―134― 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月 134-150

コ ウジ酸 の メ ラニ ン生 成 抑 制 作 用 と各 種 色 素 沈 着 症 に

対 す る治 療 効 果

三 嶋 豊*芝 田 孝 一 瀬 戸 英 伸
大 山 康 明 波多江 慎 吉

コウジ酸(KA)の メラニ ン生成抑 制作 用 を基礎 的な らび に臨床 的 に検 索 した。 マ ウスB

16メ ラ ノーマ細胞 か ら抽 出 したtyrosinaseの 活性 は添 加KA濃 度 に依 存 して抑 制 され た。
DOPAchromeか らDHIを 経 由す る メラニ ン重合 体形成 過程 に おい て,KAは 更 にDHIに
直接 的 に反 応 し中間代 謝物 を形 成す る こと によ り抑 制的 に働 くことが 見出 された 。培 養B16
細 胞系 でKA 2.5mM添 加 に よ り,tyrosinase活 性 の低 下 と共 に細 胞 は 白色化す る 。なお,
この細 胞 をKA無 添加 の新 鮮培養 液 で更 に培養 す る とtyrosinase活 性 お よび メラ ニン生成
は回復 した 。黒色 金魚 を0.15%KA添 加 水 中で54日 間 飼育 す ると槌 色 し黄 淡褐 色へ と変化
した。 これ らKA群 の 金魚 皮膚 のtyrosinase活 性 は,対 照群 の18.2%に 低下 した。有 色 モ
ルモ ッ トで 紫外線 照射 誘導 色素 沈着 もKA塗 布 に よ り濃度依 存 的に抑 制 された 。本 邦人男
性31名 お よび女性46名 の ボラ ンテ ィアの上 腕 内側 に紫外 線 を照 射 し,1%KAク リーム を
塗 布 し,男 性90.3%,女 性75.5%のKAク リーム塗布 部位 の色素 沈着 が 明 らか に抑 制 され
た。以 上の 基礎的 知見 も基 に,1%ま た は2.5%KAク リーム を肝 斑,日 光性 お よび 老人性
黒 子,炎 症 後 色素沈 着 な らび に雀卵 斑 の患 者 に2カ 月以上 適用 し,合 計204例 で臨 床効 果 を
調 べ た。 有効 以 上 の例 は93例(45.6%)や や有 効以 上 は151例(74.0%)で あ った が,KA
1%と2.5%の 両 群の 有効 率 には大差 が なか った。

キ ーワー ド:コ ウジ酸-メ ラ ニン生成 抑制 剤-肝 斑− メラ ニン重合 体-美 白剤

Yutaka MISHIMA, M.D. and Hidenobu SETO, M.D.

Yasuaki OHYAMA, Ph.D. 神 戸 大学 医学部 皮膚 科学 教室
三 嶋 皮 膚 科 学 研 究 所(主 任:三 嶋 豊 所 長) (主 任:三 嶋 豊 教 授,現 主 任:市 橋 正 光 教 授)
〒650神 戸 市 中 央 区 元 町 通3-17-8-801 〒650神 戸 市 中 央 区 楠 町7-5-1
Takakazu SHIBATA, M.D. Shinkichi HATAE
神 戸 海 星 病 院 研 究 所*・ 皮 膚 科* 三 省製 薬株 式会社 生物 薬理 研究 室
(主任:三 嶋 豊所 長 ・部 長) 〒816福 岡 県 大 野 城 市 大 池2-26-7
〒657神 戸 市 灘 区 篠 原 北 町3-11-15 平 成6年1月22日 掲 載決定
 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月 ―135―

阻 害 す る こ と を見 出 した 。 これ ら の基 礎 的 所 見 に基
緒 論 づ い て,肝 斑 を は じめ とす る各 種 色 素 沈 着 症 に 対 し

日常 診 療 に お い て,肝 斑,雀 卵 斑 を は じめ とす る 1%お よ び2.5%KAク リー ム を 使 用 し,そ の 効 果

色 素 沈 着 症 を 診 療 す る機 会 は 比 較 的 多 い 。 しか し, を解 析 し,有 効 性 を 確 認 す る こ と が で き た の で 併 せ

そ の 治 療 法 は,ほ と ん ど の 施 設 に お い て,増 悪 因 子 報 告 す る。
の1つ で あ る 日光 照 射 を避 け る よ う指 導 し,さ ら に,
材料と方法
遮 光 ク リー ム の 外 用 を 勧 め,ビ タ ミ ンC,グ ル タチ

オ ン 等 の数 少 な い 治 療 薬 剤 内 服 を気 長 に 続 け させ る 1.材 料

と い う非 常 に消 極 的 な 治 療 と な っ て い るの が 現 状 で コ ウ ジ 酸(KA)

あ る 。 ほ とん ど の 色 素 沈 着 症 の 病 変 部 位 は 限 局 して 本 研 究 に用 い たKAは,Aspergillus albus MA

い る の で,病 変 部 位 に の み 作 用 す る有 効 な 外 用 薬 の 18の 変 異 種 の 培 養 液 に グル コー ス を 加 え て 発 酵 さ

出 現 が 望 まれ て い る 。 以 前,monobenzylether of せ,菌 体 を 分 離 後,濃 縮 して 折 出 したKAを 水お

hydroquinone含 有 軟 膏 の 使 用 が試 み られ た が,長 よび 酢 酸 エ チ ル で 再 結 晶 させ て 得 た 。 得 られ た

期 間 使 用 中 に 難 治 性 脱 色 素 斑 が 生 じ1,2),我 が国 KAの 純 度 は,紫 外 部 吸 光 度 法 に よ っ て99.9%以 上

に お い て は 使 用 が 禁 止 され る に 至 って い る。 こ の よ で あった。

うな 細 胞 障 害 性 が な く,可 逆 的 か つ 特 異 的 に メ ラ ノ A.基 礎 的実験

サ イ トの機 能 を 抑 制 す る 外 用 薬 の 出 現 が 望 ま れ て い 1.分 離 したB16細 胞 由 来tyrosinase抽 出液

る。 培 養 した マ ウス メ ラ ノ ー マB16細 胞 を,リ ソ酸 緩

Kojic acid (KA)は,コ ウ ジ発 酵 液 の 中 か ら分 離 衝 生 理 食 塩 水(PBS(-))で 洗 浄 後,細 胞 を集 め,

同 定3)さ れ た γ-ピ ロ ン化 合 物(Fig.1)で あ る。 0.5%デ オ キ シ コール酸 ナ トリウム水溶 液 に懸 濁 さ

我 々 は,KAの メ ラ ニ ン生 成 抑 制 効 果 を,ま ず, せ,凍 結 ・融 解 後,ホ モ ゲ ナ イ ズ し,700×G(10

哺 乳 動 物 の 色 素 細 胞 か ら分 離 したtyrosinaseに 対 分 間)つ い で11,000×G(15分 間)で 低 温下遠 心 分

す る 抑 制 作 用,黒 色 金 魚 の 淡 色 化 作 用,紫 外線によ 離 し,上 清 分 画 を 採 取 し,tyrosinase抽 出液 と した 。

りモ ル モ ッ トに 誘 導 した 色 素 沈 着 抑 制 効 果,つ いで 2.培 養B16マ ウ ス メ ラ ノー マ 細 胞

ヒ トで の 紫 外 線 誘 導 色 素 沈 着 の 抑 制 作 用 に よ り実 証 神 戸大学 医学 部皮 膚科 学教室 におい て継代 維持 さ

した の で 報 告 す る 。 更 に,KAは メ ラニ ン生 成 の 前 れ た 細 胞 を,10%ウ シ胎 児 血 清 添 加Eagle's Mini-

駆 ・単 量 体 で あ るdihydroxyindole (DHI)に も直 mum Essential Medium培 養 液(日 水 製 薬)で,

接 作 用 し,そ れ よ り の メ ラ ニ ン ポ リマ ー の 生 成 を も 37℃, 5% CO2条 件 下 で 培 養 した 。

3.黒 色 金魚

市 販 の黒 色 出 目金(Black Moor,体 重 約5g)を

購 入 し,1水 槽 当 た り7Lの 飼 育 水 中 に10匹 を 入 れ

水 温22±2℃,人 口照 明 下 明 暗12時 間 周 期 で 飼 育 し

た 。 飼 育 水 は 水 道 水 を4日 毎 に 交 換 した 。

4.有 色 モル モ ッ ト

全 身 の 被 毛 が 赤 茶 色 のEnglish種 の雌 また は雄

性 モ ル モ ッ ト(体 重370g∼460g,九 動(株)飽託 郡,

熊 本 県)を,温 度20±1℃,温 度55±10%,明 暗12

時 間 周 期 の 条 件 下 で 飼 育 した 。3週 間 の訓 化 飼 育 後,

Fig. 1 The Chemical Structure of Kojic Acid 実 験 に使 用 した 。

 ―136― 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月

5.ヒ ト紫 外 線 誘 導 色 素 沈 着 試 験 DOPAchromeの リ ン酸 緩 衝(0.1M, pH6.0)

健 常 な 男 性31名(25∼65歳)お よ び 女 性46名(20 溶 液 にKA (1mM)を 加 え て30℃ で イ ンキ ュ ベ ー

∼55歳)の ボ ラ ンテ ィアの右腕 内側 を用 いた。 紫外 ト後,HPLCを 用 い てDOPAchromeお よ びDHI

線 照 射 に は 紫 外 線 ラ ン プFL20S・BLB(東 芝)2 を 測 定 し た。 ま た,反 応 液 を30,000×G,20分 間遠

本 お よ びFL20S・E30(東 芝)2本 を用 いた。 本試 心 分 離 し た沈 査 の メ ラニ ン ポ リマ ー量 を,伊 藤 ら の

験 に は,KAを1%配 合 した ク リー ム お よ びKAの 方 法5)に 準 じて,加 水 分 解 後 のpyrole tricarboxy-

み 含 有 し な い 同 処 方 の プ ラセ ボ ク リー ム を 用 い た 。 lic acid (PTCA)量 と して 測 定 した 。

本 ク リー ム に は,紫 外 線 吸 収 剤 を 配 合 しな か った 。 ドー パ ク ロ ム,メ ラニ ン単 量 体 は 次 の 条 件 の 高 速

6.試 薬 液 体 ク ロマ トグ ラ フ ィ(HPLC)に よ っ て測 定 した 。

Dihydroxyindole (DHI)は,藤 田保健 衛生 大学 ・ カ ラ ム:Tsk gel ODS 80TM 4.6mm×15cm

伊 藤 祥 輔 教 授 か ら恵 贈 され た 。DOPAchromeは, 移 動 相:(A) 0.1% TFA+10%ア セ トニ ト リル

Arocaら の 方 法4)に した が っ て,3,4-dihydroxy- (B) 0.1% TFA+50%ア セ トニ ト リル

phenylalanine (DOPA,ナ カ ライ テ ス ク(株))1mol Aか らBに30分 間 でlinear gradientと

と過 ヨ ウ素 酸 ナ ト リウ ム2molを 混 合 して 用 時 に 作 した 。

製 した。 検 出 器:紫 外305nm

B.臨 床 試験 3.培 養B16細 胞 の メ ラ ニ ン生 成 抑 制 作 用 お よ び

1.対 象 回復

昭 和60年 か ら63年 の 間 に 神 戸 大 学 付 属 病 院 皮 膚 科 予 備 試 験 に よ りB16細 胞 の増 殖 に影 響 を与 え な

を受 診 しKAク リー ム を2カ 月 以 上 外 用 した103例, いKAの 濃 度 を2.5mMと 決 定 した 。2.5mMKA

な ら び に 平 成4年 か ら平 成5年 の間 に神戸 海星 病院 添 加 培 養 液 で5日 間 培 養 した 。 コ ン フル エ ン トに な っ

皮 膚 科 を 受 診 しKAク リー ム を2カ 月以 上外用 し た 細 胞 を 継 代 培 養 処 置 す る と と も にKA無 添 加培

た111例 の 色 素 異 常 症 の 患 者 を 対 象 と した。 養 液 に変 更 して 更 に5日 間 培 養 した 。 細 胞 を 集 め,

2.薬 剤 遠 心 分 画6)に よ っ てsubcellular fractionsを 作製

KAを1%ま た は2.5%配 合 した 親 水(O/W)ク し,そ れ ぞ れ のtyrosinase活 性 を測 定 した 。 ま

リー ム を 使 用 した 。 な お,本 ク リー ム は,ク リー ム た,KA添 加 培 養5日 後 に4%グ ル タル アル デ ヒ ド

基 剤 を構 成 す る水 性 成 分,油 脂成 分 お よび界面活 性 お よび1%四 酸 化 オ ス ミ ウ ム で 各1時 間 固 定 し,型

剤 の 他 に オ キ シ ベ ン ゾ ン系 紫 外 線 吸 収 剤 お よ び β- 通 り脱 水 して エ ポ キ シ樹 脂 に 包 埋 し,薄 切 して 電 子

サ イ ク ロ デ キ ス ト リ ンを 含 有 して い る。 顕 微 鏡(日 本 電 子(株)JEM1200EX)で 観 察 した。

II.方 法 DOPA反 応 は グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド固 定 後,50mM

A.基 礎 的実験 L-DOPA溶 液 で37℃ 下3時 間 イ ン キ ュ ベ ー トして

1.Tyrosinase活 性 の 測 定 お よ びKAに よ る直 接 行 った。

抑制 作用 4.黒 色 金魚 の槌 色作用

Tyrosinase抽 出 液,基 質 と して0.1Mリ ン酸 緩 衝 黒 色 金 魚 を0.15%KA添 加 水 中 で飼 育 し,裾 色

液(pH6.8)に 溶 解 した10mM L-DOPAお よび リ 効 果 を 観 察 す る と と も に,54日 後 に 屠 殺 して,鱗 片

ン酸 緩 衝 液 の3者 を 等 量 混 合 して,37℃ で イ ンキ ュ のtyrosinase活 性 を 測 定 した 。
ベ ー ト しな が ら475mmに お け る 吸 光 度 を1分 毎 に測 5.モ ル モ ッ ト色 素 沈 着 抑 制 作 用

定 した 。KAは,リ ン酸 緩 衝 液 に溶 解 して 添 加 した 。 有 色 モ ル モ ッ ト9匹 の 背 部 被 毛 を 電 気 カ ミ ソ リで

2.ド ー パ ク ロ ム か ら メ ラ ニ ン ポ リマ ー 生 成 過 程 へ 剃 毛 し,紫 外 線 ラ ン プ(FL20S・E30,東 芝)3本

のKAの 作用 を 用 い て10cmの 距 離 か ら2分 間 紫 外 線 を 照 射 した 。

 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月 ―137―

紫 外 線 照 射 は3日 毎 に合 計4回 行 っ た。KAは プロ B.臨 床試 験

ピ レ ン グ リ コー ル と エ タ ノ ー ル(9:1)混 合液 に 1.外 用方 法
溶 解 し,そ の0.1m2を 最 初 の 紫 外 線 照 射 日 か ら1日 1日2回(朝 ・就寝 前),ま ず 左側 のみ単 純 塗 布
2回,1週 間 に5日 間 塗 布 した 。 な お,紫 外 線 照 射 させ,効 果 を 自覚的 な らび に他 覚的 に認 め得 た時 点
直 前 に は微 温 湯 で 塗 布 したKAを 洗 い 流 し,照 射 で両側 に塗 布 させ た。併用 内服 薬 は可能 な限 り使用
終 了後,再 びKAを 塗 布 した 。 色 素 沈 着 度 を 明 度 を避 けた が,外 用 開始 前 よ り使 用 して い る場 合 はそ
(色彩 色 差 計:ミ ノル タCR-200)に よって測定 し の まま続 け させ た。外 用 後の化 粧 は許可 した。
た 。 個 体 に よ って 皮 膚 の 元 々 の 色 素 沈 着 度 が 異 な っ 2.経 過観 察
て い る の で,各 個体 について無 処 置部位 の 明度測 定 1カ 月 に1回 の割 合で 来院 させ ること を原則 と し
値 か ら各 紫 外 線 照 射 部 位 の 明度 測 定 値 を 差 し引 い た た。 その際,初 診 時 と比較 して色素 沈着 の改善 度 を
値 を 各 個 所 の 明 度 差 と した 。 観 察 し,可 能 な限 り写 真撮 影 を行 った。
6.ヒ ト紫 外 線 誘 導 色 素 沈 着 試 験 3.効 果判 定
ボ ラ ン テ ィ ア の 上 腕 内 側 に1.5×1.5cmの 照 射部位 治療 効果 を下記 の5段 階 に分 け て同一 医師 が判 定
2カ 所 を設 定 し,紫 外 線 ラ ソ プ(FL20S・BLB×2 した。
本,FL20S・E30×2本)を 用 い て,0.88J/cm2を 色素 沈着 が
1日1回,連 続3日 間 照 射 した 。 各 照 射 部 位 の1カ 著 し く軽 減 また は完全 に消退 著 効
所 に1%KAク リー ム を 他 方 に プ ラ セ ボ ク リー ム か な り軽 減 有 効
を 塗 布 した 。 塗 布 は,1日3回(朝,夕,夜)紫 外 や や軽減 やや 有効
線 照 射 開 始 日 か ら ボ ラ ンテ ィア が 各 自 で 行 っ た 。 但 不変 無 効
し,紫 外 線 照 射 日 の3日 間 は,紫 外 線 照 射1時 間前 増強 悪 化
に塗 布 し,照 射 直 前 に ぬ る ま湯 で 洗 い流 して 紫 外 線

を 照 射 し,照 射 終 了 直 後 に再 び 塗 布 した 。 色 素 沈 着
結 果

度 は,1週 毎 に 肉 眼 的 に 下 記 基 準 に した が っ て 判 定 1.基 礎 的実験

した 。 ま た,両 塗 布 部 位 の 色 素 沈 着 度 を 比 較 して, 1.分 離 したB16細 胞 由 来tyrosinase活 性 のKA

そ の 差 を 下 記 基 準 に 従 っ て 判 定 した 。 な お,判 定は に よ る直 接 抑 制

判 定 者 に 塗 布 ク リー ム を 知 らせ な い で 行 っ た 。 B16細 胞 か ら分 離 した 分 画 のtyrosinase活 性 は,

〔色 素 沈 着 度 基 準 〕 添 加KA濃 度 依 存 的 に 抑 制 さ れ た(Fig.2)。

色 素 沈 着 の程 度 評点 2.ド ー パ ク ロ ム か ら メ ラ ニ ン ポ リマ ー 生 成 過 程 へ

な し 0 のKAの 作用

軽 微 1 ドー パ ク ロ ム 溶 液 の イ ン キ ュベ ー トに よ り,溶 液

軽 度 2 中 の ドー パ ク ロ ム 濃 度 は180分 ま で 漸 次 減 少 した 。

中等度 3 これ と相 関 して,DHI濃 度 は,90分 後 まで 漸 次 増

高 度 4 加 し,以 後 概 ね 一 定 濃 度 を 保 った 。 同 時 に メ ラ ニ ン

〔色 素 沈 着 度 比 較 の 基 準 〕 ポ リマ ー 濃 度 は増 加 した(Fig.3A)。 こ の反 応 系

評点 にKAを1mM添 加 す る と,ド ー パ ク ロ ム濃 度 は

著 明 に差 があ る 1 漸 次 減 少 し,DHI濃 度 が90分 後 ま で 増 加 し以 後 一

明 らかに差 が あ る 2 定 濃 度 を保 つ も の の,メ ラ ニ ン ポ リマ ー は 形 成 さ れ

わず かに差 が あ る 3 な か った(Fig.3B)。

差 が ない 4 DHI溶 液 にKAを 添 加 して イ ンキ ュ ベ ー ト した
 ―138― 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月

場 合 のHPLCの ク ロマ トグ ラ ム に は,保 持 時 間11 4.黒 色 金 魚 のKAに よる メラニ ン色素減 少

分 付 近 に,KA無 添 加 時 に は 見 られ な か っ た ピー ク 金 魚 外 観 の 色 調 は,開 始 時 の 深 い ビ ロー ド黒 が,

が 出 現 し,イ ン キ ュ ベ ー ト時 間 と と も に 増 大 し た KA添 加 飼 育に よ っ て,茶 褐 色 を 経 て,黄 色味 を帯

(Fig.4)。 本 反 応 液 で は,対 照 と 異 な り,メ ラニ び た 薄 い 褐 色 へ と 変 化 し た(Fig.7)。 褐 色 は,

ン ポ リマ ー の 形 成 が 認 め られ な か っ た。 KA添 加10日 後 頃 か ら見 られ,以 後,期 間 を経 るに

3.KAに よ る培 養B16細 胞 の メ ラ ニ ン生 成 抑 制 作 つ れ て 増 加 し,50日 後 に は 全 例 に 及 ん だ(Table 1)。

一方
用 ,対 照 のKA無 添 加 群 で は,1匹 のみ にわず

2.5mMKA添 加 培 養 したB16細 胞 の細 胞 ペ レ ッ か な 槌 色 が見 ら れ た もの の,他 の金 魚の体 色 に変化

トは 時 間 依 存 性 に 白色 化 し,各 細 胞 分 画 のtyrosin- は認 め られ な か っ た 。54日 後 の 生 存 金 魚 の 鱗 を 全 て

ase活 性 も添 加 後 早 急 に低 下 した(Fig.6A)。 白 集 め て,tyrosinase活 性 を 測 定 した 。KA添 加群の

色 化 した 細 胞 で は,電 顕 的 に メ ラ ニ ン化 した メ ラ ノ 酵 素 活 性 は,対 照 の18.2%に 減 少 して い た 。

ソー ム の 著 減 が 見 ら れ た(Figs.6B,C)。 他 の細 5.モ ル モ ッ ト色 素 沈 着 のKAに よ る抑 制

胞 内膜 系 および細 胞 内小器 官 に明確 な変化 は見 られ 紫 外 線 照 射 部 位 へ の 色 素 沈 着 は,最 初 の紫外 線照

なか った。 射 の2日 後 に は わ ず か に 認 め ら れ,そ の後 徐 々に増

これ らの 白 色 化 した 細 胞 をKA無 添加 の新 鮮培 強した。 紅 斑 は 肉 眼 的 に 認 め ら れ な か っ た 。KA塗

養 液 で 更 に培 養 す る と,3日 後 に は 細 胞 ペ レ ッ トの 布 部 位 で は,溶 媒 の み を 塗 布 した 対 照 よ り も 濃 度 依

色 お よ び タ イ ロ シ ネ ー ス活 性 と も に 培 養 開 始 時 と 同 存 的 に 色 素 沈 着 が 抑 制 され た(Fig.8A)。 色差の

じ レ ベ ル に 回 復 し,KAに よ る 白色 化 は可 逆 性 を 有 値 は 肉 眼 的 所 見 を 反 映 して,13日 後 以降有 意 に色素

す る こ と が判 明 した 。 沈 着 が抑 制 され て い た(Fig.8B)。

Fig. 2 Dose Dependent Suppression of Mammalian Tyrosinase Extracted from

B-16 Cells by Kojic Acid
 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月 ―139―

6.ヒ ト紫 外 線 誘 導 色 素 沈 着 のKAに よ る抑 制 と2.5%KAク リー ム の 成 績 を 比 較 す る と,有 効 以

プ ラ セ ボ 部 位 お よ びKA部 位 の色 素沈着 度 をブ 上 の 例 は1%KA群 で57%,2.5%KA群 で36%と

ラ イ ン ドで 比 較 し判 定 したKAク リー ム,の 有 効 ほ ぼ 同 等 の 有 効 率 を 示 した 。 疾 患 別 の 有 効 率 も

率 は 男 性90.3%,女 性75.5%で,明 ら か な色 素 沈 着 KA濃 度 に よ る差 は 見 られ な か っ た 。1%KA群

抑 制 作 用 を 示 した(Figs.9A,B)。 と2.5%KA群 の 両 群 で 総 合 して,疾 患 別 に有 効 度

II.臨 床 効 果 の 高 い も の か ら順 次 列 挙 す る と,肝 斑,炎 症後 色素

全 合 計204例 にKAク リー ム を用 い て,著 効11.8 沈 着,日 光 性 お よ び 老 人 性 黒 子,雀 卵 斑 とな っ た

%,有 効33.8%,や や 有 効28.4%で,合 計74.0%に (Figs.10A,B)。

何 らか の 改 善 が 認 め られ た 。 逆 転 例 は 見 ら れ な か っ 副 作 用 は,軽 微 な 発 赤 ・〓 痒 が 合 計8例3.9%に

た 。 効 果 発 現 まで の 期 間 は,改 善 の 見 られ た 症 例 の 見 られ た 。 ま た投 薬 の 中 止 に よ り速 や か に消 退 した 。

90%以 上 で4カ 月 以 内 に 効 果 が 生 じた 。1% KA 症 状 の 軽 快 後,2例 に パ ッチ テ ス トを施 行 した が,

Fig. 3 Kojic acid exhibits direct inhibitory action

in vitro on the formation of melanin polymer
measured by PTCA method.
―140― 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月

Fig. 4 Direct inhibition of melanin polymer formation by kojic acid has

been found to be due to the formation from DHI of new inter-
mediate whose peak is seen at retention time 11 minutes.

Fig. 5 Schematic Representation of the Inhibitory Action of Kojic

Acid in the Process of Eu-melanin Polymer Formation through
DHI Metabolic Pathway
 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平成6年 ・4月 ―141―

A B

Fig. 6 A Inhibitory and De-pigmenting Action

of Kojic Acid on Cultured 13-16 Cells

(above) Which is Accompanied by

the Parallel Suppression and Re-

covery of Tyrosinase (below)of Their

Various Subcellular Fractions

B The Electron Micrograph of Control

13-16 Cell Exhibiting the Formation of

Various Stages of Melanosome -

: 2ƒÊm

C Electron Micrograph of Kojic Acid-in-

duced De-pigmented B-16 Cells Reveal-

ing Almost Complete Disappearance

C of Melanosome Formation - :
2ƒÊm

Fig. 7 Control Black Moor Goldfish and

Kojic Acid-treated Hypo-pigmented
Goldfish (above) after Being Main-
tained in Fish Tank Containing
0. 15% Kojic Acid for 54 Days.
This effect is accompanied with
parallel decrease of tyrosinase ac-
tivity (below) in the integument.

Table 1 In vivo De-pigmenting Effect of Kojic Acid (KA) on Black Moor Goldfish
―142― 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・ 平 成6年4月

Fig. 8A Inhibitory effect of kojic acid/propylene glycol • ethanol solution (KA 1%, 3%,
5%) on UVB induced melanin hyper-pigmentation can be demonstrated in guinea
pigs. Dose dependent inhibition is seen.
Fig. 8 B Time course of kojic acid' s dose dependent inhibitory effect on UV-induced
hyper-pigmentation revealed by "lightness" measured by colorimeter. *: p<0.05.
 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・ 平成6年4月 ― 143―

Fig. 9 A Inhibitory effect is clearly demonstrated in UV-induced pigmentation on flexor

surface of upper arm of human volunteer obtained by 1% kojic acid cream as
compared to placebo.
Fig. 9 B Summary of Inhibitory Effect on UV-induced Hyper-pigmentation from 77
Volunteers (see Fig. PA)
ffectiveness is clinically
E evaluated after application of 1% kojic acid cream for 21
days.
 ―144― 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月

Fig. 10 Clinical Evaluation of 1% (A) and 2.5% (B) Kojic Acid Cream on Various
Hyper-Pigmentation Disorders
 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平成6年4月 ―
145―

A B
Fig. 11 Case 1: Chloasma Occurring on a 38-Year-Old Female
Before treatment (A). After 1.9 months application of 1% kojic acid cream twice daily (13).

A B
Fig. 12 Case 2: Chloasma Occurring on a 54-Year-Old Female
Before treatment (A). After 2 years and 4 months application of 1% kojic acid cream
twice daily (B).

陰 性 で あ った 。 明 に 消 退し て い る。

以下 代 表 的KA著 効例 を 示す。 (症 例2)

(症 例1) 54歳,肝 斑 の 症 例 で あ る本 症 例 は,初 診時 よ り

38歳,肝 斑 の 症例 で あ る。 初 診 時(Fig.11A)に 左 側 頬 部 の み 塗 布 さ せ,明 ら か な 効 果 を 認 め た6カ

比 べ,9カ 月 後(Fig.11B),1%KAク リー ム を 月 以 降 は.右 側 頬部およ び額 部 に も 塗 布 させ た 。 初

外 用 して い る 左 頬 部,特 に 血 管 腫下方の 色 素 斑 が著 診 時(Fig.12A)と2年4カ 月 後(Fig.12B)で あ

 ―146― 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平成6年4月

A B C

Fig-. 13 Case 3: Lentigo Senilis Occurring on Left Lower Cheek of a 54-Year-Old Female
Before tretment (A). After 10 months application of 196 kojic acid cream twice daily (13).
After 2 years 9 months application of 196 kojic acid cream twice daily (C).

る が,額,頬 部 の 色 素 斑 は 著 明に 消 退 し て い る。 も 報 告 され て お り,ま た,protein kinase Cな ど細

同 じ症 例 に 見 ら れ た 老 人 性 黒子 で あ る。 胞 情 報 伝 達 物 質 を 介 す る メラ ニ ン生 成 抑 制 も 見出 さ

初 診 時(Fig.13A)左 頬 部 に 見 ら れた 色 素 斑 は10 れ て い る13)。

カ 月 後(Fig.13B)や や 消退 し,2年9カ 月 後 前者 の グ ル ープ に 属 す る メ ラ ニ ン 生 成 抑 制 剤 は,

(Fig.13C)に は 著 明に 消 退 し て い る。 ま ず 分 離 し たtyrosinase活 性 の 直 接 的抑制 作 用に

よ っ て 評 価 さ れ て き た。 従 来 の美白 剤 の 研 究 は,ほ
考 察 と ん ど が こ の よ う な 分 離 したtyrosinaseの 直接 的

現 在 研 究 され て い る メ ラ ニ ン生 成 抑 制 剤 を 作 用 メ 抑 制 作 用 の み に よ っ て 評 価 さ れ て き て お り,生 きた

カ ニ ズ ム に よ っ て 分 類 す る と,2つ の グ ル ープ に 大 培 養 色 素 細 胞 や 実 験 動 物 に よ るin vivo系 におけ る

別 さ れ る7)。1つは分離 し たtyrosinaseの酵素 活 評 価 は 不十 分 であ っ たKAに 関 す る我 々の 現 在 ま

性 を 直 接 抑 制 す る タイプ で あ り,も う1つ は,分 離 で の一 連 の 実 験 で は,mushroom tyrosinase,黒 色

し たtyrosinase酵 素 に 直 接 抑 制 作 用 を 示 さ な い が, 金 魚 由 来 のtyrosinaseに お い てKAに よる分離 し

生 き た 色 素 細 胞 内 ではメ ラ ニ ン 生 成 を 抑 制 す る タイ たtyrosirlase活 性 の 直 接 的 抑 制 作 用 の 所 見を 先 に

プで あ る 後 者 に は,グ ル コサ ミンや ツニ カマ イ シ 呈 示 し,こ れ はKAに よ るtyrosinaseの 銅 イオ ン

ン の よ う にtyrosinaseのglycosylation・ 成 熟化 を キ レート作 用 に よ る こ と を 示 し た7)。 本 論文 に お

阻 害 し,そ のプ レ メ ラ ノ ソー ム へ の 細 胞 内 転 送 を 阻 い て は,さ ら にB16細 胞 由 来 の 分 離 したtyrosinase

害 す る 物 質8)お よ び一部 の 内 在 件 イ ン ヒ ビ タ ー9,10) で も 同 様 なKAの 抑 制 パ タ ー ン を 示 す と と も に,

な ど が 含 まれ る 最 近 で は 紫 外 線 な ど に 、よ
る メラ ニ 培 養B16細 胞 に お け るKAの 明らかな白 色化作 用

ン 色 素 沈 着 の亢 進11)に お け るendothelinの 関 与12) を 示 した,In vivo系 に お け るKAの メ ラ ニ ン生 成

 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月 ―147―

抑 制 作 用 を,上 述 の 各 種 分 離tyrosinaseお よび培 モ ッ トお よび ヒ ト上膊 皮 膚 に よ る生 化 学 的,電 顕 的,

養 細 胞 系 で の 所 見 を も と に 検 索 した 。 生 物 学 的 実 験 的 知 見 に 基 づ き,肝 斑 な らび に各 種 表

金 魚 皮 膚 に お い て は,色 素細 胞 は薄 い上皮 層 の直 皮 性 色 素 沈 着 症 に 対 す るKAの 臨 床 効 果 を追 求 し

下 に 存 在 し,そ の 色 調 が 肉 眼 的 に 明 瞭 で あ る の み な た 。 そ の 結 果,全 例 数204例 中 や や 有 効 以 上 の 数 は1

らず,鱗 片 を抜 去 す れ ば 顕 微 鏡 下 で 全 貌 を 容 易 に 直 51例(74.0%)で あ った 。 有 効 以 上 の 例 に限 定 す る

視 し得 る 。 そ の た め,金 魚 は脱 色 素 剤 の 評 価 系 と し と93例 で45.6%の 有 効 率 で あ っ た 。 な か で も炎 症 後

て 頻 用 さ れ て きた14,15)。MishimaとChavin16)は 色 素 沈 着 症 で は31例 中23例(74.2%)が やや有 効 以

黒 色 金 魚 に0.5%ハ イ ド ロ キ ノ ン水 溶 液 を 注 射 す る 上 で あ った。 この よ うに真皮性 の色 素沈 着症 で あっ

こ と に よ り,全 身 皮 膚 の 黄 色 化,メ ラ ノ フ ォア の 消 て も,そ の 初 期 段 階 で 投 与 す る こ と に よ り,メ ラニ

失 を報 告 して い る。 本 報 告 に お い て,我 々 は外用 お ン色 素 の 真 皮 へ の 新 た な供 給 を 抑 制 して,蓄 積 メ ラ

よ び経 口 で 投 与 す るた め,KAを 飼 育 水中 に溶解 さ ノ ソ ー ム のterminal ontogenyに よ る排 泄 活 性22)

せ た。KAの 毒 性 が 低 い の で,長 期 間 飼 育 して も金 と 相 ま っ て,臨 床 的 な 改 善 が 得 られ た 。KA 1%と

魚 の 死 亡 率 は 対 照 と ほ ぼ 同 等 で あ っ た。KAに よる 2.5%を 比 較 す る と有 効 率 に は 大 差 が な か っ た 。 従 っ

槌 色 効 果 を 得 るた め に は 長 期 間 を 要 した が,こ れは て,KAク リー ム の 安 定 性 と い う点 やKAの 溶 解度

メ ラ ノフ ォア内 の 大多 数 の メ ラ ノ ソー ム が成 熟 し の 極 限 ま で配 合 した こ と に よ る 結 晶 の 折 出 と い う点

たstage IVに あ る た め と 考 え られ る 。 しか し,50日 を 考 慮 す る と実 際 の 使 用 濃 度 は1%で も十分 で ある

後 に は 黒 色 金 魚 の ほ ぼ 全 例 が 槌 色 を 示 した と 考 え ら れ る。

(Fig.7)o コ ウ ジ酸 の 作 用 機 序 の1つ がtyrosinase酵 素の

KAのin vivoメ ラ ニ ン生 成 抑 制 は,赤 茶 色 モル 銅 を キ レー トす る こ とに よ る酵 素 の 不 活 性 化 に あ る

モ ッ トに お い て も 明 ら か に し得 た が,こ の 場 合,黒 と い う こ と は す で に 述 べ た7)。 さ ら に 最 近,メ ラ

色 金 魚 と 異 な り,そ の 作 用 はUVBに よ り誘 導 さ れ ニ ン単 量 体 よ り重 合 体 形 成 に至 る代 謝 径 路 が よ り明

る色 素 沈 着11)を 抑 制 す る実 験 系 で 確 認 し得 た 。 な らか と な っ て 来 て い る。 我 々 は 今 回 新 た にKAが

お,KAは ハ イ ドロ キ ノ ン軟 膏17)と 異 な り,遺 伝 DHIを 経 由 す る メ ラ ニ ン重 合 体 形 成 過 程 に お い て,

的 に 深 黒 色 の 非 紫 外 線 照 射 モ ル モ ッ トへ の 裾 色 作 用 直 接DHIと 反 応 し新 し い 中 間 代 謝 物 を 形 成 し,
は示 さなか った。 DHIの 重 合 体 形 成 を 抑 制 す る こ と を 見 出 した
モ ル モ ッ トに お け るKAの 色 素沈着 抑制 作用 と (Fig.5)。KAの 色 素 沈 着 症 に対 す る 治 療 効 果 は
ほ ぼ 同 様 に,本 邦 人 ボ ラ ン テ ィ ア 男 性31名 女 性46名 メ ラ ニ ン生 成 の 前 半 を 律 速 す るtyrosinase活 性の

の 上 腕 内側 で の 試 験 に お い て も,KAは 紫外 線誘 導 抑 制 の み な らずpost tyrosinase processの 抑制の

色 素 沈 着 に 対 して 明 ら か な 有 効 性 を 示 した が,正 常 両 者 に よ る も の と推 論 さ れ る。

色 皮 膚 に 対 す る脱 色 作 用 は 示 さ な か っ た 。
文 献
肝 斑 は 表 皮 基 底 層 メ ラ ノ サ イ トの プ レ メ ラ ノ ソー
1. 土 肥 淳 一 郎, 笹尾 信, 安斎 登, 望 月 英 彦, 外池
ム 内 メ ラ ニ ン ポ リマ ー 生 成 の亢 進 とそ れ ら成 熟 メ ラ
栄 一: ハイ ドロキ ノ ンモ ノベ ンチ ール エ ー テル含 有
ノ ソー ム の 隣 接 表 皮 細 胞 内 過 剰 蓄 積 を きた す 後 天 性 ク リー ム に よ る 色 素 異 常 症, 臨 皮 泌, 11:859-863,

表 皮 性 色 素 沈 着 症 で あ る18)。 当 時KAの メ ラニ ン 1957

生 成 機 序 は 未 解 明 の ま ま で あ った が,1%ま た は2. 2. 吉 田 良 夫, 薄場 真: Monobenzyl ether of hydro-

quinoneに よ る 白 斑 黒 皮 症, 臨 皮 泌, 12:333-
5%KAク リー ム で,肝 斑 を 中 心 に 観 察 した 外 用 効
338, 1958
果 が,伊 川 ら19),皆 見20)お よ び 中 山 ら21)に よ っ て
3. 藪 田 貞 次 郎: 麹 菌 に よ り生 産 せ ら る る1新 有機酸
報 告 され て い る 。 今 回,我 々 は 上述 の ご と き分 離
(〓 酸)に 就 て, 東 化, 37:1185-1223, 1916
tyrosinase,培 養 色 素 細 胞,金 魚,紫 外 線照 射 モル
4. Aroca P, Solano F, Borron JCG, Lozano JA: A
 ―148― 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月

new spectrophotometric assay for dopachrome 13. Oka M, Ogita K, Saito N, Mishima Y: Selec-
tautomerase, J Biochem Biophysic Methods, tive increase of the a subspecies of protein kin-
21:35-46, 1990 ase C and inhibition of melanogenesis induced
5. Ito S, Fujita K: Microanalysis of eumelanin and by retinoic acid in melanoma cells, J Invest Der-
pheomelanin in hair and melanomas by chemi- matol, 100:204S-208S, 1993
cal degradation and liquid chromatography, 14. Loud AV, Mishima y: The induction of melani-
Anal Biochem, 144:527-536, 1985 zation in goldfish scales with ACTH, in vitro; Cel-
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in neoplastic and dysfunctional human melano- 181-194, 1963
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the Melanocyte (Prota GD, Muhlbock O Eds) , melanized pigment cells in induced melanogene-
Springer-Verlag, Heidelberg, 1966, 133-155 sis, The Pigment Cell; Molecular, Biological
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8. Mishima Y, Imokawa G: Selective aberration the maintenance and proliferation of melano-
and pigment loss in melanosomes of malignant phores in the goldfish, Carassius auratus L,
melanoma cell in vitro by glycosylation inhibi- Anat Record, 137:382, 1960
tors; Premelanosomes as glycoprotein, J Invest 17. 橋本 晃, 市 橋 正 光, 三嶋 豊: Hydroquinoneの

Dermatol, 81:106-114, 1983 皮 膚 脱 色 素 機 序: In vivoお よ びin vitroで の 色素 細

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nogenic inhibitor in malignant melanomas, 析, 日皮 会 誌, 94: 797-804, 1984

Nature, 216:189, 1967 18. 三嶋 豊: 色 素 異 常 症, 基 本 皮 膚 科 学(小 嶋 理 一,

10. Ando S, Ando O, Suemoto Y, Mishima Y: Tyro- 三浦 修, 清寺 真 編), 医 歯 薬, 東 京, 1976,

sinase gene transcription and its control by mela- 433-504

nogenic inhibitors, J Invest Dermatol, 100:150S 19. 伊 川 知 子, 武 田 克 之, 山 本 忠 利, 高 橋 智 津 子: コウ

-155S ジ酸 配 合 製 剤 の使 用 経 験, 西 日皮 膚, 44:470-473,
, 1993

11. Imokawa G, Kawai M, Mishima Y, Motegi I: 1982

Differential analysis of experimental hypermela- 20. 皆 見 紀 久 男: 肝 斑 患 者 に 対 す る コ ウ ジ酸 配 合 製 剤 の

nosis induced by UVB, PUVA and allergic con- 使 用 成 績, 西 日皮 膚, 44: 474-478, 1982

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el, Arch Dermatol Res, 278:352-362, 1986 喬: Kojic acid外 用 に よ る 肝 斑 の 治 療, 臨 皮, 36:

12. Yada Y, Higuchi K, Imokawa G: Effects of endo- 715-722, 1982

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in human melanocytes, J Biol Chem, 266:18352 (清 寺 眞, 佐 野 栄 春, 久木田 淳, 山村雄 一 編),

-18357 15, 1版, 中 山, 東 京, 1983, 3-23
, 1991
 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月 ―149―

Inhibitory Action of Kojic Acid on Melanogensis

and Its Therapeutic Effect for Various Human
Hyper-Pigmentation Disorders

Yutaka Mishima* and Yasuaki Ohyama

Mishima Institute for Dermatological Research (Director: Prof. Y. Mishima)
3-17-8-801, Motomachi-dori, Chuo-ku, Kobe 650, Japan

Takakazu Shibata
Department of Dermatology*, Kobe Kaisei Hospital (Director: Prof. Y. Mishima)

Hidenobu Seto
Department of Dermatology, Kobe University School of Medicine

Shinkichi Hatae

Sansho Seiyaku Co. , Ltd. , Bio-Pharmacology Laboratory

Key words: kojic acid-melanogenesis inhibitors-chloasma-melanin polymerization-

skin whitening agent

We have investigated basic and clinical aspects of the melanogenesis inhibitory action of
Kojic Acid (KA). Isolated tyrosinase activity obtained from mouse B-16 melanoma cells has
been inhibited by KA dose dependently. KA has been found to inhibit melanin polymer
formation through the dihydroxyindole (DHI) metabolic pathway from dopachrome by directly
forming an intermediate through reaction with DHI.
The addition of 2.5mM KA to cultured B-16 cells induced whitening of cells accompanied
with decreased tyrosinase activities. This has been found to be a reversible process and the
B-16 cells can recover their tyrosinase activity and melanin forming ability after culturing in
fresh KA free culture medium.
Concerning in vivo effect, addition of 0.15% KA into the fish-tank of Black Moor goldfish in-
duced decrease of melanin pigmentation and converted the color of their integument from
black to yellowish-light brown in 54 days. Furthermore, 1%-5% KA propylene glycol-ethanol
solution dose dependently inhibited UV-induced pigmentation in brown guinea pigs. We then
tested 31 male and 46 female volunteers with UV-induced hyper-pigmentation on the flexor sur-
face of upper arm. Three applications of 1% KA cream per day for 21 days exhibited apparent
suppression of UV-induced pigmentation in 90.3% of the males and 75.5% of the females.
 ―150― 皮 膚 ・第36巻 ・第2号 ・平 成6年4月

On the basis of the above investigative studies, we have made clinical studies using 1% and
2.5% KA cream on chloasma, solar and senile lentigo as well as post-inflammatory hyper-pig-
mentation and ephelides. We have applied KA cream for more than 2 months in a total of 204
cases and evaluated its therapeutic effectiveness. Among these, 93 cases (45.6%) showed
"m
arkedly" or "moderately effective" results; 151 cases (74%) showed more than "slightly
effective." There is no distinct difference between 1% and 2.5% KA cream as to its clinical
effectiveness in suppressing hyper-pigmentation.