Họ và tên: Diêm Đăng Hoàng

MSSV: 20200235
Lớp: 716645 – chiều thứ 6
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HOÁ SINH
Bài 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN HOÀ TAN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY

I.Nguyên tắc của phương pháp Lowry

1.Nguyên tắc chung
-Phương pháp dựa trên cơ sở tạo màu giữa protein và thuốc thử
folin. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng
độ protein trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quạng
của dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa theo
đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử này, có thể dễ
dàng tính được hàm lượng protein của mẫu vật nghiên cứu.
-Đây là phương pháp rất nhạy và chính xác, được dùng phổ biến
để xác định protein.

2.Giải thích nguyên tắc

A. Giai đoạn 1: Phản ứng Biure
-Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide, tất cả các chất
có chứa từ hai liên kết peptide trở lên đều có thể phản ứng với
CuSO 4 trong môi trường kiềm mạnh tạo phức chất màu xanh tím
hoặc màu đỏ.
-Phức chất màu có cực đại hấp thụ ở bước sóng 540nm. Phản
ứng này được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng
protein. Độ nhạy phản ứng tăng lên nhiều lần khi có thuốc thử
Folin-Ciocalteau.

B. Giai đoạn 2: Thêm thuốc thử Folin-Ciocalteau

-Thuốc thử Folin-Ciocalteau có thành phần gồm
phosphomolipdic acid và phospho-vonframic acid. Các chất này
một mặt làm tăng độ nhạy phản ứng Biure, mặt khác phản ứng
với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein. Các gốc amino acid
này tham gia trong quá trình tạo phức chất màu. Phức được tạo
thành có màu xanh da trời, hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm.

II.Tiến hành thí nghiệm

1. Chuẩn bị hóa chất
-Thuốc thử Folin ( phòng thí nghiệm chuẩn bị sẵn).
-Dung dịch Na2 CO 3 2% pha trong NaOH 0,1N (dung dịch A).
-Dung dịch CuSO4.5H2O 0,5% pha trong dung dịch natri citrat
1% hoặc pha trong dung dịch Kali- Natri tartrat 1% (dung dịch
B).
-Hỗn hợp của dung dịch (A) và (B) pha theo tỉ lệ 50:1 trước khi
dùng (dung dịch C).
-Dung dịch gốc protein chuẩn: Albumin huyết thanh bò BSA: 1
mg/ml (Phòng thí nghiệm chuẩn bị sẵn)

2. Tiến hành thí nghiệm

A. Xây dựng đường chuẩn albumin cho phương pháp Lowry
-Bổ sung các hóa chất với lượng tương ứng theo bảng sau đây
Ống falcon 15ml 1 2 3 4 5 6
hoặc ống
nghiệm ngắn
Dung dịch BSA 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
gốc (ml)
Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Nồng độ BSA 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Ci (mg/ml)
Trộn đều bằng vortex thu được dãy ống BSA làm việc có nồng độ Ci

-Thực hiện dãy phản ứng 2 như sau

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch BSA 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Ci mg/ml (đã
chuẩn bị ở trên)
Dung dịch C 5 5 5 5 5 5
(ml)
Trộn đều để yên 10 phút
Dung dịch Folin 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
(ml)
Trộn đều bằng vortex, để yên 20-30 phút

-Đo độ hấp thu ánh sáng tại bước sóng 750 nm (OD 750 nm) với
mẫu đối chứng là mẫu trong ống nghiệm số 7.
-Vẽ đồ thị biểu thị mỗi tương quan giữa nồng độ BSA Ci
(mg/ml) và OD 750nm với trục tung là mật độ quang OD
750nm và trục hoành là nồng độ protein.

B. Phân tích mẫu (Mẫu đậu)

a. Chuẩn bị dịch protein cần phân tích
-Dùng ống đong chuẩn bị 20 ml NaOH 0,1N vào trong cốc dung
tích 100 ml
-Cân chính xác 0,3 g mẫu xúc xích; chuyển mẫu vào cối,
cho một ít dung dịch NaOH 0,1N từ cốc vào để làm ẩm.
-Nghiền nhuyễn mẫu; chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác
dung tích 100 ml.
-Tráng sạch cối chày bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại
-Đặt bình mẫu vào nồi đun cách thuỷ để chiết protein trong 15
phút
-Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà (tới pH 7) bằng HCl
0,1N (dùng đũa thủy tinh chấm dịch lên miếng giấy thử
pH và so với dải màu chuẩn).
-Chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức bằng nước
cất tới vạch. Trộn đều.
-Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích

b.Tiến hành phản ứng và đo hấp thụ

* Mẫu thí nghiệm:
+) Lấy vào ống nghiệm (khô, sạch):
 0,5 ml dịch lọc protein (dùng micropipet)
 5 ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1 mới pha)
(dùng micropipet). Trộn đều. Để yên 10 phút.
+)Cho tiếp 0,5 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc
bằng máy trộn Voltex). Để phản ứng 20 phút.

*Mẫu kiểm chứng (làm song song với mẫu thí nghiệm ):
+) Lấy vào ống nghiệm(khô,sạch):
 0,5 ml H2O (dùng micropipet)
 5 ml dung dịch C (dùng micropipet). Trộn đều. Để yên 10
phút.
+)Cho tiếp 0,5 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc
bằng máy trộn Voltex) Để phản ứng 20 phút.

*Đo độ hấp thụ ánh sáng và ghi kết quả

III. Kết quả

1.Xây dựng đường chuẩn albumin cho phương pháp Lowry
OD750nm 0 0,058 0,089 0,119 0,163 0,205
Nồng độ protein 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
(mg/ml)
 Đồ thị đường chuẩn dung dịch Albumin
0.25

0.2
f(x) = 0.195714285714286 x + 0.00780952380952384
R² = 0.991330894340433

0.15
OD 750nm

0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Nồng độ protein (mg/ml)

2.Phân tích mẫu

Mẫu Mẫu thí nghiệm Mẫu kiểm chứng
(đậu)
OD 750 nm Lần 1: 0,077 0
Lần 2: 0,097
Trung bình 0,087 0

3.Tính toán
-Phương trình đường chuẩn
Y=0,1957X+0,0078
Với:
+) Y là độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 750nm của mẫu (OD
750nm).
+) X là nồng độ protein (mg/ml).
=> Với y=0,087, tính được x=0,48 (mg/ml)

-Nồng độ protein tính theo công thức:

mpr
C i=
v ⅆd
(mg/ml)
Với :
+) C i là nồng độ protein (mg/ml)
=> Với x=C i=0,48, tính được mPr =Ci∗v =¿0,48*100=48 (mg)
=48*10−3 g
- Phần trăm hàm lượng protein có trong mẫu đậu là:
0 m pr
0
pr=
m xx
*100
=> mPr =48*10−3 g, tính được phần trăm protein trong mẫu đậu bằng
:
−3
0
pr = 48∗10 *100=16%
0 0,3

-Kết luận: Hàm lượng protein trong mẫu đậu là khoảng 16% (có
sai số do quá trình thực hiện các thao tác có thể không chuẩn).

IV.Một số vấn đề thảo luận

1. Lưu ý
-Khi cho thuốc thử Folin, cường độ màu sẽ phụ thuộc vào loại
protein cũng như độ tinh sạch của mẫu protein do nhiều chất có
khả năng làm tăng cường hay giảm cường độ màu phản ứng =>
gây sai số khi đo đạc.
-Phương pháp đòi hỏi duy trì môi trường phản ứng ở pH 10-10,5
cũng như nồng độ protein thấp

2.Câu hỏi
Câu 1:Tại sao phải bảo quan thuốc thử folin ở bình thủy
tinh màu, ở nơi lạnh
-Folin là hỗn hợp 2 chất oxy hóa mạnh nên cần tránh ánh sáng
và nhiệt độ để không bị oxy hóa (tăng khả năng bảo quản)

Câu 2: Na2CO3 trong dung dịch A có tác dụng gì trong bước

phản ứng của Phương Pháp Lowry?
-Dung dịch C gồm dung dịch A và dung dịch B (tỉ lệ 50:1, tỉ lệ
ổn định nhất đã được kiểm chứng bởi thực nghiệm) trong đó
dung dịch A chứa Na2CO3 2% trong NaOH và dung dịch B chứa
dung dịch CuSO4,.5H2O 0,5% pha trong dung dịch Natri citrat
1% hoặc pha trong dung dịch Kali- Natri tartrat 1%.
-Khi thêm C và trộn đều để trong 10p các ống nghiệm chứa
protein hòa tan sẽ xảy ra phản ứng màu Biuret.
- Na2CO3 đóng vai trò làm ổn định dung dịch CuSO4, làm chất
đệm dung dịch giúp duy trì , ổn định pH của môi trường tạo điều
kiện cho phản ứng Biure xảy ra. ( phản ứng màu Biure xảy ra
trong điều kiện môi trường base).

Câu 3: Tại sao trong quá trình chuẩn bị dịch protein mẫu
cần phân tích lại sử dụng NaOH
-NaOH giúp phá vỡ màng tế bào
-NaOH tạo môi trường kiềm (pH>>pI) làm giảm độ kết tủa
nhằm thu được hết protein.

Câu 4: Ưu nhược điểm của phương pháp, cách khắc phục:

*)Ưu điểm:
-Phương pháp có độ nhạy cao, không cần đến sự phá hủy
protein.
-Phương pháp có độ nhay cao hơn phương pháp phản ứng
Ninhydrin và phản ứng màu biure.
-Các bước thí nghiệm có thể đơn giản thực hiện vì vậy dễ dàng
thực hiện ở các phòng thí nghiệm có quy mô nhỏ.
*)Nhược điểm:
-Các chất tan có thể làm ảnh hưởng đến màu và độ hấp thụ ánh
sáng của phản ứng.
-Các loại pr ở cùng một nồng độ có thể cho cường độ màu khác
nhau.
*)Khắc phục
-Phương pháp Bradford: Cho protein phản ứng với Coomassie,
đo hấp thụ ở bước sóng 595nm. Phương pháp này có độ nhạy
hơn phương pháp Lowry khoảng 4 lần, không phụ thuộc vào
thành phần amino acid của protein, ít bị ảnh hưởng bởi các hợp
chất khác.