus PCR v skutočnom čase. Záznam amplifikácie je
založený na princípe fluorescencie, kedy sa používajú sondy (fluorescenční látky), ktoré sa
špecificky alebo nešpecificky viažu na amplifikované úseky DNA (Malina et al., 2009).

Primer - krátky úsek DNA; syntetický oligonukleotid (18–35 báz), ktorý sa používa na
označenie úseku DNA, ktorá má byť namnožená pomocou polymerázovej reťazovej reakcie
(Rosypal et al., 2001).

Polymorfizmus – výskyt dvoch alebo viacerých odlišných fenotypov v jednej populácii.

Polymorfná alela – alela, ktorá sa vyskytuje vo viacerých variantách s odlišným

fenotypovým prejavom (Rosypal et al., 2001).

Saponifikácia – zmydelnenie (Malina et al., 2009).

SDS - dodecylsulfát sodný, detergent .

STR profil – súbor jednotlivých alel na STR lokusoch charakterizujúci jedinca.

54
Templát – zdrojová molekula DNA, ktorá býva pomnožená počas polymerázovej reťazovej
reakcie (Rosypal et al., 2001).

Zubná abrázia – opotrebenie zubov (White et Folkens, 2005).

55
10 Register

A H

aDNA 16, 30, 42 haploskupina 43

alela 42 haplotyp 43
amelogenin 20, 24, 25, 26, 28, 42 heteroplazmia 30
amplifikácia 20, 42 hydroxylové radikály 16
amplikon 23, 26, 28, 30, 32, 42 hypervariabilná oblasť 29, 30, 43
arthrosis deformans 12 hypovitaminóza 12
aspektívne pozorovanie 9
autozóm 42
Ch

chondrosarkom 12
C

Calendarium Romanum Magnum 23

I
Cambridgská sekvencia 29 identifikácia 43
CODIS 19
J
D
James, Jesse 32, 43
dentálna hypoplázia 12 jednonukleotidový polymorfizmus 25, 29,
dioptograf 11 43
D-slučka 29 jednoreťazcový zlom 17

E K
EDTA 35, 42 Koperník, Mikuláš 23, 44
elektroferogram 25 krátke tademové repetície 27
endonukleáza III. 17 krátke tandemové repetície 18, 43
etnická príslušnosť 11 Kyslíkové radikály 17
etnikum 14
L
F
lebečné švy 10
facies symphysialis 10 lokus 44

56
M Romanov, Alexander 14, 22
Romanová, Alexandra 14, 22
Maillardove produkty 17
Romanová, Anastázia 14, 22
marker 44
Romanová, Mária 14, 22
mhonásobná PCR 26
Romanová, Oľga 14, 22
Mikuláš II. 13, 21, 44
Romanová, Tatiana 14, 15, 22
minimálny počet jedincov 44
RT-PCR 21, 45
mitochondriálna DNA 29, 44
mnohonásobná PCR 18, 28, 45 S
mnohonásobné STR profilovanie 18
SDS 35, 46
morfometrické hodnotenie 9
sekundárne pohlavné znaky 9
morfoskopické metódy 10
sprojekcia 15
O SRY gén 28
STR profil 22
osteochondrom 12
superprojekcia 15
osteom 12
synchondrosis sphenooccipitalis 10
P
T
panva 9
templát 16, 17, 21, 26, 30, 31, 46
PCR 16, 18, 19, 20, 21, 25, 28, 30, 31, 45
trauma 12
peridontitída 12
Petrarca, Francesco 28 V
pohlavie 9, 15, 24
vek 10, 15
populačná príslušnosť 9
výška postavy 10
porotická hyperostóza 12
pravdepodobnostný pomer 22 Y
primer 24, 30, 31, 32, 45
Y-STR 27
primery 20

Z
R
zubná abrázia 10
revidovaná Cambridgská sekvencia 29

57
11 Medailón autorky

Kristína Kovačovicová (8. 5. 1988, Trenčín), študentka antropológie

a genetiky a molekulárnej biológie Přírodovědecké fakulty
Masarykovy univerzity. V roku 2007 úspešne absolvovala
Gymnázium M. R. Štefánika v Novom Meste nad Váhom a nastúpila
na štúdium antropológie na Ústavu antropologie a genetiky
a molekulární biologie na Ústavu experimentální biologie. Zaujíma
sa o fyzickú a molekulárnu antropológiu.

58