Gojenje Cordycepsa

UNIVERZA V LJUBLJANI
BIOTEHNIŠKA FAKULTERA
ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE
Primož TURNŠEK
VPLIV GOJIŠČA NA RAST GLIVE Cordyceps militaris

IN NJENI BIOLOŠKI UČINKI NA KVASOVKO
Saccharomyces cerevisiae
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija
Ljubljana, 2019
UNIVERZA V LJUBLJANI
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE
Primož TURNŠEK
VPLIV GOJIŠČA NA RAST GLIVE Cordyceps militaris IN NJENI

BIOLOŠKI UČINKI NA KVASOVKO Saccharomyces cerevisiae
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija
INFLUENCE OF SUBSTRATE ON GROWTH OF FUNGUS Cordyceps

militaris AND ITS BIOLOGICAL EFFECTS ON THE YEAST
Saccharomyces cerevisiae
M. Sc. THESIS
Master Study Programmes: Field Microbiology
Ljubljana, 2019
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. II
Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2019
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študija 2. stopnje Mikrobiologija na Biotehniški

fakulteti Univerze v Ljubljani. Delo je bilo opravljeno v laboratoriju Katedre za
biotehnologijo, mikrobiologijo in varnosti živil, Oddelka za živilstvo in Katedri za lesne
škodljivce, modifikacijo in zaščito lesa, Oddelka za lesarstvo Biotehniške fakultete
Univerze v Ljubljani.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala prof. dr.

Polono Jamnik, za somentorja prof. dr. Franca Pohlevna in za recenzentko doc. dr. Polono
Zalar.
Mentorica: prof. dr. Polona JAMNIK

Somentor: prof. dr. Franc POHLEVEN
Recenzentka: doc. dr. Polona ZALAR
Komisija za oceno in zagovor
Predsednica: prof. dr. Nina GUNDE-CIMERMAN

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: prof. dr. Polona JAMNIK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Član: prof. dr. Franc POHLEVEN

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za lesarstvo
Članica: doc. dr. Polona ZALAR

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora:
Primož Turnšek
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK: 582.282:615.334:577.1/.2(043)=163.6
KG glive, Cordyceps militaris, bioaktivne spojine, rast, gojišča, kordicepin,
znotrajcelična raven ATP, znotrajcelična oksidacija, Saccharomyces cerevisiae
AV TURNŠEK Primož, dipl. mikrobiol. (UN)
SA JAMNIK, Polona (mentorica), POHLEVEN, Franc (somentor), ZALAR, Polona
(recenzentka)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije
LI 2019
IN VPLIV GOJIŠČA NA RAST GLIVE Cordyceps militaris IN NJENI BIOLOŠKI
UČINKI NA KVASOVKO Saccharomyces cerevisiae
TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija)
OP XIII, 63 str., 10 pregl., 13 sl., 2 pril., 89 vir.
IJ sl
JI sl/en
AI Gliva Cordyceps militaris ima v tradicionalni kitajski medicini dolgo zgodovino
uporabe, dandanes pa postaja pomembna kot prehransko dopolnilo tudi na zahodu.
Mnoge sodobne raziskave so potrdile terapevtske učinke te glive. Raziskave kažejo,
da imajo biološko aktivne snovi glive C. militaris, kot je kordicepin, mnoge
pozitivne farmakološke učinke na zdravje ljudi. V naši raziskavi smo preučevali
vpliv vrste gojišča na rast glive, proizvodnjo kordicepina in biološki učinek vodnih
ekstraktov preraščenega gojišča. Micelij glive smo gojili na pšeničnem gojišču z
dodanim peptonom, ličinkami mokarja ali kavnim ostankom. Vrsta gojišča je
močno vplivala na rast glive C. militaris. Micelij je na pšeničnem gojišču z
dodanimi mokarjevimi ličinkami rastel najbolj zgoščeno, medtem ko je na
pšeničnem gojišču z dodanim kavnim ostankom tvoril največ primordijev. Iz
vzorcev preraščenega gojišča, ki smo jih vzorčili v treh časovnih točkah, smo
pripravili vodni ekstrakt in izmerili koncentracijo kordicepina. Ugotovili smo, da je
na vsebnost kordicepina imela največji vpliv sestava gojišča, pri čemer sta se
najboljše izkazali pšenično gojišče z dodanimi mokarjevimi ličinkami in pšenično
gojišče z dodanim kavnim ostankom. Vodni ekstrakt preraščenega pšeničnega
gojišča z dodanim kavnim ostankom je glede na pšenično gojišče brez dodatkov v
celicah kvasovke Saccharomyces cerevisiae imel največji antioksidativni učinek in
najmanj zmanjšal znotrajcelično raven ATP glede na kontrolo.
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. IV
KEY WORDS DOCUMENTATION
DN Du2
DC UDC: 582.282:615.334:577.1/.2(043)=163.6
CX fungi, Cordyceps militaris, bioactive compounds, growth, substrate, cordycepin,
intracellular ATP level, itracellular oxidation, Saccharomyces cerevisiae
AV TURNŠEK Primož, dipl. mikrobiol. (UN)
AA JAMNIK, Polona (supervisor), POHLEVEN, Franc (co-advisor), ZALAR, Polona
(reviewer)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study in Microbiology
PY 2019
TI INFLUENCE OF SUBSTRATE ON GROWTH OF FUNGUS Cordyceps militaris
AND ITS BIOLOGICAL EFFECTS ON THE YEAST Saccharomyces cerevisiae
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Microbiology)
NO XIII, 63 p., 10 tab., 13 fig., 2 ann., 89 ref.
LA sl
AL sl/en
AB In traditional Chinese medicine the Cordyceps militaris has a long history of use
and is gaining importance as a food supplement in the west. Many modern studies
confirm its therapeutic effects. Evidence shows that bioactive ingredients of the C.
militaris have many positive pharmacological effects on human health. In our
study, we investigated the influence of substrate type on growth of fungus,
production of cordycepin and biological effect of water extracts from overgrown
substrate. The mycelium was grown on wheat grains only and with addition of
peptone, mealworm larvae or coffee waste. Type of substrate had a strong
infrulence on growth of C. militaris. Mycelium growth was most condensed on
wheat grains with added mealworm larvae. Primordia formation was strongest on
wheaten grains with added coffee waste. Samples of the overgrown substrate were
taken at three different growth periods. Water extracts were made from samples and
concentration of cordycepin was measured. We showed that type of substrate had
the most important effect on concentration of cordycepin. Substrates from wheaten
grains with added mealworm larvae and added coffee waste had resulted in biggest
production of cordycepin. Water extract of overgrown wheat grains with added
coffee waste had maximum effect on reduction of intracellular oxidation and
minimum effect on reduction of intracellular ATP level in yeast cells of
Saccharomyces cerevisiae, compared to wheat grains substrate.
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA..................................................III

KEY WORDS DOCUMENTATION...............................................................................IV
KAZALO VSEBINE...........................................................................................................V
KAZALO PREGLEDNIC.............................................................................................VIII
KAZALO SLIK..................................................................................................................IX
KAZALO PRILOG............................................................................................................X
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI............................................................................................XI
1 UVOD ............................................................................................................................... 1
1.1 NAMEN RAZISKAVE ............................................................................................ 1
1.2. DELOVNE HIPOTEZE .......................................................................................... 2
2 PREGLED OBJAV .......................................................................................................... 3
2.1 MEDICINSKO POMEMBNE GLIVE .................................................................... 3
2.2 GLIVE RODU Cordyceps ........................................................................................ 3
2.2.1 Splošne značilnosti gliv rodu Codyceps ............................................................. 3
2.2.2 Pomembnejši predstavniki rodu Cordyceps ...................................................... 5
2.2.3 Ekologija in pomen gliv rodu Cordyceps v okolju ............................................ 7
2.2.4 Pridobivanje in gojenje glive Cordyceps militaris ............................................. 8
2.2.4.1 Gojenje na žuželkah....................................................................................... 9
2.2.4.2 Gojenje na trdnih substratih........................................................................... 9
2.2.4.3 Drugi načini gojenja .................................................................................... 10
2.2.4.4 Pogoji gojenja glive C. militaris .................................................................. 11
2.3 FARMAKOLOŠKO AKTIVNI METABOLITI GLIV RODU Cordyceps........... 11
2.3.1 Kordicepin in drugi nukleozidi ........................................................................ 12
2.3.2 Polisaharidi ........................................................................................................ 13
2.3.3 Maščobne kisline ............................................................................................... 14
2.3.4 Ergosterol in drugi steroli................................................................................. 14
2.3.5 D-manitol ali kordicepinska kislina ................................................................. 15
2.3.6 Druge učinkovine............................................................................................... 16
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. VI
2.4 ZDRAVILNI UČINKI IN TRADICIONALNA UPORABA GLIV Cordyceps ... 16

2.4.1 Pripravki iz glive C. militaris ............................................................................ 17
2.5 FARMAKOLOŠKO DELOVANJE ...................................................................... 17
2.5.1 Energijski metabolizem .................................................................................... 18
2.5.2 Antioksidativno delovanje ................................................................................ 19
2.5.3 Imunomodulatorni učinek ................................................................................ 20
2.5.4 Protirakavo delovanje ....................................................................................... 21
3 MATERIALI IN METODE .......................................................................................... 23
3.1 POTEK EKSPERIMENTALNEGA DELA .......................................................... 23
3.2 MATERIALI .......................................................................................................... 24
3.2.1 Gliva Cordyceps militaris................................................................................... 24
3.2.2 Komercialni pripravek glive Cordyceps militaris............................................ 24
3.2.3 Kvasovka ............................................................................................................ 24
3.2.4 Gojišča ................................................................................................................ 24
3.2.4.1 Trdno gojišče PDA za gojenje glive C. militaris ........................................ 24
3.2.4.2 Pšenično gojišče z dodatki za kultivacijo glive C. militaris ........................ 25
3.2.4.3 Trdno gojišče YEPD za kultivacijo kvasovke Saccharomyces cerevisiae .. 26
3.2.4.4 Tekoče gojišče YEPD.................................................................................. 26
3.2.5 Reagenti in kompleti ......................................................................................... 27
3.2.5.1 Pufer PBS .................................................................................................... 27
3.2.5.2 50 mM kalijev fosfatni pufer pH 7,8 ........................................................... 27
3.2.5.3 Reagent 2',7'-diklorodihidrofluorescein diacetat (H2DCFDA) ................... 28
3.2.5.4 Reagent za določanje znotrajcelične ravni ATP .......................................... 28
3.2.6 Mobilna faza za analizo kordicepina z metodo HPLC .................................. 29
3.3 PRIBOR IN OPREMA ........................................................................................... 29
3.3.1 Priprava gojišč in pufrov za gojenje kvasovke S. cerevisiae ......................... 29
3.3.2 Gojenje kvasovke S. cerevisiae: ........................................................................ 29
3.3.3 Gojenje glive C. militaris ................................................................................... 30
3.3.4 Pribor za pripravo vodnega ekstrakta gojišča preraščenega z glivo C.
militaris ........................................................................................................................ 30
3.3.5 Pribor za merjenje znotrajcelične oksidacije ................................................. 30
3.3.6 Pribor za merjenje ravni znotrajceličnega ATP ............................................ 31
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. VII
3.3.7 Aparatura za določanje koncentracije kordicepina ....................................... 31

3.4 METODE ............................................................................................................... 32
3.4.1 Gojenje glive Cordyceps militaris ..................................................................... 32
3.4.1.1 Priprava gojišč ............................................................................................. 32
3.4.1.2 Inukolacija gojišč z glivo C. militaris ......................................................... 32
3.4.2 Opis makromorfoloških lastnosti micelija glive in vzorčenje gojišč
preraščenih z glivo C. militaris .................................................................................. 33
3.4.3 Priprava vodnega ekstrakta preraščenega gojišča ......................................... 33
3.4.4 Gojenje kvasovke Saccharomyces cerevisiae ................................................... 34
3.4.5 Izpostavitev kvasnih celic vodnemu ekstraktu preraščenega gojišča ........... 34
3.4.6 Določanje znotrajcelične oksidacije ................................................................. 35
3.4.7 Določanje znotrajcelične ravni ATP ................................................................ 36
3.4.8 Določanje optične gostote ................................................................................. 37
3.4.8 Določanje koncentracije kordicepina .............................................................. 37
3.5 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV ........................................................ 37
3.5.1 Arimetrična sredina .......................................................................................... 37
3.5.2 Standardni odklon aritmetične sredine ........................................................... 38
4 REZULTATI Z RAZPRAVO ...................................................................................... 39
4.1 RAST MICELIJA GLIVE Cordyceps militaris NA RAZLIČNIH GOJIŠČIH ..... 39
4.2 VPLIV GOJIŠČA IN ČASA RASTI GLIVE Cordyceps militaris NA
PRODUKCIJO KORDICEPINA ................................................................................. 42
4.3 BIOLOŠKI UČINEKI VODNEGA EKSTRAKTA GOJIŠČ PRERAŠČENIH Z
GLIVO Cordyceps militaris ......................................................................................... 45
4.3.1 Učinek vodnih ekstraktov gojišč preraščenih z glivo C. militaris na celično
energijsko metabolno aktivnost ................................................................................ 46
4.3.2 Učinek vodnih ekstraktov gojišč preraščenih z glivo C. militaris na
znotrajcelično oksidacijo ........................................................................................... 48
4.4 OBRAZLOŽITEV DELOVNIH HIPOTEZ .......................................................... 51
5 SKLEPI ........................................................................................................................... 52
6 POVZETEK .................................................................................................................... 53
7 VIRI ................................................................................................................................. 55
ZAHVALA
PRILOGE
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. VIII
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Sestavine trdnega gojišča PDA za gojenje glive C. militaris. ................... 25

Preglednica 2: Sestava gojišč za gojenje micelija glive Cordyceps militaris. Vrednosti so
podane v teži na kilogram gojišča. ...................................................................................... 25
Preglednica 3: Sestavine osnovnega tekočega gojišča brez pšeničnih zrn in dodatkov za
kultivacijo glive C. militaris.. .............................................................................................. 26
Preglednica 4: Sestavine trdnega gojišča YEPD za kultivacijo kvasovke S. cerevisiae.... 26
Preglednica 5: Tekoče gojišče za kultivacijo kvasovke S. cerevisiae do začetka
stacionarne faze. .................................................................................................................. 27
Preglednica 6: Sestava pufra PBS ...................................................................................... 27
Preglednica 7: Raztopina kalijevega dihidrogenfosfata - kisla komponenta pufra. ........... 28
Preglednica 8: Raztopina kalijevega hidrogenfosfata - bazična komponenta pufra. ......... 28
Preglednica 9: Razmerje gradienta ločbe mobilne faze. .................................................... 29
Preglednica 10: Primerjava morfoloških razlik med različnimi gojišči, preraščenimi z
micelijem C. militaris.. ........................................................................................................ 41
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. IX
KAZALO SLIK
Slika 1: Gliva O. sinensis in situ (A), nabrani trosnjaki glive O. sinensis (B), ki izraščajo iz
mumificiranih gosenic (Cannon in sod., 2009). .................................................................... 6
Slika 2: Trosnjak C. militaris in situ (A), trosnjaki C. militaris (B), ki izraščajo iz okužene
in mumificirane gosenice, prerez trosnjaka C. militaris z vidnimi periteciji (C) (Winkler,
2013). ..................................................................................................................................... 7
Slika 3: Trosnjaki Cordyceps militaris rastejo iz bube sviloprejke Bombyx mori (Zheng in
sod., 2011). ............................................................................................................................ 9
Slika 4: Trosnjaki C. militaris na trdnem gojišču (Padilla-Brown, 2016). ......................... 10
Slika 5: Emerzna kultivacija micelija glive C. militaris (Das in sod., 2010). .................... 11
Slika 6: Strukturna formula molekule kordicepina in adenozina (Lee in sod., 2013). ....... 12
Slika 7: Strukturna formula molekule ergosterola (Mercer, 1984) ..................................... 15
Slika 8: Shematski prikaz poteka eksperimenta.................................................................. 23
Slika 9: Shema oksidacije H2DCF, če uporabimo H2O2 kot končni akceptor elektronov
(Hensley in sod., 2003). ....................................................................................................... 35
Slika 10: Fotografije rasti micelija glive C. militaris na različnih gojiščih ob treh različnih
časih (12, 47 in 85 dni).. ...................................................................................................... 40
Slika 11: Prikaz vpliva gojišča in časa rasti glive C. militaris na produkcijo kordicepina.
Substrat smo vzorčili na 12, 47 in 85 dan............................................................................ 42
Slika 12: Vpliv vrste preraščenega gojišča iz 85. dneva kultivacije na raven ATP v
kvasovki S. cerevisiae. Rezultati so prikazani kot relativne vrednosti s standardnim
odklonom glede na kontrolo (100 %).. ................................................................................ 46
Slika 13: Vpliv vrste preraščenega gojišča iz 85. dneva kultivacije na nivo znotrajcelične
oksidacije v kvasovki S. cerevisiae. Rezultati so prikazani kot relativne vrednosti s
standardnim odklonom glede na kontrolo (100 %). ............................................................ 49
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. X
KAZALO PRILOG
Priloga A: Umeritvena krivulja za določanje koncentracije kordicepina.

Priloga B: Izmerjene koncentracije kordicepina v vodnih ekstraktih preraščenih gojišč in
komercialnega pripravka.
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. XI
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
A3AR A3 adenozinski receptor

ATP adenozin tri-fosfat
Camp ciklični adenozinmonofosfat
CAT Katalaza
PG pšenično gojišče
PGM pšenično gojišče z dodanimi mokarjevimi ličinkami
PGP pšenično gojišče z dodanim peptonom
PGK pšenično gojišče z dodanim kavnim ostankom
DCF diklorofluorescein
DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil
ELISA encimski imunoadsorpcijski test (ang. enzyme linked
immunosorbent assay)
GSH Glutation
GSH-Px glutation peroksidaza
H2DCF 2', 7'-diklorodihidrofluorescein
H2DCFDA 2', 7'-diklorodihidrofluorescein diacetat
HMNC humane mononuklearne celice (ang. human
mononuclear cells)
HPLC visokotlačna tekočinska kromatografija (ang. high
pressure liquid chromatography)
IC50 polovica maksimalne inhibitorne koncentracije
IL-12 interlevkin 12
IL-2 interlevkin 2
INF-γ interferon gama
Kordicepin metabolit glive Cordyceps militaris, 3'-
deoksiadenozin
MDA Malondialdehid
NK celice celice naravne ubijalke
NO dušikov oksid
OD optična gostota
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. XII
PBS K-fosfatni pufer

Pi anorganski fosfat
PKA protein kinaza A
ROS reaktivne kisikove zvrsti (ang. reactive oxygen
species)
RT-PCR verižna reakcija s polimerazo v realnem času (ang.
real time polimerase chain reaction)
SAM S-adenozil metionin
SOD superoksid dismutaza
T-AOC skupna antioksidativna kapaciteta (ang. total
antioxidant capacity)
TLR toll-u podobni receptorji (ang. toll like receptors)
TNF-α tumor nekrotizirajoči faktor
YEPD gojišče iz kvasnega ekstrakta, peptona in dekstroze
(ang. yeast extract peptone dextrose)
ZIM zbirka industrijskih mikroorganizmov
Turnšek P. Vpliv gojišča na rast glive C. militaris in njeni biološki učinki na kvasovko S. cerevisiae. 1
1 UVOD
Med glivami, zaradi svojih blagodejnih bioloških učinkov na človeško telo, vse več
pozornosti vzbujajo določene višje glive skupin prostotrosnic (Basidiomycota) in
zaprtotrosnic (Ascomycota). Med slednje sodijo tudi glive rodu Cordyceps, ki so že stoletja
del tradicionalne kitajske medicine. V uporabi sta predvsem vrsti Ophiocordyceps sinensis
in Cordyceps militaris. V kontekstu tradicionalne uporabe so namenjene zdravljenju
mnogih boleznih, še posebej pa so cenjene kot krepčilo, saj izboljšujejo fizično moč in
psihično stanje človeka. Znanstvene študije so mnoge izmed učinkov, ki jih glivam rodu
Cordyceps pripisuje tradicionalna medicina, potrdile. Danes je znano, da imajo
imunostimulatorni učinek, delujejo protitumorsko in protivnetno, imajo pozitiven učinek v
primeru srčno-žilnih bolezni, sladkorne bolezni ter obolenj jeter. Še najbolj fascinanten pa
je njihov vpliv na energijski metabolizem, saj povečujejo količino razpoložljivega ATP v
celicah in hkrati zmanjšajo stopnjo znotrajcelične oksidacije. Glivam učinke dajejo številni
sekundarni metaboliti, kot so kordicepin, polisaharidi, ergosterol in drugi. Gliva Cordyceps
militaris je še posebej zanimiva za raziskave, saj je ena izmed redkih predstavnikov rodu
Cordyceps, ki na umetnih gojiščih tvori trosnjake. To je razlog, da smo C. militaris izbrali
kot predmet preučevanja v tej nalogi. Kljub mnogim raziskavam, ki so preučevale
mehanizme delovanja metabolitov C. militaris na eni strani in načine gojenja glive na drugi
strani, ostaja še veliko neznank, ki bi jih bilo zanimivo raziskati.
1.1 NAMEN RAZISKAVE
Namen raziskave je bil preučiti, kakšen učinek ima sestava gojišča na rast glive C.
militaris, na količino proizvedenega kordicepina in biološko aktivnost vodnega ekstrakta
preraščenega gojišča v kvasovki Saccharomyces cerevisiae. Natančneje smo želeli
raziskati vpliv vodnega ekstrakta na raven ATP v celicah in znotrajcelično oksidacijo.
Kvasovko S. cerevisiae smo izbrali kot modelni organizem, ker je ustrezen za preučevanje
evkariontskih celičnih procesov.
1.2. DELOVNE HIPOTEZE
Hipoteze, ki smo jih postavili, so sledeče:
 Sestava gojišča ima vpliv na:

- Hitrost rasti glive in morfologijo micelija,
- produkcijo kordicepina.
 Najboljšo rast glive C. militaris in produkcijo kordicepina pričakujemo na pšeničnem

gojišču z dodanimi ličinkami mokarja, najslabšo pa na pšeničnem gojišču brez
dodatkov.
 Vodni ekstrakti preraščenih gojišč z micelijem C. militaris bodo znižali znotrajcelično

oksidacijo in povečali metabolno aktivnost kvasovk S. cerevisae. Pšenična gojišča z
dodanim peptonom, ličinkami mokarja in kavnim ostankom bodo imela večji vpliv v
primerjavi s pšeničnim gojiščem brez dodatkov.
2 PREGLED OBJAV
2.1 MEDICINSKO POMEMBNE GLIVE
V zadnjih desetletjih se v zahodnem svetu pojavlja vse več informacij o blagodejnih

učinkih nekaterih gliv. Tem glivam pripisujejo medicinske učinke v primeru rakavih
obolenj, avtoimunskih bolezni, alergij, za krepitev imunskega sistema in za zmanjševanje
stranskih učinkov kemoterapije in radioterapije pri ljudeh, ki so oboleli za rakom. Večina
znanja o uporabi gliv v medicinske namene je k nam prišla iz daljnega vzhoda, predvsem
iz tradicionalne kitajske medicine. Znanstvene študije opravljene na številnih glivah, ki jim
tradicionalna medicina prepisuje terapevtske učinke, so pokazale, da imajo glive res
številne koristne učinke, tako na celične kulture, kot na živali in ljudi. Dandanes razni
pripravki iz gliv postajajo čedalje bolj popularni in se najpogosteje uporabljajo kot
prehranska dopolnila za krepitev splošnega počutja ali kot podpora pri določenih obolenjih.
Najbolj znane glive, ki se uporabljajo pri nas kot prehranska dopolnila so: svetlikava
ploščenka (Ganoderma lucidum), pisana ploskocevka (Trametes versicolor), čaga
(Inonotus obliquus), bukov ostrigar (Pleurotus osteratus), šitake (Lentinula edodes) in tudi
glavatci (Cordyceps spp.) (Wasser, 2003; Gregori, 2012).
2.2 GLIVE RODU Cordyceps
2.2.1 Splošne značilnosti gliv rodu Codyceps
Glive za človeka predstavljajo vir hrane in biološko aktivnih metabolitov že od pradavnine,

zaradi česar imajo v mnogih kulturah posebno mesto. Glive uporabljene v zdravilstvu
proizvajajo množico sekundarnih metabolitov, ki na takšen ali drugačen način blagodejno
vplivajo v primeru prebolevanja bolezni in bolezni tudi preprečujejo. Uporabljajo jih tudi
za izboljšanje splošnega počutja in v verskih obredih, saj imajo nekatere močan
psihoaktiven učinek. Posebno mesto med medicinsko pomembnimi glivami imajo
entomopatogene glive rodu Cordyceps. Rod glavatcev (Cordyceps) je, zaradi svojih
farmakoloških učinkov, v azijskih kulturah izjemno cenjen. Zanimiva pa je tudi njegova
uporaba za kontrolo populacij določenih insektov, saj so glive rodu Codyceps za insekte
patogene (White in sod., 2003). Ko govorimo o glivah rodu Cordyceps, imamo največkrat
v mislih vrsto Cordyceps sinensis, ki jo zaradi velikosti in dostopnosti rastišča največkrat

uporabljajo. Zaradi njene redkosti in posledično visoke cene, se zato uporablja predvsem v
bogatejših slojih družbe. V tradicionalni kitajski medicini je gliva Cordyceps sinensis
poleg ginsenga priznana kot najmočnejše krepčilo in se uporablja pri težavah z ledvicami,
dihali in jetri, proti utrujenosti in oslabelosti ter pri motnjah spolne funkcije (Holliday in
Cleaver, 2008; Zhou in sod., 2009).
Dandanes medicinsko pomembne glive, med njimi tudi glavatci, ponovno pridobivajo
mesto v sodobni medicini. V raziskavah gliv rodu Cordyceps so identificirali mnoge
bioaktivne komponente, kot so kordicepin in drugi nukleozidi, različni polisaharidi,
manitol, ergosterol in aminofenoli. Tudi klinične raziskave učinkov glavatcev na človeški
organizem so pokazale, da imajo ti pozitiven učinek na jetra in ledvice, modulirajo imunski
sistem, so močni antioksidanti, zavirajo rast več oblik rakavih celic ter pozitivno vplivajo v
primeru sladkorne bolezni (Das in sod., 2010; Yue in sod., 2013). Njihova uporaba pa se je
razširila tudi med amaterskimi in profesionalnimi športniki, saj glavatci zaradi poživilnega
učinka omogočajo premagovanje večjih naporov (Paterson, 2008).
Rod askomicetnih gliv Cordyceps sensu lato vsebuje več kot 600 vrst. Po trenutnih
filogenetskih raziskavah so rod razdelili na štiri rodove: Cordyceps sensu strictu
(Cordycipitaceae), Ophiocordyceps (Ophiocordycipitaceae), kamor zdaj sodi gliva
Ophiocordyceps (prej Cordyceps) sinensis, Metacordyceps (Clavicipitaceae) in
Elaphocordyceps (Ophiocordycipitaceae). Vsi rodovi sodijo v red Sordariomycetes, deblo
Ascomycota. Glive teh rodov so patogene za širok nabor členonožcev (pajkov, pršic in
žuželk) z izjemo par vrst rodu Elaphocordyceps, ki zajedajo glive rodu Elaphomyces.
Kljub temu imajo posamezne vrste teh rodov po enega gostitelja, redkeje več sorodnih
gostiteljev z nekaj izjemami. Patogene so prav tako glive sorodne družine Clavicipitaceae,
vendar so njihovi gostitelji rastline. Pomemben predstavnik, ki je prav tako medicinsko
pomembna gliva, je roženi rožiček (Claviceps purpurea). Glive teh rodov najdemo na vseh
celinah, razen na Antarktiki. Največjo raznolikost pa najdemo v bližini ekvatorja (White in
Bacon, 2003; Sung in sod., 2007; Zheng in sod., 2013).
2.2.2 Pomembnejši predstavniki rodu Cordyceps
Najpomembnejši predstavnik med medicinsko pomembnimi entomopatogenimi glivami je

Ophiocordyceps, prej Cordycep, sinensis. Razlog za njegovo popularnost je njegova
velikost v primerjavi z ostalimi entomopatogenimi glivami in način rasti, ki omogoča, da je
glivo relativno lahko nabirati. V naravi je razširjena na visokogorskih travnatih planjavah
na Kitajskem, v Tibetu, Butanu, Nepalu in severno-vzhodnih regijah Indije na nadmorski
višini od 3000 do 5000 m. Gostitelj glive so gosenice metuljev (Lepidoptera), od teh
najdemo O. sinensis največkrat na ličinkah vešč rodov Hepialus in Thitarodes. Poleti in
jeseni glivne spore okužijo gosenice gostiteljev in jih med prezimovanjem v tleh
mumificirajo. Gliva v gosenici, ki se na zunaj skoraj ne spremeni, tvori sklerocij in v njen
prezimi. Spomladi in zgodaj poleti trosnjak oz. stromata glive požene iz glave gosenice in
se prebije na površje tal, (slika 1A), da odvrže spore. To je tudi primerna oblika glive za
nabiranje. Kitajsko ime glive je "Dong Chong Xia Cao" in opisuje njen življenjski krog.
"Dong Chong" pomeni "zimski črv" in se nanaša na zimsko obliko glive, "Xia Cao" pa
pomeni "trava poletja" in se nanaša na trosnjak, ki v toplejšem delu leta požene iz tal. V
tradicionalni medicini uporabljajo oba dela glive, tako trosnjak kot mumificirano gosenico
(slika 1B). O. sinensis je ime za telomorf glive, medtem ko je poimenovanje anamorfne
generacije glive nerazrešeno, saj poznamo kar 22 različnih imen gliv, ki bi naj bile
anamorfne oblike O. sinensis, npr. glive rodu Hirsutella (Cannon in sod., 2009; Zhou in
sod., 2009; Wang in Yao 2011; Chen in sod., 2013; Shashidhar in sod., 2013).
Zaradi slovesa, ki ga ima gliva O. sinensis v kitajski tradicionalni medicini, je po njej

visoko povpraševanje. Zaradi tega dosega tudi izjemno visoke cene, navadno nad 2000 $
na kilogram. To dvoje pripomore k temu, da se glivo prekomerno nabira, zaradi česar je
ogrožen njen obstoj v naravi. Države se proti tem borijo z zaščito specifičnih regij in
ustanovitvami rezervatov, z regulacijo nad prodajo in nabiranjem glive in s spodbujanjem
raziskav o gojenju glive. Predvsem slednje je pri O. sinensis problematično, saj trosnjakov
te glive še niso uspeli umetno vzgojiti. Micelij, ki ga je možno gojiti, pa se po vsebnosti
biološko aktivnih učinkovin razlikuje od trosnjakov (Dong in Yao, 2008; Holliday in
Cleaver, 2008; Cannon in sod., 2009).
Slika 1: Gliva O. sinensis in situ (A), nabrani trosnjaki glive O. sinensis, ki izraščajo iz mumificiranih
gosenic (B) (Cannon in sod., 2009).
Sorodna gliva, ki pa igra čedalje večjo vlogo med medicinsko pomembnimi glivami, pa je
Cordyceps militaris (Cordycipitaceae) oz. kokonov glavatec, tipska vrsta rodu Cordyceps
(sensu strictu) in predmet preučevanja v tej magistrski nalogi. Ta je razširjena v različnih
okoljih po celotnem svetu do nadmorske višine 2000 m. K široki razširjenosti prispeva
lastnost glive, da lahko okuži velik nabor različnih gostiteljev, kar za večino ostalih vrst
gliv rodu Cordyceps in sorodnih rodov ni značilno. Najpogostejši gostitelji so gosenice ter
bube metuljev redu Lepidoptera (slika 2B). Poleg teh pa tudi Ips sexdentatus (lubadar),
Lachnosterna quercina in Tenebrio molitor (navadni mokar) (Coleoptera - hrošči), Cimbex
similis (betičasta osica) (Hymenoptera - kožokrilci) in Tipula paludosa (košeninar)
(Diptera - dvokrilci). V naravi nabiranje trosnjakov C. militaris ni razširjeno, ker so
trosnjaki manjši kot pri O. sinensis. Prav tako pa se redkeje pojavlja in to posamično, ter ni
vezana na specifično obdobje leta (slika 2A) (Das in sod., 2010; Zheng in sod., 2011;
Shrestha in sod., 2012).
Bolj smiselno je zato gojenje glive C. militaris, saj je, za razliko od O. sinensis, mogoče
vzgojiti trosnjake. Po zdravilnih učinkovinah, ki jih vsebujeta in učinku, sta ti dve glivi
primerljivi. Micelij glive C. militaris vsebuje podobne metabolite v primerljivih količinah
kot trosnjaki in je zato prav tako primeren za uporabo. Nekatere raziskave celo kažejo, da
je v določenih primerih micelij glive bolj učinkovit, kot njeni trosnjaki (Liu in sod., 2014).
Tudi gojenje glive C. militaris ni prav zahtevno, saj raste na širokem naboru različnih virov
ogljika in dušika, tako na trdnih gojiščih kot na tekočih (Das in sod., 2010). Kot pri glivi O.
sinensis, tudi pri tej glivi ni razrešeno, kateri anamorf sodi k spolni obliki (Shrestha in sod.,
2012).
Slika 2: Trosnjak C. militaris in situ (A), trosnjaki C. militaris, ki izraščajo iz okužene in mumificirane
gosenice (B), prerez trosnjaka C. militaris z vidnimi periteciji (C) (Winkler, 2013).
2.2.3 Ekologija in pomen gliv rodu Cordyceps v okolju
Entomopatogene glive rodu Cordyceps in sorodnih rodov so razširjene na vseh celinah

razen Antarktike, kjer živijo v različnih kopenskih habitatih. Gostitelji gliv Cordyceps
sensu lato so organizmi iz desetih redov členonožcev, nekateri predstavniki rodu
Elaphocordyceps pa zajedajo gomoljike glive Elaphomyces (sl. košutnice) (Yue in sod.,
2013). Večina vrst je vrstno specifičnih ali pa okužujejo ozko sorodne vrste gostiteljev,
nekatere izjeme, med njimi tudi gliva C. militaris, pa so zmožne okužiti večji nabor vrst
členonožcev. V splošnem je življenjski cikel teh gliv sledeč (Evans in sod., 2011; Yue in
sod., 2013):
- Ko glivna spora zaide na površino gostitelja vzkali, hife okužijo gostiteljskega
insekta z vstopom skozi kutikulo, pri čemer uporabljajo encime (hitinaze, lipaze in
proteaze) in pritisk - tvorijo apresorij.
- Ko so v gostitelju, se morajo izogniti obrambnim mehanizmom insekta. Gliva raste
v gostiteljevem hemocelu. Za nekatere vrste Cordyceps je znano, da v tej fazi
začnejo izločati snovi, s katerimi vplivajo na obnašanje gostitelja.
- Gliva gostitelja ubije in tvori sklerocij v njegovem telesu.
- Po določenem času iz sklerocija poženejo strome, na katerih v peritecijih nastanejo

askospore (slika 2B in slika 2C).
Zaradi specifičnosti okužbe imajo te glive ključno vlogo pri uravnavanju populacij
členonožcev. Večji pomen imajo v tropskih in subtropskih regijah, kjer je raznolikost gliv
Cordyceps sensu lato velika. Pojavljajo pa se tudi dokazi, da entomopatogene glive ne
povzročijo vedno smrti gostitelja in da lahko z gostiteljem živijo v simbiozi. Narava
odnosa med entomopatogenimi glivami in njihovimi gostitelji ni v celoti preučena (Suh in
sod., 2001; Holliday in Cleaver, 2008).
Specifičnost do gostitelja in viruletnost nekaterih vrst Cordyceps sensu lato so lastnosti, ki

jih lahko uporabimo tudi za biološko kontrolo populacij določenih žuželk, ki povzročajo
škodo. Veliko različnih vrst entomopatogenih gliv so že testirali v tem smislu in rezultati
so obetavni. Na primer gliva Beauveria bassiana, anamorf Cordyceps spp., je bila uspešno
uporabljena za biološki nadzor mnogih žuželk, med drugim tudi posteljne stenice (Cimex
lectularius). Podobnih primerov pa je še mnogo (Stamets, 2000; Rehner in Buckley, 2005;
Barbarin in sod., 2012).
2.2.4 Pridobivanje in gojenje glive Cordyceps militaris
Micelij več vrst gliv Cordyceps lahko gojimo na različnih substratih. Vendar je vrsta C.
militaris edini predstavnik, ki tvori stromo v laboratorijskih pogojih in je zato tudi najbolj
zanimiva za gojenje. Kot že omenjeno, so gostitelji glive C. militars različne žuželke, te pa
lahko uporabimo kot naravni substrat za gojenje glive. Gojenje gliv rodu Cordyceps je
smiselno zaradi njihove redkosti in zaščite v naravi. Gliva O. sinensis, ki jo najdemo v
visokogorskih planjavah Himalaje, postaja zaradi pretiranega nabiranja ogrožena vrsta.
Poleg tega trosnjaki O. sinensis na trgu dosegajo vrtoglave cene, zaradi česar so pripravki
iz te glive dostopni le redkim. Z gojenjem gliv rodu Cordyceps bi tako preprečili
prekomerno nabiranje v naravi, zmanjšali njihovo ceno in dosegli izdelavo bolj
standardiziranih pripravkov (Zhu in sod., 1998a; Cannon in sod., 2009; Wang in Yao,
2011; Dong in Yao, 2011; Zhou in sod., 2014).
2.2.4.1 Gojenje na žuželkah
Eden izmed uporabljenih substratov so lahko naravni gostitelji glive C. militaris.

Poizkušali so jo gojiti na ličinkah in bubah Bombyx mori (sl. sviloprejka), Antheraea
pernyi, Tenebrio molitor (sl. mokar), Mamestra brassica (sl. kapusova sovka), Ostrinia
nubilalis (koruzna vešča) in drugih. Možno je gojenje izključno na insektih (Slika 3), kjer
glivo gojijo z inokulacijo bub oz. ličnik, lahko pa insekti predstavljajo del sestavljenega
gojišča. Problem gojenja na žuželkah je, da je takšno proizvodnjo težko prenesti na
industrijski nivo, prav tako pa so insekti nagnjeni k mikrobni kontaminaciji (Ni in sod.,
2009; Hong in sod., 2010; Liu in sod., 2014; Wen in sod., 2014).
Slika 3: Trosnjaki Cordyceps militaris rastejo iz bube sviloprejke Bombyx mori (Zheng in sod., 2011).
2.2.4.2 Gojenje na trdnih substratih
Za gojenje glive C. militaris lahko uporabimo številne substrate, ki temeljijo na ogljikovih

hidratih (Slika 4). Navadno substrat predstavljajo različna žita, kot so rjavi riž, pšenica,
koruza, proso in sirek, redkeje pa so v uporabi soja, koruzni storži, žagovina in drugi.
Omenjeni substrati predstavljajo glavnino gojišča, vendar so za uspešno rast glive potrebni
še dodatki. Kot vir dušika se v gojišče dodaja pepton, kvasni ekstrakt ali pripravki iz
insektov. Minerali (K+, Mg2+, Ca2+, PO43-) v nizkih koncentracijah spodbudijo rast glive in
tvorbo trosnjakov, prav tako lahko rast še dodatno spodbudijo različni vitamini ali
rastlinski hormoni (Shrestha in sod., 2012; Wen in sod., 2014).
Slika 4: Trosnjaki C. militaris na trdnem gojišču (Padilla-Brown, 2016).
2.2.4.3 Drugi načini gojenja
Prej omenjeni načini gojenja glive C. militaris omogočajo gojenje strome. Micelij glive za
produkcijo metabolitov pa je možno gojiti tudi v tekočih gojiščih, submerzno ali emerzno.
V prvem primeru gojimo glivo v bioreaktorjih, kjer gojišče mešamo in prezračujemo, v
drugem primeru pa gliva prerašča površino tekočega gojišča, ki ga med kultivacijo večkrat
zamenjamo (Slika 5). Sestava tekočih gojišč je podobna kot pri kultivaciji na trdnih
gojiščih, vendar brez dodanega agarja. Vir ogljika največkrat predstavlja glukoza, vir
dušika pepton ali kvasni ekstrakt, poleg teh pa gliva potrebuje še osnovne mineralne soli in
določene vitamine, aminokisline ali hormone (Shih in sod., 2007; Masuda in sod., 2007;
Das in sod., 2010).
Slika 5: Emerzna kultivacija micelija glive C. militaris (Das in sod., 2010).
2.2.4.4 Pogoji gojenja glive C. militaris
Vplivi okolja pri gojenju glive C. militaris so najpomembnejši pri prehodu iz rastne v
reproduktivno fazo rasti. Najpomembnejši sprožilec za tvorbo strome je svetloba, saj se v
odsotnosti le te stroma ne tvori. Intenziteta svetlobe pri gojenju je med 400 in 1000 luksov,
čas osvetlitve pa med 10 ur in 18 ur. Druga pomembna faktorja za uspešno gojenje glive pa
sta temperatura in zračna vlažnost. Rast micelija je najhitrejša pri 25 °C, rast trosnjakov pa
je najboljša pri temperaturi od 18 °C do 22 °C. Zračna vlažnost (70 % - 90 %) je
pomembna pri začetku rasti trosnjakov, saj prenizka zračna vlažnost povzroči, da se
primordiji glive izsušijo, kar prepreči rast trosnjakov (Shrestha in sod., 2012).
2.3 FARMAKOLOŠKO AKTIVNI METABOLITI GLIV RODU Cordyceps
Glive rodu Cordyceps vsebujejo različne biološko aktivne snovi. Poleg tega pa vsebujejo
tudi esencialne aminokisline, vitamine (E, K, B1, B2, B12), nenasičene maščobne kisline
in številne mikroelemente. Tradicionalno jih uporabljajo tudi v kulinariki, kar je eden
izmed načinov uživanja v tradicionalni kitajski medicini (Shrestha in sod., 2012).
Snovi, ki jih vsebujejo glavatci, imajo farmakološki učinek predvsem zaradi vpliva na
znotrajcelično oksidacijo, raven ATP v celicah, metabolizem sladkorjev in maščob ter
spodbujanje imunskega sistema. Mednje sodijo različni polisaharidi (npr. β - glukani,
galaktomanani,...), kordicepin (3'-deoksiadenozin), adenozin in drugi nukleozidi, steroli
(ergosterol), različni proteini in peptidi, manitol ter druge bioaktivne molekule (Zhou in
sod., 2009; Yue in sod., 2013).
2.3.1 Kordicepin in drugi nukleozidi
Nukleozidi predstavljajo dobršen del metabolitov glive C. militaris in imajo pomembno

vlogo pri zdravilnem delovanju glive. Najpomembnejša nukleozida v smislu uporabe glive
C. militaris sta adenozin in njegov analog kordicepin (Slika 6). Prav tako pa gliva
proizvaja več kot deset drugih nukleozidov, med katerimi so uridin, različni deoksiuridini,
gvanozin, hidroksietiladenozin, 2'-3'-dideoksiadenozin, inozin in drugi (Das in sod., 2010;
Shashidhar in sod., 2013). Kordicepin je derivat adenozina-3'-deoksiadenozin, torej se od
adenozina razlikuje po odsotnosti OH skupine na 3' mestu riboze. Kordicepin je bil prvič
izoliran sredi 20. stoletja, njegova struktura pa je bila določena v šestdesetih (Slika 6)
(Cunningham in sod., 1950; Kaczka in sod., 1964).
Slika 6: Strukturna formula molekule kordicepina in adenozina (Lee in sod., 2013).

Adenozinski receptorji so udeleženi v različne procese v telesu, kot so regulacija spanja,

imunski odziv, respiratorna in kardiovaskularna regulacija, aktivnost ledvic ter jeter. Glede
na tip receptorja, jih najdemo po celem telesu, ali pa v posameznih tkivih in organih kot
npr. v možganih, pljučih, srcu, jetrih ter ledvicah. Farmakološki učinki glive C. militaris se
ujemajo z razporeditvijo adenozinskih receptorjev po telesu. Poleg tega kordicepin, zaradi
podobnosti z adenozinom, deluje kot njegov analog. Ko vstopi v celico, se pretvori v 5'
mono-, di- ali tri-fosfat. V tej obliki lahko vpliva na sintezo purinov (inhibira aktivnost
encimov riboza-fosfat pirofosfokinaza in 5-fosforibozil-1-pirofosfat amidotransferaza), na
terminacijo sinteze RNA molekul (če se v nastajajočo RNA ustavi na mesto adenozina,
pride na tem mestu do terminacije sinteze RNA) in mTOR signalno pot, ki je vpletena v
rast celice, njeno proliferacijo, sintezo proteinov, gibljivost, avtofagijo in transkripcijo, iz
česar izhaja vsaj del protirakavega učinka glive (Lin in Li, 2011; Tuli in sod., 2013).
2.3.2 Polisaharidi
Polisaharidi predstavljajo od 3 do 8 % celotne biomase gliv Cordyceps spp. Strukturno so

raznolika skupina bioloških makromolekul s širokim naborom učinkov. Najpomembnejši
prispevek k učinku pripisujejo Codyceps polisaharidom (CP), raznoliki skupini
galaktomananskih polisaharidov, ki jih najdemo pri različnih vrstah rodu Cordyceps. V
splošnem je učinek CP odvisen od njihove kemijske sestave, molekulske mase,
konformacije, glikozidnih vezi in stopnje razvejanosti. Monosaharidna sestava CP je
različna, vendar na splošno večji del predstavljajo ostanki manoze, galaktoze in glukoze,
redkeje pa najdemo še monosaharide, kot so ksiloza, ramnoza, arabinoza in nekatere druge.
Prav tako se razlikujejo po molekulski masi, ki znaša od 103 Da do 105 Da (Zhong in sod.,
2009; Zhou in sod., 2009).
Pomemben učinek CP v človeškem telesu je stimulacija imunskega sistema in posledično

večja odpornost telesa prodi okužbam, raku ter drugim obolenjem. Prirojeni imunski
sistem z receptorji kot npr. tolični receptorji (ang. Toll-like receptors - TLR) CP prepozna
kot s patogeni povezane molekularne vzorce (ang. pathogen-associated molecular patterns
- PAMP). Posledica je aktivacija naravnih celic ubijalk, T-celic, B-celic in od makrofagov
odvisnega imunskega odziva, kar privede do večje odpornosti človeškega telesa. Uporaba
glivnih polisaharidov za stimulacijo imunskega sistema se raziskuje predvsem za
zdravljenje in preprečevanja raka. Poleg tega so bili potrjeni učinki CP na jetra. CP

zaščitijo oz. zmanjšajo škodo jeter v primeru kemičnih ali avtoimunih poškodb (npr. v
primeru fibroze jeter) in izboljšajo funkcijo jeter. Sklepajo, da je učinek povezan s
stimulacijo Kupfferjevih celic, zmanjšanim odlaganjem imunskega kompleksa in
nespecifičnim imunskim odzivom. Ostali učinki, ki jih izkazujejo polisaharidi gliv
Cordyceps, so še antioksidativni učinek, zmanjšanje maščob in holesterola v krvi ter
hipoglikemični učinek (Zhong in sod., 2009; Zhou in sod., 2009; Lee in Hong, 2011; Wang
in sod., 2012; Yue in sod., 2013).
2.3.3 Maščobne kisline
V glivi C. militaris najdemo nabor različnih maščobnih kislin, med katerimi prevladujejo
nenasičene maščobne kisline (linolna in oleinska kislina) pred nasičenimi (palmitinska in
oktadekanojska kislina). Nenasičene maščobne kisline imajo učinek na zmanjševanje ravni
lipidov v krvi in ščitijo pred kardiovaskularnimi obolenji. Proste maščobne kisline so
receptorji nekaterih G proteinov (GPR 40, 41, 43, 84 in 120), ki imajo vlogo pri regulaciji
glukoze v krvi in nastanku sladkorne bolezni (Zhou in sod., 2014).
2.3.4 Ergosterol in drugi steroli
Ergosterol (Slika 7) in njegove estre najdemo v celičnih membranah gliv. V človeškem

organizmu je ergosterol provitamin za vitamin D2, ki ima pomembno vlogo pri razvoju in
obnovi kostnega tkiva (Yang in sod., 2009). Poleg ergosterola, ki predstavlja glavni sterol
v glivi C. militaris, najdemo v njem še druge sterole, kot so ergosterol peroksid, β-
stiosterol, kampesterol in drugi. Ergosterolu predpisujejo predvsem citotoksični in
protirakav učinek. Poleg ergosterola pa so učinkoviti tudi drugi steroli, npr. β-sitosterol in
kampesterol, ki delujejo zaviralno na proliferacijo določenih tipov rakavih celic (Paterson,
2008; Yang in sod., 2009; Yue in sod., 2013; Zhou in sod., 2014; Lee in sod., 2015).
Slika 7: Strukturna formula molekule ergosterola (Mercer, 1984)
2.3.5 D-manitol ali kordicepinska kislina
Gliva C. militaris vsebuje manitol, ki predstavlja od 2,4 % do 3,4 % suhe mase, odvisno od
faze rasti in dela glive. Manitol je poliol oz. sladkorni alkohol s široko uporabno vrednostjo
v živilski industriji in medicini. Ni specifičen za vrste Cordyceps spp. in ga najdemo tudi v
drugih glivah, rastlinah in lišajih. Ob prvi zaznavi manitola v glivah rodu Cordyceps so le
tega napačno identificirali in ga poimenovali kordicepinska kislina (1,3,4,5-
tetrahidroksicikloheksan 1-karboksilna kislina). Kasneje se je izkazalo, da je kordicepinska
kislina v resnici D-manitol, kar je razlog za dvojno poimenovanje (Zhou in sod., 2009).
V medicini se manitol uporablja zaradi njegovih diuretično-osmotskih lastnosti. Zaradi

zniževanja krvnega tlaka in diuretičnega delovanja, D-manitol uporabljajo za zdravljenje
celebralnih endemov in oteklin možganov v primeru poškodb možganov, akutne odpovedi
ledvic ter povečanem intraokularnem pritisku. V obliki prahu se uporablja kot inhalant za
zdravljenje cistične fibroze, ker poveča čiščenje sluzi in vlaži sluznice dihal. V
tradicionalni kitajski medicini glive rodu Cordyceps uporabljajo za zdravljenje nekaterih
bolezni respiratornega sistema in ledvic, kar bi lahko povezali s tem, da te glive vsebujejo
D-manitol (Zhou in sod., 2009; Lin in Li, 2011).
2.3.6 Druge učinkovine
V več vrstah gliv Cordyceps spp. najdemo ciklične peptide. Zasledili so jih tudi v C.
militaris (npr. ciklo-(Val-Pro), ciklo-(Ala-Leu), ciklo-(Phe-Pro)) s proti-virusno,
antibiotično, proti-tumorsko, proti-malarijsko in proti-mutageno aktivnostjo (Paterson,
2008; Shashidhar in sod., 2013).
V glivi C. militaris so zasledili tudi peptid kordimin, ki ima proti-glivno aktivnost, inhibira
delovanje HIV-1 reverzne transkriptaze in ima potencialni učinek proti nekaterim vrstam
raka. Velik je okoli 10 kDa in obstojen do temperature 100 °C (Wong in sod., 2011). Ostali
metaboliti, ki jih najdemo v glivi C. militaris, so še cefarosporolidi, 10-členski makrolidi,
dipikolinska kislina in drugi (Paterson, 2008).
2.4 ZDRAVILNI UČINKI IN TRADICIONALNA UPORABA GLIV Cordyceps
Glavatci so vzbudili pozornost znanstvenikov, ko so septembra 1993 na nacionalnem

atletskem tekmovanju na Kitajskem padli svetovni rekordi v teku žensk na 10000 m, 3000
m in 1500 m. Atletinje so kot razlog za rezultat navedle dieto, ki je vključevala O. sinensis
(Pegler in sod., 1994). V kitajski tradicionalni medicini so glavatce uporabljali za širok
nabor zdravstvenih težav, zaradi česar je gliva dobila skorajda magičen sloves. Večino
zdravilnih učinkov je potrebno še dodatno preveriti z znanstvenimi metodami. Vendar so
raziskave, ki bile opravljene do danes potrdile, da je sloves glavatcev deloma upravičen. V
kontekstu tradicionalne kitajske medicine so glavatce uporabljali za zdravljenje sledečih
bolezni (Zhu in sod., 1998b; Paterson, 2008; Zhou in sod., 2009):
- nepravilno delovanje ledvic,
- bolezni respiratornega trakta, s poudarkom na pljučih in spodnjem respiratornem
traktu,
- težave z delovanjem jeter,
- splošna utrujenosti in oslabelost po boleznih ali poškodbah,
- hiperglikemija in hiperlipidemija,
- aritmija in nekaterih drugih srčnih okvar,
- rakava obolenja,
- stimulacijo imunskega sistema,

- moške in ženske hiposeksualnosti, tudi za zdravljenje impotence.
Danes so na podlagi znanstvenih raziskav nekateri izmed teh učinkov potrjeni. Večina
študij je preučevala delovanje ekstraktov ali posameznih sekundarnih metabolitov glive C.
militaris na imunski sistem, rakave celice in delovanje jeter. Podrobnejši opisi delovanja
ekstraktov in posameznih učinkovin C. militaris sledijo v nadaljevanju naloge (Ng in
Wang, 2005; Lee in sod., 2013; Liu in sod., 2014; Kang in sod., 2015).
2.4.1 Pripravki iz glive C. militaris
V tradicionalni medicini se uporabljajo trosnjaki glive C. militaris, in sicer kot dodatek k

hrani ali prehransko dopolnilo. Trosnjake gobe na Kitajskem in Tajvanu uporabljajo v
juhah, omakah, jogurtih in drugih jedeh. Drugi način uporabe je kot prehransko dopolnilo v
obliki čajev, praškov, kapsul in raznih ekstraktov (v alkoholu ali kisu). Z razvojem tehnik
gojenja micelija, tudi ta prihaja v uporabo kot nadomestek trosnjakov v prehranskih
dopolnilih. Micelij skupaj s substratom, ki je pogosto žito, posušijo, zmeljejo in direktno
uporabijo za izdelavo preparatov (Shrestha in sod., 2012). V Evropi se pripravki iz glive C.
militaris smatrajo kot prehransko dopolnilo in se zato uporabljajo za krepitev splošnega
zdravja ali kot podpora pri zdravljenju določenih obolenj ter ne kot zdravilo.
2.5 FARMAKOLOŠKO DELOVANJE
Mnoge študije potrjujejo, da imajo glive rodu Cordyceps raznolike biološke učinke in velik
farmakološki potencial. Snovi, ki jih najdemo v glivi C. militaris, vplivajo na ledvični,
imunološki, jetrni, živčni in kardiovaskularni sistem, poleg tega pa delujejo proti raku,
antivirusno, antibakterijsko in antimikotično. Označimo jih lahko kot adaptogene, ti pa so
metabolni regulatorji, ki povečajo sposobnost organizma, da se prilagodi na okoljski stres
in se s tem izogne škodi, ki jo ta lahko povzroči. V študijah in kot prehransko dopolnilo so
največkrat uporabljeni vodni ali alkoholni ekstrakti glive (Shashidhar in sod., 2013).
2.5.1 Energijski metabolizem
Izčrpanost oz. potreba po večji vzdržljivosti je eden izmed razlogov uporabe gliv rodu
Cordyceps. Uživanje glive naj bi vplivalo na energijski metabolizem, podrobneje na
učinkovitejše delovanje elektronske prenašalne verige, posledica česar je povečana raven
ATP in zmanjšana znotrajcelična oksidacija v celicah. Vpliv gliv Cordyceps na energijski
metabolizem je bil preučen na modelu miši (Ko in Leung, 2007; Zhou in sod., 2009).
Izsledki raziskav, ki so preučevale problem, so bili naslednji:
- V raziskavi na zdravih miškah je bilo pokazano, da imajo miši, ki so dnevno prejemale
200 mg/kg ekstrakta O. sinensis, večjo koncentracijo ATP in manj anorganskega fosfata v
jetrnih celicah. Razmerje ATP/Pi je bilo večje v tretiranih miših. Sedem dni po prenehanju
prejemanja ekstrakta razlike med kontrolnimi in tretiranimi skupinami miši ni bilo več
možno zaznati (Manabe in sod., 1995).
- V podobni raziskavi so preverjali učinek ekstrakta na miši, ki so bile anemične zaradi
pomanjkanja železa v krvi in so se v času prejemanja učinkovine prehranjevale z železom
bogato hrano. Znotrajcelična koncentracija ATP je bila večja tako v zdravih miših, ki so
prejemale ekstrakt kot v anemičnih. Povečan je bil tudi pretok krvi skozi jetra pri obeh
skupinah, ki so prejemale ekstrakt v primerjavi s kontrolnimi mišmi. Anemija je povezana
z zmanjšanim pretokom krvi skozi jetra, vendar se je pretok pri anemičnih miših po štirih
tednih prejemanja ekstrakta izenačil s pretokom, ki so ga dosegale zdrave miši, katere so
prejemale ekstrakt (Manabe in sod., 2000).
- Podobne rezultate so ugotovili tudi v študiji, ki je testirala učinkovitost delovanja
komercialnega preparata CordyMaxTM Cs-4. Prav tako so pokazali, da preparat poviša
znotrajcelično koncentracijo ATP v hepatocitah. Po sedmih dneh od prenehanja terapije se
je raven ATP v hepatocitah tretiranih miši vrnila na enako raven kot pri kontrolni skupini
miši (Dai in sod., 2001).
- Učinek glive C. militaris so preverjali tudi s preizkusi prisilnega plavanja na miših. V
študiji so preverjali ali ima gliva C. militaris učinek na čas plavanja do izčrpanosti. Miši so
štiri tedne prejemale 500 mg/kg ekstrakta glive na dan, na kar so jim obtežili rep z utežjo
(4 % telesne teže miši) in jih dali v bazen z vodo, kjer so morale aktivno plavati, da niso
potonile. Čas do izčrpanosti je bil pri miših, ki so prejemale ekstrakt, signifikantno daljši
(Jung in sod., 2004).
2.5.2 Antioksidativno delovanje
Reaktivne kisikove zvrsti (ang. reactive oxygen species - ROS) so normalni produkti
celičnega metabolizma. Mednje sodijo singlet kisik (1O2), superoksidni anion (O2-),
vodikov peroksid (H2O2) in hidroksilni radikal (OH•).
ROS celicam lahko škodujejo, saj povzročajo oksidativni stres. Ta se pojavi, ko v bioloških
sistemih pride do prevelike produkcije ROS na eni strani in pomanjkanja encimskih ter
neencimskih antioksidantov na drugi. Višek ROS lahko poškoduje molekule celice (lipide,
proteine, DNA) in inhibira njihovo normalno funkcijo. Škodo, ki jo v človeškem
organizmu povzroča oksidativni stres, povezujemo z rakom, kardiovaskularnimi obolenji,
arterosklerozo, povečanim krvnim tlakom, neurodegerativnimi obolenji, revmatoidnim
artritisom, staranjem in nekaterimi drugimi patološkimi stanji (Valko in sod., 2007).
Za obrambo pred ROS v človeških celicah obstajajo številni obrambni mehanizmi, ki

vključujejo preventivne mehanizme, popravljalne mehanizme, fizično obrambo in
antioksidante. Pomemben vir le teh predstavljajo rastline ali glive (Valko in sod., 2007).
Različne in vivo in in vitro raziskave so pokazale, da imajo ekstrakti gliv rodu Cordyceps
antioksidativni učinek. Pomemben del antioksidativnega učinka predstavljajo polisaharidi,
ki jih te glive vsebujejo (Yu, 2007; Wang in sod., 2012; Shashidhar in sod., 2013).
V eni izmed študij so karakterizirali strukturo in antioksidativni učinek polisaharida P70-1,

ki ga najdemo v trosnjakih glive C. militaris. Ugotovili so, da ima P70-1 antioksidativni
učinek, ki je odvisen od koncentracije. Določili so, da ima vrednost IC50 0,548 mg/ml, v
primerjavi z askorbinsko kislino, katere IC50 je 0,358 mg/ml (Yu in sod., 2007).
Zhan in sodelavci (2006) so v študiji preverjali antioksidativni učinek ekstraktov glive C.

militaris pridobljenih z ekstrakcijo z vročo vodo. Ugotovili so, da ima ekstrakt glive C.
militaris močno antioksidativno aktivnost, ki je primerljiva z askorbinsko kislino in zmeren
vpliv na kelacijo železovih ionov, redukcijo ter zaviranje peroksidacije linolne kisline.
Antioksidativni učinek glive C. militaris so preverjali tudi v in vivo študijah na miših (Liu
in sod., 2016). Preverjali so vpliv na aktivnost katalaze, superoksid dismutaze, glutation
peroksidaze in skupno antioksidativno kapaciteto v jetrih, ledvicah, srcu ter krvnem
serumu miši, ki so jih hranili z ekstraktom glive C. militaris. Rezultati so pokazali
signifikantno večjo aktivnost omenjenih encimov pri miših, ki so bili hranjene z ekstrakti
glive C. militaris v primerjavi s kontrolno skupino miši. V jetrih, ledvicah in srcu je bil
učinek ekstrakta večji kot v krvnem serumu. Učinek ekstrakta se je večal s koncentracijo
ekstrakta. Prav tako so merili količino nastalega malondialdehida (MDA), ki je končni
produkt pri peroksidaciji lipidov in ga smatrajo kot pokazatelj citotoksičnosti ter celičnih
poškodb. Izmerili so znatno manjše ravni MDA pri miših hranjenih z ekstraktom. Tudi
tukaj se je večja koncentracija ekstrakta odrazila v manjši ravni MDA.
2.5.3 Imunomodulatorni učinek
Za imunomodulatorni učinek, ki ga pripisujemo mnogim medicinsko zanimivim glivam, so

odgovorni različni polisahardi. Prostotrosnice, kot so Ganoderma lucidum, Lentinus
edodes, Inonotus obliquus, Trametes versicolor in mnoge druge, so danes v splošni uporabi
z namenom spodbujanja imunskega sistema pri ljudeh, ki se zdravijo za različnimi
oblikami raka. Prav tako pa jih uživajo tudi zdravi ljudje za ohranjanje splošne odpornosti
proti sezonskim virozam in drugim obolenjem (Wasser, 2003; Chen in sod., 2015).
Polisaharidi spadajo v strukturno raznoliko skupino makromolekul in so polimeri
monosaharidnih ostankov, ki se povezujejo z glikozidnimi vezmi. Večina glivnih
polisaharidov je glukanov z različnimi glikozidnimi vezmi, kot so (1 →3), (1→6)-β-
glukani in (1→3)-α-glukani (Wasser, 2003).
Študije so pokazale, da imajo številne glive iz rodu Cordyceps prav tako

imunomodulatoren učinek, tako imunostimulativen kot tudi imunosupresiven. Glavni
učinki biološko aktivnih molekul iz teh gliv vključujejo aktivacijo imunskih celic, kot je
limfni proliferativni odziv (ang. lymph proliferative response), aktivacijo naravnih celic
ubijalk (NK celic) in spodbujanje mononuklearnih celic (ang. human mononuclear cells) k
produkciji interleukina-2 (IL-2) in tumor nekrotizirajočega faktorja alfa (TNF-α).
Omenjene učinke najpogosteje pripisujejo polisaharidom (Zhou in sod., 2009; Brigham in

sod., 2013).
Kang in sodelavci (2015) so v študiji preučevali učinek etanolnega ekstrakta glive C.

militaris na zdrave moške v Južni Koreji. Izmerili so signifikantno večjo aktivnost celic
NK200, povišano proliferacijo limfocitov, zvišanje vrednosti IL-2 in interferona gama
(INF-γ). Prav tako niso zaznali stranskih učinkov pri nobeni izmed eksperimentalnih
skupin.
Učinke na celice imunskega sistema so preučevali tudi Lee in sodelavci (2010). V obsežni
raziskavi, kjer so karakterizirali strukturo polisaharidov iz gojenega micelija glive C.
militaris z imunostimulativnim učinkom, so preverjali učinek teh polisaharidov na linijo
makrofagom podobnih celic. Izmerili so, da izpostavljene celice proizvajajo večje količine
dušikovega oksida (NO) kot kontrolna skupina celic. Dokazali so, da so polisaharidi iz
glive C. militaris močno spodbudili izražanje citokinov TNF-α in interleukina-1-β.
Sproščanje dušikovega oksida in vnetnih citokinov kaže na to, da so polisaharidi iz glive C.
militaris zmožni aktivirati makrofage.
2.5.4 Protirakavo delovanje
Protirakavo delovanje je eden glavnih razlogov za preučevanje biološko aktivnih molekul,

ki jih posedujejo glive rodu Cordyceps. V več vrstah gliv rodu Cordyceps so opazili
zmožnost zaviranja rasti različnih oblik raka. Raziskave protirakavega delovanja
bioaktivnih komponent glive C. militaris so bile opravljene in vitro na celičnih kulturah
človeških rakavih celic ter in vivo s pomočjo živalskih modelov (Ng in Wang, 2005; Zhou
in sod., 2009; Yue in sod., 2013). V splošnem lahko mehanizme protirakavega delovanja
pripišemo sledečim učinkom (Zhou in sod., 2009):
- imunomodulatorni učinek in spodbujanje nespecifične imunosti,
- selektivna inhibicija sinteze RNA in s tem vpliv na sintezo proteinov,
- omejevanje rasti krvnih žil oz. antiangiogen učinek,
- indukcija apoptoze rakavih celic,
- vpliv na regulacijo signalih poti,
- antioksidativni učinek,
- anti-mutageni učinek,
- indukcija metilacije nukleinskih kislin,
- zaviranje replikacije virusov vpletenih v nastanek tumorjev.
V zadnjih 60 letih je bil opravljen velik nabor študij, v katerih so proučevali delovanje
kordicepina na rakave celice. Vpliv kordicepina na rakave celice so Tian in sodelavci
(2015) povzeli z mehanizmi inhibicije proliferacije rakavih celic ter indukcijo apoptoze
rakavih celic z vplivom na različne signalne poti.
Študije na celičnih linijah rakavih celic so pokazale, da ima vodotopna frakcija glive C.
militaris citotoksično aktivnost na tri rakave humane celične linije; trebušni
adenokarcinom (SNU-1), kolorektalni adenokarcinom (SUN-C4) in hepatocelularni
karcinom (SNH-354). Kot glavno učinkovino, odgovorno za ta učinek, so določili
kordicepin (Yue in sod., 2013).
V študiji, ki so jo opravili Yoo in sodelavci (2004), so preučevali vpliv ekstrakta glive C.

militaris na angiogenezo in rast tumorjev. Rezultati študije na miših so pokazali, da
ekstrakt inhibira rast endotelijskih celic, ki tvorijo nove kapilare in zavira rast določenih
tipov rakavih celičnih linij tako v in vitro sistemih kot in vivo. Ekstrakt je inhibiral rast
celičnih linij humanih umbiličnih žilnih endoteličnih celic (ang. human umbilical vein
endothelial cells - HUVEC), rakavih celic HT1080 in znižal izražanje metaloproteaze
MMP-2, ki je vpletena v sposobnost metastaziranja različnih tipov tumorskih celic. Znižal
je tudi raven izražanja rastnega faktorja bFGF, ki spodbuja angiogenezo.
Raziskava, ki je podrobneje preučevala učinek in mehanizem delovanja ekstrakta

polisaharidov iz glive C. militaris, je delo Chen in sodelavcev (2015). Ugotovili so, da
vodni ekstrakt polisaharidov ustavi rast in sproži apoptozo rakavih celic človeškega
trebušnega raka BGC-823, raka jeter SMMC-7721 in raka dojk MCF-7. Delitev celic se je,
zaradi učinka ekstrakta, ustavila v fazi G0/G1 in G2/M in zmanjšala stopnjo sinteze DNA.
3 MATERIALI IN METODE
3.1 POTEK EKSPERIMENTALNEGA DELA
Glivo C. militaris smo gojili na gojiščih, kjer so bila osnova pšenična zrna. Gojiščem smo
dodali pepton, ličinke mokarja ali kavni ostanek. V treh različnih časih gojenja glive smo
makromorfološko opisali rast glive ter odvzeli vzorce gojišča, na katerem je rastla gliva in
iz njih pripravili vodni ekstrakt. Z metodo HPLC smo določili koncentracijo kordicepina v
vodnih ekstraktih. Z vodnim ekstraktom smo v nadaljevanju tretirali celice kvasovke S.
cerevisiae ter izmerili znotrajcelično oksidacijo in raven ATP (Slika 8).
Gojenje kvasovk S. cerevisiae na

trdnem gojišču, priprava gojišč in
Priprava gojišč. pribora.
Aerobna submerzna
Gojenje glive C. militaris (28 °C).
kultivacija.
Priprava celične suspenzije celic

Opis makromorfoloških lastnosti in
kvasovke v stacionarni fazi rasti v PBS
vzorčenje preraščenega gojišča v treh
pufru.
časih kultivacije.
Izpostavitev celic vodnemu ekstraktu

Priprava vodnih ekstraktov iz preraščenega gojišča.
preraščenega gojišča.
Merjenje znotrajcelične oksidacije v

Določanje koncentracije kvasnih celicah
kordicepina.
Merjenje znotrajcelične ravni ATP v

kvasnih celicah
Slika 8: Shematski prikaz poteka eksperimenta.

3.2 MATERIALI
3.2.1 Gliva Cordyceps militaris
V raziskavi smo uporabili glivo Cordyceps militaris iz Zbirke kultur lesnih gliv Oddelka za
lesarstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
3.2.2 Komercialni pripravek glive Cordyceps militaris
Uporabili smo komercialni pripravek glive C. militaris, ki smo ga za namene

eksperimentov označili kot pripravek 1. Pripravek je komercialno dostopen na trgu in je
narejen iz zmletega gojišča, na katerem je rastla gliva C. militaris.
3.2.3 Kvasovka
V poizkusih smo uporabljali kvasovko Saccharomyces cerevisiae ZIM 2155 iz Zbirke

industrijskih mikroorganizmov (ZIM) Katedre za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost
živil Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani (Raspor in sod., 1995).
3.2.4 Gojišča
3.2.4.1 Trdno gojišče PDA za gojenje glive C. militaris
Sestavine gojišča (Preglednica 1) smo raztopili v destilirani vodi, jih zmešali na

magnetnem mešalu in avtoklavirali 20 min pri 121 °C oz. 1,2 bar. pH gojišča je bil 5,6.
Primerno ohlajeno gojišče smo nato razlili v petrijevke.
Preglednica 1: Sestavine trdnega gojišča PDA za gojenje glive C. militaris.
Sestavine Končna koncentracija (g/l)

Krompirjev ekstrakt (Sigma Aldrich) 4 g/l
Glukoza (Merck) 20 g/l
Agar (Sigma Aldrich) 20 g/l
3.2.4.2 Pšenično gojišče z dodatki za kultivacijo glive C. militaris
Pšenična zrna z dodatki smo skuhali pri temperaturi 100 °C v osnovnem tekočem gojišču
(Preglednica 3). pH osnovnega tekočega gojišča je bil 6,1. Osnovno tekoče gojišče in
gojišče s pšeničnimi zrni sta bila v razmerju 2:3. Kavni ostanek je ostanek pražene in mlete
kave, ki ostane po kuhanju kave. Pridobili smo ga iz naprave za kuhanje espresso kave.
Suhe mokarjeve ličinke smo kupili v trgovini za male živali. Pripravili smo štiri različna
gojišča (Preglednica 2).
Preglednica 2: Sestava gojišč za gojenje micelija glive Cordyceps militaris. Vrednosti so podane v masi na
kilogram gojišča.
Ime gojišča in njegova oznaka Osnovno Pšenična zrna Pepton Ličinke Kavni
tekoče gojišče mokarja ostanek
Pšenično gojišče – PG 400 g 600 g / / /

Pšenično gojišče z dodanim
400 g 600 g 4g / /
peptonom – PGP
Pšenično gojišče z dodanimi
400 g 510 g / 90 g /
mokarjevimi ličinkami – PGM
Pšenično gojišče z dodanim
400 g 480 g / / 120 g
kavnim ostankom – PGK
Legenda: / - sestavina v gojišču ni bila uporabljena.
Tako pripravljena gojišča smo prenesli v 0,7 l kozarce z navojem in avtoklavirali 2 uri pri
121 °C oz. 1,2 bar. Količina gojišča v kozarcu je bila 370 g.
Preglednica 3: Sestavine osnovnega tekočega gojišča brez pšeničnih zrn in dodatkov za kultivacijo glive C.
militaris. * Pepton smo v gojišče dodali samo pri pripravi gojišča PGP.
Sestavine tekočega gojišča Koncentracija v tekočem gojišču (g/l)

MgCl2 (Kemika) 1 g/l
K2HPO4 (Kemika) 1 g/l
CaSO4 (Kemika) 1 g/l
Pepton (Biolife)* 10 g/l
3.2.4.3 Trdno gojišče YEPD za kultivacijo kvasovke Saccharomyces cerevisiae
Sestavine gojišča (Preglednica 4) smo raztopili v destilirani vodi, zmešali na magnetnem

mešalu in avtoklavirali 20 min pri 121 °C oz. 1,2 bar. Primerno ohlajeno gojišče smo nato
razlili v petrijevke.
Preglednica 4: Sestavine trdnega gojišča YEPD za kultivacijo kvasovke S. cerevisiae ZIM 2155.
Sestavine Koncentracija v gojišču (g/l)
Pepton (Sigma Aldrich) 20 g/l

Kvasni ekstrakt (Sigma Aldrich) 10 g/l
Agar (Sigma Aldrich) 20 g/l
3.2.4.4 Tekoče gojišče YEPD
Sestavine gojišča (Preglednica 5) smo raztopili v destilirani vodi, zmešali na magnetnem

mešalu in avtoklavirali 20 min pri 121 °C in 1,2 bar. pH gojišča je bila 5,8.
Preglednica 5: Tekoče gojišče za kultivacijo kvasovke S. cerevisiae ZIM 2155 do začetka stacionarne faze.
Sestavine Koncentracija v gojišču (g/l)

Pepton (Sigma Aldrich) 20 g/l
Kvasni ekstrakt (Sigma Aldrich) 10 g/l
3.2.5 Reagenti in kompleti
3.2.5.1 Pufer PBS
Pripravljeni pufer PBS (Preglednica 6) smo avtoklavirali 20 min pri 121 °C oz. 1,2 bar. Do
uporabe smo ga hranili pri 4 °C. Pred uporabo smo ga segreli na 28 °C.
Preglednica 6: Sestava pufra PBS
Sestavine Količina Končna koncentracija

1 tableta (Oxoid) NaCl 8,0 g 80 g/l
KCl 0,2 g 2 g/l
Na2HPO4 1,15 g 11,5 g/l
KH2PO4 0,2 g 2 g/l
ddH2O Do 100 ml
3.2.5.2 50 mM kalijev fosfatni pufer pH 7,8
50 mM kalijevo fosfatni pufer pH 7,8 smo pripravili tako, da smo najprej pripravili 50 mM
raztopini kalijevega dihidrogenfosfata - KH2PO4 (Preglednica 7) in kalijevega
hidrogenfosfata - K2HPO4 (Preglednica 8). Ob konstantnem mešanju na magnetnem
mešalu smo s pH metrom nato kislo komponento dodajali bazični, dokler nismo dosegli pH
7,8. Pufer smo sterilizirali s filtracijo skozi filter z velikostjo por 0,2 μm. Do uporabe smo
ga hranili pri 4 °C. Pred uporabo smo ga segreli na 28 °C.
Preglednica 7: Raztopina kalijevega dihidrogenfosfata - kisla komponenta pufra.

KH2PO4 (Merck) 3,40 g 50 mM
ddH2O 500 ml /
Preglednica 8: Raztopina kalijevega hidrogenfosfata - bazična komponenta pufra.

K2HPO4 (Merck) 4,36 g 50 mM
ddH2O 500 ml /
3.2.5.3 Reagent 2',7'-diklorodihidrofluorescein diacetat (H2DCFDA)
Pripravljali smo 1 mM založno raztopino H2DCFDA (Sigma Aldrich). Odtehtali smo

manjšo količino reagenta (od 0,0020 do 0,0030 g) in dodali toliko 96% etanola, da smo
dobili končno koncentracijo 1 mM. Vsakič smo pripravili novo založno raztopino pol ure
pred uporabo. Suh reagent smo hranili na -20 °C.
3.2.5.4 Reagent za določanje znotrajcelične ravni ATP
Za določanje znotrajcelične ravni ATP smo uporabili komercialni komplet "BacTiter-

GloTM Microbial Cell Viability Assay" (Promega). Komplet je sestavljen iz dveh
komponent, in sicer pufra BacTiter-GloTM in liofiliziranega substrata BacTiter-GloTM.
Komponenti smo pred uporabo segreli na sobno temperaturo in nato substratu dodali pufer.
Tako smo dobili rekonstruiran reagent BacTiter-GloTM, ki vsebuje encim in substrat.
Pripravljen reagent je obstojen na sobni temperaturi 8 ur, pri temperaturi -70 °C pa en
mesec. Pred uporabo smo reagent ogreli na sobno temperaturo.
3.2.6 Mobilna faza za analizo kordicepina z metodo HPLC
Mobilna faza, ki smo jo uporabili za analizo kordicepina z metodo HPLC, je bila

sestavljena iz 0,1 % vodne raztopine HCOOH (komponenta A) in acetonitrila (komponenta
B) (Preglednica 9).
Preglednica 9: Razmerje gradienta ločbe mobilne faze.
Čas [min] A[%] B[%]

0,0 95 5
5,0 60 40
7,0 20 80
12,0 0 100
15,0 0 100
15,1 95 5
3.3 PRIBOR IN OPREMA
3.3.1 Priprava gojišč in pufrov za gojenje kvasovke S. cerevisiae

- tehnica PS 1200/C/2 (Radwag)
- avtoklav – parni sterilizator (Sutjeska)
- pH meter Seven multi (Mettler Toledo)
- magnetno mešalo MM-540 (Tehnica)
3.3.2 Gojenje kvasovke S. cerevisiae

- inkubator IG 150 (Jouan)
- stresalnik Multitron (Infors HT)
- brezprašna komora LFV P122 (Pio)
- vrtinčnik TTS2 (Ika)
- spektrofotometer MA 9510 (Iskra)
- centrifuga 322A (Tehnica)
- 100-ml elermajerica s stransko roko in utorom (Shot Duran)
- 500-ml elermajerica s stransko roko in utorom (Simex)
- 1000-ml elermajerica s stransko roko in utorom (Shot Duran)

- 50-ml merilni valj
- 100-ml merilni valj
3.3.3 Gojenje glive C. militaris

- 750-ml stekleni kozarci z navojem
- perforirani pločevinasti pokrovi
- inkubator VTRK 500 MU (Heraeus Vötsch)
- brezprašna komora LFV P122 (Pio)
3.3.4 Pribor za pripravo vodnega ekstrakta gojišča preraščenega z glivo C. militaris

- vrtničnik TTS2 (Ika)
- stresalna plošča (Biometra)
- filter z 0,2 µm porami (BRAND)
- 10-ml brizgalka
- plastična centrifugirka 50 ml (Eppendorf)
- 1-ml pipeta (ThermoFisher)
- 1,5-ml mikrocentrifugirke (Eppendorf)
- zamrzovalna omara – 80 °C Ultra Freeze (Heto)
3.3.5 Pribor za merjenje znotrajcelične oksidacije

- čitalec mikrotiterskih plošč Safire II (Tecan)
- črna mikrotitrska plošča (Nunc)
- prozorna mikrotitrska plošča (Nunc)
- 50-ml centrifugirke (Eppendorf)
- inkubator IG 150 (Jouan)
- vrtničnik TTS2 (Ika)
- tehnica CPA-3245 (Sartorius)
3.3.6 Pribor za merjenje ravni znotrajceličnega ATP

- čitalec mikrotiterskih plošč Safire II (Tecan)
- bela mikrotitrska plošča (Ratiolab)
- prozorna mikrotitrska plošča (Ratiolab)
- 200-µl pipeta (ThermoFisher)
3.3.7 Aparatura za določanje koncentracije kordicepina

- HPLC sistem Agilent 1260 z detektorjem DAD
- kolona ZORBAX Eclipse Plus C18, 2,1 x 150 mm, velikost delcev 1,8 µm
3.4 METODE
3.4.1 Gojenje glive Cordyceps militaris
3.4.1.1 Priprava gojišč
Osnovno gojišče za gojenje micelija glive C. militaris smo povzeli po članku (Wen in sod.,
2014). Gojišče je bilo sestavljeno iz pšeničnih zrn (PG) z dodanim peptonom (PGP),
kavnim ostankom (PGK) ali ličinkami mokarja (PGM), ki smo jih skuhali v raztopini
ostalih komponent gojišča (glukoza, kalijev hidrogenfosfat, magnezijev klorid in kalcijev
sulfat dihidrat) (Preglednica 2). Kavni ostanek je predstavljal 20 % suhe mase gojišča,
ličinke mokarja pa 15 % suhe mase gojišča. Pšenično gojišče z dodatki smo kuhali, dokler
ni vpilo vse raztopine. Razmerje med količino pšeničnih zrn, z ali brez dodatkov, in
osnovnim tekočim gojiščem je bilo 3:2. Pomembno je, da se med kuhanjem zrna ne
prekuhajo v celoti. V praksi velja, da je žito dovolj skuhano, ko lahko zrno z nohtom brez
težav razpolovimo in ne zmečkamo. Po tem, ko smo zrna skuhali, smo jih ohladili. Ličinke
mokarja in kavni ostanek smo predhodno zmešali s pšeničnimi zrni, pepton pa smo dodali
v osnovno tekoče gojišče (Preglednica 3). Suha masa pšenice v kozarcih je bila približno
220 g, končna masa gojišča v posameznem kozarcu pa okoli 370 g. Zaprli smo jih s
pokrovom z navojem, v katerem je bila dva centimetra velika luknja, tesno napolnjena z
vato. To je omogočilo izmenjavo zraka in preprečilo kontaminacijo gojišča. Pokrov
kozarca smo zaščitili še s papirjem, ki smo ga na pokrov pričvrstili z elastiko. Kozarce smo
nato avtoklavirali dve uri pri temperaturi 121 °C oz. tlaku 1,2 bara. Daljše avtoklaviranje je
potrebno, da pride do hidrolize škroba v pšeničnih zrnih, zaradi česar gliva lažje raste na
gojišču. Po avtoklaviranju smo kozarce ohladili na sobno temperaturo in jih naslednji dan
inokulirali z micelijem glive.
3.4.1.2 Inukolacija gojišč z glivo C. militaris
S trdnega PDA gojišča v petrijevki, katerega je prerastel micelij glive C. militaris, smo
izrezali tri koščke gojišča z micelijem in jih položili na pšenično gojišče z dodatki ali brez.
Inokulacijo smo izvajali v brezprašni komori. Po inokulaciji smo gojišča postavili v
inkubator pri 25 °C. Po nekaj dneh, ko je micelij glive prerasel površino gojišča, smo
kozarce pretresli, da so se z micelijem prerasla zrna pomešala s preostalimi zrni. Tako smo
znatno pospešili preraščanje gojišča. Dan, ko smo gojišča pretresli, smo določili kot čas 0
kultivacije.
3.4.2 Opis makromorfoloških lastnosti micelija glive in vzorčenje gojišč preraščenih z

glivo C. militaris
Glivo C. militaris smo med kultivacijo vzorčili v treh fazah rasti. Te smo določili glede na
morfološke spremembe micelija, ki smo jih lahko makroskopsko opazovali. Prvo vzorčenje
smo izvedli po dvanajstih dneh gojenja, ko je gliva prerastla celotno gojišče. Micelij je bil
pri tem vzorčenju snežno bele barve. Drugo vzorčenje smo opravili po 47 dneh. Micelij se
je v tej fazi začel barvati iz bele v bledo oranžno in rumeno. Po tem vzorčenju smo gojišča
prestavili na sobno temperaturo in jih izpostavili svetlobi. To smo naredili, ker je svetloba
sprožilec tvorbe primordijev iz katerih zrastejo trosnjaki glive. Zadnje vzorčenje smo
izvedli po 85 dneh. V tej fazi se je micelij obarval močno oranžno, poleg tega so se na
miceliju začeli pojavljati živo oranžni primordiji. Vse vzorce smo pridobili tako, da smo v
sterilnih pogojih odvzeli del gojišča s kovinsko žlico v falkonko. Vzorce smo do
ekstrakcije zmrznili pri temperaturi -20 °C.
3.4.3 Priprava vodnega ekstrakta preraščenega gojišča
V vzorcih gojišča preraščenega z glivo C. militaris smo najprej določili delež vode. Znano
količino gojišča smo sušili 24 ur pri 60 °C in iz razlike v teži vzorca pred in po sušenju,
določili delež vode. To je bilo potrebno, ker smo želeli za ekstrakcijo uporabiti 54 mg
suhega preraščenega gojišča na 1 ml vode. Razmerje suha snov : voda smo določili glede
na predhodne raziskave (Horvat, 2014). Vzorce, ki smo jih ekstrahirali, smo najprej dobro
zdrobili v terilnici. Nato smo, glede na vsebnost vode, izračunali potrebno količino
preraščenega gojišča in mu dodali 10 ml dH2O. Sledilo je stresanje 15 min na stresalni
plošči. Vzorce smo centrifugirali 5 minut na 4000 obratov/min. Supernatant vzorcev smo
filtrirali preko filtra z velikostjo por 0,22 μm. Po filtraciji smo ekstrakt alikvotirali v
mikrocentrifugirke in ga do uporabe shranili pri temperaturi -80 °C.
3.4.4 Gojenje kvasovke Saccharomyces cerevisiae
Kultivacija kvasovke S. cerevisiae je bila sestavljena iz dveh delov, in sicer:

- Kultivacija kvasovke na trdnem gojišču YEPD
Kvasovko smo tedensko precepljali. Za začetek gojenja kvasovk do stacionarne faze smo
potrebovali biomaso tri dni stare kulture S. cerevisiae s trdnega gojišča. Kvasovko smo
gojili v inkubatorju pri temperaturi 28 °C.
- Kultivacija kvasne kulture v tekočem gojišču YEPD do stacionarne faze rasti

V prvem delu kultivacije do stacionarne faze rasti smo tri dni staro kvasno kulturo s
trdnega YEPD gojišča s cepilno zanko precepili v tekoče YEPD gojišče. V 50 ml gojišča,
ki smo ga imeli v 100-ml elermajerici s stransko roko, smo dodali toliko biomase, da smo
dobili optično gostoto 0,95. Optično gostoto smo merili pri 650 nm. V 360 ml svežega
YEPD gojišča v 1-litrski elermajerici s stransko roko smo dodali 40 ml celične suspenzije z
optično gostoto 0,95. Sledila je 60-urna kultivacija na stresalniku pri temperaturi 28 °C in
220 obratov/minuto.
Po 60-urni kultivaciji je sledil prenos kulture v pufer PBS. V 50-ml centrifugirko smo
odlili 50 ml kulture in jo centrifugirali 3 minute pri 4000 obratih/min. Sledilo je spiranje
biomase s pufrom PBS ogretim na 28 °C. Po centrifugiranju smo odlili izrabljeno gojišče
in dolili okoli 50 ml pufra. Celice smo resuspendirali na vrtinčniku in jih ponovno
centrifugirali pri enakih pogojih. V naslednjem koraku smo z merilnim valjem odmerili 40
ml celične suspenzije v pufru PBS in jo odlili v 500-ml erlenmajerico s stransko roko.
Suspenziji smo dodali še 160 ml pufra PBS, do končnega volumna 200 ml. Koncentracija
celic v tako pripravljeni suspenziji je bila okoli 1·108 celic/ml. Suspenzijo smo pred
uporabo inkubirali 96 ur na stresalniku pri temperaturi 28 °C in 220 obratih/min.
3.4.5 Izpostavitev kvasnih celic vodnemu ekstraktu preraščenega gojišča
Celice S. cerevisiae smo izpostavili vodnim ekstraktom po tem, ko so bile 96 ur v

stacionarni fazi rasti v pufru PBS. K 10 ml celične suspenzije v 50-ml centrifugirki smo
dodali 1 ml vodnega ekstrakta. Sledile so štiri ure inkubacije na stresalniku pri 220
obratih/min in 28 °C. Postopek tretiranja je bil za merjenje znotrajcelične oksidacije in

ravni ATP enak. Čas štirih ur smo določili na podlagi prejšnjih testiranj vodnih ekstraktov
glive C. militaris na kvasnih celicah (Horvat, 2014). Kot negativno kontrolo smo uporabili
celice, ki so bile tretirane z destilirano vodo.
3.4.6 Določanje znotrajcelične oksidacije
Pri določanju znotrajcelične oksidacije v celicah kvasovke S. cerevisiae smo uporabili

fluorescentno barvilo diklorofluorescein (DCF). Celični suspenziji smo dodali 2',7'-
diklorodihidrofluorescein diacetat (H2DFC-DA), ki je diacetatni ester DCF. Ta prehaja
celično membrano, kjer ga nespecifične esteraze pretvorijo v 2',7'-
diklorodihidrofluorescein (H2DCF), ki pa je polarna molekula in zato ne prehaja celične
membrane. V celici H2DCF reaktivne kisikove zvrsti (ang. reactive oxygen species - ROS)
oksidirajo v DCF, tega pa lahko uporabimo za merjenje znotrajcelične oksidacije.
Intenziteta fluorescence barvila DCF je odvisna od količine prisotnega DCF. Nastanek tega
pa je odvisen od ROS, ki se v danem trenutku nahajajo v celicah (Slika 9). DCF ekscitira
svetloba valovne dolžine 488 nm, emitira pa svetlobo valovne dolžine 520 nm (Jakubowski
in Bartosz 1997; Jakubowski, 2000).
Slika 9: Shema oksidacije H2DCF, če uporabimo H2O2 kot končni akceptor elektronov (Hensley in sod.,
2003).
Ko so bile kvasne celice štiri ure izpostavljene ekstraktu, smo jih centrifugirali 5 min pri
4000 obratih. Po centrifugiranju smo supernatant odlili in celice resuspendirali v 10 ml K-
fosfatnega pufra, ki je bil predhodno segret na 28 °C. V tem koraku smo celice sprali s K-
fosfatnim pufrom in sledilo je ponovno centrifugiranje ter odlitje supernatanta. Kvasovke
smo nato resuspendirali v 5 ml K-fosfatnega pufra in jih inkubirali 10 minut v inkubatorju
pri 28 °C. Kot pokrov na centrifugirki smo uporabili celulozni zamašek, da smo zagotovili
aerobne pogoje. Po inkubaciji smo dodali 50 µl reagenta H2DFCDA s koncentracijo 1 mM
(končna koncentracija je bila 10 µM) in ponovno inkubirali, tokrat na stresalniku pri 220
obr/min in temperaturi 28 °C. Po 15 minutah inkubacije smo nanesli 200 µl vzorca v treh
ponovitvah na črno mikrotitersko ploščo in s čitalcem mikrotiterskih plošč Safire II
(Tecan) izmerili znotrajcelično oksidacijo. Merili smo porast fluorescence v času (5
meritev v pol urnih intervalih). Naredili smo dve biološki ponovitvi in tri tehnične
ponovitve znotraj teh.
3.4.7 Določanje znotrajcelične ravni ATP
Za določanje ravni energijske metabolne aktivnosti smo uporabili komercialni komplet

"BacTiter-GloTM Microbial Cell Viability Assay". Kit za določanje uporablja ATP v celici
rekombinantni encim luciferazo "Ultra-GloTM Recombinant Luciferase" in substrat. Pri
reakciji luciferaza pretvori substrat luciferin v oksiluciferin, pri čemer se sprosti svetloba.
Za potek reakcije je potreben ATP, torej lahko iz intenzitete svetlobe, ki se pri reakciji
sprosti, določimo raven ATP v celici (McElroy, 1947). Za potek reakcije so potrebni še
kisik (O2) in magnezijevi ioni (Mg2+). Reakcija poteče po sledeči enačbi:
...(1)
Po štirih urah inkubacije z vodnim ekstraktom smo 100 µl suspenzije kvasih celic prenesli
v 1,5 ml mikrocentrifugirko v katero smo že predhodno odmerili 900 µl pufra PBS.
Suspenzijo celic smo 10× redčili zato, da smo bili v linearnem območju intenzitete
lumniscence glede na število celic na mililiter suspenzije. Na belo mikrotitersko ploščo
smo nato nanesli 100 µl rečene celične suspenzije in dodali 100 µl reagenta. Preden smo
izmerili lumininscenco, smo vzorce 5 min inkubirali. Luminiscenco smo izmerili s
čitalcem mikrotiterskih plošč Safire II (Tecan). Tako kot pri merjenju znotrajcelične
oksidacije smo tudi tukaj naredili dve biološki ponovitvi in znotraj teh še tri tehnične.
3.4.8 Določanje optične gostote
Po merjenju znotrajcelične oksidacije in ravni ATP smo izmerili še optično gostoto celične
suspenzije S. cerevisiae (pri valovni dolžini 650 nm). Rezultate meritev je bilo namreč
potrebno normalizirati glede na količino biomase v vzorcu, ki jo izmerimo z OD. Po vsaki
meritvi znotrajcelične oksidacije ali ravni ATP smo enak volumen vzorcev celične
suspenzije nanesli na prozorno mikrotitersko ploščo. Optično gostoto smo izmerili s
čitalcem mikrotiterskih plošč Saphire II (Tecan).
3.4.8 Določanje koncentracije kordicepina
Analize so bile opravljene na HPLC sistemu Agilent 1260 HPLC z detektorjem DAD.
Mobilna faza je vsebovala 0,1 % vodno raztopino HCOOH (komponenta A) in acetonitril
(komponenta B). Temperatura kolone je bila 25 °C. Pretok na koloni je bil 0,2 ml/min,
volumen injiciranja pa 1 µl. Detekcija je potekala na detektorju DAD (ang. diode array
detector) pri valovni dolžini 260 nm.
3.5 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV
Podatke smo obdelali in prikazali s pomočjo programa Microsoft Excel 2007.
3.5.1 Aritmetična sredina
Rezultate, pridobljene znotraj določene metode, smo podali kot aritmetično sredino
izmerjenih vrednosti. Izračunali smo jo po enačbi (Košmelj, 2007):
...(2)
predstavlja aritmetrično sredino, n število različnih spremenljivk in xi vrednost i-te

meritve.
3.5.2 Standardni odklon aritmetične sredine
Za podatke, kjer je to bilo možno smo, podali standardni odklon aritmetične sredine.
Standardni odklon vzorčne porazdelitve aritmetične sredine je mera za natančnost vzorčne
meritve in mu pravimo tudi standardna napaka. Pridobili smo ga z enačbo (Košmelj,
2007):
...(3)
4 REZULTATI Z RAZPRAVO
4.1 RAST MICELIJA GLIVE Cordyceps militaris NA RAZLIČNIH GOJIŠČIH
Micelij glive C. militaris smo gojili na štirih različnih gojiščih (Poglavje 3.2.4.2).
Preraščeno gojišče smo vzorčili v treh različnih časovnih točkah kultivacije. Prva je bila 12
dni po inokulaciji gojišča, takoj po tem, ko je micelij glive gojišče v prerastel (Slika 10 A,
B, C, D). Drugi čas vzorčenja je bil po 47 dneh rasti glive na gojišču, ko se je micelij glive
začel spreminjati barvo iz bele v rumeno in oranžno (Slika 10 E, F, G, H), kar je
nakazovalo, da je micelij popolnoma prerastel gojišče in da gliva prehaja v fazo, v kateri se
lahko začne tvorba trosnjakov. Po drugem vzorčenju smo gojišča z micelijem prestavili iz
inkubatorja, kjer je bila tema in 25 °C, na sobno temperaturo in izpostavili svetlobi. To je
sprožilo nastanek primordijev trosnjakov (Slika 10 I, J, K, L). 85. dan po inokulaciji
gojišča smo vzorčili še tretjič.
Najbolj intenzivno rast micelija smo na začetku opazili na gojišču PG (Slika 10 C) in

gojišču PGP (Slika 10 B). Nekoliko počasnejša rast je bila opazna na gojiščih PGK (Slika
10 A), sledila je rast na gojišču PGM (Slika 10 D). Vidna razlika med gojišči je bila tudi v
tem, kako zgoščeno je micelij preraščal gojišče. Najbolj zgoščeno rast micelija smo opazili
na gojišču PGM, sledilo je gojišče PG, gojišče PGP, najmanj zgoščeno rast pa smo opazili
na gojišču PGK. Razlika med micelijem na posameznih gojiščih je bila opazna tudi na 47.
dan, ko smo gojišča prestavili iz inkubatorja na sobne pogoje in izpostavili svetlobi.
Sprememba barve iz bele v odtenke rumene in oranžne je bila najbolj opazna na gojišču
PG (Slika 10 G) in gojišču PGP (Slika 10 F), medtem ko je bila sprememba barve najmanj
opazna na gojišču PGM (Slika 10 H). V raziskavi, ki so jo opravili Dong in sod., 2013 so
ugotovili, da pigmenti, ki jih proizvaja gliva C. militaris, sodijo med karotenoide. Še ena
morfološka razlika, ki smo jo opazovali, je bila tvorba primordijev trosnjakov. Kljub temu,
da je bila zgoščenost micelija na gojišču PGM najmanjša (Slika 10 A, E, I), je micelij na
tem gojišču tvoril največ primordijev (Slika 10 I). Sledilo je gojišče PG, gojišče PGP,
najmanjšo rast primordijev pa smo opazili na gojišču PGM (Slika 10 L).
Slika 10: Fotografije rasti micelija glive C. militaris na različnih gojiščih ob treh različnih časih (12, 47 in 85
dni). Na dan 47 smo kozarce z gojiščem izpostavili sobnim pogojem in svetlobi. Uporabili smo pšenično
gojišče (PG), pšenično gojišče z dodanim peptonom (PGP), pšenično gojišče z dodanim kavnim ostankom
(PGK) in pšenično gojišče z dodanimi mokarjevimi ličinkami (PGM). Fotografije A, B, C in D prikazujejo
rast micelija na 12. dan, fotografije E, F, G in H predstavljajo rast micelija na 47. dan, fotografije I, J, K in H
pa rast micelija na 85. dan.
Preglednica 10: Primerjava morfoloških razlik med različnimi gojišči, preraščenimi z micelijem C. militaris.
Oznaka +++ opisuje močno opazno razliko, ++ dobro opazno razliko, + opazno razliko +/- pa šibko opazno
razliko.
Opis rasti micelija PG PGP PGK PGM

Hitrost rasti +++ +++ ++ +
Zgoščenost ++ + + +++
Barvna sprememba + ++ ++ +/-
Tvorba primordijev ++ + +++ +/-
V raziskavi so Shrestha in sod. (2006) opazili, da je zgoščena rast micelija negativno

povezana s hitrostjo rasti micelija. Navajajo, da so kulture micelija, ki so rastle bolj
zgoščeno, imele počasnejšo radialno rast. To smo opazili tudi v našem primeru. Micelij, ki
je rastel na gojišču PGM in je rastel najbolj zgoščeno, je imel najpočasnejšo radialno rast.
Kljub temu pa je micelij, ki je rastel na gojišču PGK, rastel najmanj zgoščeno in ne glede
na to rastel relativno počasi. Sklepamo, da je bila rast micelija na gojišču PGM najbolj
zgoščena, ker je bilo to gojišče najbolj ustrezno za glivo C. militaris. Gliva C. militaris
ličinke nekaterih žuželk, tudi mokarja, okuži v naravi in predstavljajo substrat, na katerega
je gliva evolucijsko najbolj prilagojena.
Shrestha in sod. (2006) poročajo, da je obarvanost micelija odvisna od časa rasti, seva
glive, sestave gojišča in svetlobe, pri čemer izpostavljajo, da je svetloba najpomembnejši
dejavnik. V njihovi raziskavi izolati glive C. militaris, ki so rastli na različnih trdnih
gojiščih v temi, niso proizvedli pigmenta. V našem primeru so se tudi v temi miceliji na
posameznih delih obarvali rumeno ali oranžno. Pigmentacija micelijev pa se je povečala po
tem, ko smo jih izpostavili svetlobi. Sestava gojišča je v našem primeru močno vplivala na
pigmentacijo micelija. V omenjeni raziskavi so opazili, da je izrazitejša pigmentacija
povezana z gojišči, bogatimi s peptonom ali kvasnim ekstraktom. V našem primeru je bilo
najbolj hranilno gojišče PGM, vendar je bila pigmentacija micelija na tem gojišču
najmanjša. Najizrazitejša pigmentacija pa je bila opazna na gojiščih PGP in PGK. Razloga
za to ne vemo. Sklepamo, da je v našem primeru odvisna od uporabljenega seva in
drugačne in bolj kompleksne sestave gojišča.
4.2 VPLIV GOJIŠČA IN ČASA RASTI GLIVE Cordyceps militaris NA PRODUKCIJO

KORDICEPINA
Največ kordicepina smo izmerili v vodnem ekstraktu preraščenega gojišča na 85. dan
kultivacije, in sicer v gojišču PGM (7,75 mg/g). Sledilo je gojišče PGK (6,90 mg/g), temu
pa PG (4,57 mg/g). Najmanjšo vsebnost kordicepina ob istem času kultivacije smo izmerili
v gojišču PGP (2,16 mg/g) (Slika 11). Za primerjavo smo izmerili še vrednost kordicepina
v komercialnem pripravku, ki je narejen iz žitnega gojišča preraščenega z micelijem.
Vsebnost kordicepina je bila nižja, in sicer 1,16 mg/g.
9,0
8,0
7,0
Koncentracija kordicepina [mg/g]
6,0
PGK
5,0
PGP
4,0
PG
3,0 PGM
2,0
12 dni 47 dni 85 dni
1,0
0,0
0 20 40 60 80 100
Čas kultivacije [dan]
Slika 11: Prikaz vpliva gojišča in časa rasti glive C. militaris na produkcijo kordicepina. Substrat smo
vzorčili na 12, 47 in 85 dan. Uporabili smo pšenično gojišče (PG), pšenično gojišče z dodanim peptonom
(PGP), pšenično gojišče z dodanim kavnim ostankom (PGK) in pšenično gojišče z dodanimi mokarjevimi
ličinkami (PGM).
V večini dostopnih raziskavah (Das in sod., 2010; Shrestha in sod., 2012; Cui, 2014) so
merili količino kordicepina v trosnjakih, gojenih na trdnem gojišču ali pa so glivo gojili
emerzno. Našli smo le eno študijo Kang in sod. (2017), v kateri so merili količino
kordicepina v trdnem gojišču iz žitnih zrn.
Izmerjene vrednosti kordicepina v trosnjakih so glede na literaturo od 2,7 mg/g suhe mase
trosnjakov (Lin in sod., 2017) do 24,98 mg/g suhe mase trosnjakov (Shrestha in sod.,
2012). Največ rezultatov pa je v rangu okoli 5 do 10 mg/g suhe teže trosnjakov (Wen in
sod., 2014; Gregori, 2015; Lin in sod., 2017). V edini študiji, v kateri so merili količino
kordicepina v preraščenem gojišču iz žitnih semen, so izmerili povprečno vrednost
kordicepina za 20 različnih sevov glive C. militaris na substratu iz rjavega riža 2,98 ± 1,41
mg/g in substratu z dodanimi ličinkami sviloprejk 4,17 ± 1,66 mg/g (Kang in sod., 2017).
Rezultati, ki smo jih izmerili v naši raziskavi, so glede na dostopne rezultate iz literature,
relativno visoki. Najvišjo vrednost kordicepina smo izmerili v gojišču PGM, kar se ujema
z rezultati raziskave Kang in sod. (2017). V vseh primerih, kjer so uporabili gojišče z
dodanimi ličinkami sviloprejk, so tudi Kang in sod. izmerili najvišje vrednosti kordicepina.
Sklepamo, da je najvišja vrednost kordicepina v gojišču PGM rezultat dejstva, da so tako
ličinke mokarja kot sviloprejke optimalen substrat, na katerega je gliva prilagojena.
Posledica tega pa je boljša produkcija kordicepina.
Visoka izmerjena vrednost kordicepina je bila opažena tudi v gojišču PGK. Razlogi, zakaj
smo se odločili za uporabo kavnega ostanka kot substrata, so:
- Kavni ostanek je lahko dostopen odpadni produkt, ki se je že izkazal kot dober
substrat za gojenje določenih užitnih gliv, kot so npr. različne vrste ostrigarjev
(Pleurotus spp.) (Stamets, 2000).
- Metabolita, kot sta kofein in teobromin, v vrstah rodu Coffea spadata med purine in
nastaneta iz ksantozina, ta pa je produkt različnih metabolnih poti purinov in med
drugim nastane iz adenozina, ki je del S-adenozil metionin cikla (SAM) ter iz
adeninskega in gvaninskega bazena v celicah (Ashihara in sod., 2008). Tudi
kordicepin spada med purine in nastane iz adenozina. Glede na to, da tako v kavi
kot v glivah rodu Codyceps purini predstavljajo pomembne metabolite, smo
sklepali, da lahko C. militaris za sintezo kordicepina, koristi purinske metabolite, ki
so prisotni v kavnem ostanku.
- Precejšen del kavnega ostanka (okoli 15 %) predstavljajo maščobne kisline (Pujol

in sod., 2013). Park in sod., 2002 so v raziskavi pokazali, da dodatek nekaterih
rastlinskih olj v substrat spodbudi rast micelija C. militaris in poveča produkcijo
ekso-biopolimerov. Največji učinek sta imela oljčno in sončnično olje pri
koncentraciji 2 % masnega deleža gojišča.
Rast micelija glive C. militars na gojišču PGK sicer ni bila zgoščena, je pa micelij tvoril
največ primordijev in proizvedel precejšnjo količino kordicepina. Če primerjamo podatek,
da 15 % kavnega ostanka predstavljajo različne maščobne kisline, od katerih večino
predstavljajo (okoli 65 %) nasičene maščobne kisline, potem je celotni delež maščobnih
kislin v suhi masi gojišča okoli 3 %. Za potrditev hipoteze, da je na produkcijo kordicepina
vplivala sestava kavnega ostanka, bi morali opraviti še več raziskav, predpostavljamo pa
lahko, da purinske metabolite gliva C. militaris koristi v lastnem metabolizmu, kar bi lahko
bil razlog za relativno visoko vsebnost kordicepina v preraščenem gojišču s kavnim
ostankom. Rezultat, ki smo ga pridobili nakazuje, da je kavni ostanek komponenta gojišča,
ki ima s stališča proizvodnje kordicepina potencialno uporabo kot gojišče za vzgojo glive
C. militaris.
Presenetila nas je nizka koncentracija kordicepina v gojišču z dodanim peptonom. V

literaturi smo namreč zasledili, da pepton spodbuja rast glive C. militaris in produkcijo
kordicepina (Shrestha in sod., 2006; Shih in sod., 2007; Wen in sod., 2014).
4.3 BIOLOŠKI UČINEK VODNEGA EKSTRAKTA GOJIŠČ PRERAŠČENIH Z GLIVO

Cordyceps militaris
Za modelni organizem za določanje vpliva vodnega ekstrakta, preraščenega gojišča z glivo

C. millitaris na celično energijsko metabolno aktivnost in znotrajcelično oksidacijo, smo
izbrali kvasovko Saccharomyces cerevisiae v stacionarni fazi rasti. Kvasovka S. cerevisiae
je preprost enocelični evkariontski organizem. Lastnosti, ki ji dajejo prednost pred ostalimi
organizmi, so hitra rast in preprosto gojenje, saj za njeno kultivacijo ne potrebujemo
kompleksnih gojišč ali posebnih pogojev. To se odraža tudi v nizki ceni gojenja (Menacho-
Márquez in Murguía, 2007).
Še ena izmed prednosti kvasovke S. cerevisiae je, da vsaj 31 % genov, vpletenih v

nastanek bolezni pri človeku, izkazuje homologijo z geni S. cerevisiae. Enostavna genetika
kvasovke in visoka ohranjenost osnovnih celičnih procesov med višjimi organizmi in
kvasovko je razlog, da je le ta primeren modelni organizem za preučevanje delovanja
bioaktivnih snovi. Poleg tega je, zaradi podobnosti med nekaterimi človeškimi geni in geni
kvasovke, primerna za preučevanje temeljnih celičnih procesov, kot so osnovne metabolne
poti, odziv na stres, staranje, celični cikel in drugih (Foury, 1997; Menacho-Márquez in
Murguía, 2007; Zakrajšek, 2014).
Kvasne celice v stacionarni fazi so še posebej primeren model za preučevanje procesov v

večceličnih organizmih. Večina celic v večceličnih organizmih je se redko deli in večino
življenjskega cikla preživijo v stanju mirovanja. Tako kot celice večceličnih organizmov,
celice kvasovke S. cerevisiae večino energije pridobijo s celičnim dihanjem, ki poteka v
mitohondrijih in so v fazi G0 podvržene poškodbam, ki se skozi čas kopičijo (Zakrajšek,
2014).
Za preučevanje vpliva vodnega ekstrakta preraščenega gojišča z glivo C. militaris na

celično energijsko metabolno aktivnost in znotrajcelično oksidacijo v kvasnih celicah smo
uporabili samo ekstrakte iz 85. dneva kultivacije glive C. militaris. Takrat je bila
preraščenost gojišč z glivo najbolj izrazita in vsebnost kordicepina najvišja.
4.3.1 Učinek vodnih ekstraktov gojišč preraščenih z glivo C. militaris na celično

energijsko metabolno aktivnost
V splošnem so ekstrakti gojišča, preraščenega z glivo C. militaris 85. dan kultivacije glive,
znižali raven ATP-ja v kvasnih celicah v primerjavi z destilirano vodo, ki smo jo uporabili
kot negativno kontrolo. Opazili pa smo razliko med različnimi vrstami gojišč. Glede na
gojišče PG je bila pri ekstraktih gojišč PGP, PGK in PGM znotrajcelična raven ATP
signifikantno višja. Med gojišči PGP, PGK in PGM ni bilo moč opaziti statistično
značilnih razlik, vendar je razviden trend, da je ekstrakt preraščenega gojišča PGK najmanj
znižal nivo ATP v celicah glede na kontrolo (Slika 12).
110 %
100 %
90 %
Znotrajcelična raven ATP [v %]
80 %
70 %
60 % PGK
PGP
50 %
PGM
40 % PG
30 %
20 %
10 %
0%
85. dan kultivacije glive C. militaris
Slika 12: Vpliv vrste preraščenega gojišča iz 85. dneva kultivacije na raven ATP v kvasovki S. cerevisiae.
Rezultati so prikazani kot relativne vrednosti s standardnim odklonom glede na kontrolo (100 %), n = 4. PG -
pšenično gojišče, PGP – pšenično gojišče z dodanim peptonom, PGK - pšenično gojišče z dodanim kavnim
ostankom in PGM - pšenično gojišče z dodanimi mokarjevimi ličinkami.
Študije, v katerih so preučevali učinek ekstraktov glive C. militaris in sorodne glive O.

sinensis na znotrajcelično raven ATP in energijski metabolizem, so pokazale, da ekstrakti
glive C. militaris in kordicepin povečajo raven znotrajceličnega ATP-ja in spodbudijo
energijski metabolizem. Naj navedemo nekaj študij:
- Manabe in sod. (2000) so izmerili povečan energijski metabolizem v jetrih
anemičnih miši, ki so prejemale 200 mg/kg ekstrakta micelija glive O. sinensis.
- Dai in sod. (2001) so ugotovili povišane ravni ATP-ja v jetrnih celicah miši, ki so
jih hranili s pripravkom iz glive O. sinensis CordyMax™ Cs-4.
- Ekstrakt glive O. sinensis je stimuliral elektronski transport v mitohondrijih in
nastanek ATP v srčnih mišicah miši, ki so jih hranili z ekstraktom O. sinensis (Siu
in sod., 2004).
- Jung in sod. (2004) so dognali, da se miši, ki so jih hranili z ekstraktom glive C.
militaris, kasneje utrudijo v testu prisilnega plavanja.
- V raziskavi je Horvat (2014) dokazala povišano raven znotrajceličnega ATP glede
na kontrolo in povečano produkcijo CO2 v celicah S. cerevisiae, ki so jih izpostavili
ekstraktu komercialnega pripravka iz trosnjakov C. militaris.
Vodni ekstrakti vzorcev gojišč preraščenih z glivo C. militaris so v našem primeru znižali
raven znotrajceličnega ATP-ja, kar nas je sprva presenetilo. Povišanje ravni ATP-ja smo
zaznali pri ekstraktu iz komercialnega pripravka C. militaris. Vrednostni so bile za 66%
višje od kontrole. Najnižje vrednosti znotrajceličnega nivoja ATP smo izmerili pri
ekstraktih gojišča PG (42 %) (Slika 12).
Iz rezultatov, ki smo jih pridobili tekom raziskave, ne moremo ugotoviti kateri dejavnik je
imel, v primerjavi s kontrolo, negativen učinek na znotrajcelično raven ATP-ja, lahko pa
predvidevamo naslednje:
- Ker smo za gojenje glive C. militaris uporabili kompleksno gojišče, ki ga
sestavljajo različne komponente z neznanim učinkom, smo z ekstrakcijo gojišča
skupaj z metaboliti glive C. militaris ekstrahirali še učinkovine iz pšenice in
dodatkov (pepton, kavni ostanek in mokarjeve ličinke). Predvidevamo, da je imela
ena ali več sestavin gojišč pro-oksidativen ali toksičen učinek na kvasne celice,
vendar ne moremo zagotovo vedeti katere. Izmerjen rezultat v primeru
komercialnega pripravka nakazuje, da bi to lahko bila pšenica, saj jo komercialni

pripravek ne vsebuje. Kljub nizki vsebnosti izmerjenega kordicepina je komercialni
pripravek zvišal znotrajcelični nivo ATP za 66 %. Še en dokaz, ki kaže na pro-
oksidativni učinek pšenice oziroma neznane komponente pšenice, saj so ekstrakti
vseh vrst gojišč zmanjšali znotrajcelično raven ATP-ja. Medtem pa je ekstrakt
komercialnega pripravka in pripravek iz trosnjakov glive C. militaris,
znotrajcelično raven ATP povišal Horvat (2014).
- Med metaboliti v ekstraktu glive C. militaris in komponentami gojišča, je lahko

prišlo do antagonističnega ali sinergističnega delovanja z neznanim učinkom na
kvasne celice.
4.3.2 Učinek vodnih ekstraktov gojišč preraščenih z glivo C. militaris na

znotrajcelično oksidacijo
Glede na vrsto gojišča sta imela največji učinek na zmanjšanje znotrajcelične oksidacije
vodni ekstrakt preraščenega gojišča PGK, ki mu je sledil ekstrakt gojišča PGP, medtem ko
sta imela ekstrakta gojišč PGM in PG v primerjavi s kontrolo statistično neznačilen učinek
na znotrajcelično oksidacijo (Slika 13).
120 %
110 %
100 %
90 %
Znotrajcelična oksidacija [%]
80 %
70 %
PG
60 % PGP
50 % PGK
PGM
40 %
30 %
20 %
10 %
0%
85. dan kultivacije glive C. militaris
Slika 13: Vpliv vrste preraščenega gojišča iz 85. dneva kultivacije na nivo znotrajcelične oksidacije v
kvasovki S. cerevisiae. Rezultati so prikazani kot relativne vrednosti s standardnim odklonom glede na
kontrolo (100 %), n = 4. PG - pšenično gojišče, PGP – pšenično gojišče z dodanim peptonom, PGK -
pšenično gojišče z dodanim kavnim ostankom in PGM - pšenično gojišče z dodanimi mokarjevimi ličinkami.
Veliko raziskav, ki so bile opravljene tako v in vitro (Won in Park, 2005; Zhan in sod.,
2006; Reis in sod., 2013) kot in vivo (Wang in sod., 2012; Liu in sod., 2016) so pokazale,
da ima gliva C. militaris antioksidativen učinek in zniža nivo znotrajcelične oksidacije.
Pomembna razlika je, da smo v našem primeru preverjali antioksidatiovno aktivnost
vodnega ekstrakta preraščenega gojišča in ne trosnjakov glive, kar so preučevali v večini
drugih raziskav.
Rezultati, ki smo jih pridobili pri merjenju znotrajcelične oksidacije celic kvasovke S.
cerevisiae, kažejo na to, da ima micelij glive C. militaris antioksidativni učinek, vendar je
ta odvisen od vrste gojišča, na katerem gliva raste. Od uporabljenih gojišč je nivo
znotrajcelične oksidacije v povprečju najbolj znižal vodni ekstrakt preraščenega gojišča
PGK, sledil mu je ekstrakt gojišča PGP.
Ker je bil naš sistem kompleksen, sklepamo, da so na nivo znotrajcelične oksidacije

delovale tudi druge sestavine gojišča, ki pa so lahko imele oksidativen učinek na kvasne
celice. Rezultati merjenja znotrajceličnega nivoja ATP in znotrajcelične oksidacije se
deloma ujemajo. Gojišči PGK in PGP sta najmanj znižali znotrajcelično raven ATP. Prav
tako sta omenjeni gojišči od testiranih gojišč najbolj znižali nivo znotrajcelične oksidacije.
Možni mehanizmi, preko katerih ekstrakt C. militaris vpliva na znotrajcelično oksidacijo,

so sledeči:
- Povečanje aktivnosti encimov udeleženih v antioksidativni odziv.
Raziskave in vivo na modelu miši so pokazale, da gliva poveča antioksidativno
aktivnost s spodbujanjem aktivnosti encimov, kot so superoksid dismutaza,
glutation peroksidaza in katalaza, kar se odraža tudi v povečanju skupne
antioksidativne kapacitete (ang. total antioxidant capacity - T-AOC) in zmanjšanem
nivoju malondialdehida (ang. malondialdehyde - MDA), ki je pokazatelj
oksidativnega stresa (Wang in sod., 2012; Liu in sod., 2016). Glede na to, da so
antioksidativni sistemi med evkarionti ohranjeni, je možno, da pride do podobnega
učinka tudi v kvasnih celicah.
- Večja učinkovitost dihalnih verig.

Za glivo O. sinensis, ki je sorodna glivi C. militaris, so v raziskavah ugotovili, da
poveča učinkovitost delovanja dihalnih verig v mitohondrijih mišjih srčnih mišičnih
celic (Siu in sod., 2004). Poleg tega so dokazali, da ekstrakt glive O. sinensis vpliva
na povečanje količine ATP molekul v hepatocitih miši (Manabe in sod., 2000; Dai
in sod., 2001) in poveča učinkovitost porabe kisika, s čimer omogoči boljšo
vzdržljivost prisilnega plavanja (Jung in sod., 2004). Dihalne verige namreč niso
popolnoma učinkovite. Kisik lahko sprejme elektron iz posamičnih elektronskih
prenašalcev, pri čemer nastanejo reaktivne kisikove vrste (ROS), ki v celici
povzročajo oksidativni stres (Cadenas in Davies, 2000). Celice S. cerevisiae v
stacionarni fazi večino energije pridobijo iz celičnega dihanja, ki poteka v
mitohondrijih. Eden izmed možnih načinov delovanja glive C. militaris je torej
vpliv na učinkovitost dihalne verige, s čimer se poveča količina nastalega ATP in
zmanjša nastanek ROS.
- Antioksidanti glive C. militaris

Gliva C. militaris proizvaja bioaktivne molekule z antioksidativnim učinkom. Glavni
tip molekul z antioksidativnim učinkom predstavljajo polisaharidi (Yu, 2007; Wang in
sod., 2012; Shashidhar in sod., 2013), ki pa za spremembo ravni znotrajcelične
oksidacije v kvasnih celicah niso pomembni, saj ne prehajajo celične membrane
kvasovk. Poleg polisaharidov micelij glive C. militaris vsebuje tudi različne fenolne
spojine (npr. salicilno kislino) in flavonoide, ki izražajo antioksidativni učinek (Hui in
sod., 2006; Zhang in sod., 2012).
4.4 OBRAZLOŽITEV DELOVNIH HIPOTEZ
Kot smo predvideli v delovnih hipotezah, je sestava gojišča vplivala na hitrost rasti in na
morfologijo micelija ter na količino kordicepina, ki jo je gliva C. militaris proizvedla. V
skladu z našimi hipotezami, je gliva največjo količino kordicepina proizvedla na
pšeničnem gojišču z dodanimi ličinkami mokarja (PGM), najmanj pa na pšeničnem gojišču
z dodanim peptonom (PGP), česar nismo predvideli. Potrdili smo hipotezo, da bo gliva
najboljše rastla na pšeničnem gojišču z dodanimi mokarjevimi ličinkami (PGM), kjer je
bila prerast micelija glive C. militaris najbolj zgoščena. Metabolna aktivnost kvasnih celic,
izpostavljenih vodnemu ekstraktu preraščenih gojišč, se je v nasprotju s hipotezami
zmanjšala glede na kontrolo, se je pa v skladu s pričakovanji znižala raven znotrajcelične
oksidacije. Z našimi predvidevanji se ujema tudi rezultat, da so vodni ekstrakti preraščenih
pšeničnih gojišč z dodanim peptonom, ličinkami mokarja in kavnim ostankom (PGP, PGM
in PGK), v primerjavi z ekstraktom pšeničnega gojišča (PG) imeli signifikantno slabši
učinek na znižanje znotrajcelične ravni ATP. V primeru določanja znotrajcelične
oksidacije je vodni ekstrakt preraščenega gojišča PGK najbolj znižal raven oksidacije.
Razlike med ostalimi gojišči pa niso bile statistično značilne. Vodni ekstrakti preraščenih
gojišč z dodatki so imeli večji biološki učinek kot vodni ekstrakt pšeničnega gojišča PG.
5 SKLEPI
 Vrsta gojišča je vplivala na rast micelija glive C. militaris. Najbolj zgoščeno rast smo
opazili na pšeničnem gojišču z dodanimi mokarjevimi ličinkami, sledilo je pšenično
gojišče, pšenično gojišče z dodanim peptonom in pšenično gojišče z dodanim kavnim
ostankom. Največ primordijev smo opazili na pšeničnem gojišču z dodanim kavnim
ostankom.
 Koncentracija izmerjenega kordicepina se je povečevala s časom kultivacije glive. Na

količino kordicepina je vplivala tudi sestava gojišča. Največjo koncentracijo smo
izmerili v pšeničnem gojišču z dodanimi mokarjevimi ličinkami (7,75 mg/g), sledilo je
pšenično gojišče z dodanim kavnim ostankom (6,90 mg/g) in pšenično gojišče (4,57
mg/g). Najmanj kordicepina pa smo izmerili v pšeničnem gojišču z dodanim
peptonom (2,16 mg/g).
 Sestava gojišča preraščenega z glivo C. militaris je po 85. dneh kultivacije je vplivala

na znotrajcelično oksidacijo in raven ATP v kvasnih celicah. Ekstrakti vseh vrst gojišč
preraščenih z glivo C. militaris so znižali raven ATP v kvasnih celicah v primerjavi s
kontrolo. Glede na preraščeno pšenično gojišče je bila pri ekstraktih ostalih gojišč
znotrajcelična raven ATP signifikantno višja. Največji antioksidativni učinek v
kvasnih celicah je imel, glede na kontrolo in vrsto gojišča, vodni ekstrakt preraščenega
pšeničnega gojišča z dodanim kavnim ostankom.
 Kavni ostanek je primeren dodatek gojišč za kultivacijo C. militaris za proizvodnjo

trosnjakov in kordicepina ter predstavlja potencialni substrat za gojenje medicinsko
zanimivih gliv.
6 POVZETEK
Gliva Cordyceps militaris oz. kokonov glavatec je etomopatogena gliva, ki spada v

skupino zaprtotrosnic. Tradicionalno jo uporabljajo v Aziji v kontekstu tradicionalne
kitajske medicine, kjer ji pripisujejo raznovrstne učinke, kot so blagodejni učinek na
ledvice, respiratorni sistem in delovanje jeter, odpravljanje splošne utrujenosti in oslabelost
itd. Raziskave so mnoge izmed učinkov, ki jih glivi pripisujejo v tradicionalni medicini,
potrdile. Danes je znano, da imajo biološko aktivne spojine, ki jih gliva vsebuje, učinek na
energijski metabolizem celic (znotrajcelični nivo ATP), antioksidativni,
imunomodulatorni, protivnetni, antikarcinogeni, hepatoprotektivni in hipoglikemični
učinek. Glavne biološko aktivne snovi, ki jih gliva C. militaris proizvaja, so kordicepin,
različni polisahardi in ergosterol.
Še ena prednost glive C. militaris je, da jo za razliko od sorodnih gliv, dokaj enostavno
gojimo v laboratorijskih pogojih. Poleg tega so bioaktivne snovi, ki jih vsebuje micelij,
primerljive z bioaktivnimi snovmi, ki jih najdemo v njenih trosnjakih. Tako micelij kot
trosnjake je možno gojiti na substratih, ki temeljijo na različnih žitih ali pa jih gojijo
submerzno ali emerzno v tekočih gojiščih. Kljub temu je še veliko možnosti za izboljšave
gojitvenih tehnik in bazične raziskave učinkov, ki jih imajo biološko aktivni metaboliti
glive C. militaris.
Laboratorijski del naše raziskave je bil razdeljen na dva dela. V prvem delu smo glivo C.
militaris gojili na gojiščih iz pšenice z dodanim peptonom, kavnim ostankom ali ličinkami
mokarja. Gojišča preraščena z micelijem smo vzorčili v treh fazah rasti in iz njih naredili
vodne ekstrakte. V drugem delu naloge smo celice kvasovke Saccharomyces cerevisiae v
stacionarni fazi izpostavili vodnim ekstraktom z glivo preraščenega gojišča in opazovali
njihov učinek na znotrajcelično oksidacijo in nivo ATP. V vodnih ekstraktih smo izmerili
tudi vsebnost kordicepina.
Ugotovili smo, da vrsta gojišča vpliva na rast micelija glive C. militaris. Najbolj zgoščeno
rast smo opazili na gojišču z dodanimi mokarjevimi ličinkami, medtem ko je bila najmanj
zgoščena rast micelija na gojišču z dodanim kavnim ostankom, vendar pa smo na tem
gojišču opazili največ primordijev. Koncentracija kordicepina se je povečevala s časom

kultivacije. Nanjo pa je močno vplivala tudi sestava gojišča. Največje koncentracije
kordicepina smo izmerili na gojišču z dodanimi mokarjevimi ličinkami in kavnim
ostankom.
Sestava gojišča, preraščenega z glivo C. militaris po 85 dneh kultivacije, je imela vpliv na

znotrajcelično oksidacijo in raven ATP v kvasnih celicah. Ekstrakti vseh vrst gojišč
preraščenih z glivo C. militaris so znižali raven ATP v kvasnih celicah v primerjavi s
kontrolo, kar je v neskladju z literaturo in to povezujemo z ostalimi komponentami gojišča.
Glede na preraščeno pšenično gojišče, je bila pri ekstraktih ostalih gojišč (PGK, PGM in
PGP) znotrajcelična raven ATP signifikantno višja. Največji antioksidativni učinek v
kvasnih celicah, glede na kontrolo in vrsto gojišča, je imel ekstrakt preraščenega
pšeničnega gojišča z dodanim kavnim ostankom.
Rezultati so nam dali pomemben vpogled v gojenje glive na žitnih gojiščih in možne
težave, ki jih gojenje na takšnih substratih predstavlja. Presenečeni smo bili nad učnikom
gojišča na znotrajcelično oksidacijo in raven ATP v kvasnih celicah, saj smo glede na
visoke izmerjene količine kordicepina pričakovali večji pozitiven učinek na omenjena
parametra. Ugotovili smo, da je kavni ostanek lahko dodatek gojiščem za vzgojo
Cordyceps militaris. Poleg zadovoljivih rezultatov, ki smo jih izmerili iz vzorcev gojišča z
dodanim kavnim ostankom, je odpadek in bi ga lahko na tak način koristno uporabili.
7 VIRI
Ashihara H., Hiroshi S., Alan C. 2008. Caffeine and related purine alkaloids: biosynthesis,
catabolism, function and genetic engineering. Phytochemistry, 69, 4 : 841–856
Barbarin A. M., Jenkins N. E., Rajotte E. G., Thomas M. B. 2012. A preliminary

evaluation of the potential of beauveria bassiana for bed bug control. Journal of
Invertebrate Pathology, 111, 1: 82–85
Brigham A., Bryan J. K., Ceurvels J., Conquer J., Costa D., Culwell S., Giese N., Hashmi
S., Hawkins E. B., Isaac R., Le T. D., LeBlanc Y., Liu A., Rusie-Seamon E., Grimes
S., Jill M., Tanguay-Colucci S., Weissner W., Zhou S. 2013. Cordyceps (Cordyceps
spp.): an evidence-based systematic review by the natural standard research
collaboration. Alternative and Complementary Therapies, 19, 6: 326–336
Cadenas E., Kelvin J. A. D. 2000. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress
and aging. Free Radical Biology and Medicine, 29, 3–4: 222–230
Cannon P. F., Hywel-Jones N. L., Maczey N., Norbu L., Tshitila, Samdup T., Lhendup P.
2009. Steps towards sustainable harvest of Ophiocordyceps sinensis in Bhutan.
Biodiversity and Conservation, 18, 9: 2263–2281
Chen C., Wang M., Jin C., Chen H., Li S., Li S., Dou X., Jia J., Gui Z. 2015. Cordyceps
militaris polysaccharide triggers apoptosis and G0/G1 cell arrest in cancer cells.
Journal of Asia-Pacific Entomology, 18, 3: 433–438
Chen P., Wang S., Nie S., Marcone M. 2013. Properties of Cordyceps sinensis: a review.
Journal of Functional Foods, 5, 2: 550–569
Cui J. D. 2015. Biotechnological production and applications of Cordyceps militaris, a

valued traditional Chinese medicine. Critical Reviews in Biotechnology, 35, 4: 475-
484
Cunningham K. G., Manson W., Spring S. F., Hutchinson S. A. 1950. Cordycepin, a

metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris (Linn.). Nature, 166:
949-949
Dai G., Bao T., Xu C., Cooper R., Zhu J.S. 2001. CordyMaxTM Cs-4 improves steady-state
bioenergy status in mouse liver. Journal of Alternative and Complementary Medicine,
7, 3: 231–240
Das S. K., Masuda M., Sakurai A., Sakakibara M. 2010. Medicinal uses of the mushroom
Cordyceps militaris: current state and prospects. Fitoterapia, 81, 8: 961–968
Dong C. H., Yao Y. J. 2008. In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous

extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis. LWT - Food
Science and Technology, 41, 4: 669–677
Dong C. H., Yao Y. J. 2011. On the reliability of fungal materials used in studies on
Ophiocordyceps sinensis. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 38,
8: 1027–1035
Dong J. Z., Wang S. H., Ai X. R., Yao L., Sun Z. W., Lei C., Wang Y., Wang Q. 2013.
Composition and characterization of cordyxanthins from Cordyceps militaris fruit
bodies. Journal of Functional Foods, 5, 3: 1450–1455
Evans H. C., Elliot L. S., Hughes P. D. 2011. Hidden diversity behind the zombie-ant
fungus Ophiocordyceps unilateralis: four new species described from carpenter ants
in Minas Gerais, Brazil. PLoS ONE, 6, 3: e17024, doi:
10.1371/journal.pone.0017024: 9 str.
Foury F.. 1997. Human genetic diseases: a cross-talk between man and yeast. Gene, 195, 1:
1–10
Gregori A. 2013. Zdravilne gobe rastejo predvsem na lesu. Les/Wood, 65, 1–2: 37–40
Gregori A. 2014. Cordycepin production by Cordyceps militaris cultivation on spent

brewery grains. Acta Biologica Slovenica, 57, 2: 45–52
Hensley K., Kelly S. W., Robert A. F. 2003. Flurogenic analiysis of H2O2 in biological
material. V: Methods in biological oxidative stress. Hensley K., Floyd A. R. (ur.).
Totowa, Humana Press Inc.: 169–174
Holliday J. C., Cleaver P. M. 2008. Medicinal value of the caterpillar fungi species of the
genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes). a review. International Journal of
Medicinal Mushrooms, 10, 3: 219–234
Hong I. P., Kang P. D., Kim K. Y., Nam S. H., Lee M. Y., Choi Y. S., Kim N. S., Kim H.
K., Lee K. G., Humber R. 2010. Fruit body formation on silkworm by Cordyceps
militaris. Mycobiology, 38, 2: 128–132
Horvat N. 2014. Biološki učinki preparata gobe Cordyceps militaris. Magistrsko delo.
Ljubljana, Študij mikrobiologije, Biotehniška fakulteta: 74 str.
Hui M. Y., Wang B. S., Shiow C. H., Duh P. D. 2006. Comparison of protective effects
between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against
oxidative damage. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 8: 3132–3138
Jakubowski W. 2000. 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what

does it measure? Cell Biology International, 24, 10: 757–760
Jakubowski W., Bartosz G. 1997. Estimation of oxidative stress in Saccharomyces

cerevisae with fluorescent probes. International Journal of Biochemistry & Cell
Biology, 29, 11: 1297–1301
Jung K., Kim I. H., Han D. 2004. Effect of medicinal plant extracts on forced swimming
capacity in mice. Journal of Ethnopharmacology, 93, 1: 75–81
Kaczka A. E., Trenner N. R., Arison B., Walker W. R., Folkers K. 1964. Identification of
cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris as 3'-deoxyadenosine. Biochemical
and Biophysical Research Communications, 14, 5: 456–457
Kang H. J., Baik H. W., Kim S. J., Lee S. G., Ahn H. Y., Park J. S., Park S. J., Jang E. J.,
Park S. W., Choi J. Y., Sung J. H., Lee S. M. 2015. Cordyceps militaris enhances cell-
mediated immunity in healthy Korean men. Journal of Medicinal Food, 18, 10: 1164–
1172
Kang N., Lee H. H., Park I., Seo Y. S. 2017. Mycobiology development of high
cordycepin producing Cordyceps militaris strains. Mycobiology, 45, 1: 31–38
Ko K. M., Leung H. Y. 2007. Enhancement of ATP generation capacity, antioxidant

activity and immunomodulatory activities by Chinese yang and yin tonifying herbs.
Chinese Medicine, 2: 3 doi: 10.1186/1749-8546-2-3: 10 str.
Košmelj K. 2007. Uporabna statistika, 2. dop. izd. Ljubljana, Biotehniška fakulteta: 53-68
http://www.bf.uni-
lj.si/fileadmin/groups/2721/Uporabna_statistika_okt_2007/Uporabna_statistika_01.pdf
(23. 3. 2019)
Lee E. J., Jang K. H., Im S. Y., Lee Y. K., Farooq M., Farhoudi R., Lee D. J. 2015.
Physico-chemical properties and cytotoxic potential of Cordyceps sinensis
metabolites. Natural Product Research, 29, 5: 455–459
Lee H. H., Park C., Jeong J. W., Kim M. J., Seo M. J., Kang B. W., Park J. U., Kim G. Y.,
Choi B. T., Choi Y. H., Jeong Y. K. 2013. Apoptosis induction of human prostate
carcinoma cells by cordycepin through reactive oxygen speciesmediated
mitochondrial death pathway. International Journal of Oncology, 42, 3: 1036–1044
Lee J. S., Kwon J. S., Yun J. S., Pahk J. W., Shin W. C., Lee S. Y., Hong E. K. 2010.
Structural characterization of immunostimulating polysaccharide from cultured
mycelia of Cordyceps militaris. Carbohydrate Polymers, 80, 4:1011–1017
Lee J. S., Eock K. H. 2011. Immunostimulating activity of the polysaccharides isolated

from Cordyceps militaris. International Immunopharmacology, 11, 9: 1226–1233
Lee K., Bae J. R., Oh K. W., Shah V. K., Oh E. H., Lee C. I., Hu Z., Han J. Y., Chong M.
S., Hong J. T. 2013. Cordycepin increases nonrapid eye movement sleep via
adenosine receptors in rats. Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine, 2013: e 840134, doi: 10.1155/2013/840134: 8 str.
Lin B., Li S. 2011. Cordyceps as an hebral drug. V: Herbal medicine: biomolecular and
clinical aspects. 2nd ed. Benzie I. F. F., Watchel-Garol S. (ur.) Los Angeles, Taylor &
Francis Group, CRC Press: 73-107
Lin Q., Long L., Wu L., Zhang F., Wu S., Zhang W., Sun X. 2017. Evaluation of different
agricultural wastes for the production of fruiting bodies and bioactive compounds by
medicinal mushroom. Journal of the Science of Food and Agriculture, 97, 10: 3476–
3480
Liu J., Feng C., Li X., Chang M., Meng J., Xu L. 2016. Immunomodulatory and
antioxidative activity of Cordyceps militaris polysaccharides in mice. International
Journal of Biological Macromolecules, 86: 594-598
Liu X., Huang K., Zhou J. 2014. Composition and antitumor activity of the mycelia and
fruiting bodies of Cordyceps militaris. Journal of Food and Nutrition Research, 2, 2:
74–79
Manabe N., Azuma Y., Sugimoto M., Uchio K., Miyamoto M., Taketomo N., Tsuchita H.,
Miyamoto H. 2000. Effects of the mycelial extract of cultured Cordyceps sinensis on
in vivo hepatic energy metabolism and blood flow in dietary hypoferric anaemic mice.
British Journal of Nutrition, 83, 2: 197–204
Manabe N., Sugimoto M., Azuma Y., Taketomo N., Yamashita A., Tsuboi H. 1996.
Effects of the mycelial extract of cultured Cordyceps sinensis on in vivo hepatic enery
metabolism in the mouse. Japanese Journal of Pharmacology, 70, 1: 85-88
Masuda M., Urabe E., Honda H., Sakurai A., Sakakibara M. 2007. Enhanced production of
cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris.
Enzyme and Microbial Technology, 40, 5: 1199–1205
McElroy D. W. 1947. The energy source for bioluminescence in an isolated system.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
33, 11: 342–345
Menacho-Márquez M., Murguía J. R. 2007. Yeast on drugs: Saccharomyces cerevisiae as a

tool for anticancer drug research. Clinical & Translational Oncology. 9, 4: 221–228
Mercer E. I. 1984. The biosynthesis of ergosterol. Pesticide Science, 15, 2: 133–155
Ng, T. B., Wang H. X. 2005. Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk

medicine. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 57, 12: 1509–1519
Ni H., Zhou X. H., Li H. H., Huang W. F. 2009. Column chromatographic extraction and
preparation of cordycepin from Cordyceps militaris waster medium. Journal of
Chromatography B, 877, 22: 2135–2141
Padilla Brown W. 2018. Cordyceps militaris culture. New Cumberland, MycoSymbiotics:

1 str. https://www.mycoshop.net/listing/485723676/cordyceps-militaris-culture
(7.3.2018)
Park J. P., Kim S. W., Hwang H. J., Cho Y. J., Yun J. W. 2002. Stimulatory effect of plant
oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris. Enzyme
and Microbial Technology, 31, 3: 250–255
Paterson R., Russell M. 2008. Cordyceps - a traditional Chinese medicine and another
fungal therapeutic biofactory?. Phytochemistry, 69, 7: 1469–1495
Pegler D. N., Yao Y. J., Li Y. 1994. The Chinese ‘caterpillar fungus.’ Mycologist 8, 1: 3–5
Pujol D., Liu C., Gominho J., Olivella M. À., Fiol N., Villaescusa I., Pereira H. 2013. The
chemical composition of exhausted coffee waste. Industrial Crops and Products 50,
7: 423–429
Raspor P., Smole Možina S., Podjavoršek J., Pohleven F., Gogala N., Nekrep F. V., Rogel
I., Hacin, J. 1995. ZIM : zbirka industrijskih mikroorganizmov Ljubljana, Katalog
biokultur. 1. izd. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Katedra za biotehnologijo: 98 str.
Rehner S., Buckley E. 2005. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-
alpha sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps
teleomorphs. Mycologia, 97, 1: 84–98
Reis F. S., Barros L., Calhelha R. C., Ćirić A., Griensven L. J., Soković M.,
Ferreira I. C. 2013. The methanolic extract of Cordyceps militaris (L.) Link fruiting body
shows antioxidant, antibacterial, antifungal and antihuman tumor cell lines properties.
Food and Chemical Toxicology, 62: 91–98
Shashidhar M. G., Giridhar P., Udaya Sankar K., Manohar B., 2013. Bioactive principles
from Cordyceps sinensis: a potent food supplement - a review. Journal of Functional

Foods, 5, 3: 1013–1030
Shih I. L., Tsai K. L., Hsieh C. 2007. Effects of culture conditions on the mycelial growth
and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris.
Biochemical Engineering Journal, 33, 3: 193–201
Shrestha B., Lee W., Han S., Sung J. 2006. Observations on some of the mycelial growth
and pigmentation characteristics of Cordyceps militaris isolates. Mycobiology, 34, 2:
83-91
Shrestha B., Zhang W., Zhang Y., Liu X. 2012. The medicinal fungus Cordyceps militaris:
research and development. Mycological Progress, 11, 3: 599–614
Siu K. M., Mak D. H. F., Chiu P. Y., Poon M. K. T., Du Y., Ko, K. M. 2004.
Pharmacological basis of ‘yin-nourishing’ and ‘yang-invigorating’ actions of
Cordyceps, a Chinese tonifying herb. Life Sciences, 76, 4: 385–395
Stamets P. 2000. Growing gourmet and medical mushrooms. 3rd ed. New York, Ten Speed
Press.: 308-315
Stephen C. A. 2003. Diversity and speciation in Claviceps. V: Clavicipitalean fungi:

evolutionary biology, chemistry, biocontrol and cultural impacts, White J. F., Bacon
W. C., Hywel Jones L. N., Spatafora W. J. (ur.). Basel, Marcel Dekker Inc.: 203-252
Suh S. O., Noda H., Blackwell M. 2001. Insect symbiosis: derivation of yeast-like
endosymbionts within an entomopathogenic filamentous lineage. Molecular Biology
and Evolution, 18, 6: 995–1000
Sung G. H., Hywel-Jones N. L., Sung J. M., Luangsa-ard J. J.,Shrestha B., Spatafora J. W.
2007. Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi. Studies
in Mycology, 57: 5–59
Tian X., Li Y., Shen Y., Li Q., Wang Q., Feng L. 2015. Apoptosis and inhibition of
proliferation of cancer cells induced by cordycepin (review). Oncology Letters, 10, 2:
595–599
Tuli H. S., Sandhu S. S., Sharma A. K. 2013. Pharmacological and therapeutic potential of
Cordyceps with special reference to cordycepin. 3 Biotech, 4, 1: 1–12
Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M. T., Mazur M., Telser, J. 2007. Free radicals
and antioxidants in normal physiological functions and human disease. International
Journal of Biochemistry & Cell Biology, 39, 1: 44–84
Wang, M., Meng, X. Y., Yang, R. L., Qin, T., Wang, X. Y., Zhang, K. Y., Fei, C. Z., Li,
Y., Hu, Y. L. in Xue, F. Q. 2012. Cordyceps militaris polysaccharides can enhance
the immunity and antioxidation activity in immunosuppressed mice. Carbohydrate
Polymers, 89, 2: 461–466
Wang X. L., Yao Y. J. 2011. Host insect species of Ophiocordyceps sinensis: a review.
ZooKeys, 127: 43–59
Wasser S. 2002. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating

polysaccharides. Applied Microbiology and Biotechnology, 60, 3: 258–274
Wen T., Li G., Kang J., Kang C., Hyde K. D. 2014. Optimization of solid-state
fermentation for fruiting body growth and cordycepin production by Cordyceps
militaris. Chiang Mai Journal of Science, 41, 4: 858–872
Winkler D., 2013. Cordyceps militaris in Arkansas, Seattle, MushRoaming: 1 str.

http://mushroaming.com/content/cordyceps-militaris-arkansas (13.12.2018)
Won S. Y., Park E. H. 2005. Anti-inflammatory and related pharmacological activities of

cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris. Journal of
Ethnopharmacology, 96, 3: 555–561
Wong J. H., Ng T. B., Wang H., Sze S. C. W., Zhang K. Y., Li Q., Lu X. 2011. Cordymin,
an antifungal peptide from the medicinal fungus Cordyceps militaris. Phytomedicine,
18, 5: 387–392
Yang F. Q., Feng K., Zhao J., Li S. P. 2009. Analysis of sterols and fatty acids in natural
and cultured Cordyceps by one-step derivatization followed with gas
chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 49, 5: 1172–1178
Yoo H., Shin J., Cho J., Son C., Lee Y., Park S., Cho C. 2004. Effects of Cordyceps
militaris extract on angiogenesis and tumor growth. Acta Pharmacologica Sinica, 25,
5: 657–665
Yu R., Yang W., Song L., Yan C., Zhang Z., Zhao Y. 2007. Structural characterization and
antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured
Cordyceps militaris. Carbohydrate Polymers, 70, 4: 430–436
Yue K., Ye M., Zhou Z., Sun W., Lin X. 2013. The genus Cordyceps: a chemical and
pharmacological review. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 65, 4: 474–493
Zakrajšek, T. 2014. Vpliv eksogenih antioksidantov na endogeni antioksidativni obrambni

sistem pri kvasovki Saccharomyces cerevisiae. Doktorska disertacija, Ljubljana,
Biotehniška fakulteta: 28-29
Zhan Y., Dong C., Yao Y. 2006. Antioxidant activities of aqueous extract from cultivated
fruit-bodies of Cordyceps militaris (L.) Link in vitro. Journal of Integrative Plant
Biology, 48, 11: 1365–1370
Zhang Z., Lv G., Pan H., Fan L., Soccol C. R., Pandey A. 2012. Production of powerful
antioxidant supplements via solid-state fermentation of wheat (Triticum aestivum
Linn.) by Cordyceps militaris. Food Technology and Biotechnology, 50, 1: 32–39
Zheng P., Xia Y., Xiao G., Xiong C., Hu X., Zhang S., Zheng H., Huang Y., Zhou Y.,
Wang S., Zhao G. P., Liu X., St Leger R. J., Wang C. 2011. Genome sequence of the
insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine.
Genome Biology, 12, 11: R116, doi: 10.1186/gb-2011-12-11-r116
Zheng P., Xia Y., Zhang S., Wang C. 2013. Genetics of Cordyceps and related fungi.
Applied Microbiology and Biotechnology, 97, 7: 2797–2804
Zhong S., Pan H., Fan L., Lv G., Wu Y., Parmeswaran B., Pandey A., Soccol C. R. 2009.
Advances in research of polysaccharides in Cordyceps species. Food Technology and
Biotechnology, 47, 3: 304–312
Zhou, X. W., Li, L. J., Tian E. W. 2014. Advances in research of the artificial cultivation
of Ophiocordyceps sinensis in China. Critical Reviews in Biotechnology, 34, 3: 233–
243
Zhou X., Gong Z., Su Y., Lin J., Tang K. 2009. Cordyceps fungi: natural products,
pharmacological functions and developmental products. Journal of Pharmacy and
Pharmacology, 61, 3: 279–291
Zhu J. S., Halpern G. M., Jones K. 1998a. The scientific rediscovery of a precious ancient
Chinese herbal medicine: Cordyceps sinensis: part I. Journal of Alternative and
Complementary Medicine, 4, 3: 289–303
Zhu J. S., Halpern G. M., Jones K. 1998b. The scientific rediscovery of a precious ancient
Chinese herbal regimen: Cordyceps sinensis: part II. Journal of Alternative and
Complementary Medicine, 4, 4: 429–457
Turnšek P., Vpliv gojišča na rast in biološke učinke glive Cordyceps militaris.
ZAHVALA
Zahvaljujem se mentorici prof. Poloni Jamnik, ker je skrbno bdela nad mojim
laboratorijskim in pisnim delom magistrske naloge. Njeni nasveti in usmeritve so mi pri
izdelavi magistrske naloge močno olajšali pisano in laboratorijsko delo.
Prav tako se zahvaljujem somentorju, prof. Francu Pohlevnu. Za potrebe magistrske naloge
je priskrbel micelij glive C. militaris, mi pomagal pri njenem gojenju in strokovno
usmerjal moje delo. V laboratoriju njegove katedre sem dobil mnogo znanja o gojenju
užitnih kot zdravilnih gliv, ki mi bo služilo pri razvoju svoje kariere.
Hvaležen sem za znanje, ki sem ga s pomočjo obeh mentorjev pridobil tekom ustvarjanja
magistrske naloge, tako v kontekstu pisanja naloge, kot tudi splošnega vpogleda v
možnosti, ki nam jih ponujajo glive.
Zahvaljujem se tudi prof. Samu Kreftu, ki mi je priskrbel kordicepin za pripravo

umeritvene krivulje in dr. Emilu Zlatiču, ki je opravil meritve kordicepina z metodo HPLC.
Posebej se zahvaljujem tudi staršema, ki sta me v času študija potrpežljivo podpirala in mi

omogočila, da sem pridobil želeno izobrazbo. Hvala za vse razumevanje, podporo,
potrpežljivost in zaupanje!
PRILOGE
Priloga A: Umeritvena krivulja za določanje koncentracije kordicepina.

Priloga B: Izmerjene koncentracije kordicepina v vodnih ekstraktih preraščenih gojišč in komercialnega

pripravka.
Vrsta vzorca Koncentracija [g/l] Koncentracija [mg/g]

PGP – 12. dan 0,0174 0,3228
PG – 12. dan 0,0100 0,1858
PGK – 12. dan 0,0249 0,4618
PGM – 12. dan 0,0325 0,6015
PGP – 47. dan 0,1166 2,1601
PG – 47. dan 0,0973 1,8011
PGK – 47. dan 0,2387 4,4206
PGM – 47. dan 0,3320 6,1482
PGP – 85. dan 0,1164 2,1563
PG – 85. dan 0,2467 4,5690
PGK – 85. dan 0,3728 6,9036
PGM – 85. dan 0,4185 7,7500
Komercialni pripravek 0,0627 1,1611

Gojenje Cordycepsa

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Gojenje Cordycepsa

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERZA V LJUBLJANI

VPLIV GOJIŠČA NA RAST GLIVE Cordyceps militaris

VPLIV GOJIŠČA NA RAST GLIVE Cordyceps militaris IN NJENI

INFLUENCE OF SUBSTRATE ON GROWTH OF FUNGUS Cordyceps

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študija 2. stopnje Mikrobiologija na Biotehniški

Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala prof. dr.

Mentorica: prof. dr. Polona JAMNIK

Komisija za oceno in zagovor

Predsednica: prof. dr. Nina GUNDE-CIMERMAN

Članica: prof. dr. Polona JAMNIK

Član: prof. dr. Franc POHLEVEN

Članica: doc. dr. Polona ZALAR

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

KEY WORDS DOCUMENTATION

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA..................................................III

2.4 ZDRAVILNI UČINKI IN TRADICIONALNA UPORABA GLIV Cordyceps ... 16

3.3.7 Aparatura za določanje koncentracije kordicepina ....................................... 31

Preglednica 1: Sestavine trdnega gojišča PDA za gojenje glive C. militaris. ................... 25

Priloga A: Umeritvena krivulja za določanje koncentracije kordicepina.

A3AR A3 adenozinski receptor

PBS K-fosfatni pufer

1.1 NAMEN RAZISKAVE

1.2. DELOVNE HIPOTEZE

Hipoteze, ki smo jih postavili, so sledeče:

 Sestava gojišča ima vpliv na:

 Najboljšo rast glive C. militaris in produkcijo kordicepina pričakujemo na pšeničnem

 Vodni ekstrakti preraščenih gojišč z micelijem C. militaris bodo znižali znotrajcelično

2.1 MEDICINSKO POMEMBNE GLIVE

V zadnjih desetletjih se v zahodnem svetu pojavlja vse več informacij o blagodejnih

2.2 GLIVE RODU Cordyceps

2.2.1 Splošne značilnosti gliv rodu Codyceps

Glive za človeka predstavljajo vir hrane in biološko aktivnih metabolitov že od pradavnine,

v mislih vrsto Cordyceps sinensis, ki jo zaradi velikosti in dostopnosti rastišča največkrat

2.2.2 Pomembnejši predstavniki rodu Cordyceps

Najpomembnejši predstavnik med medicinsko pomembnimi entomopatogenimi glivami je

Zaradi slovesa, ki ga ima gliva O. sinensis v kitajski tradicionalni medicini, je po njej

2.2.3 Ekologija in pomen gliv rodu Cordyceps v okolju

Entomopatogene glive rodu Cordyceps in sorodnih rodov so razširjene na vseh celinah

- Po določenem času iz sklerocija poženejo strome, na katerih v peritecijih nastanejo

Specifičnost do gostitelja in viruletnost nekaterih vrst Cordyceps sensu lato so lastnosti, ki

2.2.4 Pridobivanje in gojenje glive Cordyceps militaris

2.2.4.1 Gojenje na žuželkah

Eden izmed uporabljenih substratov so lahko naravni gostitelji glive C. militaris.

2.2.4.2 Gojenje na trdnih substratih

Za gojenje glive C. militaris lahko uporabimo številne substrate, ki temeljijo na ogljikovih

Slika 4: Trosnjaki C. militaris na trdnem gojišču (Padilla-Brown, 2016).

2.2.4.3 Drugi načini gojenja

Slika 5: Emerzna kultivacija micelija glive C. militaris (Das in sod., 2010).

2.2.4.4 Pogoji gojenja glive C. militaris

2.3 FARMAKOLOŠKO AKTIVNI METABOLITI GLIV RODU Cordyceps

2.3.1 Kordicepin in drugi nukleozidi

Nukleozidi predstavljajo dobršen del metabolitov glive C. militaris in imajo pomembno

Slika 6: Strukturna formula molekule kordicepina in adenozina (Lee in sod., 2013).

Adenozinski receptorji so udeleženi v različne procese v telesu, kot so regulacija spanja,

Polisaharidi predstavljajo od 3 do 8 % celotne biomase gliv Cordyceps spp. Strukturno so

Pomemben učinek CP v človeškem telesu je stimulacija imunskega sistema in posledično

zdravljenje in preprečevanja raka. Poleg tega so bili potrjeni učinki CP na jetra. CP

2.3.3 Maščobne kisline

2.3.4 Ergosterol in drugi steroli

Ergosterol (Slika 7) in njegove estre najdemo v celičnih membranah gliv. V človeškem

Slika 7: Strukturna formula molekule ergosterola (Mercer, 1984)

2.3.5 D-manitol ali kordicepinska kislina

V medicini se manitol uporablja zaradi njegovih diuretično-osmotskih lastnosti. Zaradi