Ợ TP Ồ Í M N

K OA Ợ NỘ UNG
BỘ MÔN V KÝ S N
MÔN: T Ự TẬP V S N ọc
- Nộ q p ò g í g
- Q a sá la ẫ dư kí ể v
h ệ môn học và - Kỹ ậ cấy và p â lập v k ẩ
Hư ng dẫn mộ kỹ h ậ cơ bản rong
hực ập V s nh

N ỰC ÀN V S N
Là ọc ư g dẫ s vê ộ số kỹ ậ và p ươ g p áp cơ Nế s vê k g đạ yê cầ p ầ ực à
bả ro g lĩ vực v s
Các ức í đ ể
ì p ả ọc lạ
iểm thành phần Số điểm Lưu ý
Nế s vê k g đạ p ầ lý yế ực
Điểm p đượ
à ì được lạ lầ 2. Lầ 2 cũ g k g đạ
Kiểm ra đ u giờ 1 ìs v ê p ả ọc lạ .
í eo buổi
Điểm ổ g kế ọ p
Kế quả 3 bằ g điểm “Tru g bì ộ g
p ” ộ g với điểm
Kỹ ă g, ái độ, “p lý uyế ”
3
uyê SV đạ yêu u k i ĐTB > 3,5
lý si viê ỉ đạ yêu u k i ó
B i i lý uyế
uyế 3 điểm lý uyế ừ 1,5 điểm rở
lê
NỘ Q Y P ÒN ÍN Xử lý rác thải sinh học
Dịc cấy v s vậ số g: Đổ bỏ vào bì đự g có ắp c ứa d g dịc
Q y đị về ọc bù/đổ b ổ ực ập sá k ẩ
Rác ả l ê q a đế v s vậ số g: đĩa pe r , đầ ýp, eppe dorf... ao
S v ê có cầ bù/đổ b ổ ực ập p ả x p ép
ác rực ếp rê v s vậ số g được ập kế ro g các ộp ựa ở vị rí
rư c và được sự đồ g ý của bộ . q y đị . Được ấp v rù g rư c k xử lý
Tro g rườ g ợp đa , ố độ x ấ oặc gặp các sự cố bấ Rác ả lê q a d g độc, ă ò : đầ ýp, eppe dorf dù g để ú
oá c ấ , d g có í ă ò oặc độc được ập kế ro g ù g rác có
k ảk á g ìp ả g báo c o ó rưở g của b ổ
ắp đặ ro g ủ ố và sẽ được xử lý eo rác ả đặc b
ực à x p ép bộ rư c rồ ộp đơ sa .
Rác ả g ườ g:đầ ýp, eppe dorf dù g để ú oá c ấ , d g
Mẫ đơ x ực ập bù s v ê sử dụ g eo ẫ k gă ò ,k g độc và k g l ê q a đế v s vậ số g sẽ được
ro g g áo rì ực ập đự g vào ro g các ộp ựa được p á sẵ c o ỗ ể ó .

An toàn phòng thí nghiệm sinh học

t í ệm
Mặc áo c oà g rắ g (blo se), đeo bả g ê , óc cộ gọ gà g
K g ặc q ầ , váy gắ rê đầ gố
Ma g dụ g cụ bảo ộ: k ẩ ra g, gă g ay, ắ kí bảo ộ (k cầ ế)
K gă ố g ro g k vực p ò g í g
KỸ T UẬT QUAN SÁT LAM MẪU
ã lê ấ cả các be, ố g g , bì c ứa... vậ l s ọc à Ớ KÍN ỂN V
ì ạo ra.
Đọc kỹ ã oá c ấ rư c k sử dụ g
Xử lý rác ả s ọc eo đú g q y đị
Mọ sự cố d ễ ra ro g q á rì ực ập cầ p ả g báo c o â vê
p ò g í g để được ư g dẫ xử lý íc ợp
KÍN ỂN V ẤU T O ỦA KÍN ỂN V

ỊN NG ĨA:

Kí ể v được sử dụ g để q a sá các vậ ể có kíc ư c rấ

ỏ à ắ ườ g k g ể q a sá được.

T ế bị ày có ể p ó g đạ ữ g vậ có kíc ư c cực kỳ ỏ bé
rở ê c ế và rõ rà g ơ (độ p ó g đạ lê ừ 40 - 3000 lầ ).
K ả ă g q a sá của kí được q yế đị bở độ p â g ả

T ỳ vào ừ g loạ kí k ể v à c ú g có c ức ă g và cấ ạo k ác
a ư g c ú g có ộ số cấ ạo c g bao gồ 04 ố g: g á
đỡ, p ó g đạ , c ế sá g, đ ề c ỉ

ấu tạo kính hiển vi quang học: 1. Phần quang học

1.1. Bộ phận chiếu sáng

Sử dụ g á sá g k ả kiế ằm qua sá á vậ ể
ỏ đượ p ó g đại ờ ệ ố g ấu kí uỷ u sá g
ắp èn hiếu sáng. Có thể iều hỉnh ộ sáng
khá nhau nhờ núm vặn
Tr iếp dù g mắ để qua sá ì ả , oặ ó ể
gắ êm á bộ p ậ ụp ả ư: p im qua g ọ , Tụ qu g :
á CCD amera để g i lại ì ả , video qua sá Cấu tạo bởi một số thấu kính ể hội tụ á tia sáng èn vào
đượ . mặt phẳng tiêu bản.
Tụ quang ó một ố iều hỉnh ể nâng ao hay hạ thấp.
Nâng ao tụ quang thị tr ờng sẽ sáng hơn ng ại hạ thấp
tụ quang thị tr ờng sẽ tối.
Trong tụ quang òn ó màn hắn sáng ó thể óng hoặ mở
ể thêm bớt ánh sáng.
1.2. Vật kính b Vật kí 100x : ó ộ phóng ại 100 ần, dùng ể quan sát
vi khuẩn sau khi ã nhuộm màu, quan sát á ấu tử ủa tế
Bộ phận quan trọng nhất ủa
bào.
Cấu tạo bởi một hệ thống thấu kính, thấu kính ngoài ùng
Đây à vật kí dầu (vật kính nhúng hìm) nên khi sử dụng
quan trọng nhất, quyết ịnh khả năng phóng ại ủa kính,
ầu vật kính phải u cè e. Các vật kính
á thấu kính òn ại ó nhiệm vụ oại trừ á quang sai, giúp
dầu có 1 vòng đen trên thân vật kính và ó ký hiệu .
ho hình ảnh quan sát rõ nét.
Độ phóng ại ủa vật kính uôn ghi trên thân vật kính.
Vật kí 40x : ó ộ phóng ại 40 ần dùng ể quan sát
vi khuẩn di ộng.

Cá vậ kí ó độ p ó g đại k á au

1.3. hị Kính Năng suất phụ thuộ khoảng á h tối thiểu giữa 2 iểm ó
thể phân biệt :
Thị kính à một hệ thống thấu kính giúp quan sát á hình aä
t
d = λ / n.sinU kính

ảnh do vật kính ung ấp ồng thời ũng phóng ại hình daàu

ảnh thêm một ần nữa. Năng suất phân y = 1 / d hoâ

ng khí
daà
u Lame

n = hệ số khú xạ môi tr ờng Baø

n kính
Tuïquang
U = ½ gó mở (khẩu ộ)
1.4. Độ phóng đại và năng suất phân ly λ = b ớ sóng ánh sáng sử dụng
Một kính hiển vi tốt phải ó khả năng phân biệt hai iểm
Độ phóng ại ủa kính hiển vi à tí h số ủa ộ phóng ại
àng gần (d nhỏ) và do ó sẽ ho ảnh rõ nét.
vật kính và thị kính.
í dụ : vật kính 100X và thị kính 10X thì kính ó ộ phóng Sử dụng dầu edre àm tăng năng suất phân y.
ại : 100x10 = 1000 ần
Độ rõ ủa ảnh quyết ịnh bởi năng suất phân y.
2. Phần cơ học: gồm thân kính, ế kính, bàn kính Á LO KÍN ỂN V SỬ ỤNG P Ổ B ẾN K Á
hân kính: mang hệ thống quang họ và à hỗ ầm khi di
huyển kính.
đ ệ tử
Trong thân ó hệ thống ố iều hỉnh: L loại kí đượ sử dụ g p ổ biế , guồ bứ xạ á
- Ố sơ ấp: iều hỉnh thô sá g đượ ay ế bằ g á ùm điệ ử ẹp đượ
- Ố vi ấp: iều hỉnh tinh ă g ố duói iệu điệ ế ừ v i ụ đế v i răm KV.
Trên thân kính ó bàn xoay ể ắp vật kính Sử dụ g ấu kí ừ để ội ụ ùm điệ ử
Bàn kính: nơi ặt vật ần quan sát, ó bộ phận giữ và di
huyển tiêu bản.

2 so ổ : 3 s ọc
L iế bị sử du g để qua sá mẫu vậ ở độ p ó g đại Dù g để qua sá vi si vậ v quá rì si sả ủa
ấp. Sử dụ g á sá g p ả xạ. Đườ g ruyề qua g ú g. Hệ ố g ấu kí ao ơ so với ữ g loại
ủa ị kí v vậ kí á biệ . kí p ó g đại ô g ườ g.
Sử dụ g qua sá vi k uẩ sẽ ạo gó ì k á au Dù g ro g g iê ứu ế b o, p áp y, si ọ p â ử
o ai mắ v ạo ê ì ả 3 iều o mẫu.
C o ì ả rõ é , m u sắ í xá .

Kính hiển vi sinh học 3 mắt

4 có gắ camera 5 so gược ( HV đảo gược)
Cò gọi l kí iể vi kỹ uậ số Kí ó guồ á sá g v ụ qua g ằm ở p ía rê v
Tra g bị amera CCD o p ép ruy xuấ ì ả v video. b đặ mẫu p ía dưới, á vậ kí v b để kí sẽ ở
dưới b ma g mẫu v ướ g lê rê .
Có guồ đè sá g LED bê ro g, k ô g ể qua sá
bằ g ị kí , ì ả iể ị qua m ì . Qua sá ế b o số g oặ vi si vậ dưới đáy ủa bì
ứa lớ . Hì ả qua sá iê ơ .
Kí ó úm xoay o p ép zoom ừ 20 đế 80 l , ó ể
ụp ả oặ quay video eo p mềm đí kèm. Có ể qua sá á ao á vi mô ay ứ g dụ g ro g
soi kim loại

7 p ả p a ( HV tươ g p ả ) 8 cầm tay m

L loại KHV qua g ọ ó ể uyể đổi lệ p a ro g L KHV điệ ử kế ối với máy í ô g qua ổ g USB
á sá g ruyề qua mộ mẫu vậ ro g suố để ay đổi để p ó g o mộ vậ rê m ì máy í .
độ sá g rê ì ả .
T iế kế ỏ gọ ó ể m v di uyể , o ể zoom
Hiệ ượ g ươ g p ả rấ ữu í k i qua sá á 20 đế 100 l .
mẫu k ô g m u, ro g suố , k ô g uộm.
Có ể ụp ả v quay video lại rê p mềm đi
Ứ g dụ g ro g SH T, SHTB. Vi si ọ v g iê ứu ù g máy í .
về y k oa.

Kính hiển vi huỳnh quang phản pha Kí iể vi m ay kế ối với điệ oại

Q AN SÁ SỰ D ĐỘN CỦA V K ẨN BẰN
KÍN ỂN V Q AN ỌC Sử dụng vật kính 40X và tiến hành theo các bước:
i khuẩn di huyển trong môi tr ờng n ớ à B1. Đ a vật kính 40X vào vị trí, á h mặt phẳng bàn kính
khoảng 0.5 m
nhờ tiêm mao.
B2. Chỉnh ờng ộ èn hiếu sáng vừa phải
Đây à bộ phận không phải vi khuẩn nào ũng ó.
B3. ạ thấp tụ quang, đóng bớt chắn sáng
B4. Đặt tiêu bản ên bàn kính, tiêu bản phải đậy lamelle.
Di huyển vị trí quan sát vào d ới vật kính
B5. ặn ố sơ ấp a vật kính hạm vào tiêu bản. Tránh
va hạm mạnh ầu vật kính vào tiêu bản.
B6. Nhìn vào thị kính ồng thời dùng ố sơ ấp iều hỉnh
ho vật kính i ên từ từ ến khi thị tr ờng xuất hiện.
B7. Dùng ố vi ấp hỉnh ho hình ảnh rõ nét.

Hì iêm mao ủa vi k uẩ phi

QUAN SÁT I UẨN ĐÃ N UỘM MÀU BẰNG

Cá b ớ tiến hành quan sát am nhuộm màu:
ÍN IỂN I QUANG ỌC
Đ a vật kính 100X vào vị trí
ụ quang nâng tối đa, mở hết chắn sáng
Để quan sát hình dạng, á h sắp xếp ủa tế bào vi khuẩn
ũng nh á ấu tử thì phải tiến hành nhuộm màu bằng Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào vùng bắt màu tốt, ều và
á ph ơng pháp thí h h p. vừa phải trên tiêu bản. Không đậy lamelle. Đ a tiêu
bản ên bàn kính, hỉnh giọt dầu giữa tụ quang
Quan sát với vật kính 100X
Dùng ố sơ ấp a ầu vật kính nhúng vào giọt dầu,
hi quan sát vi khuẩn nhuộm màu ần u ý á iểm:
tránh va hạm mạnh àm hỏng vật kính
Màu sắ tế bào
Nhìn vào thị kính, vặn ố sơ ấp thật hậm ể hạ vật
ình dạng tế bào: trự khuẩn, ầu khuẩn hay xoắn kính ến khi thị tr ờng thoáng hiện
khuẩn
Dùng ố vi ấp ể iều hỉnh ho hình ảnh rõ nét
Cá h sắp xếp: riêng ẻ, huỗi hay kiểu sắp xếp ặ tr ng
ủa oài
MỘT SỐ ÌN ẢN V K UẨN SAU N UỘM MÀU QUAN SÁT MỘT SỐ ÌN ẢN V K UẨN SAU N UỘM MÀU QUAN SÁT
Ớ KÍN ỂN V Ớ KÍN ỂN V

B ci us sub i is ph c cus ur us
E. c i C r b c riu diph ri

r p c ccus p g s Vibri ch r

1. ỤNG Ụ VÀ MÔ TR ỜNG NUÔ Ấ , P ÂN LẬP

1.1. ỤNG Ụ Ấ :
Que ấy ẳ g: que ấy kim loại ó đ u ọ
Que ấy mó : que ấy ó đ u vuô g gó
Que ấy vò g: que ấy kim loại đ u ó vò g rò , dù g ấy
KỸ T UẬT Ấ VÀ P ÂN LẬP ủ g ừ môi rườ g rắ oặ lỏ g lê môi rườ g rắ , lỏ g.

V K UẨN Que ấy ra g: L que bằ g kim loại ay ủy i , đ u ì

am giá , dù g để d rải vi k uẩ rê bề mặ ạ rắ .
Ố g ú ủy i : Dù g để uyể mộ lượ g vi k uẩ
iế lê bề mặ môi rườ g rắ oặ v o môi rườ g lỏ g.
Đ u ăm bô g vô rù g: Dù g để ấy giố g ừ môi rườ g lỏ g
lê bề mặ ủa môi rườ g rắ .
 1.2. ỤNG Ụ T ỆT TRÙNG QUE Ấ
Que ấy a: sử dụ g 1 l v đượ iệ rù g sẵ .

Que ấy i ox: p ải đượ iệ rù g rướ v sau k i ấy vi

k uẩ bằ g đè ồ ay á iế bị iệ rù g bằ g điệ ồ g
goại.

1 2 3

1. Que ấy ra g; 2. Que ấy mó ; 3. Que ấy ẳ g

Đè ồ Đè đố gas Tiệ rù g dây ấy bằ g điệ

1.3. MÔ TR ỜNG NUÔ Ấ 2. KỸ T UẬT Ấ V K UẨN

Cấy vi khuẩn à huyển vi khuẩn từ môi tr ờng hiện tại
Môi rườ g p ải đượ ấp iệ rù g rướ k i sử dụ g
sang một môi tr ờng khá nhằm á mụ í h:
Môi rườ g ó ai rạ g ái ơ bả : lỏ g (bro ) v rắ (agar)
Cá loại môi rườ g p ổ biế : Cấy uyề : huyển gố vi khuẩn thuần hủng từ môi
Môi rườ g di dưỡ g: l môi rườ g ơ bả o VK p á tr ờng ũ sang môi tr ờng mới ể giữ giống.
riể
Môi rườ g ọ lọ : ứa ấ gă ặ ỉ o vi k uẩ Tiến hành ịnh kỳ, thời gian dài ngắn tùy theo gố .
p â lập p á riể gồm ọ lọ vừa v ọ lọ ao.
Cấy v k uẩ ầ k ảo sát ên á môi tr ờng ể khảo
Môi rườ g p o g p ú: o p ép vi k uẩ uôi ấy p á
riể mạ . sát hình thái và tính hất sinh ý, sinh hóa …, ấy vi
Môi rườ g p â biệ : ó ể p â biệ đượ mộ số vi khuẩn vào môi tr ờng nuôi ấy ể thu hoạ h số ng
k uẩ rê môi rườ g ô g qua m u sắ
ớn vi khuẩn
Các lưu ý khi cấy :
Thao tá phải nhanh gọn.
Phải tiệt trùng kỹ dây ấy.
Đốt miệng ống nghiệm khi mở ũng nh khi óng nắp.
Dây ấy và miệng ống nghiệm phải ể trong vùng an
toàn ủa ngọn ửa ( á h ngọn ửa < 2 m), không để
ống nghiệm ngay trên ngon lửa trong khi cấy.
Đốt bỏ phần vi khuẩn thừa trên dây ấy tr ớ khi ặt
dây ấy xuống.
ấy truyền vi sinh vật
ác phương pháp cấy vi khuẩn:
Cấy ừ môi rườ g lỏ g sa g môi rườ g lỏ g
Cấy ừ môi rườ g rắ sa g môi rườ g lỏ g
Cấy ừ môi rườ g rắ sa g môi rườ g rắ
Cấy ừ môi rườ g lỏ g sa g môi rườ g rắ
Môi trường trong các dụng cụ đựng
Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng
B A
A. Môi rườ g B. MT sau ấy vi k uẩ Nấm sau k i ấy rê môi rườ g
3. KỸ THUẬT HÂN LẬ VI KHUẨN
3.2. ươ g p áp đườ g rạ
Vi khuẩn thuần chủng: ập ợp á vi k uẩ p á riể ỉ ừ 01 ế
b o ba đ u.

â lập vi k uẩ : l kỹ uậ đượ sử dụ g để ó vi k uẩ u
ủ g ừ ỗ ợp vi k uẩ .
3.1. Nguyê ắ
Vi k uẩ đượ rải rê môi rườ g với mậ độ giảm d đế k i
á ế b o vi k uẩ ro g ỗ ợp ba đ u á rời ừ g ế
b o riê g rẽ v ằm xa au.
Sau ời gia ủ á ế b o vi k uẩ rời rạ rê sẽ p á riể 1
k óm, đây í l vi k uẩ u ủ g
ách thức thực hiện phân lập

3.3. ươ g p áp đườ g zig – zag

Đố dây cấy, là g ộ , lấy 1 vò g dây cấy v k ẩ . Q
vò g dây cấy lê ặ ạc ừ sá à ộp ra k oả g 1 - 1,5
c để đặ v k ẩ lê ặ ạc . Đố dây. K óm vi k uẩ
Trả v k ẩ ừ v rê sa g a bê bằ g đườ g z g-zag sá i k iế
a c o đế k v v k ẩ k . Đố dây.
Trả v k ẩ ừ bư c 2 ra eo đườ g z g-zag, c ỉ c ạ vào
đườ g cũ (bư c 2) 1 - 2 lầ . Đố dây.
Lặp lạ ư bư c 3 ở p ầ ạc cò lạ . Đố dây.

Kết quả phân lập vi khuẩn theo phương pháp đường rạch
 Á P ƠNG P ÁP T ỆT TRÙNG

K óm vi k uẩ
i k iế 1. ươ g p áp iệ ẩm
2. ươ g p áp iệ k ô
3. ươ g p áp Ty dall

Kết quả phân lập vi khuẩn theo phương pháp đường zig-zag

1. Phương pháp nhiệt ẩm: o p ép iệ rù g ả b o ử

Sử dụng hơi n ớ ó nhiệt ộ 121,5oC, a áp suất hơi ên
1 atm trên áp suất khí quyển, phải tiến hành trong nồi hấp
(autoclave)
Phạm vi áp dụng : dụng ụ, bông băng, áo quần, môi
tr ờng và á vật iệu hóa hất
ạn chế : Cá ồ vật không hịu nhiệt
hời gian hấp tùy theo dung tí h ồ vật

ung tích đồ vật Thời gia hấp (phút)

Ố g g iệm ứa 2,5ml, bì ó < 100 ml 15

Bì ó 500ml 17 22

Bì ó 1000ml 25

Bì ó 2000ml 35
 N iệ độ, áp suấ ấp v ấ kiểm ra ươ g ứ g 2. Phương pháp nhiệt khô
Dù g để iệ rù g dụ g ụ ư ộp pe ri, pipe …, á oá ấ
Nhiệt độ (o ) Áp suất trên áp suất khí quyển (atm) hất kiểm tra
ịu iệ
121 1 a id be zoi
N iệ độ iệ rù g: 165 – 200oC ro g 120 p ú
128 1.5 al ydri p ali 3. Phương pháp Tyldall
Dù g iệ rù g môi rườ g ứa ữ g ấ k ô g ịu iệ độ
Lưu ý khi sử dụng lò hấp:
ao.
L iế bị áp suấ ao do đó p ải uâ ủ ặ ẻ ội qui sử dụ g
để đảm bảo a o , rá đứ g g lò k i đa g vậ . Cá iế : iệ rù g 03 g y liê iếp mỗi g y 2 giờ ở iệ
Bảo rì đú g ời gia qui đị . độ 70oC. Sau mỗi l để môi rườ g iệ độ p ò g.