Cytometria

25.02.2021

 co możemy badać?

Co umożliwia nam porównywanie komórek?:

 Wielkość względna
 Ziarnistość względna wewnetrzna organizacja

Fotopowielacze – detektory rozproszenia światła w cytometrze;

  im komorka wieksza tym wieksza intensywność światła rozpraszanego do przodu (przodu do kierunku wiązki
laserowej padającej na komórkę);
 jeżeli komórka jest bardziej gęsta, ma więcej ziarnistości i elementów kom to padające światło ulega
rozproszeniu na tych strukturach na boki. Intensywność światła rozpraszanego na boki daje nam informacje
o względnej zairnisotści komórki.

Osie na wykresie maja podpisy: FSC – rozproszenie do przodu i SSC – rozproszenie na boki;

 Limfocyty – małe i mają dużo ziarnistości

 Monocyty – większe ale nadal mało ziarnistości
 Granulocyty- duże i mają dużo ziarnistości

Jak można wzmocnić sygnał świetlny tak żeby był łatwo mierzony? (bo komórki sa bardzo małe przecież więc sygnały
będą zbyt małe)  Należy zamienić sygnał świetlny na inny sygnał  elektryczny

Sygnał ze świetlnego na elektryczny zamieniany jest w detektorze (FOTOPOWIELACZ)

Większe napięcie na fotopowielaczu sprawi, że obraz wykresu przesunie się na skali w prawo i do góry!

Debris – smieci

Dlaczego erytrocytów jest tak mało?  Jest tak dlatego że lizujemy erytrocyty do analizy leukocytów! I zostają tylko
zlepy błon erytrocytów;

Leukocyty różnia się od s różnymi markerami powierzchniowymi  bialka te sa antygenami i możemy uzyskać
odpowiednie przeciwciała do nich (a przeciwciała flruorochromami znakujemy) i to wykorzystujemy do analizy;

Fluorescencja  gdy po zaniku czynnika pobudzającego następuje szybki zanik emisji (10 -8 sek)

Fosforescencja  gdy zanik jest dłuższy niż 10-8 sek.

Fala emitowana przez fluorochrom jest większej długości niż fala absorbowana

Można znakować również struktury wewnątrzkomórkowe czy DNA!

Co jest ważne w emisji fluorescencji?

Światło o jednej długości może wzbudzać kilka fluorochromów, ale ważne jest aby różne te wybrane fluorochromy
emitowały światło o różnej fali;

Przesunięcie Stocksa – powoduje ze można odróżnić spektrum wzbudzające od spektrum emitowanego;

CD4 - limfocyty T helperowe

CD8- limfocyty cytotoksyczne

FL1 i FL2 (FL3, FL4 itd.)  FL to fluorescencja a liczba odnosi się do konkretnego detektora;

 44% to komórki wykazujące ekspresję CD4+

 23% to limfocyty CD8+
 1% to limfocyty co mają i CD4 i CD8; jeśli odsetek tych limfocytow jest zbyt duzy to możemy myslec ze mamy
jakiś defekt selekcji i migracji limfocytów z grasicy (może dochodzić do rozwoju choroby autoimmunizacyjnej;
podwójnie reaktywne limfocyty to te które nie przeszły selekcji negatywnej (maja potencjał autoreaktywny);
 31% to głównie limfocyty B (nie mają CD4 ani CD8), ale też będą tu NK które tez nie maja tych markerów;

Intensywność świecenia będzie zależeć od ilości danego markera;

Jest masa bialek których poziom ekspresji zależy od tego czy komorka jest aktywowana czy nie  możemy w ten
sposób wnioskować o stanie spoczynku komórki.
FITC – fluoresceina?

M1 i M2 to odcinki; program liczy odsetek komórek zawartych w odcinku M1 i odsetek mieszczący się w odcinku M2;

Jak spowodować żeby komórki w komorze pamiarowej cytometru ustawiały się w jednym rzedzie i przechodzily
przez wiazke promieniowania w sposób uporządkowany?

OGNISKOWANIE HYDRODYNAMICZNE – do jakiejś przestrzeni (komory pomiarowej) wtryskiwane sa jednocześnie 2

ciecze z różna predkoscia (proba badana wolniej i ciecz inna szybciej). Ponieważ płyn wtryskiwany z duza szybkoscia
wyciąga komórki z proby wtryskiwanej z malej komórki co powoduje rozciagniecie strumienia próby powoduje wąski
obszar objetosci jego przepływu. Predkosc ustala się tak żeby w plynie proby teoretycznie znajdowala się jedna
komorka.

Nosel 70-130 mikrometrów (dysza) – pozwala przejść dwóm komórkom nawet niestety, nie jest to średnica że ciasno
przechodzą komórki;

 Jesli jest więcej laserów w cytometrze to jest możliwość badania większej ilości fluorochromów.
 Ograniczone będzie to tylko dostępnością fluorochromów jeśli ma duuuuzo laserów;
Komorka analizowana jest tylko 1 raz!

 Lasery – emitują swiatlo o określonej dlugosci; (źródło światla)

 Wiazka laserowa musi obejmować komorke (mniej więcej) i dlatego są soczewki ogniskujące
 Układ hydrauliczny z komora pomiarowa z dyszą
 Uklad optyczny – zestaw różnych filtrów których zadaniem jest porządkowanie wiązek swiatla pochodzących
z odbicia swiatla na boki (detektora) rozproszenia swiatla do porzdu (detektor ) i kierowania wiazek do
określonych dekterów fluorescencji
 Układ elektryczny – detektory emitują sygnal prądowy które powstaje w fotopowielacza w skutek działania
fotonow padających na zestaw płytek fotopowielaczy
 Komputer zbierający dane i przetwarazajce je na cyfrowe
  Laser niebieski jednocześnie sluzy do analizy wielkości i ziarnistości komórek!
 Światlo laserowe charakteryzuje się określonym zakresem, co oznacza ze wiazka jest zogniskowana w
malej obietosci plynu .
 Aparaty chłodzone sa powietrzem!
 Im wieksza moc lasera tym wieksza jego jest czułość (analiza DNA, chromosomów i sortowania
chromosomów – musi być duża moc)

W układzie hydraulicznym  Dwa zbiorniki z płynem (probówka z zawiesiną komorek i drugi z sola fizjologiczną)

Regulacja ciśnienia wtryskiwania próby:

 Jak wtryskujemy pod małym ciśnieniem to strumień jest węższy! Co w efekcie zwiększa nasza pewność ze
komórki będą przechodzić pojedynczo - dobre do DNA;
 Gdy jest większe ciśnienie wtryskiwanej próby to strumień robi się szerszy ale jest to wystarczające do innych
analiz poza DNA;

Układ optyczny ma różne filtry które będą absorbować, odbijać albo przepuszczać określone dlugosci fali. Zwierciadła
dichroiczne!
Filtry longpass, shortpass i badpass.

W układzie elektrycznym fotony zamieniane sa na sygnał elektryczny. Każda komorka przechodząc aprzez wiazke
generuje puls w postaci pradu elektrycznego, który nazywany jest ,,iwentem”. Gdy komorka wchodzi w wiazke lasera
to generuje sygnaly od swiatla rozproszonego i fluorescencji i manifestują się one strumieniem elektronów w
fotopowielaczu

 Natężenie pradu jest proporcjonalne do ilość fotonów i jest proporcjonalne do intensywności sygnału.
 Gdy komorka jest cala w centrum wiazki to sygnal jest maksymalny
 Na histogram sklada się zbior pulsów wszystkich podobnych komorek które przeszly przez aparat.

Po ustawieniu thesholdu to oś X przenosi się do góry.

Negatywna kontrola  komórki nie wyznakowane przeciwciałem z danym fluorochromem; żywe komórki emitują
fluorescencję – słaba ale jednak! Dlatego zawsze dajemy kontrole negatywną!!!

 Cytometry analogowe  dopiero na koniec zmieniają dane na cyfrowe;

  Cytometry cyfrowe  system elektroniczny jest na wielu etapach

Ustawianie KOMPENSACJI – zależy od tego jaki mamy aparat! Ważne jest tu czy mammy analogowy czy cyfrowy.

Trzy komponenty pulsu:

 Wysokość – intensywność sygnału

 Powierzchnia – intensywność sygnału
 Szerokość - jest proporcjonalna do czasu w której komorka znajduje się w strumieniu lasera.

Do obrazowania pulsu używamy skalę logarytmiczną (wzmacnia slabe sygnaly, kompensuje mocne sygnały) lub skale
liniowe gdy analizujemy małe róznice fluorescencji (np. ilośc DNA w cyklu kom).

A) B)

A) Z lewej puls jednej komórki, z prawej puls 2 komórek

B) bramka na populacji charakterystycznej dla komorek które przechodzą pojedynczo (wykres z lewej z A)

Fluorochromy tandemowe  jeden fluorochrom przekazuje energie drugiemu i dopiero drugi emituje światło.

Białka fluorescencyjne np.: EGFP (z meduzy; ma zastosowanie do znakowania różnych komorek ssaczych), CFP,
Gdy używamy dwóch flourochromów których widma na siebie zachodzą. Do kompensacji spektrów fluorochromów
musimy mieć komórki wyznakowane tylko jednym fluorochoromem.

W lewym dolnym rogu to komórki które nie wykazują emisji fluorescencji.

Spillover – zachodzenie fluorescencji z jednego kanału do innego

Po lewej źle skompensowana, po prawej lepiej
Średnia intensywność fluorescjencji – mówi nam o intensywności fluorescencji która jest proporcjonalna do ekspresji
makrkera na komórce
Ładunek (+ lub -) umożliwia przesuniecie drogi przepływu okreslonych komorek i ich sort

Przy uzyciu 3 laserowego analizatora można analizować 4 populacje komorek

ĆWICZENIA 2:

INDEKS ŚWIECENIA  ,,bright”;

INDEKS ZNAKOWANIA – obrazuje nam różnicę między próbą negatywna i pozytywna w danej populacji; Im wieksza
roznica miedzy tymi dwoma populacjami tym lepszy jest fluorochrom dla naszych potrzeb i silniejsza siła znakowania;

Negatywna populacja może mieć rożny zasięg i w specyficznym świecieniu należy uwzglednic udział tła  komórki
nieznakowane – autoffluorescencja; receptory dla fragmentow fc immunoglobulin; nakładanie się spektrów
fluorescencji z inna fluorescencją;

SZUMY ELEKTRONICZNE – wynika z konstrukcji samej aparatury i neimoznosci przekraczania pewnych zalozeń
technicznych (filtry, rozmieszczenie detektorów itp.)

Im więcej analizujemy kolorów tym więcej nałożonych emisji będziemy mieć  nakładanie się to ,,spill-over”;
Silny marker – jego ekspresja w błonie jest duża;

Słaby marker- niska ekspresja;

Do silnego markera bierzemy słaby fluorochrom a do słabego markera silny fluorochrom!

PE – fikoerytryna; FITC- fluoresceina;
A) Nieprawidłowo ustawiona kompensacja
B) Prawidłowa kompensacja
Kompensacja nie zależy od intensywności świecenia; ale zależy od spektrów emisji oraz wyboru fluorochromow;

KOMPENSACJA NA KULKACH KALIBRACYJNYCH

!!!!
Kontrola izotypowa  Kom wyznakowane izotypem przeciwciała, taka sama jak klasa przeciwciała specyficznego
REKOMENDOWANE KONTROLE:

Kontroli izotypowej zazwyczaj nie używamy, ale czasami się taka kontrole też bierze;

Kontrola negatywna jest obligatoryjna we wszystkich eksperymentach!!!

Bardzo wazna kontrola gdy znakujemy nasze komórki różnymi fluorochromami!

FMO –analizy w których kolejno brakuje jednego z fluorochromów;  stąd ,,minus one” 😉
Brefeldyna – hamuje transport bialek do aparatu Golgiego;

Monensyna – zatrzymuje bialka w aparacie Golgiego ale jest toksyczna dla komórek;
Log – uwidacznia słabe sygnały, kompresuje silniejsze;

Biexponencjalna skala łączy skale liniowa i log jakby;

Dodany musi być fluorochrom umożliwiający zróżnicowanie komorek żywych od martwych! (2)
  tymocyty tu są!

Barwniki polimerowe – większość z nich jest wzbudzają laserem UV lub fioletowym;

Barwniki polimerowe – sa bardzo silnymi barwnikami;

MARTWE- silnie świecące tu będą! 10-20 razy silniej;

Nanokryształy – ich zastosowanie zwiększa możliwości badania różnych markerów;

ĆWICZENIA 3:
Mleczna warstewka na granicy faz  ffrakcja leukocytów mononuklearnych (leukocyty, monocyty?)
TAK 😊 ale najpierw musimy zacząć od znakowania pośredniego, a dopiero później bezpośredniego ale ogolnie to
staramy się tego unikać;
 wykazuje powinowactwo do fosfatydyloseryny która w
żywych kom znajduje się wewnątrz, natomiast w kom apoptotycznych jest weksponowana na zewnątrz błony;
Aneksyna V- Wczesna faza apoptozy

Jodek propidyny – znakuje komórki które majajuż zaburzoną integralność błony (późna apoptozy faza)
Subpik G0/G1  ma mniej DNA niż kom diploidalna  komórki nekrotyczne albo apoptotyczne to są (mają mniej
DNA);
W żywych komórkach jest CFSE, a przed wejściem do komórki jest CFDA-SE (enzymy zmieniają);